CN110256572A - 一种rhc-(rada)4融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RHC‑(RADA)4融合蛋白，该融合蛋白的基因序列由以下两部分组成：RHC基因序列和(RADA)4基因序列。本发明的RHC‑(RADA)4融合蛋白在国内外尚属首次，其优点为：(1)RHC‑(RADA)4融合蛋白为基因工程直接表达产物，解决了低分子量(RADA)4通过化学合成导致成本高的问题。(2)获得的RHC‑(RADA)4融合蛋白较单纯使用RHC具有更优异的止血效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种RHC-(RADA)4融合蛋白。
背景技术
治疗战争和外科创伤所导致的不可控出血是全球关注的热点，这种不可控出血造成的死亡率达30％以上，其中半数以上发生在未做急救护理之前。因此，使用止血材料快速有效地控制出血是非常重要的创伤急救措施。自组装肽(RADA)4是化学合成的强效止血材料，能够在15s内终止成年仓鼠脑、脊髓、股动脉和肝等部位的创伤出血，其生物可降解，降解产物氨基酸机体可利用，无病原风险。但合成、纯化价格昂贵，应用范围极大受限。当前，低成本获取药用蛋白的首选方法是基因工程发酵。但是，(RADA)4相对分子量偏低，即使利用基因工程技术在宿主细胞中过表达，也因稳定性太差而难以获得理想的浓度水平。提高(RADA)4在宿主细胞中的稳定性是实现基因工程法生产(RADA)4的关键。
类人胶原蛋白是根据胶原蛋白多肽链中“Gly-Pro-Hyp”、或“Gly-Pro-Xaa”和“Gly-Xaa-Yaa”(Xaa、Yaa代表Gly和Pro以外的任何氨基酸)的重复序列，通过基因工程技术获得的具有胶原蛋白特性的蛋白质。RHC(Recombinant Human Collagen，重组人胶原蛋白)海绵除具有动物胶原蛋白的生物特性外，还具有高孔隙率、高弹性模量、加工性能好、且无病毒隐患和排异反应低等优点。类人胶原蛋白已被证实可应用于皮肤护理，药物递送，止血海绵，包裹改性纳米微球，皮肤缺损修复，组织工程血管支架，组织工程软骨及骨研究等，充分表明了类人胶原蛋白优异的生物相容性。但目前尚未有将RHC与(RADA)4复合的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种利用基因工程技术制备的RHC-(RADA)4融合蛋白，该融合蛋白为基因工程直接表达产物，解决(RADA)4只能通过化学合成导致成本高、不能稳定性表达的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种RHC-(RADA)4融合蛋白，该融合蛋白的基因序列由以下两部分组成：RHC基因序列和(RADA)4基因序列，该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示。
本发明还具有如下区别技术特征：
所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、合成RHC-(RADA)4编码基因，并保存于克隆载体；
步骤二、通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收，将RHC-(RADA)4融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得RHC-(RADA)4融合蛋白表达载体；
步骤三、实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达；
步骤四、纯化过表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白，干燥保存。
所述步骤一中，RHC的序列(Gly-Xaa-Yaa)n中的n可以是任一数字，其中Xaa、Yaa为Gly以外的任何氨基酸。
所述步骤二中，将RHC-(RADA)4融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体包括：采用细菌表达时，将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化的原核表达载体的相应位点，经细菌转化和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的RHC-(RADA)4表达载体；采用真核表达时，将RHC-(RADA)4编码基因的克隆载体线性化，转化真核细胞和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的RHC-(RADA)4表达载体。
所述步骤二中，用于保存RHC-(RADA)4融合蛋白的克隆菌株为原核细胞或真核细胞。
所述步骤三中，实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达包括：采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定RHC-(RADA)4融合蛋白为可溶性表达还是包涵体表达，对可溶性表达收集上清，对包涵体表达收集沉淀后用盐酸胍或尿素溶解。
所述步骤四中，纯化表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白包括：确定RHC-(RADA)4融合蛋白等电点后采用阴/阳离子交换层析或反相色谱法进行纯化。
上述的RHC-(RADA)4融合蛋白用于提高(RADA)4在宿主细胞中的稳定性。
本发明的有益效果是：
