WO2006137209A1 - Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法 - Google Patents

Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006137209A1
WO2006137209A1 PCT/JP2006/307748 JP2006307748W WO2006137209A1 WO 2006137209 A1 WO2006137209 A1 WO 2006137209A1 JP 2006307748 W JP2006307748 W JP 2006307748W WO 2006137209 A1 WO2006137209 A1 WO 2006137209A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human
protein
apa
dna
vector
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/307748
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigehiko Mizutani
Original Assignee
P-Lap Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by P-Lap Corporation filed Critical P-Lap Corporation
Priority to EP06745401A priority Critical patent/EP1916299A4/en
Publication of WO2006137209A1 publication Critical patent/WO2006137209A1/ja
Priority to US12/003,142 priority patent/US20080213838A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention incorporates a method for efficiently producing a human AP A protein, a DNA encoding a human AP A recombinant protein required for producing a human AP A protein, and the DN A.
  • the present invention relates to a vector and a transformant carrying the vector.
  • human AP A protein is known as an active ingredient that is predicted to be effective in the treatment of pregnancy toxemia.
  • the human APA protein can be recovered from the human placenta.
  • the task itself such as recovery from the human placenta, is difficult in the first place, and since there is only a very small amount in the human placenta, the recovery amount is very small. ,. In other words, it is a protein that is extremely difficult to recover in nature. Therefore, research has been conducted to collect genetically engineered human APA protein by culturing, and as an example, as described in Non-Patent Document 1, human APA protein is obtained using hamster cells. Methods such as culture 'recovery are known.
  • human AP A protein When human AP A protein is cultured using such hamster cells, 0.06 mg of human AP A protein can be recovered per 300 milliliters of culture medium.
  • Non-Patent Document 1 Gilles VAZEUX, Sherwin WILK, Elizabeth WILK, Pierre CORVOL and d Catherine LLORENS_CORTES, "Production and properties of a recombinant solu ble form of aminopeptidase A,, Eur J. Biochem., 1998, 254 , P.671-678
  • the present invention encodes a production method capable of recovering a large amount of human APA protein efficiently and in comparison with conventional methods, and a human APA recombinant protein required for production of human APA protein.
  • the present invention intends to provide a DNA to be transformed, a vector incorporating the DNA, and a transformant carrying the vector.
  • the invention described in claim 1 is a DNA encoding the recombinant human APA protein shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the invention according to claim 2 is a DNA comprising DNA encoding the human APA recombinant protein shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the invention according to claim 3 is DNA in which a part of the DNA encoding the human APA recombinant protein represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted, deleted, or inserted.
  • the invention according to claim 4 is a vector incorporating the DNA according to any one of claims 1 to 3.
  • the invention according to claim 5 is a transformant having the vector according to claim 4.
  • the invention according to claim 6 is the transformant according to claim 5, which is an insect cell.
  • the invention according to claim 7 is a method for producing a human APA protein, comprising culturing the transformant according to claim 5 or 6 and collecting the expressed product.
  • N A human APA recombinant protein (hereinafter referred to as secreted APA) in which the amino acid sequence from the end to the 71st amino acid sequence is replaced with the human trypsin II shown in SEQ ID NO: 3 and the human A—LAP signal peptide shown in SEQ ID NO: It was found that the culture should be carried out.
  • secretory APA can be expressed very easily and in large quantities by utilizing insect cells such as sputum cells in culturing the secretory APA.
  • insect cells such as sputum cells
  • the above signal peptide is rapidly cleaved when it is transferred to the intracellular secretory pathway after protein synthesis, only the active site can be easily recovered.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the precursor of lobster tropomyosin IJ (AACTCCTAAAAAACCGCCAC C) and the human trypsin II signal sequence (MNLLLILTFVAAAVAA) followed by human AP
  • a sense strand primer encoding Ala 72 -Asp 76 of A and Leu 953 -Gly 957 of human APA, and an antisense strand primer designed to encode 6 histidine residues and a stop codon.
  • the antisense strand primer was amplified 30 cycles by repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 3 minutes for 1 cycle. .
  • the amplified DNA fragments are separated by electrophoresis using agarose gel, and the target DNA fragments are recovered and purified from the gel by a conventional method.
  • the purified DNA fragment is incorporated into the pENTR plasmid using the PENTR- / D-TOPO cloning kit from Invitrogen. Furthermore, using Invitrogen's Geteway LR clonase, the secretory APA cDNA is transferred to the baculovirus. As described above, the cDNA encoding the secretory APA is amplified and the transfer vector is constructed.
