KR100232647B1 - 곤충세포를 이용한 인간 트롬보포이에틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈소판이 생성되고 분화하는 과정을 촉진시키는 조혈단백질인 인간 트롬보포이에틴(human Thrombopoietin, 이하‘hTPO’라고 약칭함)을 곤충세포를 이용하여 대량으로 생산하는 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유전자 재조합 방법으로 리더 서열을 가지는 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스(Baculovirus) 이동벡터, 이를 야생형 베큘로바이러스와 동형 재조합(homologous recombination)하여 얻은 재조합 베큘로바이러스 및 이를 곤충세포에 감염시켜 hTPO 단백질의 생산을 최적화하는 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 제조방법을 이용하면 인체에 활성이 있는 당단백질 형태의 hTPO 단백질을 대량으로 세포 배양액에서 용이하게 분리, 정제할 수 있다.

Description

곤충세포를 이용한 인간 트롬보포이에틴의 제조방법

본 발명은 혈소판이 생성되고 분화하는 과정을 촉진시키는 조혈단백질인 인간 트롬보포이에틴(human Thrombopoietin, 이하‘hTPO’라고 약칭함)을 곤충세포를 이용하여 대량으로 생산하는 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 유전자 재조합 방법으로 리더 서열을 가지는 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스(Baculovirus) 이동벡터, 이를 야생형 베큘로바이러스와 동형 재조합 (homologous recombination)하여 얻은 재조합 베큘로바이러스 및 이를 곤충세포에 감염시켜 hTPO 단백질의 생산을 최적화하는 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 제조방법을 이용하면 인체에 활성이 있는 당단백질 형태의 hTPO 단백질을 대량으로 생산하고, 생산된 hTPO 단백질을 세포 배양액에서 용이하게 분리, 정제할 수 있다.

인간 트롬보포이에틴 (hTPO)은 332개의 아미노산으로 구성된 당단백질 (glycoprotein)로서, 인간의 간 또는 신장 등의 조직에서 생성되고 분비되어 골수에 작용하여, 골수 내의 조혈세포인 혈소판의 수를 증가시키고 분화를 촉진시키는 조혈단백질이다.

1961년 오델 등이 쥐의 혈액 내에 혈소판의 수를 조절하는 인자가 존재한다는 사실을 처음으로 보고한 (Odell, et, al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108, 428, 1961) 이래, 1994년에 이르러 hTPO 가 존재함을 밝히져 그의 구조와 작용에 대한 연구가 이루어졌다 (Sauvage, et al., Nature, 369, 533-538, 1994; Bartley, et al., Cell, 77, 1117-1124, 1994).

hTPO 는 골수세포 내에 존재하는 혈소판 전구세포인 거핵구 콜로니형성전구세포들에 작용하여 혈소판 전구세포를 증식시켜 궁극적으로 혈소판의 수를 증대시키고 그의 분화를 촉진시키는 당단백질로서, 최근 의학 분야에서 관심이 모아지고 있는 유망한 단백질이다. 구체적으로 hTPO 가 사용되어 치료될 수 있는 적응증은 혈소판의 수가 감소 (Thrombocytopenia)되거나 그의 기능이 퇴화되어 유발되는 질환으로, 특히 항암제 또는 약물을 과량으로 투여하는 경우에 유발되는 혈소판 감소증 및 골수 이식을 한 환자를 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

현재까지 이러한 혈소판 감소증을 치료하는 방법으로 혈소판을 수혈하는 방법이 유일하게 사용되었으나, 이는 출혈의 유발, 에이즈 바이러스 또는 간염 바이러스와 같은 혈액에서 유래한 감염원에 의한 감염 및 혈소판의 항원성 등에 의한 부작용이 있었다 (Lok, Stem Cells, 199, 12, 586-598, 1994). 따라서 이러한 부작용들을 최소화하거나 원천적으로 제거할 수 있는 hTPO 단백질은 혈소판이 관여하는 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

베큘로바이러스(Baculovirus)는 곤충에만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로서 약 80-200Kbp 크기의 이중가닥 DNA 가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있다. 일찍부터 생물학적 살충제를 연구하기 위하여 많이 사용되어 왔으며, 최근들어 각종 유용한 단백질을 곤충세포에서 대량으로 생산할 수 있는 발현 벡터로 이용되어 더욱 크게 각광을 받고 있다.

베큘로바이러스 속은 바이러스의 형태에 따라 다시 세 개의 아그룹으로 분류될 수 있다. 구체적으로 아그룹 A 바이러스인 핵다각체형 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus, NPV)는 한 개의 뉴클레오캡시드가 외피에 포함되거나 (single nuclear polyhedrosis virus, SNPV) 여러 개의 뉴클레오캡시드가 하나의 외피에 둘러싸인 (multiple nuclear polyhedrosis virus, MNPV) 형태를 가지며, 이 바이러스들은 다시 폴리히드라라는 플리히드린 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 B 바이러스는 그래눌로시스바이러스 (GV)인데 외피당 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 그래눌린(granulin) 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 C 바이러스은 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 단백질 봉입체에 둘러싸여 있지 않다 (NOBV, non occluded Baculoviruses).

