JP6661072B2 - 細胞分離用酵素剤 - Google Patents
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Description
少なくとも、前記プレペプチダーゼC末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。
コラゲナーゼを産生する微生物としてクロストリジウム属(Chrostridium sp.)、ビブリオ属(Vibrio sp.)、バチルス属(Bacillus sp.)、ストレプトマイセス属(Streptomyces sp.)などが知られているが、本発明で使用するコラゲナーゼは、グリモンティア属(Grimontia sp.)に由来する。なお、グリモンティア・ホリセーは、例えばATCC No.33564やATCC No.33565として入手することができる。
グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのアミノ酸配列のドメイン構造を図1Aに示す。「84kDaコラゲナーゼ」で示すドメイン構造は、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング配列に対応するドメイン構造である。N末端からC末端に向かって、アミノ酸番号1〜87がプレプロ領域、アミノ酸番号88〜615が触媒ドメイン領域(CD)、アミノ酸番号616〜687がリンカー領域、アミノ酸番号688〜749がPPCドメイン領域(PPC)である。767個のアミノ酸で構成され、分子量は84kDaである。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの一例として、グリモンティア・ホリセー1706B株のコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号1に、全コーディング領域のDNA配列を配列番号2に示す。なお、前記プレプロ領域は、分泌シグナル配列であることが判明した。ただし、翻訳のいずれの段階で分泌シグナル配列が離脱するかは明確ではない。本発明では、プレプロ領域を有するコラゲナーゼおよびプレプロ領域を欠失したコラゲナーゼの双方を、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼとする。プレプロ領域を欠失したグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの分子量は74kDaである。このドメイン構造を、図1Aに、「74kDaコラゲナーゼ」として示す。
本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、グリモンティア・ホリセーに由来する。そのドメイン構造は、少なくともPPCを含まないものであればよい。例えば、前記図1Aの84kDaコラゲナーゼに示すドメイン構造において、アミノ酸番号688以降の配列が欠失され、N末端からC末端に向かって、プレプロ領域、CD、リンカー領域で構成されるリコンビナントコラゲナーゼである。更にプレプロ領域を欠失し、CDとリンカー領域とからなるリコンビナントコラゲナーゼであってもよい。後記する実施例に示すように、PPCを欠失しても高いコラゲナーゼ活性を発揮し、かつコラゲナーゼ活性が安定することが判明した。更に、本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、後記実施例に示すように、洗浄後のコラゲナーゼ活性が低減され、細胞障害が低減される。
本発明のリコンビナントコラゲナーゼを調製する際の形質転換用DNAとしては、少なくともCDに対応するアミノ酸配列をコードするものであり、より好ましくはCDとリンカー領域の一部とを含むアミノ酸配列をコードするものである。更に、N末端側に、プレプロ領域に対応するアミノ酸配列を有するものであってもよい。リンカー領域のC末端は、リンカー領域配列に含まれる−G1X1Y1G2X2Y2−で示される配列のY1とG2との間で切断されたものを好適に使用することができる。PPCを含まず、C末端から3番目がグリシンとなるリコンビナントコラゲナーゼを作製するために使用し得るDNAとしては、下記(I)で示されるアミノ酸配列をコードするものを使用することできる。
AVEQCDLSQFQTTSSNQLMAAIRQQGASCVNALFSADTGVQEAAFSSNHMYNVAQYTRTLAQQYAGGGSDELEALYLYLRAGYYAEFYNSNITFLSWVTPAVKGAVDAFVQNAHFYDNGDAHGKVLNEVIITMDSAGLQHAYLDVVTQWLTRWNAQYAEHWYMRNAVNGVFTLLFGGQWNNQYTSLIGEQTALVTALQAFALDRTKVNSPTEFMAANAARELGRLARYTDATIAPKVTEGLTAIFGQYPSYGDGDAIWLGAADTASYYADCSQFNICGFEDALRDAALNQTFICSDTIKIRSQDMSQAQHLAACDKMAYEESFFHTTLETGNQPVADDHNTQLQVNIFNSDTDYGKYAGPIFGIDTNNGGMYLEGNPANVGNIPNFIAYEASYANPDHFVWNLEHEYVHYLDGRFNMYGDFGTPTELVVWWSEGVAEYVSRVNDNPQAIATIQDGSTYTLAQVFDTTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFERHPDEVQRMLSATRQGRWAEYKAIISGWANQYQSEFAQW-X