  • Escherichia coli is a prokaryotic organism
  • a protein for example, human APA protein
  • an expression system derived from a eukaryotic organism such as an animal
  • baculovirus insect cell system is very cheap compared to the mammalian cell system, and it is very convenient to use because it does not bother the work related to culture. It also has the property that the target protein can be expressed in a large amount while maintaining its original biological properties.
  • baculovirus expression system for example, baculowill in the field of recombinant proteins is an insect double-stranded DNA virus called nuclear polyhedrosis virus (NPV). And this group of viruses is characterized by making a large amount of inclusions called polyhedra consisting of proteins called polyhedrin in the nucleus of infected cells. Therefore, it is a baculovirus expression system that allows the synthesis of recombinant proteins in insect cells using the very strong promoter of this polyhedon gene.
  • NDV nuclear polyhedrosis virus
  • baculovirus expression system what is generally used at present is a solid
  • This is a system that uses the baculovirus Autographa californica NPV (AcNPV) from the night moth family as the data and Sf9 derived from the larvae of Spodoptera Fmgiperda from the night moth family as the infected cells.
  • baculovirus Autographa californica NPV AcNPV
  • Sf9 derived from the larvae of Spodoptera Fmgiperda from the night moth family as the infected cells.
  • BmNPV Bombymori's nuclear polyhedrosis virus
  • the latter system using silkworms can produce a large amount of product by directly infecting the recombinant virus with silkworm larvae without culturing a large volume using a medium containing expensive serum.
  • the half-eye invention is applicable to any system and is not particularly limited.
  • baculovirus gene is as large as 130 kb, it is not possible to insert the gene to be expressed directly downstream of the polyhedrin promoter by DNA manipulation performed in a general test tube.
  • Bac-to-Bac system from Invitrogen.
  • the desired DNA fragment as described above is incorporated into a plasmid called a transfer vector and then introduced into E. coli DHlOBac (Invitrogen) to produce a bacmid DNA containing the secreted APA cDNA. did.
  • the gene to be expressed is first incorporated into a donor plasmid having sequences at both ends of the transposon Tn7 of E. coli, and this is incorporated into the baculovirus incorporating the target site of ⁇ 7 and the origin of replication in E. coli. It introduce
  • E._coli DHlOBac which has DNA (Baculovirus shuttle vector bacmid).
  • a helper plasmid expressing a transposase is also introduced into this bacterium, and the region containing the target gene of the donor plasmid in the bacterium is transferred to a bacmid by the action of the transposase, so that a recombinant bacmid can be obtained.
  • bacmid is purified from E. coli and transferred into insect cells, a virus is produced in the insect cells.
  • the introduction of the foreign gene into the viral DNA is carried out in E. coli, so that the time can be reduced and the virus has been cloned at this stage. There is an advantage that only the operation (purification) is not necessary.
  • the human secreted APA bacmid DNA thus obtained was introduced into Sf9 cells using Cellfection reagent (Invitrogene), and the cells were then cultured at 27 ° C for 3 days. Virus production was performed. Then, the virus secreted in the culture supernatant is collected, A high titer virus solution was prepared by performing amplification twice.
  • Cellfection reagent Invitrogene
  • a secretory APA-expressing baculovirus is prepared as described above.
  • the recombinant virus obtained through the above-mentioned acquisition is scaled up and increased to obtain a high titer virus stock.
  • the virus stock obtained can be stored semi-permanently at _80 ° C, but the titer is lowered by freezing and thawing. Therefore, it can be stored for about 2 years even at 4 ° C, so it is better not to freeze it after use.
  • MOI Multiplicity of Infection
  • infection should be performed in a logarithmic growth machine rather than infection after the cell density is very high.
  • the expression of secreted APA generally peaks 48 to 72 hours after infection, but should be observed over a time course.
