CN110305869A - 一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法，所述重组鼠源抗菌肽Rattusin基因序列针对毕赤酵母菌密码子优化表达。所述重组鼠源抗菌肽Rattusin基因针对毕赤酵母的密码子进行序列优化表达，使得重组鼠源抗菌肽Rattusin基因在毕赤酵母菌种的表达产出浓度提高，且在表达的重组鼠源抗菌肽Rattusin蛋白上增加6个组氨酸，使得重组菌丝霉素更容易纯化，达到了提高产量和纯度的目的。

Description

一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法。
背景技术
鼠源抗菌肽Rattusin是大鼠α-防卫素相关肽，在远端小肠的帕内特细胞中表达，与大多数其他被灭活的α-防御素和β-防御素不同，鼠源抗菌肽Rattusin是一种独特的防御素相关肽，具有强大的不依赖盐的杀菌活性，对哺乳动物细胞基本没有毒性。功能和结构上与肠道其他防御素不同，鼠源抗菌肽Rattusin有可能提高宿主防御机制，此外具有很好的抗菌性，可以进一步开发鼠源抗菌肽Rattusin用于治疗囊性纤维化和克罗恩病，由于其低细胞毒性，鼠源抗菌肽Rattusin可能用于局部和全身感染的治疗。
鼠源抗菌肽Rattusin的生产方式主要有三种：提取、化学合成和生物合成。鼠尾草中的鼠源抗菌肽Rattusin的含量较少，因此通过提取的方式获得鼠源抗菌肽Rattusin是非常不经济的，化学合成成本太高，步骤繁琐，价格昂贵，不适合大规模生产，生物合成主要通过基因工程手段构建工程菌株异源表达鼠源抗菌肽Rattusin，但现有技术所构建的表达系统的鼠源抗菌肽Rattusin产量都非常低。
发明内容
本公开的目的是提供一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法，以提高鼠源抗菌肽Rattusin的产量。
为实现上述目的，技术方案如下：
一种重组鼠源抗菌肽Rattusin基因片段，所述基因片段序列针对毕赤酵母菌密码子优化表达，具体序列为SEQ ID No.1。
一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin表达载体的方法，所述方法的具体步骤包括：
(1)将SEQ ID NO.2-5基因片段进行拼接重组得到重组鼠源抗菌肽Rattusin基因，然后再进行PCR扩增；
(2)将含有编码MBP标签的载体进行线性化；
(3)利用同源重组法构建重组载体，将重组鼠源抗菌肽Rattusin基因与MBP标签片段进行重组，以得到具有MBP标签的重组鼠源抗菌肽Rattusin基因片段的重组载体；
(4)然后将重组载体进行转化，最后进行阳性菌落鉴定。
所述步骤(1)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
所述步骤(2)中载体线性化的引物序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。
所述MBP的基因序列为SEQ ID NO.10。
一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin酵母表达的方法，所述方法的具体步骤包括：
(a)将上述所构建的具有MBP标签的重组鼠源抗菌肽Rattusin基因片段的重组载体经限制性内切酶AvrⅡ线性化处理；
(b)将线性化的重组载体电转化至毕赤酵母菌感受态细胞中，然后在YPD固体培养基上培养，长出菌落，最后进行菌落鉴定；
(c)将鉴定为阳性的菌落进行重组鼠源抗菌肽Rattusin基因进行蛋白表达，然后将蛋白纯化。
所述步骤(b)菌落鉴定的方法为PCR鉴定，其中PCR扩增的引物序列分别为SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
重组鼠源抗菌肽Rattusin的氨基酸序列为SEQ ID NO.13。
本公开的有益效果是：提供了一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法，所述重组鼠源抗菌肽Rattusin基因针对毕赤酵母的密码子进行序列优化表达，使得重组鼠源抗菌肽Rattusin基因在毕赤酵母菌种的表达产出浓度提高，且在表达的重组鼠源抗菌肽Rattusin蛋白上增加6个组氨酸，使得重组菌丝霉素更容易纯化，达到了提高产量和纯度的目的。在重组鼠源抗菌肽Rattusin基因N端增加BMP标签，使得所表达的重组鼠源抗菌肽Rattusin的生物活性增强。
附图说明
图1为重组鼠源抗菌肽Rattusin基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2为载体线性化PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图3为重组鼠源抗菌肽Rattusin蛋白Western blot检测图。
图4为鼠源抗菌肽Rattusin蛋白蛋白纯化图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1重组鼠源抗菌肽Rattusin基因表达载体的构建
1.密码子的优化及基因的拼接重组
1.1密码子的优化
根据鼠源抗菌肽Rattusin氨基酸序列，进行密码子优化并确定碱基序列，设计如下6条基因序列：