ただし、Xは、TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT、またはTEALAKGDSで示されるポリペプチドである。配列番号3は、XがTEALAKGDSである場合のアミノ酸配列であり、配列番号4は、XがTEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNTである場合のアミノ酸配列である。なお、上記式で使用されるアルファベットは、以下のアミノ酸を示す。A:アラニン、C:システイン、D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸 F:フェニルアラニン、G:グリシン、H:ヒスチジン、I:イソロイシン、K:リシン、L:ロイシン、M:メチオニン、N:アスパラギン、P:プロリン、Q:グルタミン、R:アルギニン、S:セリン、T:スレオニン、V:バリン、W:トリプトファン、Y:チロシン。
本発明の製造方法で得たリコンビナントコラゲナーゼは、従来のコラゲナーゼと同様に使用することができ、例えば細胞分離用酵素剤として使用することができる。摘出臓器から細胞を分離する対象として、膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織、繊維芽細胞などがある。摘出組織に限定されず、コラーゲン培地内で培養した培養細胞の分離にも好適である。特に本発明で得たリコンビナントコラゲナーゼは、比活性が安定性しているため、摘出した膵臓臓器から膵島を単離するための細胞分離用酵素剤として好適に使用することができる。後記する実施例に示すように、洗浄組織に対するコラゲナーゼ活性が低く、細胞損傷が少ない。
摘出した臓器や動物組織に本発明の細胞分離用酵素剤を添加して所定時間培養する。摘出物を上記細胞分離用酵素剤や、更に他の成分を添加した培養液で培養すると、前記摘出組織の細胞外マトリックスや細胞間結合を分離し、細胞を単離することができる。組織から単離された細胞が培養液中に浮遊する場合は、培養液からろ過や遠心などで単離細胞を回収すればよい。
グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドpCC1BAC−2(受託番号;NITE BP−00739:寄託日(原寄託);2009年4月28:寄託機関の名称;独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD):寄託機関のあて名;日本国2920818千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)を鋳型として、配列番号5のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列(長さ2040bp)の5’側にNco Iサイトを、3’側にHind IIIサイトを付加し、Expand High Fidelity PCR System(Roche)により増幅した。PCR反応には、下記プライマーセットを使用した。プライマーの配列のうち、制限酵素サイトを下線で示す。
Fwd:AAACCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(配列番号6)
Rvs: AAAAAGCTTTTACTGACGACACTGGTTAC(配列番号7)
増幅された断片をNco I−Hind IIIで処理して回収した当該DNA断片を、プラスミドベクターpNY326のクローニングサイトに挿入して、pNY326−Col.74を作製した。この組換えプラスミドでブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31−SP3株を形質転換して、組換え体を作製した。
プライマー:
Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(配列番号8)
Rvs:CATCCTGTTAAGCTTACTGTCGCCCTTCGCCAGC(配列番号9)
プライマー:
Fwd: AAGCTTAACAGGATGCGGGG(配列番号10)
Rvs: AGCGAAAGCCATGGGAGCAA(配列番号11)
プライマー:
Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT(配列番号12)
Rvs:CATCCTGTTAAGCTTAGGTATTACCACCAGATTCA(配列番号13)
実施例1で得た74kDaコラゲナーゼ、リコンビナント62kDaコラゲナーゼおよびリコンビナント60kDaコラゲナーゼの比活性の経時変化を下記方法で測定した。測定結果を図3に示す。74kDaは、精製直後に18,000(U/mg)の活性であったが24時間後には11,500(U/mg)に低減し、活性が経時的に低下した。これに対し、リコンビナント62kDaコラゲナーゼおよびリコンビナント60kDaコラゲナーゼは、精製直後から24時間時に至るまで、いずれも12,000(U/mg)前後で推移し、コラゲナーゼ活性が安定していた。
実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼを、温度4℃で保存した際の比活性の経時変化を評価した。0日目の比活性値を100%とした時の相対値を図4に示す。図4に示すように、100日間に亘り、高い比活性を安定に維持することができた。なお、リコンビナント60kDaコラゲナーゼも同様の安定性を示した。
