CN102220338B

CN102220338B - 人脐带间充质干细胞表达人2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法

Info

Publication number: CN102220338B
Application number: CN 201110116404
Authority: CN
Inventors: 杨国成; 夏腊菊; 周波; 杨媛
Original assignee: WUHAN BEIDU BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: WUHAN BEIDU BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2031-05-06
Also published as: CN102220338A

Abstract

本发明涉及一种STEMPRO MSC SFM无血清Cytolinel微载体培养技术，培养人脐带间充质干细胞(HUMSC)表达重组人2.5SβNGF和分离纯化人2.5SβNGF的方法。该方法采HUMSC表达系统表达2.5S-βNGF，采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用法分离纯化。该方法与从小鼠颌下腺提取NGF或大肠杆菌表达系统表达NGF利用亲和层析、离子交换层析和疏水层析技术分离相比，具有生产规模大、产品纯度高、产品生物活性高和收率高、可避免异源性蛋白的污染等优点。

Description

人脐带间充质干细胞表达人2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法

技术领域

本发明是涉及生物医药技术领域，特别是一种用人脐带间充质干细胞(HUMSC)表达人2.5Sβ-神经生长因子(2.5Sβ-NGF)及分离纯化的方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。

大鼠体内试验结果表明：神经生长因子可改善由己二酮和丙烯酰胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经-肌肉动作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果表明，神经生长因子有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤维数量等作用。以上结果提示神经生长因子可能有促进神经损伤修复的作用。目前，生产2.5Sβ-NGF的方法主要从小鼠颌下腺提取，还没见到利用HUMSC表达的报道。

利用HUMSC细胞表达2.5Sβ-NGF是新一代NGF表达系统，它克服了传统大肠杆菌系统不能进行翻译后的修饰活性低等缺点。利用基因重组技术表达人神经生长因子的优点是NGF的结构和功能与人体天然的NGF结构和功能完全一致，没有免疫原性，具有半衰期较长，没有鼠源性病毒交叉感染的安全隐患等优点。在临床上治疗神经损伤，促进损伤神经恢复方面占有重要地位。

发明内容

本发明的目的是提供一种用HUMSC干细胞表达重组人2.5SβNGF，采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用法分离纯化法。

人体脐带间充质干细胞表达人体2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤：

1、HUMSC原代细胞的分离与培养；

2、传代扩增；

3、冻存：

4、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增；

5、HUMSC的微载体扩增；

6、2.5Sβ-NGF的分离纯化。

该方法的有益效果是：具有比传统亲和层析、离子交换层析和疏水层析法具有分离规模大、产品纯度高、活性高和收率高等优点。

具体实施方式

实施例1

一、HUMSC原代细胞的分离与培养

1、取破宫产无菌脐带20cm，置无菌生理盐水瓶中，4℃保存。

2、生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成5cm片段，剔除血管，PBS洗涤2次。

3、将8cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml。

4、将脐带剪成10mm³小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％(含3mM的CaCl₂，)，混匀，37℃消化4小时。

5、STEMPRO MSC SFM培养：消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO₂。

6、3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养。

二、传代扩增

1、原代细胞培养12天后，培养瓶内细胞达到80％生长面积，集落生长达到95％融合可进行传代，P1代后90％融合后可传代。

2、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化40秒。

3、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，离心收获细胞，STEMPRO MSCSFM分瓶培养传代。

三、冻存

1、取对数生长期的HUMSC加10％DMSO和FBS于冻存管按冻存曲线在程控降温仪中降温，降温结束后置液氮中保存。

四、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增

1、将带有(1)2.5Sβ-NGF基因、(beta亚基)；(2)EGFP(enhanced green fluorescent protein)基因和(3)Neo(R)基因(新霉素抗性基因)的慢病毒载体LV(multigenic lentiviral vector，LV)导入HUMSC干细胞培养基培养，经筛选、鉴定后再诱导分化。