Gene1:TTGAGAGTTAGAAGAACTTTGCAAT(SEQ ID NO.2)；
Gene2:AAGTGTTTCTACAAACTCTACGACAAGAGCATTGCAAAGTTCTTCTAACTCTCA(SEQ IDNO.3)；
Gene3:GTCGTAGAGTTTGTAGAAACACTTGTTCTTGTATTAGATTGTCTCGTTCTACATA(SEQ IDNO.4)；
Gene4:AGAAGCGTATGTAGAACGAGACAATCTAATACAA(SEQ ID NO.5)；
Gene-FP:AGGGAAGGTTGAGAGTTAGAAGAACTT(SEQ ID NO.6)；
Gene-RP:TCTAGAAAAGAAGCGTATGTAGAACGAG(SEQ ID NO.7)。
1.2基因的拼接重组
1.2.1基因的拼接
拼接PCR的反应体系如表1：
表1拼接体系
2×PfuMax HiFi PCR ProMix 10μL
Gene1～Gene4 各0.4μL
ddH<sub>2</sub>O Add to 20μL
拼接PCR反应程序如表2：
表2反应程序
1.2.2 PCR扩增重组基因
PCR反应体系如表3：
表3反应体系
2×PfuMax HiFi PCR ProMix 25μL
Gene-FP、Gene-RP(10μM) 各1μL
上一步PCR产物 1μL
ddH<sub>2</sub>O Add to 50μL
PCR反应程序如表4：
表4反应程序
PCR反应结束后，取PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳分析，如图1(泳道M：DNA Marker(100bp～1500bp)泳道1～4:目的蛋白基因PCR产物)所示，亮带与理论分子量约100bp相符，按照凝胶纯化试剂盒说明书回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测定浓度为25ng/μL，A260/A280为1.847。
2.重组载体的构建
2.1载体线性化
将含有编码MBP标签的pGAPZa A重组载体设计如下载体线性化引物：
Line-RP:ACTCTCAACCTTCCCTCGATCCC(SEQ ID NO.8)；
Line-FP:ATACGCTTCTTTTCTAGAACAAAAACTC(SEQ ID NO.9)。
线性化PCR反应体系如表5：
表5 PCR反应体系
2×PfuMax HiFi PCR ProMix 25μL
Line-RP、Line-FP(10uM) 各1μL
pGAPZa A-MBP质粒 1ng
ddH<sub>2</sub>O Add to 50μL
线性化PCR反应程序如表6：
表6 PCR反应程序
PCR反应结束后，取PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳分析，如图2(泳道M：DNA Marker(300bp～5000bp)泳道1～4:载体PCR产物)所示，亮带与理论分子量相符，按照凝胶纯化试剂盒说明书回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测定浓度为68.8ng/μL，A260/A280为1.825。
2.1同源重组
利用同源重组的方法构建重组载体，同时使得所表达目的蛋白N端融合MBP标签，使用表7的反应体系，37℃反应30min，冰浴冷却5min。
表7同源重组反应体系
5×CE Entry Buffer 4μL
目的基因胶回收产物 1μL
线性化载体胶回收产物 2μL
Exnase Entry 2μL
ddH<sub>2</sub>O Add to20μL
2.2转化
取10μL重组产物加到100μL DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30分钟；将上述转化液置于42℃水浴60秒，取出后立即置于冰浴中放置5分钟；向其中加入500μL 37℃预热的LowSalt LB(不含抗生素)培养液，150rpm、37℃振荡培养45分钟；2500rpm离心5分钟，将上清液吸走，留100μL混匀菌液，加到含Low Salt LB固体琼脂培养基上(Zeocin浓度25μg/mL)，用无菌的玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
2.3阳性菌落鉴定
挑取上述平板上的单菌落10个，分别溶到500μl含25μg/mL Zeocin的Low Salt LB培养液，37℃、180rpm/min震荡培养4h。每管取0.5μL菌液做模板，进行PCR。反应体系设计为10μL总体系如表8：
表8反应体系
2×Hotstart Taq PCR ProMix 5μL
菌液 0.5μL
Gene-RP(10μM) 0.5μL
Gene-FP(10μM) 0.5μL
H<sub>2</sub>O 3.5μL
反应程序如表9：
表9 PCR反应程序
PCR反应完取5μL PCR产物进行1.5.0％琼脂糖电泳分析，用特异性上游和下游引物扩增的条带理论大小为100bp左右。挑选阳性的克隆送测序公司测序进一步鉴定，测序结果为SEQ NO.14。
2.4重组质粒的提取
将阳性单克隆接种于含25μg/mL Zeocin的Low Salt LB培养液(16-20μL)中，于37℃、200r/min的摇床中培养16h；按照质粒提取试剂盒提取质粒，用微量分光光度计进行质粒浓度测定，浓度为224ng/μL，A260/A280为1.924，-20℃保存备用。
