CN101003802A - 人骨形态发生蛋白－2成熟肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物合成技术领域，尤其涉及一种人骨形态发生蛋白－2成熟肽的制备方法，其包括如下步骤：(1)人骨形态发生蛋白－2成熟肽基因的获得；(2)表达载体的构建及转化大肠杆菌宿主菌；(3)阳性克隆的筛选、培养和诱导表达；(4)包含体的收集和复性；(5)表达产物的分离纯化。其中所述的载体是pET系列表达载体。本发明的人骨形态发生蛋白－2成熟肽表达量高，生产工艺简单，成本低，产物具有生物学活性，适合于产业化，所生产的产品可应用于临床加速骨组织的再生。

Description

人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物合成技术领域，尤其涉及一种人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法。

背景技术

1965年，美国医生Urist发现脱钙的骨间质有诱导异位成骨作用，他认为在脱钙的骨间质中含有一种能诱导新骨形成的物质，并将其命名为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein BMP)。1988年，Wozney等人利用重组DNA技术在世界上首先克隆到4种人BMP的cDNA，他们的发现受到了世界各国科学家的极大重视。1990年，Celeste等报道了另三中BMP的克隆化研究，并建议将已克隆到的BMP分别命名为BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7。除BMP-1之外，它们都是TGF-β超家族成员，无论在基因或蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似。

在众多BMP中，有关BMP-2的成骨作用研究的最多，BMP-2被认为是活性最强，唯一能单独诱导成骨的因子[8]。体内体外实验证明BMP-2有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力。对于小鼠成骨细胞株，BMP-2可促进体外成骨。不表达BMP-2的成骨细胞的前体细胞不具备分化能力，但加入外源的BMP-2或将BMP-2的cDNA导入这种细胞可促进其分化。由于天然的BMP-2在各种组织中的含量极少，因此，各种研究用的多为在动物细胞中表达的重组人BMP-2。人BMP-2由114个氨基酸组成，分子量约16KD。在其55位的天冬酰胺残基上有糖基相连，糖基化可能与其生物半衰期有关。BMP-2的疏水性很强，除少数强变性剂之外，几乎不溶于各种溶剂。BMP-2为同源二聚体，分子量约为30kD，等电点约8.8。编码人BMP-2的基因位于染色体20p12的保守区域，cDNA全长1587bp，开放阅读框1188bp，编码有396个包括N端的信号肽、中间的前肽以及C端的成熟肽三部分。

BMP诱导成骨作用大致可分为四个时期：趋化期、分化期、骨质形成期及重塑期。首先是间充质细胞发生化学趋向、聚集、分化形成软骨和骨，最后形成骨髓。BMP的靶细胞是未分化、在一定条件刺激下有成骨潜能的间充质细胞。无论是胚胎期还是成年期，骨组织细胞均来源于间充质细胞，并且成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和成纤维细胞均是由未分化的间充质细胞衍生而来。间充质细胞在分化过程中受多种调节因子的控制，定向分化为具有各种表型的细胞。如果没有BMP的作用，间充质细胞就不会分化形成软骨和骨。成骨细胞的分化经历两个阶段，首先是未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞的前体细胞，接着由前体细胞转化为成熟的成骨细胞。BMP的主要作用就是诱导间充质细胞分化为成骨细胞，进而产生新骨。BMP诱导成骨的方式主要是软骨内化骨，也可以是膜内化骨方式成骨。

BMP对于靶细胞的调控主要通过其相应的受体起作用，信号传递是由I型和II型BMP的受体(Bone Morphogenetic Protein Receptor BMPR)共同介导的。BMPR属于转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)受体超家族的成员，是膜蛋白受体[22]，受体分子由细胞外区，跨膜区和细胞内区组成，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构以及与TGF-β受体类似的信号传递机制。目前公认的受体模型是四聚体(tetramer)模型，即两个I型受体的同二聚体(homodimer)和两个II型受体的二聚体一起组成四聚体，共同将信号传入细胞内。II型受体处于自动磷酸化状态，当与BMP结合后，其蛋白激酶活性激活，催化I型受体GS区的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，磷酸化的I型受体可进一步磷酸化下游分子，将信号传入细胞。BMPR的信号传递过程与TGF-β受体类似，所不同的是I型BMPR可直接与BMP结合，但这一结合的亲和力很弱，在II型受体同时存在的情况下，BMP对受体的亲和力大大增强，细胞对BMP的反应也随之增加。目前认为Smad1和Smad5参与了BMP的信号传递。有活性的I型BMPR可与Smad1或Smad5结合，并磷酸化Smad1或Smad5蛋白质羧基端的丝氨酸，激活的Smad1或Smad5蛋白可由细胞浆转入细胞核，或直接作用于下游靶基因，或与其他转录调节因子一起作用于下游靶基因。一系列基因的表达使得靶细胞出现分化，碱性磷酸酶活性提高，基质形成，血管形成，进而形成新的骨组织。