이들 바이러스 중에 현재 알팔파 루퍼 (alfalfa looper)로 불리우는 나방모충인 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica)에서 분리한 핵다각체형 바이러스(NPV)인 AcMNPV 바이러스 또는 봄비스모리 (Bombix mori)에서 분리한 NPV 인 BmNPV 바이러스가 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 발현 벡터 또는 발현 시스템으로 많이 이용되어 왔다.

베큘로바이러스가 곤충세포에 감염되는 경우 폴리히드린이라는 단백질이 총단백질 양의 25% 이상에 달할 정도로 발현되므로, 베큘로바이러스의 폴리히드린 프로모터를 이용하면 유용한 외래 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다. 또한, 베큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키면 대장균의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고 대장균이나 효모와는 달리 당의 부가(glycosylation)와 같은 번역후수식 (post-translational modification)이 효과적으로 이루어질 수 있다. 따라서 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하면 생물학적으로 활성이 있는 천연형의 단백질과 유사한 단백질을 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

또한 대장균의 발현 시스템을 이용하여 치료용 단백질을 생산하는 경우, 대장균의 세포벽에서 유래하는 발열성 물질인 파이로젠 (pyrogen) 등이 혼입되어 부작용이 유발될 수 있고, 번역후수식이 전혀 이루어지지 않으므로 천연형 단백질과 유사한 당단백질 형태로서의 hTPO 를 생산할 수 없는 단점이 있다. 한편 동물세포의 발현 시스템을 이용하여 생산된 단백질은 그 구조는 천연형 단백질과 유사하나 발현된 단백질의 양이 대장균 또는 곤충세포에 비하여 매우 적게 발현되는 단점이 있다.구체적으로 곤충세포를 이용하여 외래 단백질을 발현시키는 경우, 발현되는 단백질의 양에 있어서 일반적으로 세포내 단백질은 200mg/L 이상으로 발현되나, 당단백질로서 분비되는 단백질은 평균 1mg/L 로 발현된다고 보고되어 있다 (Murphy, et al., Protein Expression & Purification, 4, 349-357, 1993).

지금까지 hTPO 를 대량으로 생산하기 위하여, 대장균 또는 포유동물 세포인CHO 세포 및 293 세포 등을 이용하는 연구가 일부에서 이루어졌다. 이 때 발현된 hTPO 단백질의 양이 구체적으로 언급되어 있지는 않지만, 적은 것으로 알려져 있다. 또한 대장균에서 hTPO 단백질을 발현시킨 경우 불용성의 단백질 (inclusion body)이 형성되므로 이를 녹여서 활성형 단백질의 형태로 전환시키는 공정에 많은 노력과 시간이 필요하고, 대장균을 파쇄하여 hTPO 단백질을 회수하는 과정에서 대장균의 엔도톡신이 불순물로서 혼입될 수 있어 이를 완전히 제거하는 추가적인 공정이 필요한 문제점이 있다. 또한, 곤충세포에서 당단백질을 발현시키는 경우 발현되는 당단백질의 양은 보통의 세포내 단백질의 양에 비하여 200배 이하로 적게 나타난다.

이에 본 발명자들은 인체에서 활성이 있는 당단백질 형태의 hTPO 단백질을 효과적으로 대량 생산하기 위하여, hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터를 제조하고, 이를 야생형 베큘로바이러스와 곤충세포에 공형질감염시켜 hTPO 단백질을 발현할 수 있는 재조합 베큘로바이러스를 얻고, 이를 곤충세포에 감염시켜 당단백질 형태의 hTPO 단백질을 세포외로 분비되도록 대량 발현시키고 이들 과정의 배양 조건을 최적화시켜 생산되는 hTPO 단백질의 양을 극대화시킴으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 곤충세포에서 인간 트롬보포이에틴 (hTPO)을 대량으로 생산하는 새로운 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 폴리히드린 프로모터와 인접한 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터를 야생형 베큘로바이러스와 곤충세포에 공형질감염시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조한 다음 이를 곤충세포에 감염시켜 당단백질 형태의 hTPO 단백질을 대량으로 생산하는 제조방법을 제공한다.

이 때 곤충세포로는 스포돕프테라 푸르기페다 (Spodoptera frugiperda, Sf9) 및 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni, TN5) 세포주 등을 사용하고, 야생형 베큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) 등을 사용한다.

본 발명은 hTPO 단백질은 천연형 단백질 형태로 세포 배양액에서 얻을 수 있다.

본 발명은 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 hTPO 단백질의 리더 서열을 가지는 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 및 그의 대장균 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 hTPO 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 상기 이동벡터 pBac404-7 와 야생형 오토그라파 캘리포니카 MNPV 바이러스를 동형 재조합 (homologous recombination)시켜 hTPO 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 곤충세포주에 감염시켜 hTPO 단백질의 발현을 최적화하는 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명은 hTPO 단백질이 발현되는 곤충세포의 밀도, 바이러스의 양 (multiplicity of infection, MOI) 및 hTPO 단백질을 회수하는 시간 등을 조절하여 hTPO 단백질이 발현되는 배양 조건을 최적화하고 이의 생산을 극대화시키는 제조방법을 제공한다. 이 때 곤충세포의 밀도는 25 - 50% 가 바람직하고, 바이러스의 양은 5 - 10 MOI가 바람직하며, 회수하는 시간은 48 - 72시간이 바람직하다.

도 2은 본 발명의 인간 트롬보포이에틴 (hTPO) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pBlue404 의 제조 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 의 제조 과정을 나타낸 것이다.

