JP2006020539A - スタテリン融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 スタテリン構造ペプチドがシスタチンのカルボキシ末端と融合してなるスタテリン融合タンパク質;当該スタテリン融合タンパク質をコードする遺伝子;当該遺伝子を挿入した組換えベクターを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させ、培養物中に生成蓄積されたタンパク質を採取することを特徴とするスタテリン融合タンパク質の製造法。
【選択図】なし
Description
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ特異的プロテアーゼにより切断され、更にSer2及びSer3のリン酸化を受けることによりスタテリン様活性を示すタンパク質
(a)配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ特異的プロテアーゼにより切断され、更にSer2及びSer3のリン酸化を受けることによりスタテリン様活性を示すタンパク質をコードするDNA
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ特異的プロテアーゼにより切断され、更にSer2及びSer3のリン酸化を受けることによりスタテリン様活性を示すタンパク質
なお、上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、公知の部位特異的変異誘発法により実施することができる。
以下、本発明のスタテリン融合タンパク質の製造法を説明する。
(1)スタテリン遺伝子のクローニング
ヒト唾液スタテリンの遺伝子配列は、既に決定されている[Sabatini L., et al, GENE, 89,245-251(1990)]。従って、スタテリン遺伝子のクローニングは、この配列を参考にしてプライマーを合成し、プラスミドDNA型cDNA Library Human Pituitary Gland(タカラバイオ)を鋳型として、スタテリン構造ペプチド43残基をコードする領域をPCR法により増幅することにより行うことができる。PCR反応は、例えばPyrobest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ)を用いることができ、反応条件はその説明書に従って行えばよい。
本発明のスタテリン融合タンパク質発現用に用いることのできるプラスミドベクターとしては、宿主細胞内で複製可能であり、適当な形質転換マーカー遺伝子、宿主内で分泌可能なシグナル配列等をもち、導入した宿主細胞で機能するプロモーターの制御下、シスタチン遺伝子の下流にスタテリン遺伝子を接続した時にシスタチンと融合した状態でスタテリンを発現させることのできるものであれば如何なるものでもよい。また、シスタチン−スタテリンcDNA挿入のため、適当な制限酵素サイトがあることが望ましい。斯かるベクターとしては、例えばStaphylococcus aureus由来のpUB110、Bacilluscereus由来のpBC16、Enterococcus faecalis由来のpAMα1、pAMα1の一部を含み大腸菌、枯草菌で増殖できるシャトルベクターpHY300PLK(タカラバイオ)等が挙げられる。
斯かるプラスミドは、例えば、プロモーター配列及びリボソーム結合部位の下流に本発明のDNAを挿入する方法、例えばシグナルペプチドをコードするDNAの下流に、読み取り枠を揃え、本発明のDNAを挿入する方法等により作製することができる。
得られた組換えDNAを用いて、宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を作製する。本発明においてスタテリン融合タンパク質を生産するための宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母等を用いることができるが、枯草菌が好ましい。特に、プロテアーゼ遺伝子が欠損若しくは欠失した枯草菌、プロテアーゼの菌体外分泌が低下した枯草菌が好ましく、特に細胞外プロテアーゼであるaprE遺伝子が削除若しくは不活性化した枯草菌が好適である。プロテアーゼ遺伝子を欠損させる削除又は不活性化させる方法は、公知の方法、例えば標的遺伝子を順次削除又は不活性化する方法や、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりプロテアーゼ生産性の評価等を行うことにより目的の遺伝子を削除又は不活性化した菌株を得る方法がある。
尚、形質転換は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、塩化ルビジウム法、リポフェクション法、DEAE−デキストラン法、リチウム法、スフェロプラスト法、ウイルス等により行えばよい。
以上のようにして得られた形質転換体を適当な培地にて培養し、培養物中にタンパク質を生成蓄積させ、これを採取することにより、本発明のスタテリン融合タンパク質を得ることができる。形質転換体を培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
培養は、15〜45℃、好ましくは25〜45℃で、6〜60時間、更に好ましくは24〜60時間行い、必要により通気や攪拌を加えてもよい。
上記、組換え枯草菌の場合は、培地のpHは用いる枯草菌が生育し得る範囲、例えば、pH6.0〜8.0に調整するのが好適である。また、培養条件は、15〜42℃、好ましくは28〜37℃で2〜7日間振盪、または通気撹拌培養すればよい。
(1)バチルス・エスピーKSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpHYEglSを鋳型とし、配列番号3(GCGAATTCGATTTGCCGATGCAACAGGCTTATATTTAG)及び配列番号4(AGGAACTTCATATTACCTCCTAAATATTTTTAAAG)の2種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによって237プロモーター、シグナル遺伝子を含む0.66kbの遺伝子断片を得た。
(1)バチルス・エスピーKSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpHYEglSを鋳型とし、配列番号3及び配列番号7(TTTATCATCATCATCGGCTTCTTGACACCTGGA)の2種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたPCRによって237プロモーター、シグナル遺伝子、ヒト唾液シスタチン構造遺伝子及びエンテロキナーゼ認識配列遺伝子を含む1.04kbの遺伝子断片を得た。
融合タンパク質の切断には組換えエンテロキナーゼ(ノバジェン)を使用した。切断条件は添付の説明書に従った。切断され生じた7kDaのペプチドについて抗スタテリン抗体による発色を確認した。(図3)
Claims (8)
- スタテリン構造ペプチドがシスタチンのカルボキシ末端と融合してなるスタテリン融合タンパク質。
- シスタチンがヒトシスタチンSである請求項1記載のスタテリン融合タンパク質。
- ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約20kDaである請求項1記載のスタテリン融合タンパク質
- 以下の(a)又は(b)に示すスタテリン融合タンパク質。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ特異的プロテアーゼにより切断され、更にSer2及びSer3のリン酸化を受けることによりスタテリン様活性を示すタンパク質 - 請求項1又は2記載のスタテリン融合タンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)又は(b)のDNAからなるスタテリン融合タンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ特異的プロテアーゼにより切断され、更にSer2及びSer3のリン酸化を受けることによりスタテリン様活性を示すタンパク質をコードするDNA - 請求項3又は4に記載の遺伝子を挿入した組換えベクターを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させ、培養物中に生成蓄積されたタンパク質を採取することを特徴とするスタテリン融合タンパク質の製造法。
- 請求項3又は4に記載の遺伝子を挿入した組換えベクターを宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して当該遺伝子を発現させ、培養物中に生成蓄積したスタテリン融合蛋白質又は生成蓄積後に採取したスタテリン融合蛋白質からスタテリン構造ペプチドを切り出し、次いで当該ペプチドのSer2及びSer3をリン酸化することを特徴とするスタテリンの製造法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08505619A (ja) * | 1992-12-30 | 1996-06-18 | ジョー レビス,ジョージ | 抗虫歯組成物 |
JP2002029948A (ja) * | 2000-07-12 | 2002-01-29 | Kao Corp | 蛋白質吸着阻害剤 |
JP2004097153A (ja) * | 2002-09-12 | 2004-04-02 | Kao Corp | 組換えバチルスメガテリウム菌 |
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