  • human AP A protein is expressed.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】従来の方法と比較して効率良く大量にヒトＡＰＡタンパク質を回収可能な製造方法、ならびにヒトＡＰＡタンパク質の製造時に必要とされるヒトＡＰＡ組換タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体を提供する。 【解決手段】ヒトＡＰＡタンパク質の活性部位（ヒトＡＰＡタンパク質において、妊娠中毒症の治療等に有効な部分）を大量に且つ容易に回収すべく、Ｎ末端から７１番目までのアミノ酸配列を、配列番号３に示すヒトトリプシンIIや配列番号４に示すヒトＡ－ＬＡＰのシグナルペプチドに置換したヒトＡＰＡ組換タンパク質（以下、分泌型ＡＰＡと称す）を培養する。

Description

明 細 書
DNA、ベクター、形質転換体、及び AP Aタンパク質の製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、ヒト AP Aタンパク質を効率良く作成するための方法、ならびにヒト AP Aタ ンパク質の作成時に必要とされるヒト AP A組換タンパク質をコードする DNA、該 DN Aを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体に関するものであ る。
背景技術
[0002] 従来より、妊娠中毒症の治療に効果的であると予測されている有効成分として、ヒト AP Aタンパク質が知られている。該ヒト APAタンパク質は、ヒト胎盤から回収すること 力 Sできる。し力しながら、そもそもヒト胎盤からの回収といった作業自体が困難である 上、ヒト胎盤内においても非常に僅かな量しか含まれていないため、その回収量にし ても非常に微量でしかなレ、。すなわち、 自然界において極めて回収困難なタンパク 質であると言える。そこで、遺伝子組み換え型ヒト AP Aタンパク質を培養によって回 収しょうとする研究が行われており、その一例として非特許文献 1に記載されているよ うに、ハムスターの細胞を用いてヒト AP Aタンパク質を培養 '回収するといった方法が 公知となっている。
このようなハムスターの細胞を用いてヒト AP Aタンパク質を培養した場合、培養液 3 00ミリリットノレに対して、 0. 06mgのヒト AP Aタンパク質を回収することができる。
[0003] 非特許文献 1： Gilles VAZEUX, Sherwin WILK, Elizabeth WILK, Pierre CORVOL an d Catherine LLORENS_CORTES、 "Production and properties of a recombinant solu ble form of aminopeptidase A，，、 Eur J.Biochem.、 1998年、 254、 P.671-678
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] し力 ながら、依然回収率が低ぐ種々の実験に必要な量さえも容易に得難い状況 であり、より効率良く大量に回収することができるヒト APAタンパク質の製造方法が希 求されている。 [0005] そこで、本発明は、従来の方法と比較して効率良く大量にヒト APAタンパク質を回 収可能な製造方法、ならびにヒト APAタンパク質の製造時に必要とされるヒト AP A組 換タンパク質をコードする DNA、該 DNAを組み込んだベクター、及び該ベクターを 保持する形質転換体を提供しょうとするものである。
課題を解決するための手段
[0006] 請求項 1に記載の発明は、配列番号 1又は 2に示されるヒト APA組換タンパク質を コードする DNAである。
請求項 2に記載の発明は、配列番号 1又は 2に示されるヒト APA組換タンパク質を コードする DNAを含んだ DNAである。
請求項 3に記載の発明は、配列番号 1又は 2に示されるヒト APA組換タンパク質を コードする DNAに対しその一部が置換、欠失、揷入された DNAである。
請求項 4に記載の発明は、請求項 1〜3のいずれかに記載の DNAを組み込んだ ベクターである。
請求項 5に記載の発明は、請求項 4に記載のベクターを保持する形質転換体であ る。
請求項 6に記載の発明は、昆虫細胞であることを特徴とする請求項 5に記載の形質 転換体である。
請求項 7に記載の発明は、請求項 5又は 6に記載の形質転換体を培養し、発現産 物を回収することを含むヒト AP Aタンパク質の作成方法である。
発明の効果
[0007] 本発明によれば、 N末端から 71個のアミノ酸を、配列番号 1又は 2に示されるような DNAから転写 ·翻訳される配列番号 3 (配列番号 1に対応）又は 4 (配列番号 2に対 応）で示されるようなシグナルペプチドに置換することにより、本来の細胞膜結合型か ら細胞外分泌型へと変化させることになる。したがって、ヒト AP A組換タンパク質の発 現率が極めて高くなる上、従来と比較して、ヒト AP Aタンパク質 (活性部位）を非常に 効率良く且つ大量に回収することができる。
また、上記ヒト AP A組換タンパク質を、昆虫細胞を利用したバキュロウィルス発現系 を利用して培養することにより、培養液 3リットルに対して 10mg〜30mg (従来の 10 倍以上）のヒト AP Aタンパク質の活性部位を回収することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本発明の一実施形態となるヒト AP Aタンパク質の製造方法、ならびにヒト AP Aタンパク質の製造時に必要とされるヒト AP A組換タンパク質をコードする DNA、該 DNAを組み込んだベクター、及び該ベクターを保持する形質転換体ついて説明す る。