도 3은 상기 hTPO 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pBlue404 를 제한효소로 단하여 hTPO 유전자가 삽입되고 단일 제한효소 인지부위가 존재함을 아가로오즈 겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 및 레인 6 : 마커; 레인 2 : 제한효소 Xba I 및 Hind Ⅲ; 레인 3 : Bam HI; 레인 4 : Kpn I; 레인 5 : Pst I 및 Hind Ⅲ 절단

도 4는 본 발명의 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 을 제한효소로 절단하여 hTPO 유전자가 삽입되고 단일 제한효소 인지부위가 존재함을 아가로오즈 겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 및 레인 6 : 마커; 레인 2 : 제한효소 Bam HI; 레인 3 : Xba I; 레인 4 : Hind Ⅲ; 레인 5 : Sac I 절단

도 5는 본 발명의 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 내에 hTPO 유전자가 존재함을 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 아가로오즈 겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : 마커; 레인 2 : 야생형 베큘로바이러스; 레인 3 - 레인 9 : 재조합 베큘로바이러스

도 6 은 곤충세포주인 Sf9 및 TN5 세포에 재조합 베큘로바이러스 AcBAC404-2 를 감염시켜 시간의 경과에 따라 발현되어 분비되는 hTPO 단백질을 효소면역측정방법 (ELISA)으로 정량한 결과를 나타낸 것이다.

●---● : 5 PFU/세포; ○---○ : 10 PFU/세포

도 7은 곤충세포주인 TN5 세포에 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 감염시켜 시간의 경과에 따라 발현되어 분비되는 hTPO 단백질의 양을 웨스턴블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 ; 마커; 레인 2 - 레인 5 : 감염후 24, 36, 48, 62 시간 경과시의 배양 상등액; 레인 6 - 레인 9 : 감염후 24, 36, 48, 62 시간 경과시의 세포 파쇄액

도 8은 곤충세포인 Sf9 세포에 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 감염시킬 때 투니카마이신 (Tunicamycin)을 처리하여 hTPO 단백질이 N-글리코실레이션되는 양상을 나타낸 것이다.

레인 1 : Sf9 세포; 레인 M : 마커 레인 2 - 레인 4 : 감염시켜 튜니카마이신을 각각 1, 10, 100 ㎍/ml 처리한 경우; 레인 5 : 바이러스만 감염시킨 세포

도 9는 본 발명의 hTPO 단백질을 대량으로 발현시킬 때 TN5 세포주의 밀도가 TPO 단백질의 생산에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 hTPO 유전자를 클로닝하기 위하여, 인간 태아 간세포의 cDNA 라이브러리를 사용한다. 구체적으로 λgtll 파아지를 이용한 cDNA 라이브러리로부터 hTPO 유전자의 cDNA 단편을 클로닝하기 위하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 " PCR "이라고 약칭함)으로 스크리닝하는데, 이 때 프라이머로는 hTPO 의 아미노 말단의 리더 서열에 해당하는 염기 서열과 제한효소 인지 부위를 가지는 서열 1의 올리고 뉴클레오타이드와 hTPO 의 카복시 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 인지 부위를 가지는 서열 2 의 올리고 뉴클레오타이드를 사용한다.

본 발명에서 사용한 hTPO 유전자는 이미 공지된 염기 서열 (Sauvage, et al., Nature, 369, 533-538, 1994)에서 단백질로 발현되지 않는 5′-말단 및 3′-말단 의 인트론 부분을 완전히 제거시킴으로 단백질이 전사되어 번역되는 과정의 효율을 저해할 수 있는 유전자의 2차 구조가 형성되는 것을 배제한다.

본 발명은 상기 방법으로 분리되고 제한효소 Xba I 과 Hind Ⅲ 로 절단시킨 hTPO 유전자를 플라스미드 벡터 pBluescriptⅡ SK(+)에 삽입하여 이를 포함하는 플라스미드 벡터 pBlue404 및 그의 대장균 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 플라스미드 벡터 pBlue404 의 제한효소 지도 및 염기 서열 등을 분석하여 이에 공지된 서열과 완전히 동일한 염기 서열 및 이로부터 유추한 아미노산 서열을 가지는 hTPO 유전자를 포함하는 것을 확인한다 (도 1 및 도 3 참조).

또한, 본 발명은 상기 플라스미드 벡터 pBlue404 를 제한효소 Xba I 과 Hind Ⅲ 로 절단하여 hTPO 유전자를 포함하는 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pUC18 에 삽입한 플라스미드 벡터 pUC404 를 제조한다.

다음 베큘로바이러스의 폴리히드린 프로모터를 포함하는 공지의 이동벡터인 pBlueBacⅢ (Invitrogen사)를 제한효소 Bam HI 과 Hind Ⅲ 로 절단하고, 이 DNA 단편에 플라스미드 벡터 pUC404 를 제한효소 Bam HI 으로 부분 절단하고 제한효소 HindⅢ 로 완전 절단하여 얻은 1075bp 크기의 hTPO cDNA 단편을 연결함으로써, 최종적으로 상기 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 을 제조한다 (도 2 및 도 4 참조).

상기 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 을 대장균에 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체를 국제기탁기관인 한국종균협회에 1997년 2월 3일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC-10953).