实施例2重组鼠源抗菌肽Rattusin酵母表达的构建
1.重组质粒的线性化及纯化
根据质粒pGAPZa A中可选择的线性化位点以及插入基因的碱基序列，最终选取限制性内切酶AvrⅡ对实施例1所制备的重组载体进行线性化处理。线性化体系如下表10所示：
表10线性化体系
成分 添加量
10×Cutsmart Buffer 15μL
重组质粒 15μg
AvrⅡ内切酶 3μL
补充无菌水至 150μL
将线性化溶液混匀后置于恒温水浴槽中，37℃酶切2h后，取2μL酶切后的产物用1.5％(v/v)的琼脂糖凝胶检测，确定重组质粒线性化完全。剩余线性化产物用有机酚/氯仿/异戊回收，具体步骤如下：
(1)加入等体积的有机酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀2min；
(2)加入1/10体积的3M醋酸钠及3倍体积的乙醇并混匀，置于-20℃冰箱中2h以上；
(3)13000rpm/min离心10min回收DNA沉淀，用500μL80％乙醇洗净2遍；
(4)加入30μL的Nuclease-free H2O溶解；
用微量分光光度计测定回收的线性化产物的浓度，浓度为245ng/μL，A260/A280为1.858，-20℃保存备用。
2.表达酵母的制备及筛选
2.1毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
(1)将毕赤酵母GS115菌液用无菌接种环划线接种至YPD固体培养基上，用封口膜将平板封口后，于30℃恒温培养箱中倒置平板培养至有单菌落长出；
(2)挑取纯化后的GS115单菌落接种至5mLYPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下过夜培养；
(3)按1：1000的比例将上述酵母菌液接种至100mLYPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下培养至OD值达1.3-1.5；
(4)将上述菌液分装至两个50mL无菌离心管中，4℃条件下1500g/min离心5min后，去除培养基；
(5)加入40ml新配(2h内)的LDST溶液(100mM LiAc，10mM dithiothreitol,0.6Msorbitol and 10mM Tris-Hcl pH 7.5，现用现配不能保存)，30℃孵育30min；
(6)室温6000rpm离心5min。弃上清，用1mL冰浴1M山梨醇重悬菌体，转至1.5ml EP管；
(7)用1ml冰浴1M山梨醇洗涤菌体3次(应快速，菌脆弱)最后用400μL冰浴1M山梨醇重悬菌体，分装80μL/管(现配现用)。
2.2重组质粒电转入毕赤酵母GS115感受态细胞
(1)打开电转化仪，预热30min；
(2)设置电穿孔转化电击条件：电压1500V，电阻200Ω，电容2.5mF，5ms；
(3)将5-10μg纯化后的线性化重组质粒加入到新鲜制备的GS115感受态细胞中，轻轻旋转离心管，使重组质粒和感受态细胞完全混匀后，将其全部转移至冰预冷处理的0.2cm无菌电转杯中；
(4)将电转杯继续冰浴5min后，放入电击槽，开始电击；
(5)电击结束后，立即向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇，用移液枪轻轻吹打混匀后，将其全部转移至无菌的1.5mL离心管中；
(6)将上述离心管置于30℃恒温培养箱中静置孵育1-2h；
(7)分别吸取10、25、50、100、200ul菌液涂布在含100μg/mL Zeocin的YPD固体培养基上；
(8)30℃恒温倒置平板2-3天，至长出单菌落。
2.3重组毕赤酵母基因组PCR鉴定
(1)将筛选出的三个耐Zeocin的转化子接种于5mL含100μg/ml Zeocin的YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下培养16-18h；
(2)取酵母裂解液50ul加入1μL的过夜培养的酵母菌液，85℃孵育30min，12000r/min离心2min，取1μL上清进行PCR扩增；
(3)采用载体通用引物、目的蛋白基因特异性引物分别对酵母基因组DNA进行PCR扩增。
载体通用引物：
pGAP Forword：GTCCCTATTTCAATCAATTGAA(SEQ ID NO.11)；
3’AOX1：GCAAATGGCATTCTGACATCC(SEQ ID NO.12)
目的蛋白基因特异性引物：
Gene-FP:AGGGAAGGTTGAGAGTTAGAAGAACTT(SEQ ID NO.6)；
Gene-RP:TCTAGAAAAGAAGCGTATGTAGAACGAG(SEQ ID NO.7)。
反应体系如表11：
表11反应体系
2×Hotstart Taq PCR ProMix 5μL
酵母细胞裂解液上清 1μL
pGAP Forword/Gene-FP 0.5μL
3’AOX1/Gene-RP 0.5μL
H<sub>2</sub>O 3μL
反应体系如表12：
表12反应体系
PCR反应完取5μL PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳分析，挑选阳性单克隆进行蛋白表达。
3.重组鼠源抗菌肽Rattusin蛋白的表达及纯化