[0009] 本発明者は、ヒト AP Aタンパク質の活性部位（ヒト AP Aタンパク質におレ、て、妊娠 中毒症の治療等に有効な部分）を大量に且つ容易に回収するためには、 N末端から 71番目までのアミノ酸配列を、配列番号 3に示すヒトトリプシン IIや配列番号 4に示す ヒト A— LAPのシグナルペプチドに置換したヒト AP A組換タンパク質（以下、分泌型 APAと称す）を培養させればよいことを見出した。
[0010] また、該分泌型 APAの培養にあたって、たとえば蚕細胞といった昆虫細胞を利用 することにより、非常に容易に且つ大量に分泌型 APAを発現することができることも 見出した。尚、上記シグナルペプチドはタンパク質合成後、細胞内の分泌経路へと 移行した際に速やかに切断されるため活性部位のみを容易に回収することができる
[0011] そこで、このような分泌型 APAを用レ、、昆虫細胞を利用して培養するヒト AP Aタン パク質 (活性部位）の製造方法について以下に詳述する。尚、上記分泌型 DNAのう ち、ヒトトリプシン IIのシグナルペプチドに置換するもの（配列番号 1で示す）を用いた 製造方法について以下に詳述するが、ヒト A—LAPのシグナルペプチドに置換する もの（配列番号 2で示す）を用いた製造方法についても略同様の方法となる。
[0012] (a)分泌型 APAをコードする cDNAの増幅、及びトランスファーベクターの構築
分泌型 APAをコードする cDNAの構築は、天然に存在するヒト AP Aタンパク質をコ ードする cDNAを铸型とする PCR法にて行った。 PCR (Polymerase Chain Reaction) とは、 DNA Polymeraseの反応を連続的且つ連鎖的に実行することにより、 1セットの p rimerの間に挟まれる DNA断片を特異的に増幅する反応である。
[0013] ここでは、ロブスターのトロポミオシンの前駆配歹 IJ (AACTCCTAAAAAACCGCCAC C)力らヒトトリプシン IIシグナル配列（MNLLLILTFVAAAVAA)へと続き、さらにヒト AP Aの Ala72-Asp76をコードするセンス鎖プライマーカらヒト APAの Leu953-Gly957、そして 6 個のヒスチジン残基、終止コドンとなるようにコードすべく設計したアンチセンス鎖ブラ イマ一を用いる。そして、該アンチセンス鎖プライマーを、 94°Cで 30秒、 52°Cで 30 秒、 72°Cで 3分を 1サイクルとした過程を 30サイクル繰り返して、 目的とする DNA断 片を増幅した。増幅後の DNA断片は、ァガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し 、 目的の DNA断片を、ゲルから従来の方法により回収 '精製する。
[0014] その後、インビトロジェン社の PENTR-/D- TOPOクローニングキットにて、精製され た DNA断片を pENTRプラスミドへと組み込む。さらに、インビトロジェン社 Geteway L Rクロナーゼによって、分泌型 APAの cDNAをバキュロウィルスへのトランスファーべ 以上のようにして、分泌型 APAをコードする cDNAの増幅、及びトランスファーべク ターの構築を行う。
[0015] (b)分泌型 AP A発現バキュロウィルスの作製
大腸菌は原核生物であるため、動物等の真核生物由来の発現系を用いてタンパク 質（たとえば、ヒト AP Aタンパク質）を発現させると、正しいフォールデイングを取れな レ、といった事態が多々発生する。そこで、真核細胞を用いた大量発現系として、バキ ュロウィルス 昆虫細胞系に注目した。バキュロウィルス発現系は、哺乳動物細胞系 と比べると非常に安価である上、培養に係る作業等も煩わしくなぐ使い勝手が非常 に良い。また、 目的とするタンパク質を大量に且つ本来の生物学的性質を保持した 状態で発現させることができるといった特性を備えている。
[0016] 該バキュロウィルス発現系において、たとえば、リコンビナントタンパク質の分野でバ キュロウィルと言えば、核多角体病ウィルス（Nuclear Polyhedorosis Virus： NPV)と呼 ばれる昆虫の二本鎖 DNAウィルスのことである。そして、このグループのウィルスは 、感染細胞の核内にポリヘドリンと呼ばれるタンパク質からなる多角体と呼ばれる封 入体を大量に作るという特徴を備えている。そこで、このポリへドン遺伝子の非常に強 力なプロモーターを利用して昆虫細胞内でリコンビナントタンパク質の合成を行わせ るの力 バキュロウィルス発現系である。
[0017] このようなバキュロウィルス発現系として、現在一般的に用いられているものは、ベタ ターとして夜蛾科のバキュロウィルス Autographa californica NPV (AcNPV)を、感染細 胞として同じく夜蛾科の Spodoptera Fmgiperdaの幼虫由来の Sf9を用いたシステムで ある。他にも、カイコ (Bombix mori)の核多角体病ウィルス BmNPVを用いたシステムも 日本で開発されている。後者のカイコを利用したシステムは、高価な血清を含む培地 を使用した大容量の培養を行わなくても、組換え体ウィルスをカイコの幼虫に直接接 種することによって大量に産物を得ることができるという利点がある。尚、半眼発明に あたっては、どちらのシステムであっても適用可能であり、特に限定することはない。
[0018] さらに、組換え型ウィルスの作製について説明する。バキュロウィルスの遺伝子は 1 30kbもあるため、発現させたい遺伝子をポリヘドリンプロモーターの下流に直接挿入 することは、一般的な試験管内で行う DNA操作では不可能である。し力 ながら、ィ ンビトロジェン社の Bac-to-Bacシステムを利用することで簡便かつ迅速に組換えウイ ルスを作製することが可能である。すなわち、上述の如ぐ 目的の DNA断片をー且ト ランスファーベクターと称されるプラスミドに組み込んだ後、大腸菌 DHlOBac (インビト ロジェン社）へと導入し、分泌型 APAの cDNAを含むバクミド DNAを作製した。