本发明提出了一种提高(RADA)4在宿主细胞中稳定性的新思路，不同于目前的研究热点(通过研究(RADA)4本身来解决其在宿主细胞中的稳定性问题)，本发明是将(RADA)4与其他蛋白融合表达，通过提高其共同表达产物的稳定性来达到间接提高(RADA)4在宿主细胞稳定性的目的。本发明首次将RHC与(RADA)4融合，获得的RHC-(RADA)4融合蛋白能实现稳定性表达，且表达不受复合的影响。
本发明还同时获得了以下效果：
(1)RHC-(RADA)4融合蛋白为基因工程直接表达产物，解决(RADA)4只能通过化学合成导致成本高的问题。
(2)获得的RHC-(RADA)4融合蛋白相比于(RADA)4具有更优异的止血效果。
附图说明
图1为实施例3：Xho I和Not I双酶切检测RHC-RADA编码基因在pPIC9K中的克隆。M：DNA Marker III；1-2：pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒。
图2为实施例3：Sal I单酶切线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒后，核酸电泳检测线性化结果。M：DNA Ladder Mix；1：未线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒；2：线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒。
图3为实施例3：线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒电转入酵母，提取酵母基因组，检测电转效率，以提取基因组为模板，用RHC-(RADA)4序列中的一段设计引物然后PCR，核酸电泳，筛选导入pPIC9K-RHC-(RADA)4的酵母菌株。M：DNA Ladder Mix；1-23：导入pPIC9K-RHC-(RADA)4酵母菌株的基因组PCR RHC-(RADA)4部分基因。其中1、7、8、11、12、14、16、19-22号菌株基因组中有RHC-(RADA)4部分基因。
图4为实施例3：挑选了7株酵母菌表达菌株，SDS-PAGE结果表明7株酵母菌中1、4、6、7可表达RHC-(RADA)4融合蛋白(分子量52kD)。M：蛋白分子量Marker；1-7：诱导菌株上清。
图5为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白纯化过程，通过阳离子交换色谱纯化，收集图谱中出峰时的洗脱液做SDS-PAGE确定纯化工艺。通过阳离子交换色谱法获得纯度达到95％以上的RHC-(RADA)4融合蛋白。
图6为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白形貌观察及血小板粘附后形貌观察(a,b)RHC和(c,d)RHC-(RADA)4大体形貌观察；(e,f)RHC和(g,h)RHC-(RADA)4的SEM形貌观察，RHC为多孔结构，RHC-(RADA)4为纤维结构；(i,j)RHC和(k,l)RHC-(RADA)4孵育富血小板血浆1小时后的SEM形貌观察。RHC表面未观察到血小板，RHC-(RADA)4表面观察到血小板，且部分血小板伸出伪足。
图7为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验过程(a)RHC(b)RHC-(RADA)4(c)RHC物理复合(RADA)4。RHC已被血液浸透，而RHC-(RADA)4材料并未被血液浸透，只在与小鼠肝脏接触面有血液浸染，在阳性对照中，RHC物理复合(RADA)4也并未被血液浸透。在出血停止时，用镊子夹取材料时，RHC-(RADA)4与肝脏的结合最紧密，与肝脏之间形成了粘度较大的凝胶层。
图8为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验(a)RHC，(b)RHC-(RADA)4和(c)RHC物理复合(RADA)4止血前形貌观察；(d)RHC，(e)RHC-(RADA)4和(f)RHC物理复合(RADA)4止血后形貌观察；(g)应用止血材料后小鼠肝脏破裂出血量统计。RHC-(RADA)4组(20.17±7.47μL)的平均出血量显著低于RHC组(29.33±4.68μL,p＜0.05)，且与RHC与(RADA)4物理复合组无显著性差异(22.83±5.49μL,p>0.05)，证实RHC-(RADA)4有较好的止血效果。
图9为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验后电镜图片(a)RHC，(b)RHC-(RADA)4和(c)RHC物理复合(RADA)4材料200倍；(d-f)500倍；(g-i)1000倍；(j-l)3000倍；(m-o)6000倍。RHC组红细胞数量较其他两组多，推测原因为出血量较大，红细胞堆叠，数量大。RHC组未见到纤维蛋白，而RHC-(RADA)4组可观察到大量被激活的纤维蛋白，呈渔网状网罗住血细胞，形成血栓。RHC与(RADA)4物理复合组也可见激活的纤维蛋白，形成纳米纤维网，但数量及激活程度均低于RHC-(RADA)4组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供一种RHC-(RADA)4融合蛋白，其制备步骤为：
步骤一、人工合成RHC-(RADA)4编码基因(198bp，大肠杆菌偏好，如下)，并保存于pUC57克隆载体；
ACCATGGGCCAGGGCGTGGGTGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTAGCGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTTCCGCAGTGCCGGGCGGGCTGCG TGCTGATGCCCGCGCAGACGCGCGAGCTGATGCCCGGGCAGACGCGCTCGAG
步骤二、用NcoⅠ和Xho I双酶切pUC57-RHC-RADA质粒、pET28a质粒，分别回收RHC-(RADA)4目的片段及pET28a载体片段；用T4DNA连接酶连接获得pET28a-RHC-(RADA)4质粒；
步骤三、pET28a-RHC-(RADA)4质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，从转化平板上挑取单克隆接种至10mL接种工作浓度含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养5h左右至菌液明显浑浊，OD600约为0.4～0.6；加入10μL 100μg/mL的IPTG，37℃、200rmp诱导培养4h；收集菌液，离心收集上清及沉淀，上清样与沉淀样分别进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。
步骤四、利用阴/阳离子交换层析、镍填料亲和层析制备高纯度RHC-RADA；通过真空冷冻干燥制备RHC-(RADA)4融合蛋白多孔材料。
实施例2：
本实施例提供一种RHC-(RADA)4融合蛋白，其制备步骤为：
步骤一、人工合成RHC-(RADA)4编码基因(1304bp，酵母菌偏好，如下)，并保存于pUC57克隆载体；
CTCGAGAAAAGAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCACGTGCTGATGCCCGCGCAGACGCGCGAGCTGATGCCCGG GCAGACGCGTAAGCGGCCGC步骤二、用XhoⅠ和NotⅠ双酶切pUC57载RHC-(RADA)4质粒、pPIC9K质粒，回收RHC-(RADA)4目的片段及pPIC9K载体片段，用T4DNA连接酶连接获得pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒。接种DNA测序正确的转化子于含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，进行质粒大量提取，取适量进行梯度稀释后琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度。用Sal I单酶切质粒，线性化载体。将上述溶液混匀后在37℃条件下反应2h后取1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定酶切完全，回收pPIC9K-RHC-(RADA)4线性化片段。制备毕赤酵母GS115感受态；将线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4片段电转化入GS115感受态细胞，涂布平板，将平板在29℃生化培养箱中倒置培养2～5天，直到出现单菌落；将菌落依次点到含0.25mg/mL～4.0mg/mL 418抗性的YPD平板上，进行低拷贝到高拷贝筛选。G418抗性平板上随机挑取几个单菌落接15mLYPD培养基中29℃，220rpm振荡培养过夜，菌液分装保存甘油种，取少量菌体提取基因组作为模板，用RHC-(RADA)4序列中的一段设计引物然后PCR，核酸电泳，筛选导入RHC-(RADA)4目的片段的酵母菌株。
步骤三、取适量已导入RHC-(RADA)4的酵母菌转接25mLBMGY培养基，29℃，220rpm振荡培养至OD 600达到2～8，将菌液转移至50mL灭菌离心管中，室温4000rpm离心3min后倒掉上清液，用双蒸水重悬，离心倒掉上清后，用25mLBMMY培养基将菌体重新悬浮至OD 600等于1后转入250mL灭菌锥形瓶中，用六层灭菌纱布将瓶口封住，29℃，250rpm诱导培养，以同样条件培养未诱导菌株。诱导菌株每24h加250μL甲醇，诱导5天后停止培养，将发酵液离心，分别保存上清液和菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。
步骤四、利用阴/阳离子交换层析、反相色谱法制备高纯度RHC-(RADA)4；通过真空冷冻干燥制备RHC-(RADA)4融合蛋白多孔材料。
实施例3：
本实施例提供一种RHC-(RADA)4融合蛋白，其制备步骤为：
步骤一、人工合成RHC-(RADA)4编码基因(1718bp，酵母菌偏好，如下)，并保存于pUC57克隆载体；
CTCGAGAAAAGAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGAATTCGGTGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCACGTGCTGATGCCCGCGCAGACGCGCGA GCTGATGCCCGGGCAGACGCGTAAGCGGCCGC