또한 본 발명은 hTPO 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위하여, 천연형의 오토그라파 캘리포니카 바이러스 (AcMNPV)를 곤충세포인 스포돕테라 푸루기페다 9 (Sf9) 세포주 등에 감염시켜 세포에 봉입되지 않는 바이러스 (Extracellular virus, 이하 " ECV "라고 약칭함)를 분리하고 이로부터 베큘로바이러스 DNA 를 공지된 밀러 등의 방법으로 (O＇Reilly, et al., Baculovirus expression vectors, A laboratory manual, 1989, W. H. Freeman company) 정제한다. 구체적으로 제한효소 Bsu 36I 로 삼중 절단하여 준비한 단일 DNA 인 Bacpak6 DNA (Clotech사)를 상기 본 발명의 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 과 함께 Sf9 세포주에 공형질감염시키고 몇 일이 경과한 다음 배양 상등액을 취한다. 이 때 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 및 야생형 오토그라파 캘리포니카 MNPV 바이러스의 DNA 사이에 동형 재조합(homologous recombination)이 일어나 hTPO 유전자의 cDNA 단편을 포함하는 본 발명의 재조합 베귤로바이러스가 제조된다.

이 때 재조합 베큘로바이러스가 제조되면 감염된 곤충세포는 세포 및 세포 핵의 크기가 정상세포보다 커지고 핵 내에 바이러스의 봉입체가 보이지 않는 (occlusion negative, occ) 플라크가 현미경 상에서 관찰되고, 이 플라크를 고정시킨 한천배지에 X-gal 시약을 부가한 경우 푸른 원형의 플라크를 얻을 수 있어 이를 확인할 수 있다.

상기에서 10개 미만의 재조합 베큘로바이러스 플라크를 취하여 다시 상기 Sf9 세포에 다시 감염시키고 몇 일 후에 배양 상등액에서 ECV 바이러스를 수거하고 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 염화나트륨 용액으로 침전시켜 그의 DNA 를 분리하고 상기에서 사용한 서열 1및 서열 2 의 프라이머를 이용한 PCR 을 수행하여 hTPO 유전자가 삽입된 베큘로바이러스가 제조됨을 확인한다 (도 5 참조)

이렇게 하여 1079bp 크기의 hTPO 유전자의 cDNA 단편을 포함하는 여러 개의 재조합 베큘로바이러스 중에서 하나를 선택하여 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2로 명명하고, 이를 국제기탁기관인 한국종균협회에 1997년 2월 3일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC-10952).

본 발명은 상기 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 곤충세포주에 감염시켜 1×10⁸PFU/ml 이상의 고농도의 타이터를 가지는 고농도 베큘로바이러스 원액 (High titer stock, HTS)를 제공한다. 또한, hTPO 단백질을 발현시키기 위하여 숙주세포에 상기 고농도 바이러스 원액을 감염시켜 단백질이 발현되는 여부를 효소면역 측정방법 (ELISA) 및 웨스턴 블로팅 방법으로 확인한다. 이 때 바이러스가 증폭되는 숙주 세포로는 Sf9 세포주가 바람직하고, 이를 세포 1개당 5-10개의 바이러스의 수의 비율로 감염시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 있어서, hTPO 단백질은 Sf9 세포주에서보다 TN5 세포주에서 약 2-5배 이상으로 발현되므로 hTPO 단백질을 대량으로 생산하는데는 Tn5 세포주를 사용하는 것이 바람직하다 (도 6 참조).

구체적으로, 본 발명은 곤충세포주에서 hTPO 단백질의 발현을 극대화하는 최적의 발현 조건을 확립하기 위하여, 상기 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 고농도 바이러스원액을 TN5 세포주를 포함한 곤충세포에 감염시키는 경우 곤충세포를 전체 면적의 25%∼50% 정도의 밀도로 배양한 것이, 75% 이상의 밀도로 배양한 것보다 2배 이상의 hTPO 단백질을 발현하는 것을 확인한다. 또한, 곤충세포에 상기 재조합 베큘로바이러스를 감염시킨 다음 48시간 내지 72시간이 경과한 경우에 최대로 hTPO 단백질이 발현되고 더 시간이 경과하면 hTPO 단백질의 양이 감소됨을 확인한다 (도 6, 도 7 및 도 9 참조). 또한 상기 곤충세포에 감염시키는 바이러스의 감염수는 5∼10 MOI 가 적당하다.

본 발명은 상기의 방법으로 hTPO 단백질을 세포 배양액으로 분비되는 당단백질 형태로 생산하며 그 발현 양에 있어서도 최소 배양액 1ℓ당 5mg 이상, 평균 10-15mg, 많게는 20-40mg 이상의 hTPO 단백질이 생산된다.

또한, 본 발명에서 생산한 hTPO 단백질에 당이 부착되는 정도를 확인하기 위하여 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 로 감염시킨 곤충세포에 투니카마이신 (Tunicamycin)을 처리하여 hTPO 단백질이 N-글리코실레이션되는 양상을 조사하였다.(도 8 참조).

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]인간 태아 간세포의 cDNA 라이브러리로부터 hTPO 유전자의 cDNA 제조

26주된 인간 태아 간조직으로부터 mRNA 를 추출하여 제조한 cDNA 를 λgtll 파아지 DNA 에 삽입시킨 cDNA 라이브러리 (Clontech사, cat#HL1064b)를 hTPO 유전자를 클로닝하는데 사용하였다.