动物来源的BMP成功地应用于人骨缺损的治疗，但异种BMP能引起不同程度的免疫反应。人BMP由于含量很低，并且人骨来源不易，提取过程复杂，批次间差异较大，诱骨活性往往不高。人BMP基因克隆成功，为基因工程重组BMP的研制创造了条件。

1988年，Wozney等将BMP-2的cDNA插入真核表达载体，转染COS-1细胞，BMP-2基因在转染细胞中表达了全长蛋白质分子和部分小分子蛋白质，表达水平在不同细胞株中有一定差别，但总体水平都低于1％[5] 。经过不懈的努刀，Thies等于1992年实现了BMP-2在真核细胞中的表达，纯度达90％以上，并可以糖基化。

1994年，国内赵明等人首次完成了BMP-2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达，产物主要以包含体形式存在，经纯化获得了高纯度的BMP-2。骨诱导试验显示，0.5mg的重组BMP-2植入小鼠肌肉后的不同时间，局部出现间充质细胞的聚集和增生，软骨细胞分化及软骨和骨组织的形成。这表明大肠杆菌表达的非糖基化重组BMP-2具有良好的诱骨活性。

2002年，德国Vallejo等采用高密度发酵培养大肠杆菌实现了BMP-2的大规模生产。每升培养液可获得细胞干重75g，包含体形式的无活性BMP-2每升8.6g。表达产物经洗涤溶解后稀释复性形成二聚体，最后通过一步亲和层析纯化得到高纯度BMP-2二聚体，每升培养液可以得到750g纯化BMP-2。生物活性分析表明纯化的BMP-2与CHO细胞表达的BMP-2一样可诱导C2C12细胞的碱性磷酸酶活性。

另外，国内刘新平等、卢兹凡、赵明等、林松等也利用大肠杆菌表达了有诱骨活性的不同长度的BMP-2C端肽，表达量一般占菌体总蛋白的20％。蒲勤等利用温度诱导启动子体系在大肠杆菌中实现了BMP-2成熟肽的高效表达，表达量达45％～60％。林松还尝试了利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中高效表达BMP-2，表达产物在蚕体内可加工成具有诱骨活性的同二聚体。

Genetics Institute公司率先将人的BMP-2 cDNA转入真核工程细胞中(如COS和CHO细胞)表达，1996年已被FDA批准进入临床试验。

2002年7月2日，美国FDA批准Medtronic Sofamor Danek研制的INFUSE骨移植剂同LT-CAGE腰椎融合器械合用治疗椎尖盘退行性疾病。INFUSE骨移植剂是含有重组人骨形成蛋白2和胶原海绵的制剂，具有与天然蛋白相似的诱导骨形成的活性。该制剂与腰椎融合器械一起使用治疗锥尖盘退化症，减少了手术的疼痛和各种并发症。整形外科医生Scott Boden博士称该制剂将给脊柱外科带来一场革命。

Wyeth和Yamanouchi Europe B.V.联合开发的InductOs(TM)(rhBMP-2/ACS)已获得了欧洲的上市许可，该产品用于成人急性扁骨骨折的治疗，2003年上市。

国内杭州华东医药集团公司华东基因技术研究所研制成功的药物“骨优导”，是一种有生物活性的卫生材料。适用于治疗难愈性骨缺损。骨优导的活性来自它所含有的截短型重组人骨形态发生蛋白-2。该产品于2001年7月获得了国家药品监督管理局医疗器械临床研究批文。

目前应用于临床的人骨形态发生蛋白-2，国外产品来源于真核细胞表达体系，生产成本很高。国内产品是大肠杆菌表达的人骨形态发生蛋白-2截短突变体。而文献报道的一些全长人骨形态发生蛋白-2只停留在实验室水平，无法进入产业化水平。