[0019] Bac-to-Bacシステムでは、まず発現させたい遺伝子を大腸菌のトランスポゾン Tn7 の両末端の配列を持つドナープラスミドに組み込み、これを Τη7のターゲットサイトと 大腸菌での複製起点を組み込んだバキュロウィルス DNA (バキュロウィルスシャトル ベクター =バクミド)を持つ大腸菌 DHlOBacに導入する。この菌にはトランスポザーゼを 発現するへルパープラスミドも導入してあり、菌体内でドナープラスミドの目的遺伝子 を含む領域がトランスポザーゼの働きによってバクミドへと転移し、組換え型バクミドを 得ること力 Sできる。バクミドは、大腸菌から精製して昆虫細胞にトランスフエクシヨンす れば、昆虫細胞内でウィルスが作製される。この方法では、ウィルス DNAへの外来 遺伝子の揷入を大腸菌内で行なうため、時間が短縮できることと、この段階でウィル スのクローンィ匕されていることになり非組換え型ウィルスを除き目的のウィルスのみに する操作（純化）が必要ない、とレ、つた利点を有してレ、る。
[0020] このようにして得られたヒト分泌型 APAのバクミド DNAを、 Cellfection試薬試薬（ィ ンビトロジヱン社）にて Sf9細胞へと導入した後、同細胞を 27°C、 3日間培養を行って ウィルスの作製を行った。その後、培養上清中に分泌されたウィルスの回収を行い、 2度の増幅を行って、高力価のウィルス液を作製した。
以上のようにして、分泌型 AP A発現バキュロウィルスの作製を行う。
[0021] (c)ヒト AP Aタンパク質の発現
上述の悟得して得られた組換え型ウィルスをスケールアップして増大させ、高タイタ 一のウィルスストックを得る。該スケールアップの際、あまり継代数を多くすると変異株 が出現して発現効率が低下するため、 6代以上は継代しない方がよい。また、得たゥ ィルスストックは _ 80°Cで半永久的に保存可能であるが、凍結融解によりタイターが 下がる。したがって、 4°Cでも 2年程度であれば保存可能であるため、使用分にあたつ ては凍結しない方がよい。
[0022] 効率の良くタンパク質を発現させるためには、 1細胞あたりに出来るだけ多くのウイ ルスを感染させることが必要である。そこで、 M〇I (Multiplicity of lnfection)を 5〜： 10 程度とする。また、細胞の密度が非常に高くなつてから感染させるよりも、対数増殖機 にある状態で感染させるようにする。分泌 APAの発現は、感染後 48〜72時間でピ ークになるのが一般的であるが、一応タイムコースをとつて観察する。
[0023] 本実施の形態では、 Sffi細胞を、酵素濃度 8ppmとなるように制御可能な 3リットルの スピナ一フラスコを用いて無血清培地 SFM900IKインビトロジェン社）中、 27°Cの条件 のもとで培養する。そして、細胞濃度が 1. 5 X 106細胞/ mLまで達した後、上述の 如く作製した高力価ウィルス液をウィルスと細胞との比が略 10： 1 (M〇I= 10)となる ように添加してウィルス感染を行う。さらに、ウィルス感染後 3日間培養を続け、タンパ ク質の発現を行う。
以上のようにして、ヒト AP Aタンパク質の発現を行う。
[0024] (d)ヒト AP Aタンパク質の精製
上記 3リットルの培養液を回収し、遠心分離機によって細胞と培養上清とを分離す る。また、分離されたヒト AP Aタンパク質を含む細胞培養上清を、 4°C、 36時間、 50 mMの条件のもと Tris_HCL溶液（pH8.0)にて透析する。尚、透析後の試料としては、 一般的に affinity chromatographyが用いられてレ、る。
[0025] そして、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE トーョーパール：東ソ一社） により精製した後、コバルトイオンを用いた金属キレートカラムクロマトグラフィー（キレ 一ティングセファロース：アマシャムバイオサイエンス社）によって精製して、ヒト APA タンパク質を得た。さらに必要な場合はゲルろ過カラムクロマトグラフィーや疎水性ク 口マトグラフィーなど一般的なカラムクロマトグラフィーを用いて精製可能である。 以上のようにして、ヒト AP Aタンパク質の精製を行う。
[0026] このようなヒト AP Aタンパク質の製造方法によれば、真核生物である昆虫細胞を用 レ、たバキュロウィルス発現系を利用しているため、真核生物由来のタンパク質の場合 でも、多くの場合正しいフォールデイングをとつていると考えられる産物が得られ、ジ スルフイド結合も天然型と同じ様に形成される。また、大腸菌では無理な翻訳後の修 飾も期待でき、発現産物のリン酸化、脂肪酸の付加が起こる。さらに、シグナルぺプ チドは正しく認識切断され分泌も起こる。尚、糖鎖の付加については、 Asn結合型糖 鎖は、複合型までプロセッシングは進まず、高マンノース型の糖鎖となり、 Tkm/Ser結 合型糖鎖は付加されないと言われている。そのため、バキュロウィルスの系で発現さ れたタンパク質は、天然型に比べて若干 (糖鎖部分の)分子量が小さくなる傾向があり 、天然型よりも結晶化に向く。
[0027] さらに、培養液 3リットルに対して 10mg〜30mg (従来の 10倍以上）のヒト APAタン ノ ク質 (活性部位)を回収することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1又は 2に示されるヒト AP A組換タンパク質をコードする DNA。
[2] 配列番号 1又は 2に示されるヒト AP A組換タンパク質をコードする DNAを含んだ D