(단계 1) λ 파아지의 타이터 (titer) 결정

λgtll 파아지를 감염시킨 균주로는 대장균 Yl090r^-를 사용하였다. MgSO₄가 없는 LB 배지 (배지 1ℓ당 박토트립톤 10g, 효모추출물 5g, NaCI 10g)를 사용하여 대장균 Y1090r^-의 단일 콜로니를 접종하고 37℃에서 배양액의 600nm 에서의 흡광도가 2.0 이 될 때까지 배양하였다. 여기에 상기 파이지를 1 : 250,000 까지 1X 람다 희석 완충용액 (lamda dilution buffer)으로 희석하여 그 희석액을 2, 5, 10, 0㎕ (대조군) 씩, 상기 대장균을 15시간 동안 배양시킨 배양액 200㎕에 각각 첨가하였다. 이를 37℃에서 다시 진탕 배양기로 15분 동안 배양한 다음, 4개의 각 시험관에 10mM MgSO₄와 0.7% 한천이 첨가된 LB 소프트탑 한천배지를 부가하여 균질하게 섞고, 10mM MgSO₄가 첨가된 LB 고형배지에 플레이팅하였다. 다음 37℃에서 7시간 동안 배양하여 생성된 플라크의 수를 세어, 원액 ml 당 4.58×10¹⁰플라그 형성단위 (PFU)를 나타내는 λgtll 파아지의 타이터를 결정하였다.

(단계 2) λgtll 파아지로부터 DNA 분리

대장균 Y1090r^-의 단일 콜로니를 10mM MgSO₄와 0.2% 말토오즈가 첨가된 3ml LB 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 배양액 2ml 를 200ml NZC 배지 (물 1ℓ당 NZ 아민 10g, NaCl 5g, MgCl₂2g 을 포함한 배지)에 접종하여 배양액의 600nm 에서의 흡광도가 0.6 이 될 때까지 배양하였다. 이 배양액에 λgtll 파아지 원액 30㎕을 접종하고 37℃ 에서 다시 6시간 - 10시간 동안 배양액이 투명하게 될 때까지 배양하였다. 여기에 클로로포름 2ml 을 첨가하여 15분 동안 진탕 배양함으로 용액 상태의 파아지 분쇄물을 얻었다. 이 분쇄물을 4℃ 에서 7,000rpm 으로 10분 동안 원심분리 (Sovall SS34)하여 상등액을 취하고, 20% 폴리에틸렌글리콜 8000 / 2.0M NaCl 을 동등한 부피만큼 첨가하여 얼음에서 1 시간 동안 방치하였다. 이를 다시 4℃에서 6000rpm 으로 10분 동안 원심분리하여 λgtll 파아지의 침전물을 얻고 이를 TM 완충용액 (20mM Tris-Cl (pH8.0), 20mM MgCl₂) 6ml 에 녹여 동량의 클로로포름을 가하였다. 이를 잘 섞은 다음, 4℃에서 5000rpm 으로 10분 동안 원심분리하고 상등액을 취하여 3ml TM 완충용액으로 완전히 평형화된 DEAE-셀룰로스 칼럼 (1.5 X 5cm, Bio-Rad.)에 로딩 (loading)하고 상기 완충용액으로 파아지 용액을 용출하였다. 초기 용출액 3ml 은 제거하고, 수집된 용출액 13ml 에 2ml 의 5M NaCl 과 10ml 의 얼음같이 찬 (ice-cold) 100% 이소프로판올을 가한 다음 -20℃에서 15분 동안 방치하였다. 이를 4℃에서, 5000rpm 으로 10분 동안 원심분리(Sorvall SS34)하여 그의 침전물을 얻고, 0.8ml TE 완충용액 (pH 8.0)으로 완전히 녹여 동량의 페놀로 1회, 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 (25 : 24 : 1)로 2회, 마지막으로 클로로포름으로 1회 추출한 다음, 1/10 부피의 3M 소듐아세테이트(pH 6.0)와 2배 부피의 얼음같이 찬 100% 에탄올을 첨가하였다. 이렇게 얻은 DNA 펠렛 (pellets)을 70% 에탄올로 세척하여 공기 건조시킨 다음 100㎕ TE 완충용액 (pH 8.0)에 녹여 4℃에서 보관하였다.

(단계 3) 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용한 hTPO 유전자의 스크리닝

상기 방법으로 분리한 파아지 라이브러리의 DNA 5-50ng 을 주형으로 사용하고, TPO 유전자의 리더 서열 및 N-말단 서열을 포함하는 염기 서열을 가지는 서열 1의 올리고 뉴클레오타이드와 TPO 유전자의 C-말단 전사해독틀 (open reading frame, ORF) 지역과 종결코돈을 포함하는 염기 서열을 가지는 서열 2 의 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 구체적으로 각각의 프라이머를 ㎕당 10pmol 씩 녹인 다음 100pmol - 150pmol 의 범위로 조정하고 Taq 폴리머레이즈 1유니트를 부가하여 최종 20㎕부피로 PCR 반응을 진행시켰다. PCR 반응은 1차 변성 ; 94℃ 5분, 프라이머 접합 ; 58℃ 2분, 효소 신장 반응 ; 72℃ 1분 20초, 변성 ; 94℃ 1분 과정을 30회 반복하여 진행시킨 다음, 최종 효소반응을 72℃ 5분으로 수행하여 반응을 종료하고 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하였다. 또한, hTPO cDNA 서열을 포함하는 크기에 해당되는 DNA 밴드를 찾아낸 다음 hTPO cDNA 서열을 포함하는 1079bp 에 해당되는 밴드를 다시 증폭하였다. 구체적으로 1차 PCR 반응 산물을 상기와 같은 조건으로 프라이머를 부가하여 아래의 반응 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 1차 변성 ; 94℃, 5분, 프라이머 접합 ; 58℃, 2분, 효소 신장 반응 ; 72℃, 80초, 변성 ; 94℃ 1분의 과정을 30회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72℃ 5분으로 진행시켜 종료하였다.