有必要建立全长人骨形态发生蛋白-2成熟肽的大肠杆菌表达体系，以降低成本和避免使用突变体蛋白可能引起的无法预测的不良反应。

发明内容

为了解决上述长人骨形态发生蛋白-2的无法实现工业化生产的技术缺陷，本发明的目的是提供一种表达量高，工艺简单，成本低，产物具有生物学活性，适合于产业化的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法。

为了实现上述的技术目的，本发明采用了以下的技术方案。

人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)、人骨形态发生蛋白-2成熟肽基因的获得，基因序列如下：

5’ATA CAT ATG CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG

TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG

GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT

TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG GCT GAT CAT CTG AAC

TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC TCT GTT AAC

TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT GCT

ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG

AAC TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG TAC

AGC AAA ATT AAA TAC ATA AAT ATA TAT ATA CTC TAG AGT CGA CGG

AAT TCT GCA  3’；

(2)、将上述基因片段酶切后插入到用同样酶处理的pET系列质粒载体，连接后转化大肠杆菌宿主菌；

(3)、筛选出阳性克隆后在培养基中进行培养，经诱导剂诱导使目标蛋白表达；

(4)、将上述得到的发酵菌体缓冲液悬浮，破碎，离心收集得到包含体，然后包含体复性；

(5)、表达产物的分离纯化，得到所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽。

作为优选，步骤(1)是通过设计的引物从胎肝组织提取的RNA，通过RT-PCR扩增获得目的基因。作为优选，所设计的引物包括：

引物1：5’TATA CAT ATG CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG；

引物2：5’TGCA GAA TTC CGT CGA CTC TAG AGT ATA。

作为优选，步骤(2)中pET系列载体质粒为pET-11或pET-22。作为优选，步骤(2)中酶切位点是Nde I/EcoR I或Nco I/EcorR I位点。

作为优选，步骤(3)中选用氨苄青霉素做抗性筛选，培养的温度控制在28℃～40℃，诱导表达使用浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG作为诱导剂。作为再优选，步骤(3)培养的温度控制在30℃～37℃。作为再优选，步骤(3)采用0.4～1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂。

作为优选，步骤(4)是发酵菌体缓冲液充分悬浮，超声破碎，离心收集沉淀即为粗包含体，粗包含体充分悬浮后搅拌洗涤2～4次，离心收集沉淀即为纯化包含体；纯化包含体按1∶30～1∶20的比例悬浮于裂解液中，变性蛋白稀释于0.3～0.8mol/L精氨酸使其复性。

作为优选，步骤(5)采用离子交换层析、疏水层析或分子筛层析技术纯化。

本发明由于采用了上述的方案后，人骨形态发生蛋白-2成熟肽表达量高，生产工艺简单，成本低，产物具有生物学活性，适合于产业化，所生产的产品可应用于临床加速骨组织的再生。

附图说明

图1：重组BMP-2表达质粒结构图。

图2：BMP-2诱导表达SDS-PAGE电泳分析图，其中M：分子量标准(自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD)；1：诱导前菌体全蛋白；2：诱导1小时菌体全蛋白；3：诱导2小时菌体全蛋白；4：诱导3小时菌体全蛋白；5：诱导4小时菌体全蛋白；6：诱导5小时菌体全蛋白。

图3：BMP-2包含体SDS-PAGE电泳分析图，其中M：分子量标准(自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD)；1、2、3、4、5、6、7：经洗涤的包含体。

图4：非还原SDS-PAGE电泳分析纯度结果图，其中M：分子量标准(自上而下为97.4、66.2、43、31、20.1、14.4kD)；2、3、4：纯化BMP-2样品。

具体实施方式

1、BMP-2基因的获得

取胎儿肝组织0.5g，匀浆器粉碎，用Trizol试剂抽提总RNA。根据Genebank公布的BMP-2基因序列设计PCR引物：

引物1：5’TATA CATATG(NdeI酶切位点)CAA GCC AAA CAC AAA CAGCGG。

引物2：5’TGCA GAATTC(EcoR I酶切位点)CGT CGACTC TAGAGTATA。

设计序列时，在起始密码子ATG之前，加入了Nde I酶切位点，而在基因的3’端是非编码区序列，这样在表达时有基因3’端终止密码和调控序列终止翻译。

逆转录获得BMP-2 cDNA：在0.5ml微量反应管中，24μl反应液中加入3’端引物200pmol/L，总RNA 15μg，70℃加热5分钟后加入第一链缓冲液、RNsin、AMV逆转录酶、dNTPs，混合反应物于42℃反应1小时。