在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和细胞因子等诱导下，HUMSC可向神经细胞和神经胶质细胞分化。将HUMSCs在STEMPROMSC SFM培养基培养，加入神经条件培养基NCM中诱导成神经细胞，进一步诱导，最后可得到12.7％的酪氨酸羟化酶TH阳性神经细胞，该细胞能分泌出多巴胺。并表达成熟神经细胞相关蛋白、可稳定的表达2.5Sβ-NGF，生物活性可达到180万AU/mgNGF，还可分泌如粒细胞集落刺激因子(G-SCF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)等各种神经营养因子。

五、HUMSC的Cytoline1微载体培养

1、小规模一次性生物反应器Cytoline1微载体培养：将诱导分化的细胞和微体进行小规模培养，Cytoline1微载体浓度为5克/L，待细胞浓度达到2×10⁶后转入大规模培养。

2、大规模一次性生物反应器微载体培养：将小规模培养的细胞换液，调整细胞密度至5×10⁵cells/ml，加入间充质干细胞培养基和微载体，加入组合细胞因子SCF15ng/ml，FL5ng/ml，TPO6ng/ml]，IL-315ng/l1]，G-CSF1 ng/mg GM-CSF5ng/ml，接种至生物反应器中，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共同养12天；规模为每批5L，收获细胞总数约为5×10¹³个细胞。

六、2.5Sβ-NGF的分离纯化

1、等电点沉淀；采用离心法将培养基和细胞分离，将培养基P^H调至9.1，搅匀，室温静置2小时，离心分离沉淀，备用。

2、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析分离：

CM-SepharosFF用2-3倍柱床体积的PH6.8，0.02MPB平衡，离心分离沉淀液经透析平衡后加入层析柱，流速50ml/h.cm²，s收集流出液，4℃酸化处理。再经SP-SepharoeHP层析，温度4℃，离子交换层析分离纯化2.5SβNGF，一次可分离10L以上，可获得10mgNGF，生物活性达到150万AU/mg，分子量14,000Da，等电点为9.1。生物活性鉴定表明：纯化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表达的100多倍。该方法分离纯化的2.5Sβ-NGF能促进鸡胚和新生小鼠背根节细胞在体外的存活、生长和分化。

实施例2

一、HUMSC原代细胞的分离与培养

1、取破宫产无菌脐带30cm，置无菌生理盐水瓶中，5℃保存。

生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成6cm片段，剔除血管，PBS洗涤3次。

2、将10cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml。

3、将脐带剪成10mm3小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％(含3mM的CaCl₂，)，混匀，37℃消化4.5小时。

4、STEMPRO MSC SFM培养：消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO₂.

5、3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养。

二、传代扩增

1、原代细胞培养13天后，培养瓶内细胞达到85％生长面积，集落生长达到95％融合可进行传代，P1代后90％融合后可传代。

2、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化55秒。

三、冻存

四、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增

1、将带有(1)2.5Sβ-NGF基因、(beta亚基)；(2)EGFP(enhanced green fluorescent prote in)基因和(3)Neo(R)基因(新霉素抗性基因).的慢病毒载体LV(multigenic lentiviralvecto r，LV)导入HUMSC干细胞干细胞培养基培养，经筛选、鉴定后再诱导分化。

在二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和细胞因子等诱导下，HUMSC可向神经细胞和神经胶质细胞分化。将HUMSCs在DMEM培养，加入神经条件培养基NCM中诱导成神经细胞，进一步诱导，最后可得到12.7％的酪氨酸羟化酶TH阳性神经细胞，该细胞能分泌出多巴胺。并表达成熟神经细胞相关蛋白、可稳定的表达2.5Sβ-NGF，生物活性可达到180万AU/mgNGF，还可分泌如粒细胞集落刺激因子(G-SCF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)等各种神经营养因子。