実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼを用いて膵臓消化実験を行った。マウスより膵臓を単離し、HBSSバッファー1mlに、リコンビナント62kDaコラゲナーゼを0.00625〜0.20mgと、サーモリシン(ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼC/T」の内包品)0.012mgとを含む酵素液を膵管より注入し、37℃で15分間インキュベートした。その後、目開き1mmメッシュを通過した画分(分解組織)と、メッシュ上に残った画分(非分解組織)のタンパク量を測定した。酵素液に含まれるリコンビナント62kDaコラゲナーゼの濃度に依存して、分解組織量が増加し、それに伴い非分解組織量が低減した。結果を図5に示す。図5に示すように、リコンビナント62kDaコラゲナーゼの濃度が0.05mg/mlで反応はプラトーに達した。
実施例4と同様に、実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼを用いて膵臓消化実験を行い、分解して得た膵島の個数を測定し、IEQ(Islet Equivalent:直径が150μmの膵島を1と規定する、膵島の体積を示す国際単位)を評価した。リコンビナント62kDaコラゲナーゼの濃度の相違による膵島の個数の結果を図6Aに、IEQの結果を図6Bに示す。また、単離された膵島の光学顕微鏡写真を図7に示す。
実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼに代えてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ(ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼC/T」)を使用した以外は、実施例5と同様に操作し、膵島の個数およびIEQを評価した。結果を図6A、図6Bに併せて記載する。実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼは、従来の市販品と同様に、膵臓組織から膵島を分離することができた。
実施例5で得た膵島を、STZ誘導糖尿病マウスの腎皮膜下に移植し、経時的に血糖値を測定した。膵島を移植しなかったコントロール群(n=3:STZ−1、STZ−2、STZ−3)では、高血糖値を示したのに対し、膵島移植群(n=5:STZ/islet−1〜STZ/islet−5)では、移植後すぐに血糖値が正常レベルにまで低下した。移植後39日目に膵島を移植した腎臓を摘出すると、血糖値が再び上昇した。結果を図8Aに示す。摘出した膵島移植腎とその部分拡大写真を図8Bの左端の上下2段に示す。また、摘出した膵島移植腎のヘマトキシリン・エオジン染色(H&E染色)を行ったところ腎皮膜下に膵島が確認され、さらには抗インシュリン抗体で膵島が染色された(図8B)。これらは、実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼにより、膵島機能が保持された膵島が単離できたことを示すものである。
実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼを用いて肝臓消化実験を行った。麻酔したラットの肝臓をHBSSバッファー潅流下に脱血してカルシウムを除去し、次いで肝臓内にリコンビナント62kDaコラゲナーゼ0.05mg/mlとサーモリシン0.01mg/mlとを10分間潅流してカルシウムを添加した後、肝臓を摘出した。摘出肝臓を氷冷し、メスで細切し、ガーゼおよびストレイナーでろ過した。死細胞を除去した後に肝臓細胞を遠心回収した。肝細胞の位相差顕微鏡写真を図9に示す。この肝細胞を7日間培養したところ、生存率は98%であった。
実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼのコラーゲン線維への結合能と、洗浄後コラーゲン線維に残留するコラゲナーゼ活性を評価した。
豚皮コラーゲン線維5mgと400μlの0.2MのNaCl、5mMのCaCl2を含むトリスHCl緩衝液(pH7.5)とをフィルターを内蔵するスピンカラムに入れ、10,000rpmで2分間の遠心を行い、コラーゲン線維を前記緩衝液で洗浄して全5回の遠心分離を行った。
洗浄液を廃棄し、前記スピンカラムのフィルター上のコラーゲン線維に酵素混合液(リコンビナント62kDaコラゲナーゼを0.2mg/ml、オボアルブミンを0.2mg/ml、オルトフェナントロリンを4mM、NaClを0.2M、CaCl2を5mM含むトリスHCl緩衝液(pH7.5))100μlを添加し、4℃で30分静置し、コラーゲン線維にリコンビナント62kDaコラゲナーゼを結合させた。
次いで、10,000rpmで2分間の遠心分離を行い、前記フィルター上のコラーゲン線維とフィルターを通過した混合液とに分離した。この混合液の一部を、SDS−PAGEで分析した。なお、比較のために豚皮コラーゲン線維を添加せず、上記と同様に処理して得た混合液も、SDS−PAGEで分析した。結果を図10Aの「混合液/コラーゲン線維「−」、「+」」で示す。リコンビナント62kDaコラゲナーゼのバンドは、「+」で薄く「−」で濃くなった。リコンビナント62kDaコラゲナーゼは、コラーゲン線維と混合すると、コラーゲン線維に結合することが示された。なお、図10においてMはマーカーを示す。