[실시예 2] hTPO 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pBlue 404 의 제조

상기 방법으로 증폭된 hTPO 유전자를 클로닝하기 위하여, 이를 함유하는 시험관으로부터 250㎕ 를 취하여 2회 페놀로 추출하고 100% 에탄올을 동량 부가한 다음 침전시켰다. 이를 100㎕ 이차증류수에 완전히 녹이고 이중 33㎕를 취하여 1% 아가로오즈 겔 전기영동하였다. 다음 1079bp 크기의 hTPO 유전자의 DNA 밴드를 면도 칼로 잘라 진클린Ⅱ 용출키트를 이용하여 용출하고 이를 최종적으로 50㎕ 이 되도록 이차증류수에 녹였다. 이중 30㎕를 취하고 hTPO 유전자를 제한효소 Xba I 및 Hind Ⅲ 를 이용하여 37℃에서 5시간 동안 반응시킴으로 완전히 절단하였다.

또한, 플라스미드 벡터 pBluescriptⅡ SK(+) (Statagene사)를 제한효소 Xba I 및 Hind Ⅲ 로 절단하여 2979bp 의 DNA 단편을 1% 아가로오즈 겔 전기영동으로 상기와 같이 해당 밴드만을 분리한 다음 상기의 hTPO 유전자 DNA 단편과 함께 35㎕의 이차증류수에 녹였다. hTPO cDNA PCR 산물과 플라스미드 벡터 pBluecriptⅡSK(+) 를 연결시키기 위하여 이들을 1 : 1 의 몰 비율로 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 16℃에서 10시간 동안 반응시켰다. 이 반응액으로 대장균 XL1 blue (Stratagene사) 균주를 하나한 방법으로 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 획득하였다 (Hanahan, et al., DNA Cloning, Vo1.1: A Practical Approach, IRL Press, 1985, p109∼135). 이렇게 제조된 hTPO 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 pBlue404 라고 명명하고, 이를 제한효소 Xba I, Hind Ⅲ, Bam HI, Kpn I, Pst I 및 Hind Ⅲ 를 이용하여 단일 절단 및 이중 절단시킨 다음 1% 아가로오즈 겔 전기영동을 수행하여 hTPO 유전자가 바르게 삽입되었음을 확인하였다 (도 3 참조).

또한, 최종적으로 생거(Sanger)의 다이디옥시 뉴클레타이드 서열 결정방법을 수행하여 본 발명에서 클로닝한 hTPO 유전자가 공지의 서열과 완전히 동일한 염기 서열을 가지는 hTPO 유전자임을 확인하였다.

[실시예 3] hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7의 제조

곤충세포에서 hTPO 단백질을 생산할 수 있는 베큘로바이러스 이동벡터를 제조하기 위하여, 실시예 2 에서 얻은 hTPO 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pBlue404 약 800ng 을 제한효소 Xba I 과 Hind Ⅲ 를 각 4유니트씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시키고 1069bp 크기의 hTPO 유전자의 DNA 단편을 진클린 DNA 용출키트Ⅱ 를 이용하여 (Bio101 INC) 분리하였다. 다음 이미 공지되어 있으며, 일반 분리생물학 실험에 널리 사용되고 있는 플라스미드 벡터인 pUC18 900ng 을 제한효소 Xba I 및 Hind Ⅲ 로 절단하여 2662bp 의 DNA 단편을 1% 아가로오즈 겔 전기영동하여 용출시켜 분리하였다. 이들 2662bp 의 DNA 단편 5ng 과 hTPO 유전자의 DNA 단편 10ng 을 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈 0.5유니트를 부가한 다음 16℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행하였다. 이를 대장균 XL-1 blue 균주에 형질전환시켜 플라스미드 벡터 pUC18 에 hTPO 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터를 얻어 pUC404 라 명명하고, 이를 제한효소 Xba I, Hind Ⅲ, Bam HI, Pst I 및 Kpn I 으로 처리하여 hTPO 유전자가 바르게 삽입되었음을 확인하였다.