步骤二、用XhoⅠ和NotⅠ双酶切pUC57载RHC-(RADA)4质粒、pPIC9K质粒，回收RHC-(RADA)4目的片段及pPIC9K载体片段，用T4DNA连接酶连接获得pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒(酶切验证见图1)。接种转化子于含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，进行质粒大量提取，取适量进行梯度稀释后琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度。用Sal I单酶切质粒，线性化载体。将上述溶液混匀后在37℃条件下反应2h后取1μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定酶切完全(见图2)，回收pPIC9K-RHC-(RADA)4线性化片段。制备毕赤酵母GS115感受态；将线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4片段电转化入GS115感受态细胞，涂布平板，将平板在29℃生化培养箱中倒置培养2～5天，直到出现单菌落；将菌落依次点到含0.25mg/mL～4.0mg/mL 418抗性的YPD平板上，进行低拷贝到高拷贝筛选。G418抗性平板上随机挑取几个单菌落接15mLYPD培养基中29℃，220rpm振荡培养过夜，菌液分装保存甘油种，取少量菌体提取基因组作为模板，用RHC-(RADA)4序列中的一段设计引物然后PCR，核酸电泳，筛选导入RHC-(RADA)4目的片段的酵母菌株(见图3)。
步骤三、取适量已导入RHC-(RADA)4的酵母菌转接25mLBMGY培养基，29℃，220rpm振荡培养至OD 600达到2～8，将菌液转移至50mL灭菌离心管中，室温4000rpm离心3min后倒掉上清液，用双蒸水重悬，离心倒掉上清后，用25mLBMMY培养基将菌体重新悬浮至OD 600等于1后转入250mL灭菌锥形瓶中，用六层灭菌纱布将瓶口封住，29℃，250rpm诱导培养，以同样条件培养未诱导菌株。诱导菌株每24h加250μL甲醇，诱导5天后停止培养，将发酵液离心，分别保存上清液和菌体，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测(见图4)。
步骤四、利用阴/阳离子交换层析、反相色谱法制备高纯度RHC-RADA，纯化过程见图5；通过真空冷冻干燥制备RHC-(RADA)4融合蛋白多孔材料。
效果验证：
图6为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白形貌观察及血小板粘附后形貌观察(a,b)RHC和(c,d)RHC-(RADA)4大体形貌观察；(e,f)RHC和(g,h)RHC-(RADA)4的SEM形貌观察，RHC为多孔结构，RHC-(RADA)4为纤维结构；(i,j)RHC和(k,l)RHC-(RADA)4孵育富血小板血浆1小时后的SEM形貌观察。RHC表面未观察到血小板，RHC-(RADA)4表面观察到血小板，且部分血小板伸出伪足。
图7为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验过程(a)RHC(b)RHC-(RADA)4(c)RHC物理复合(RADA)4。RHC已被血液浸透，而RHC-(RADA)4材料并未被血液浸透，只在与小鼠肝脏接触面有血液浸染，在阳性对照中，RHC物理复合(RADA)4也并未被血液浸透。在出血停止时，用镊子夹取材料时，RHC-(RADA)4与肝脏的结合最紧密，与肝脏之间形成了粘度较大的凝胶层。
图8为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验(a)RHC，(b)RHC-(RADA)4和(c)RHC物理复合(RADA)4止血前形貌观察；(d)RHC，(e)RHC-(RADA)4和(f)RHC物理复合(RADA)4止血后形貌观察；(g)应用止血材料后小鼠肝脏破裂出血量统计。RHC-(RADA)4组(20.17±7.47μL)的平均出血量显著低于RHC组(29.33±4.68μL,p＜0.05)，且与RHC与(RADA)4物理复合组无显著性差异(22.83±5.49μL,p>0.05)，证实RHC-(RADA)4有较好的止血效果。
图9为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验后电镜图片(a)RHC，(b)RHC-(RADA)4和(c)RHC物理复合(RADA)4材料200倍；(d-f)500倍；(g-i)1000倍；(j-l)3000倍；(m-o)6000倍。RHC组红细胞数量较其他两组多，推测原因为出血量较大，红细胞堆叠，数量大。RHC组未见到纤维蛋白，而RHC-(RADA)4组可观察到大量被激活的纤维蛋白，呈渔网状网罗住血细胞，形成血栓。RHC与(RADA)4物理复合组也可见激活的纤维蛋白，形成纳米纤维网，但数量及激活程度均低于RHC-(RADA)4组。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 西北大学
<120> 一种RHC-(RADA)4融合蛋白
<160> 3
<210> 1
<211> 198
<212> 重组蛋白基因序列 DNA（SEQ ID NO.1）
<213> 人工合成
<400> 1
ACCATGGGCCAGGGCGTGGGTGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTAGCGCAGGTGCACCTGGCCCGCCTGGTGCCCCGGGTCCTGCGGGTCCTCCGGGTTCCGCAGTGCCGGGCGGGCTGCGTGCTGATGCCCGCGCAGACGCGCGAGCTGATGCCCGGGCAGACGCGCTCGAG
<210> 2
<211> 1304
<212> 重组蛋白基因序列 DNA（SEQ ID NO.2）
<213> 人工合成
<400> 2
CTCGAGAAAAGAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCACGTGCTGATGCCCGCGCAGACGCGCGAGCTGATGCCCGGGCAGACGCGTAAGCGGCCGC
<210> 3
<211> 1718
<212> 重组蛋白基因序列 DNA（SEQ ID NO.3）
<213> 人工合成
<400> 3
CTCGAGAAAAGAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGATCCCCGGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGGTACCCCAGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCAGAATTCGGTGGTCCTCCCGGCGAACCAGGTAATCCTGGTAAACCTGGTTCTCCCGGCCCAGCTGGTTCCAACGGGGAGCCGGGTCCTGCCGGCTCACCCGGAGAAAAGGGGTCGCAAGGTAGTAATGGCAACCCAGGACCGGCAGGGAATCAGGGTCAACCTGGCAACAAAGGAAGCCCCGGGAATCCAGGTAAGCCGGGCGAGCCTGGATCTAACGGGCCCCAGGGTGAACCAGGCTCCCAAGGAAATCCGGGGAAAAACGGTCAGCCTGGCTCACCCGGATCGCAAGGGAGTCCAGGTAATCAGGGCCAACCGGGAAAGCCTGGGCAGCCCGGTGAGCAAGGCAGCCCAGGAAACCAGGGGCCGGCGGGTAATGAAGGCCCTAAAGGACAACCCGGGCAGAACGGTAAGCCACGTGCTGATGCCCGCGCAGACGCGCGAGCTGATGCCCGGGCAGACGCGTAAGCGGCCGC
Claims (9)
1.一种RHC-(RADA)4融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、合成RHC-(RADA)4编码基因，并保存于克隆载体；
步骤二、将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得RHC-(RADA)4融合蛋白表达载体；
步骤三、实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达；
步骤四、纯化过表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白，干燥保存。
3.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，步骤一RHC-(RADA)4编码基因中，RHC的序列为(Gly-Xaa-Yaa)n，其中，n可以是任一数字，Xaa、Yaa为Gly以外的任何氨基酸。
4.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤二中，通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收，将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化表达载体，经转化和重组子筛选鉴定，获得RHC-(RADA)4融合蛋白表达载体。
5.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，将RHC-(RADA)4融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体包括：采用细菌表达时，将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化的原核表达载体的相应位点，经细菌转化和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的RHC-(RADA)4表达载体；采用真核表达时，将RHC-(RADA)4编码基因的克隆载体线性化，转化真核细胞和重组子筛选鉴定，获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的RHC-(RADA)4表达载体。
6.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤二中，用于保存RHC-(RADA)4融合蛋白的克隆菌株为原核细胞或真核细胞。
7.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤三中，实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达包括：采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定RHC-(RADA)4融合蛋白为可溶性表达还是包涵体表达，对可溶性表达收集上清，对包涵体表达收集沉淀后用盐酸胍或尿素溶解。
8.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述步骤四中，纯化表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白包括：确定RHC-(RADA)4融合蛋白等电点后采用阴/阳离子交换层析或反相色谱法进行纯化。
9.权利要求1所述RHC-(RADA)4融合蛋白在提高(RADA)4在宿主细胞中的稳定性的应用。
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