PCR扩增目的基因：逆转录结束后于20μl反应液中加入5’端引物、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶，覆盖石蜡油。扩增条件为：94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后于75℃延伸5分钟。电泳检测扩增片段大小约为400bp。将扩增基因装入T Vector中，转化Top10菌株，准备用于测序。

序列测定结果：测得的序列与文献序列完全一致。序列如下：

5’ATA CAT ATGCAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT

AAG AGA CAC CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT

GTG GCT CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT

CTG GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAGACG TTG GTC AAC

TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT GCT

ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC TAT CAG

GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG TAC AGC AAA ATT AAA TAC ATA

AAT ATA TAT ATA CTC TAG AGT CGA CGG AAT TCT GCA 3’(注：下划线处为酶切位点)

2、BMP-2表达载体的构建

PCR产物用Nde I和EcoR I双酶切，将其插入用相同的两种酶酶切过的pET-11b(+)载体中，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，载体自连作为对照。

挑取重组质粒转化平板单克隆，小量质粒抽提试剂盒提取质粒，以Nde I和EcoRI双酶切鉴定，得到双酶切片段大小约为400bp的单克隆为含有目的基因的重组菌。

质粒酶切图谱鉴定为正确后，用该质粒转化感受态BL21/DE3大肠杆菌，挑选10个克隆，分别接种在小试管中的LB培养基中，37℃振荡培养，待细菌生长到OD_600nm＝0.6时，留少量细菌悬液于-20℃后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，继续振荡培养，每隔1小时收获细菌直至5小时。

用15％SDS-PAGE观察不同克隆的细菌在加入IPTG之前以及之后的不同时间点的蛋白表达情况，结果显示全部克隆均在诱导后增加了分子量12kDa左右的蛋白条带。该条带分子量与文献报道的rhuBMP-2分子量一致。

取经IPTG诱导表达的菌体超声破碎，离心收集上清和沉淀，用15％SDS-PAGE电泳分析，结果目标蛋白主要在细胞破碎后的沉淀中，表明BMP-2以包含体形式表达。

3、包含体的复性

将一定量包含体裂解液(裂解液采用8mol/L的尿素或6mol/L盐酸胍)稀释于复性液中，使蛋白质终浓度为0.08～0.1mg/mL，置4℃冰箱复性18小时。复性液组成如下：

L-Arg                0.5mol/L

GSSG                 0.1mmol/L

GSH                  1mmol/L

Glycerol             5％

Tris-CL，pH8.5       20mmol/L

4、表达产物的纯化

缓冲液Q-A：20mmol/L Tris-CL，pH8.5；

缓冲液Q-B：20mmol/L Tris-CL，pH8.5，1.2mol/L NaCL；

缓冲液CM-A：15mmol/L H3PO4，pH6.5；

缓冲液CM-B：15mmol/L H3PO4，pH6.5，1.2mol/L NaCL。

阴离子交换层析

预先装好Q-Sepharose Fast Flow凝胶的层析柱用缓冲液Q-A平衡至少两个柱床，使流出液pH为8.5。复性液用缓冲液Q-A稀释10倍，溶液电导在6mS/cm以下，上样流速30ml/min，上样结束后用缓冲液Q-A再洗脱使紫外吸收值回到基线。用15％缓冲液Q-B洗脱收集目标蛋白峰。用100％缓冲液Q-B清洗层次柱。

阳离子交换层析

预先装好CM-Sepharose Fast Flow凝胶的层析柱用缓冲液CM-A平衡至少两个柱床，使流出液pH为6.5。Q柱收集的目标蛋白峰用缓冲液CM-A稀释5倍，溶液电导在6mS/cm以下。用10％HAc将样品pH调至6.5，上样流速20ml/min，上样结束后用缓冲液CM-A洗脱使紫外吸收值回到基线。用1个柱床体积10％缓冲液CM-B洗脱，除去少量杂质。第二步用18％缓冲液CM-B洗脱，收集目标蛋白峰。第三步用100％缓冲液CM-B清洗层次柱。

5、纯化产物的活性分析

将胶原和样品称好分装于灭菌ependof管中，使用前将胶原加入到样品中，加微量无菌生理盐水，使胶原和样品混合在一起，压成一小团。

选体重25-30g的小白鼠，腹腔注射巴比妥麻醉，剂量0.2mg/g，后肢股部皮肤经去毛，消毒，切开股四头肌，将蛋白胶原混合体埋植进去，不加样品的胶原做空白对照，缝合肌肉和皮肤，正常饲养。