3.1重组鼠源抗菌肽Rattusin蛋白在毕赤酵母菌中的表达
取阳性单克隆过夜培养液0.1mL接种到50mL(250mL摇瓶)的YPD培养基中，于30℃、250r/min条件下摇瓶表达；分别在培养24h、48h、72h后用15mL离心管取10mL培养液，于8000r/min离心5min，将上清转至另一15mL离心管，后将上清和菌沉淀，并放入-80℃保存，直至检测蛋白表达时取出。
将表达时间为24h、48h、72h的培养液上清经超滤浓缩、硫酸铵沉淀并复溶后进行Western blot检测，结果图3(M为Mark；1泳道为24h；2泳道为48h；3泳道为72h)所示，带组氨酸标签的目的蛋白获得可溶表达，并且在48h培养后目的蛋白的表达量最佳，因此确定表达培养时间为48h较好。
3.2重组鼠源抗菌肽Rattusin蛋白的纯化
3.2.1硫酸氨沉淀
(1)称取硫酸铵：按照每升上清加361g硫酸氨的比例称取硫酸氨粉末；
(2)硫酸的添加：在0℃的条件下，并边搅拌边将硫酸粉末慢慢敲入发酵液上清；
(3)静置沉淀：4℃冰箱静置4h，12000r/min离心30min，弃上清；
(4)蛋白复溶：按每1L发酵液上清所得到的沉淀蛋白中加入20mL组氨酸标签-亲和层析柱结合缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)计算加入适当的缓冲液，并涡旋直至所有蛋白复溶；
(5)过膜转移：将复溶后所得溶液过0.22μm过滤头，转移到新的无菌瓶中。
3.2.2亲和层析
(1)选用1ml组氨酸标签-亲和层析柱，纯化系统GE Healthcare AKTA pure；
(2)洗泵:用蒸馏水洗A1、B1泵后，再分别用结合缓冲液Buffer A(50mMTris-HCl，pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)、洗脱缓冲液Buffer B(50mMTris-HCl，pH 8.0、50mM氯化钠、500mM咪唑、5％甘油)分别洗A1、B1泵，流速75mL/min；
(3)平衡柱子：将A1泵放入Buffer A(50mMTris-HCl，pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)中，平衡10个柱体积结合缓冲液Buffer A(50mMTris-HCl，pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)，流速1mL/min；
(4)上样：用A1泵上样，流速为0.5mL/min；
(5)洗脱：按0％Buffer B、5％Buffer B、60％Buffer B、100％Buffer B进行梯度洗脱，每个梯度洗脱10个柱体积；
(6)收集：按峰收集，并超滤浓缩；
(7)电泳检测：将收集到的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图4，其中泳道M：蛋白Marker；泳道1：48h培养液上清浓缩液；泳道2：硫酸铵沉淀复溶；泳道3：亲和层析穿透液；泳道4：0％Buffer B洗脱收集液；泳道5：5％Buffer B洗脱收集液；泳道6：60％BufferB洗脱收集液；泳道7：100％Buffer B洗脱收集液。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因及酵母表达的方法
<130> 2019.05.22
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<213> 人工合成
<400> 3
aagtgtttct acaaactcta cgacaagagc attgcaaagt tcttctaact ctca 54
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtcgtagagt ttgtagaaac acttgttctt gtattagatt gtctcgttct acata 55
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
agaagcgtat gtagaacgag acaatctaat acaa 34
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agggaaggtt gagagttaga agaactt 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tctagaaaag aagcgtatgt agaacgag 28
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
actctcaacc ttccctcgat ccc 23
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
atacgcttct tttctagaac aaaaactc 28
<210> 10
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagtat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140
aacctcggga tcgagggaag g 1161