다음 곤충세포에서hTPO 유전자를 폴리히드린 프로모터의 조절하에서 발현하는 베큘로바이러스 이동벡터를 제조하기 위하여, 폴리히드린 프로모터를 포함하는 공지의 벡터 pBlueBacⅢ (Invitrogen사)를 제한효소 Bam HI 및 Hind Ⅲ 로 상기와 동일한 반응 조건으로 절단하고 약 10kbp 의 DNA 단편을 분리하였다. 또한 상기 플라스미드 벡터를 제한효소 Bam HI 으로 부분 절단시켜 완전한 hTPO 유전자를 포함하는 1075bp 의 DNA 단편을 분리하고 상기 벡터 pBlueBaeⅢ 의 DNA 단편과 T4 DNA라이게이즈를 이용하여 연결시켜 최종적으로 hTPO 유전자가 삽입된 베큘로바이러스 이동벡터를 제조하였다. 이렇게 얻은 재조합 이동벡터를 pBac404-7 이라고 명명하고, 제한효소 Bam HI, Xba I, Hind Ⅲ 및 Sac I 으로 절단하여 hTPO 유전자가 바르게 삽입되었음을 확인하였다 (도 4 참조).

상기 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 을 대장균에 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체를 국제기탁기관인 한국종균협회에 1997년 2월 3일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC-10953).

[실시예 4] hTPO 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 의 제조

hTPO 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위하여, Sf9 세포주를 35mm 디쉬에 1.5×10⁶개의 세포수로 접종하여 27℃에서 2시간 동안 배지 3ml을 부가하여 배양하였다. 이 때 배지로는 그레이스 곤충세포 배양배지(Gibco.사)에 10% 소혈청을 첨가한 배지를 사용하였다. 다음 디쉬에서 이미 사용된 구배지를 제거하고 소혈청 및 항생제가 첨가되지 않은 그레이스 배지 2ml 을 첨가하여 다시 상온에서 30분 동안 배양하였다.

다음 실시예 3 에서 제조한 본 발명의 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 약 500ng 에 제한효소 Bsu 36I 으로 절단된 야생형 베큘로바이러스 AcMNPV DNA (Clontech 사) 5μ1 를 첨가하여 공형질 감염시키고, 공지의 방법대로 플라크 검정방법 (O′Relly, et, al., Baculovirus expression vectors, A laboratory manual, 1989 W.H Freeman company)을 수행하여, 상기 세포주의 핵 내에 핵다각체가 형성 되지 않으면서 X-gal 시약을 첨가할 때 푸른색을 띠는 재조합 바이러스 플라크를 분리하였다. 이렇게 분리된 8종의 재조합 베큘로바이러스를 1×10⁶세포의 농도로 모노레이어 배양된 Sf9 세포에 감염시켜 5일간 배양하고, 그 배양 상등액 0.75ml을 취하여 세포 외로 방출되는 형태의 바이러스(ECV)를 얻어 hTPO 유전자가 삽입되었음을 PCR 을 수행하여 확인하였다 (도 5 참조).

상기 ECV 바이러스 내에서 유전자 DNA 를 추출하기 위하여 다음의 방법을 수행하였다. 상기 배양 상등액 750 ㎕를 5000rpm 으로 3분 동안 원심분리하고 그의 상등액을 얻어 여기에 동량의 20% 폴리에틸렌글리콜 8000 / 1M NaCl 용액을 부가하고 완전히 섞은 다음 30분 동안 상온에 방치하였다. 그 다음 상온에서 14000rpm 으로 10분 동안 원심분리하여 침전액을 얻고 100㎕ 이차 증류수에 녹여 완전히 균질화시켰다. 여기에 프로테아제 K 10㎍ 을 넣고 50℃에서 1시간 동안 반응시키고 다시 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 (25 : 24 : 1) 용액을 부가하여 잘 섞은 다음 5분 동안 10000rpm 으로 원심분리하여 상등액을 취하였다. 여기에 약 1/10 부피의 3M 소디움아세테이트 용액을 가한 다음 2배 부피의 100% 에탄올을 부가하여 -20℃에서 5분 동안 방치하였다. 이를 14000rpm 에서 15분 동안 원심분리하여 80% 에탄올로 1회 세척하고 10㎕의 이차증류수로 녹인 다음 이중 2㎕를 취하여 실시예 1 의 PCR 조건과 동일하게 반응시킴으로 hTPO 유전자가 존재함을 확인하였다 (도 5 참조). 이렇게 제조한 hTPO 유전자를 포함한 재조합 베큘로바이러스를 AcBac404-2 로 명명하고, 이를 다음 hTPO 유전자의 발현에 사용하였다.

본 발명의 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 국제기탁기관인 한국종균협회에 1997년 2월 3일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KFCC-10952).

[실시예 5] 고농도의 재조합 베큘로바이러스 원액의 제조 및 이를 이용한 hTPO 유전자의 발현

곤충세포에서 hTPO 유전자를 발현시키기 위하여, 고농도의 재조합 베큘로바이러스 원액 (HTS : High Titer Stock)을 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 구체적으로 35mm 디쉬에서 얻은 베큘로바이러스 AcBac404-2 액 1ml 을 Sf9 세포가 5×10⁶세포수로 배양된 75㎠ T-플라스크에 접종하여 4일이 경과한 다음 상등액을 얻어 다시 100mm 디쉬 20개나 175㎟ T-플라스크 30개에 약 50% 의 세포 밀도로 배양한 모노레이어에 감염시키고 5-6일 동안 배양하여 베큘로바이러스 원액을 제조하였다. 바이러스 원액의 타이터(titer)를 결정하기 위하여 공지의 플라크 검정법을 수행하여 원액 1ml 당 1×10⁸PFU 이상의 원액이 제조되었음을 확인하였다.