样品植入后14天，取植入区新骨组织，剔除肌肉，剪成1-2mm的小块，放入试管中，每管分别加5ml 0.6N HCl，加盖，密封，在室温下放置24小时以上。离心，取上清，定容至100ml，用于测定钙含量。测定前用超纯水稀释到适当浓度。取同样重量的一般肌肉作为对照进行测量，同时也取胶原植入区的肌肉进行测量做对照。

活性单位定义为：rhBMP-2植入小鼠股部肌肉间隙14天时，植入区钙生成1μg为一个生物学活性单位，缩写为“BU”。rhBMP-2的比活性定义为rhBMP-2的生物学活性单位与植入的rhBMP-2量(mg)之比，单位为BU/mg，结果样品比活性达到8888BU/mg、9780BU/mg、7320BU/mg。

序列表

<110>杭州北斗生物技术有限公司

<120>人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法

<160>2

<170>patientin 3.3

<210>1

<211>411

<212>DNA

<213>人工

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(411)

<400>1

atacatatgc aagccaaaca caaacagcgg aaacgcctta agtccagctg taagagacac    60

cctttgtacg tggacttcag tgacgtgggg tggaatgact ggattgtggc tcccccgggg    120

tatcacgcct tttactgcca cggagaatgc ccttttcctc tggctgatca tctgaactcc    180

actaatcatg ccattgttca gacgttggtc aactctgtta actctaagat tcctaaggca    240

tgctgtgtcc cgacagaact cagtgctatc tcgatgctgt accttgacga gaatgaaaag    300

gttgtattaa agaactatca ggacatggtt gtggagggtt gtgggtgtcg ctagtacagc    360

aaaattaaat acataaatat atatatactc tagagtcgac ggaattctgc a             411

Claims (10)

1.人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)、人骨形态发生蛋白-2成熟肽基因的获得，基因序列如下：

5’ATA CAT ATG CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG

TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG

GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT

TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG GCT GAT CAT CTG AAC

TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC TCT GTT AAC

TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT GCT

ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG

AAC TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG TAC

AGC AAA ATT AAA TAC ATA AAT ATA TAT ATA CTC TAG AGT CGA CGG

AAT TCT GCA 3’；

(2)、将上述基因片段酶切后插入到用同样酶处理的pET系列质粒载体，连接后转化大肠杆菌宿主菌；

(3)、筛选出阳性克隆后在培养基中进行培养，经诱导剂诱导使目标蛋白表达；

(4)、将上述得到的发酵菌体用缓冲液悬浮，破碎，离心收集得到包含体，然后进行包含体裂解和复性；

(5)、表达产物的分离纯化，得到所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽。

2.如权利要求书1所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(1)是通过设计的引物从胎肝组织提取的RNA，通过RT-PCR扩增获得目的基因。

3.如权利要求书2所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于设计的引物包括：

引物1：5’TATA CAT ATG CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG；

引物2：5’TGCA GAA TTC CGT CGA CTC TAG AGT ATA。

4.如权利要求书1或2或3所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(2)中pET系列载体质粒为pET-11或pET-22。

5.如权利要求书4所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(2)中酶切位点是Nde I/EcoR I或Nco I/EcorR I位点。

6.如权利要求书1所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(3)中选用氨苄青霉素做抗性筛选，培养的温度控制在28℃～40℃，诱导表达使用浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG作为诱导剂。

7.如权利要求书1所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(3)培养的温度控制在30℃～37℃。

8.如权利要求书1所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(3)采用0.4～1.0mmol/L的IPTG作为诱导剂。

9.如权利要求书1所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(4)是发酵菌体用缓冲液充分悬浮，破碎，离心收集沉淀即为粗包含体，粗包含体充分悬浮后搅拌洗涤2～4次，离心收集沉淀即为纯化包含体；纯化包含体按1∶30～1∶20的比例悬浮于裂解液中，变性蛋白稀释于0.3～0.8mol/L精氨酸使其复性。

10.如权利要求书1所述的人骨形态发生蛋白-2成熟肽的制备方法，其特征在于步骤(5)采用离子交换层析、疏水层析或分子筛层析技术纯化。

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