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gtccctattt caatcaattg aa 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gcaaatggca ttctgacatc c 21
<210> 13
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu Tyr Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile
370 375 380
Glu Gly Arg Leu Arg Val Arg Arg Thr Leu Gln Cys Ser Cys Arg Arg
385 390 395 400
Val Cys Arg Asn Thr Cys Ser Cys Ile Arg Leu Ser Arg Ser Thr Tyr
405 410 415
Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser
420 425 430
Ala Val Asp His His His His His His
435 440
<210> 14
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagtat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140
aacctcggga tcgagggaag gttgagagtt agaagaactt tgcaatgctc ttgtcgtaga 1200
gtttgtagaa acacttgttc ttgtattaga ttgtctcgtt ctacatacgc ttcttttcta 1260
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 1320
cat 1323

Claims (8)

1.一种重组鼠源抗菌肽Rattusin基因片段，其特征在于，所述基因片段序列针对毕赤酵母菌密码子优化表达，具体序列为SEQ ID No.1。
2.一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因表达载体的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
(1)将SEQ ID NO.2-5基因片段进行拼接重组得到重组鼠源抗菌肽Rattusin基因，然后再进行PCR扩增；
(2)将含有编码MBP标签的载体进行线性化；
(3)利用同源重组法构建重组载体，将重组鼠源抗菌肽Rattusin基因与MBP标签片段进行重组，以得到具有MBP标签的重组鼠源抗菌肽Rattusin基因片段的重组载体；
(4)然后将重组载体进行转化，最后进行阳性菌落鉴定。
3.根据权利要求书2中所述的构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因表达载体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增的引物序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
4.根据权利要求书2中所述的构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因表达载体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中载体线性化的引物序列为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。
5.根据权利要求书2中所述的构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因表达载体的方法，其特征在于，所述MBP的基因序列为SEQ ID NO.10。
6.一种构建重组鼠源抗菌肽Rattusin酵母表达的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
(a)将权利要求书2-5中任意一项所述的构建重组鼠源抗菌肽Rattusin基因表达载体的方法所构建的具有MBP标签的重组鼠源抗菌肽Rattusin基因片段的重组载体经限制性内切酶AvrⅡ线性化处理；
(b)将线性化的重组载体电转化至毕赤酵母菌感受态细胞中，然后在YPD固体培养基上培养，长出菌落，最后进行菌落鉴定；
(c)将鉴定为阳性的菌落进行重组鼠源抗菌肽Rattusin基因进行蛋白表达，然后将蛋白纯化。
7.根据权利要求书6中所述的构建重组鼠源抗菌肽Rattusin酵母表达的方法，其特征在于，所述步骤(b)菌落鉴定的方法为PCR鉴定，其中PCR扩增的引物序列分别为SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
8.一种根据权利要求书6或7中所述的构建重组鼠源抗菌肽Rattusin酵母表达的方法所制备的重组鼠源抗菌肽Rattusin，其特征在于，所述重组鼠源抗菌肽Rattusin的氨基酸序列为SEQ ID NO.13。
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