[3] 配列番号 1又は 2に示されるヒト AP A組換タンパク質をコードする DNAに対しその 一部が置換、欠失、挿入された DNA。
[4] 請求項 1〜3のいずれかに記載の DNAを組み込んだベクター。
[5] 請求項 4に記載のベクターを保持する形質転換体。
[6] 昆虫細胞であることを特徴とする請求項 5に記載の形質転換体。
[7] 請求項 5又は 6に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収することを含むヒト
AP Aタンパク質の作成方法。
PCT/JP2006/307748 2005-06-20 2006-04-12 Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法 WO2006137209A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06745401A EP1916299A4 (en) 2005-06-20 2006-04-12 DNA VECTOR, TRANSFORMANT AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF APA PROTEIN
US12/003,142 US20080213838A1 (en) 2005-06-20 2007-12-20 DNA, vector, transformant and method for producing APA protein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-179766 2005-06-20
JP2005179766A JP2006345831A (ja) 2005-06-20 2005-06-20 Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/003,142 Continuation US20080213838A1 (en) 2005-06-20 2007-12-20 DNA, vector, transformant and method for producing APA protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006137209A1 true WO2006137209A1 (ja) 2006-12-28

Family

ID=37570245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/307748 WO2006137209A1 (ja) 2005-06-20 2006-04-12 Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20080213838A1 (ja)
EP (1) EP1916299A4 (ja)
JP (1) JP2006345831A (ja)
WO (1) WO2006137209A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015115610A1 (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 国立大学法人徳島大学 発現カセット

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000031284A1 (fr) * 1998-11-20 2000-06-02 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Vecteur d'expression de proteine et utilisation de ce dernier

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1000146E (pt) * 1997-08-01 2006-10-31 Serono Genetics Inst Sa Ests 5' para proteinas secretadas sem especificidade tecidular
WO2004011654A1 (ja) * 2002-07-31 2004-02-05 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. 新規セリンプロテアーゼ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000031284A1 (fr) * 1998-11-20 2000-06-02 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Vecteur d'expression de proteine et utilisation de ce dernier

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HATTORI A. ET AL.: "Molecular cloning of Adipocyte-derived leucine aminopeptidase highly related to placental leucine aminopeptidase/oxytocinase", J. BIOCHEM., vol. 125, no. 5, 1999, pages 931 - 938, XP002155174 *