五、HUMSC的扩增

1、一次性生物反应器小规模Cytoline1微载体培养：将诱导分化的细胞和微体进行小规模培养，微载体浓度为5克/L，待细胞浓度达到2×10⁶后转入大规模培养。

2、一次性生物反应器大规模微载体培养：将小规模培养的细胞换液，调整细胞密度至5×10⁵cells/ml，加入间充质干细胞培养基和微载体，加入组合细胞因子SCF15ng/ml，FL5ng/ml，TPO6ng/ml]，IL-315ng/l1]，G-CSFl ng/mg GM-CSF5ng/ml，接种至生物反应器中，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共同养12天；规模为每批5L，收获细胞总数约为5×10¹³个细胞。

六、2.5Sβ-NGF的分离纯化

2、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析分离：

CM-SepharosFF用2.5倍柱床体积的PH6.8，0.02MPB平衡，离心分离培养上清液经透析平衡后加入层析柱，流速50ml/h.cm2，s收集流出液，4℃酸化处理。再经SP-SepharoeHP层析，温度4℃，离子交换层析分离纯化2.5SβNGF，一次可分离10L以上，可获得15mgNGF，生物活性达到140万AU/mg，分子量14,000，等电点为9.1。生物活性鉴定表明：纯化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表达的100多倍。该方法分离纯化的2.5Sβ-NGF能促进鸡胚和新生小鼠背根节细胞在体外的存活、生长和分化。

实施例3

一、HUMSC原代细胞的分离与培养

1、取破宫产无菌脐带40cm，置无菌生理盐水瓶中，6℃保存。

2、生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成7cm片段，剔除血管，PBS洗涤4次。

3、将12cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml。

4、将脐带剪成10mm³小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％(含3mM的CaCl₂，)，混匀，37℃消化5小时。

5、STEMPRO MSC SFM培养：消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO₂.

6、3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养。

二、传代扩增

1、原代细胞培养14天后，培养瓶内细胞达到90％生长面积，集落生长达到95％融合可进行传代，P1代后90％融合后可传代。

2、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化70秒。

三、冻存

四、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增

1、将带有(1)2.5Sβ-NGF基因、(beta亚基)；(2)EGFP(enhanced green fluorescent protein)基因和(3)Neo(R)基因(新霉素抗性基因).的慢病毒载体LV(multigenic lentiviralvecto r，LV)导入HUMSC干细胞干细胞培养基培养，经筛选、鉴定后再诱导分化。

在二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和细胞因子等诱导下，HUMSC可向神经细胞和神经胶质细胞分化。将HUMSCs在STEMPROMSC SFM培养，加入神经条件培养基NCM中诱导成神经细胞，进一步诱导，最后可得到12.7％的酪氨酸羟化酶TH阳性神经细胞，该细胞能分泌出多巴胺。并表达成熟神经细胞相关蛋白、可稳定的表达2.5Sβ-NGF，生物活性可达到180万AU/mgNGF，还可分泌如粒细胞集落刺激因子(G-SCF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)等各种神经营养因子。

五、HUMSC的扩增

2、一次性生物反应器大规模Cytoline1微载体培养：将小规模培养的细胞换液，调整细胞密度至5×10⁵cells/ml，加入间充质干细胞培养基和微载体，加入组合细胞因子SCF15ng/ml，FL5ng/ml，TPO6ng/ml]，IL-315ng/l1]，G-CSFl ng/mg GM-CSF5ng/ml，接种至生物反应器中，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共同养12天；规模为每批5L，收获细胞总数约为5×10¹³个细胞。

六、2.5Sβ-NGF的分离纯化

1、等电点沉淀：采用离心法将培养基和细胞分离，将培养基P^H调至9.1，搅匀，室温静置2小时，离心分离沉淀，备用。

2、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析分离：

CM-SepharosFF用3倍柱床体积的PH6.8，0.02MPB平衡，离心分离培养上清液经透析平衡后加入层析柱，流速50ml/h.cm²，s收集流出液，4℃酸化处理。再经SP-SepharoeHP层析，温度4℃，离子交换层析分离纯化2.5SβNGF，一次可分离10L以上，可获得20mgNGF，生物活性达到160万AU/mg，分子量14,000，等电点为9.1。生物活性鉴定表明：纯化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表达的100多倍。该方法分离纯化的2.5Sβ-NGF能促进鸡胚和新生小鼠背根节细胞在体外的存活、生长和分化。