リコンビナント62kDaコラゲナーゼに代えて同量のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ(ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼC/T」)を用いた以外は実施例8と同様に操作した。結果を図10Bおよび図11に示す。
実施例1で得たリコンビナント62kDコラゲナーゼおよびクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ(ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼC/T」)の、蛍光標識したI型コラーゲン(以下、FITC−コラーゲンと称す。)および合成基質N−(3[2−furyl]acryloyl)−Leu−Gly−Pro−Ala(以下、FALGPAと称す。)に対する分解活性を評価した。
FITC−コラーゲンは、0.2MのNaCl、5mMのCaCl2を含む50mMのTris−HCl(pH7.5、30℃)緩衝液を使用し、FALGPAには0.4MのNaCl、40mMのCaCl2を含む50mM トリシン(pH7.5、30℃)を使用した。FITC−コラーゲンを基質とする場合には上記コラゲナーゼを0.5μg添加し、FALGPAを基質とする場合には、リコンビナント62kDコラゲナーゼを1.0μg、またはリベラーゼC/Tを2.5μg添加した。マイクロプレートリーダーにてFALGPAを検出および定量し、FALGPA分解活性を評価した。反応系1mlにおいて、1mgの酵素が1分あたり1μmoleの前記ペプチドを分解する活性を比活性1U/mgとし算出し、得られた比活性を表1に示した。リコンビナント62kDコラゲナーゼは、コラーゲンを分解できるだけでなく、合成基質FALGPAに対する分解活性に優れるため、コラーゲンのみならずゼラチン分解性にも優れることが示唆された。
実施例1で得たリコンビナント62kDaコラゲナーゼを用いて、I型、II型、III型、IV型、V型、およびVI型コラーゲンに対する活性を評価した。0.5mg/mlの上記コラーゲンに、0.2MのNaClと5mMのCaCl2とを含有する50mMのTris−HCl緩衝液(pH7.5)に溶解した1μg/mlのコラゲナーゼを添加し、30℃でインキュベートし、インキュベート開始時、1時間後、3時間後、5時間後にサンプルを分取し、電気泳動で分析した。また、比較のため、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼ(ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼC/T」)を用いて同様の操作を行った。結果を図12に示す。なお、図12において、62kDaは、リコンビナント62kDaコラゲナーゼを使用したカラムを、リベラーゼは、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを用いたカラムを示す。
I型コラーゲンでは、α1(I)およびα2(I)の3時間後、5時間後のバンドの消失の程度から、リコンビナント62kDaコラゲナーゼの方がリベラーゼよりも迅速にI型コラーゲンを分解していると推定された。この傾向は、II型、III型、IV型、V型、VI型コラーゲンでも同様に観察された。特にIV型およびV型コラーゲンは、リコンビナント62kDaコラゲナーゼを用いて3時間、または5時間反応させるとバンドが薄くなるのに対し、リベラーゼではバンドが消失していない。VI型コラーゲンは、リコンビナント62kDaコラゲナーゼを用いて72時間反応させるとバンドが薄くなるのに対し、リベラーゼではバンドが消失していない。リコンビナント62kDaコラゲナーゼは、リベラーゼで分解が容易でないコラーゲンも分解できる可能性が示唆された。
Claims (4)
- N末端からC末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼC末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、
少なくとも前記コラゲナーゼ触媒ドメインを含み、前記プレペプチダーゼC末端ドメインを含まず、
前記リンカー領域配列のC末端は、−G 1 −X 1 −Y 1 −G 2 −X 2 −Y 2 −(式中、G 1 とG 2 とはグリシンを示し、X 1 、Y 1 、X 2 およびY 2 は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。)で示すアミノ酸配列のY 1 とG 2 との間で切断されたものである前記リコンビナントコラゲナーゼを含む、細胞分離用酵素剤。 - 前記リンカー領域配列のC末端は、−Gly−Asp−Ser、−Gly−Asn−Glu、−Gly−Glu−Ser、または−Gly−Asn−Thrのいずれかである、請求項1記載の細胞分離用酵素剤。
- 膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織、骨、軟骨、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織および繊維芽細胞からなる群から選択される1以上の細胞の分離に使用されることを特徴とする、請求項1または2に記載の細胞分離用酵素剤。
- コラーゲンIV、コラーゲンV、またはコラーゲンVIを分解するための、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞分離用酵素剤。
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