OFNER L.D. ET AL.: "The C-terminal domain, but not the interchain disulphide, is required for the activity and intracellular trafficking of aminopeptidase A", BIOCHEM. J., vol. 362, 2002, pages 191 - 197, XP003005383 *
ROZENFELD R. ET AL.: "The C-terminal domain of aminopeptidase A is an intramolecular chaperone required for the correct folding, cell surface expression, and activity of this monizinc aminopeptidase", J. BIOL. CHEM., vol. 279, no. 41, 2004, pages 43285 - 43295, XP003005384 *
See also references of EP1916299A4 *
VAZEUX G. ET AL.: "Production and properties of a recombinant soluble form of aminopeptidase A", EUR. J. BIOCHEM., vol. 254, no. 3, 1998, pages 671 - 678, XP003005382 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1916299A1 (en) 2008-04-30
EP1916299A4 (en) 2008-10-08
JP2006345831A (ja) 2006-12-28
US20080213838A1 (en) 2008-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR950001992B1 (ko) 배양된 세포내에서 바쿨로바이러스 벡터를 이용한 펩타이드의 제조방법
US20080081353A1 (en) Production of recombinant human collagen
US5804410A (en) Nucleic acid sequence encoding trypsin-like enzyme and process for producing the enzyme
KR20020071476A (ko) 단백질 제조 방법
US20130085111A1 (en) Production of human c1 inhibitor in human cells
WO2006137209A1 (ja) Ｄｎａ、ベクター、形質転換体、及びａｐａタンパク質の製造方法
JPH05500615A (ja) ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法
WO2019143193A1 (ko) 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리 펩타이드를 생산하는방법
JP2007228814A (ja) 外来タンパク質の発現用遺伝子カセットおよび外来タンパク質の製造方法
US7842493B2 (en) Cell lines having enhanced cell longevity and protein expression
Lee et al. Gene Expression of Cotesiaplutellae Bracovlrus EP1-like Protein (CpBV-ELP1) in Parasitized Diamondback Moth, Plutellae xylostella
KR20220108113A (ko) 아스퍼질러스 자포니쿠스로부터의 프룩토실트랜스퍼라제의 제조를 위한 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 방법
CA2560161A1 (en) Production of recombinant human collagen
JP6044974B2 (ja) 組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター
LATCHINIAN‐SADEK et al. Secretion, purification and characterization of a soluble form of the yeast KEX1‐encoded protein from insect‐cell cultures
US20090035815A1 (en) Synthetic Gene for Enhanced Expression in E. Coli
KR102070940B1 (ko) 당단백질 호르몬 생산용 조성물
JP5020487B2 (ja) 融合タンパク質発現用新規ｄｎａ及び該ｄｎａを用いたタンパク質の製造方法
KR102315217B1 (ko) 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 및 이의 변이체
CN115161306B (zh) 绿盲蝽rna降解酶、其编码基因、载体、菌株及其应用
JP5830486B2 (ja) 組換えバキュロウイルスおよびその利用
JP2007176831A (ja) 有用タンパク質の製造方法
KR100232647B1 (ko) 곤충세포를 이용한 인간 트롬보포이에틴의 제조방법
KR100320165B1 (ko) 누에핵다각체병바이러스-케이원과그의다각체단백질유전자를포함하는전이벡터
JP4564791B2 (ja) スタテリン融合タンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006745401

Country of ref document: EP