本方法采用无血清培养技术培养HUMSC干细胞并用该细胞表达人2.5Sβ-NGF并采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用技术分离纯化2.5Sβ-NGF，产品纯度达到98％(HPLC法)、相对分子质量约为14000Da，收率达73.0％，产品DNA残留可降低到1.5ng/mg以下，生物活性达到150万AU单位/mg，(鸡胚背根神经节法)，比小鼠颌下腺高50％。与传统大肠杆菌等原核表达系统和亲和层析分离技术比较，该表达分离纯化系统可对蛋白质进行翻译后的折叠和糖基化，提高了2.5Sβ-NGF的生物活性，利用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用技术分离纯化2.5Sβ-NGF，具有收率高、规模大、纯度高工艺稳定等优点，适合大规模生产。采用了无血清培养技术，培养携带有2.5Sβ-NGF基因的HUMSC干细胞，蛋白表达量可达到1-20mg/L.蛋白质可折叠和糖基化，使活性提高了50％以上。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.人体脐带间充质干细胞表达人体2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤：

一、人脐带间充质干细胞的分离与培养：

1)取破宫产无菌脐带20-40cm，置于无菌生理盐水瓶中，4-6℃保存；

2)生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成5-7cm片段，剔除血管，PBS洗涤2-4次；

3)将8-12cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml；

4)将脐带剪成10mm³小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％，混匀，37℃消化4-5h；

5)消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO₂；

6)3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养；

二、传代扩增：

1)、原代细胞培养12-14天后，培养瓶内细胞达到80-90％生长面积，集落生长达到95％融合进行传代，P1代后90％融合后传代；

2)、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化40-70秒；

3)、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，离心收获细胞，STEMPRO MSC SFM分瓶培养传代；

三、冻存；

四、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增：

1)、将带有2.5Sβ-NGF基因、EGFP基因和新霉素抗性基因的慢病毒载体LV导入HUMSC干细胞干细胞培养基培养，经筛选、鉴定后再诱导分化；

2)、在二甲基亚砜和细胞因子诱导下，HUMSC向神经细胞和神经胶质细胞分化；将HUMSCs在STEMPRO MSC SFM培养，加入神经条件培养基NCM中诱导成神经细胞，进一步诱导，最后得到12.7％的酪氨酸羟化酶TH阳性神经细胞；

五、HUMSC的扩增：

1)、一次性生物反应器小规模Cytoline1微载体培养：将诱导分化的细胞和微体进行小规模培养，Cytoline1微载体浓度为5克/L，待细胞浓度达到2×10⁶后转入大规模培养；

2)、一次性生物反应器大规模Cytoline1微载体培养：将小规模培养的细胞换液，调整细胞密度至5×10⁵cells/ml，加入间充质干细胞培养基和Cytoline1微载体，加入组合细胞因子SCF15ng/ml，FL5ng/ml，TPO6ng/ml，IL-3 15ng/ml，G-CSF1ng/mg，GM-CSF5ng/ml，接种至生物反应器中，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共同养12天；规模为每批5L，收获细胞总数约为5×10¹³个细胞；

六、2.5Sβ-NGF的分离纯化：

1)、等电点沉淀：采用离心法将培养基和细胞分离，将培养基PH调至9.1，搅匀，室温静置2小时，离心分离沉淀，备用；

2)、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析分离：CM-SepharosFF用2.5倍柱床体积的PH6.8，0.02MPB平衡，离心分离培养上清液经透析平衡后加入层析柱，流速50ml/h·cm²收集流出液，4℃酸化处理；再经SP-SepharoeHP层析，温度4℃，离子交换层析分离纯化2.5SβNGF。

2.如权利要求1所述的方法，所述步骤三包括取对数生长期的HUMSC加10％DMSO和FBS于冻存管按冻存曲线在程控降温仪中降温，降温结束后置液氮中保存的步骤。