상기에서 제조된 HTS 를 이용하여 곤충세포주 Sf9 과 TN5 를 각각 감염시키고 hTPO 단백질을 발현시킨 결과, Sf9 세포주에서는 배지 1리터당 약 평균 1.0∼5.0mg 으로 hTPO 단백질이 분비되고, TN5 세포주는 리터당 평균 15-20mg, 많게는 30mg 까지 분비됨을 확인하였다. 항원코팅 ELISA 법으로 상기 hTPO 단백질의 발현량을 측정하여 도 6 에 나타내었다. 또한 상기 배양 상등액 10㎕를 취하여 공지의 방법대로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Novex 사) 및 웨스턴 블러팅(Bio-Rad 사)을 수행한 결과, hTPO 단백질에 특이적인 진한 발색 밴드를 확인하였으며 이를 도 7 에 나타내었다.

[실시예 6] 본 발명의 hTPO 단백질의 특성 분석 및 발현 최적화

본 발명의 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 곤충세포인 Sf9 및 TN5 세포주에 감염시켜 얻은 hTPO 단백질은 웨스턴 블러팅을 수행한 결과 그의 분자량이 약 50-60kd 임을 확인하였다 (도 8 참조). 그리고 발현된 전체 단백질의 90% 이상이 세포 외로 분비됨을 확인하였다. 또한, N-글리코실레이션 억제제인 투니카마이신 (Tunicamycin)을 ml당 각각 1, 10, 100 마이크로그램으로 처리하여 배양하는 경우 35∼44kd 크기 범위에서 약 5개의 단백질 밴드를 나타내는데, 당을 제외한 이론적인 hTPO 단백질의 크기를 약 35kd 으로 예상한다면 곤충세포에서 발현된 hTPO 단백질은 전체의 약 30∼40% 가 N-글리코실레이션된 당단백질임을 알 수 있었다.

또한, 곤충세포인 TN5 세포주에 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 를 감염시켜 모노레이어로 배양하는 경우 hTPO 단백질의 발현을 극대화하는 조건을 연구하였다. hTPO 단백질을 발현시키는 경우의 곤충세포의 밀도 효과를 조사한 결과, 전체 플라스크 면적의 약 25∼50% 를 차지하는 밀도 (2×10⁷세포수/T₁₇₅)에서 감염시킨 경우가 75∼100% 의 밀도 (3∼4×10⁷세포주/T₁₇₅)로 감염시킨 경우보다 2배 이상 발현량이 높게 나타났다. 또한 hTPO 단백질의 발현을 최적화하는데 필요한 바이러스 농도는 5∼10 MOI 가 적절하였으며, hTPO 단백질을 함유하는 단백질 용액을 회수하는 최적 시간은 바이러스를 감염시킨 다음 48시간에서 72시간이 경과한 사이가 적절함을 확인하였다 (도 6, 도 7 및 도 9 참조).

본 발명은 hTPO 단백질을 곤충세포에서 발현시킴으로 hTPO 단백질을 세포 배양액으로 분비되는 당단백질 형태로 얻고, 이렇게 생산된 hTPO 단백질은 인체에 활성을 탁월하게 나타낼 것으로 기대된다.

또한 본 발명은 세포의 배양 조건을 최적화하여 발현되는 hTPO 단백질의 양을 극대화하는데, 구체적으로 곤충세포의 밀도, 바이러스의 양 및 단백질을 회수하는 시간 등을 조절하여 최소한 배양액 1ℓ당, 5mg 이상, 평균 10-15mg, 많게는 20-40mg 이상의 hTPO 당단백질을 세포 배양액에서 얻을 수 있다.

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 27

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오티드)

[서열 1]

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 30

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오티드)

[서열 2]

Claims (10)

1. 인간 트롬보포이에틴 (hTPO) 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터.
2. 제 1항에 있어서, 폴리히드린프로모터와 인접한 hTPO 의 리더 서열을 가지는 hTPO 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7.
3. 제 2항의 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7 로 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체 (수탁번호: KFCC-10953).
4. 곤충세포에서 제 1항의 베큘로바이러스 이동벡터를 야생형 베큘로바이러스와 공형질감염시켜 얻은 재조합 베큘로바이러스.
5. 제 4항에 있어서, 베큘로바이러스 이동벡터 pBac404-7을 야생형 베큘로바이러스 오토그라파 캘리포니카 MNPV와 공형질 감염시켜 얻는 것을 특징으로 하는 재조합 베큘로바이러스 AcBac404-2 (수탁번호 : KFCC-10952).
6. 제 1항의 베큘로바이러스 이동벡터를 제 4항의 야생형 베큘로바이러스와 곤충세포에 공형질 감염시켜 재조합 베큘로바이러스를 제조하고, 이를 곤충세포에 다시 감염시켜 일정시간후 당단백질 형태의 hTPO 단백질을 회수하는 제조방법.
7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 곤충세포는 스포돕프테라 푸르기페다 (Spodoptera frugiperda) 및 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 세포주를 포함하는 제조방법.
8. 제 6항에 있어서, 곤충세포의 밀도는 25 내지 50%인 제조방법.
9. 제 6항에 있어서, 바이러스의 양은 5 내지 10 MOI 인 제조방법.
10. 제 6항에 있어서, 회수하는 시간은 48 내지 72시간인 제조방법.

Images