WO2015115610A1 - 発現カセット - Google Patents

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WO2015115610A1
WO2015115610A1 PCT/JP2015/052727 JP2015052727W WO2015115610A1 WO 2015115610 A1 WO2015115610 A1 WO 2015115610A1 JP 2015052727 W JP2015052727 W JP 2015052727W WO 2015115610 A1 WO2015115610 A1 WO 2015115610A1
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WO
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formula
base sequence
sequence represented
expression cassette
orf
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PCT/JP2015/052727
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French (fr)
Inventor
間世田　英明
麻希 上手
Original Assignee
国立大学法人徳島大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Definitions

  • the present invention relates to an expression cassette that enables a novel expression induction system, a protein expression method using the same, and a method for screening candidate substances for drug resistance inhibitors.
  • recombinant protein expression technology is used in various fields. For example, in the pharmaceutical field, protein preparations such as insulin are produced by expressing them from genes introduced into E. coli or yeast. In addition, recombinant protein expression technology is also used for preparing proteins used for antibody production, protein functional analysis, protein tertiary structure analysis, and the like.
  • Non-patent Document 1 when the target protein is expressed in bacteria such as E. coli, cell growth may be inhibited by the function of the protein, and as a result, the target protein may not be obtained efficiently. Therefore, a system is usually used in which the expression of the target protein is induced after the bacteria have grown to some extent (Non-patent Document 1).
  • a system in which, by adding IPTG during the logarithmic growth phase of bacteria, an IPTG-responsive promoter (such as a lac promoter) is activated to induce protein expression.
  • an IPTG-responsive promoter such as a lac promoter
  • protein expression is induced by switching the carbon source to be used accompanying bacterial growth by culturing in a medium containing two types of carbon sources.
  • the expression induction period, the ratio of induced bacteria, the effect of expression induction on bacterial growth, and the like are different.
  • protein expression is induced simultaneously in all bacteria in culture by the addition of IPTG, so that induction occurs relatively rapidly.
  • protein expression is sequentially induced from the bacteria that have switched the carbon source used, so that induction occurs relatively slowly.
  • Such characteristics of each expression induction system are thought to affect the final yield of the target protein, whether it can be recovered without denaturation, and the like.
  • Pseudomonas aeruginosa is a resident bacterium present in the natural environment and is a causative bacterium of opportunistic infections. It is known that resistance to drugs such as disinfectants and antibiotics is inherently high, and therefore there are fewer types of drugs that exert antibacterial effects against Pseudomonas aeruginosa compared to other bacteria. Specifically, it is known that ⁇ -lactam antibacterial agents such as penicillin and cephem do not exhibit antibacterial effects against Pseudomonas aeruginosa.
  • the NfxC type mutant is one of the resistant bacteria that is often isolated from patients with cystic fibrosis (CF), a genetic disease of 1 in 2500 Westerners.
  • the NfxC type mutant expresses an RND type drug efflux pump (MexEF-OprN), and as a result, is known to acquire drug resistance performance.
  • the ORF of the mexT gene is deleted by 8 bp and the frame is shifted, and the activated MexT protein (transcription factor) expressed as a result activates the expression of the RND type drug efflux pump ( Non-patent document 2).
  • the present invention aims to provide a novel expression induction system. It is another object of the present invention to provide a protein expression method using the system.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a drug resistance inhibitor candidate substance in order to eliminate the so-called “weasel play” problem of drug development and the emergence of resistant bacteria. Furthermore, it aims at providing the method of performing this screening more simply and efficiently.
  • the present inventors have analyzed the mechanism of drug resistance of bacteria. Surprisingly, in bacteria in general, an array of XYX and an array of XYX overlapped in X (XYXYX; hereinafter, We found that there is a rule that the non-overlapping sequence (XY) in the sequence (sometimes referred to as “overlapping direct repeat”) is deleted. The present inventors have also found that there is a rule that a base sequence represented by X-Y is inserted adjacent to the 5 'side of the sequence X-Y-X to create an overlapping direct repeat.
  • an expression cassette comprising overlapping direct repeats or the sequence XYX, for example, using a frameshift caused by the deletion or insertion, or a change in the transcriptional activity of the promoter caused by the deletion or insertion. It has also been found that the expression of the target protein can be induced using the amino acid deletion or insertion caused by the above deletion or insertion.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 Formula (1): XYXYX (1) [wherein X and Y represent different base sequences having one or more bases. ] Or formula (2): XYX (2) [wherein X and Y are the same as defined above.] ] The expression cassette containing the base sequence shown by this. Item 2. The number of bases of the base sequence represented by XY in the formula (1) is 3n + 1 or 3n + 2 (where n is an integer), and the number of bases of the base sequence represented by XY in the formula (2) The expression cassette according to Item 1, wherein is 3p + 1 or 3p + 2 (p is an integer). Item 3. Item 3.
  • Item 1 or 2 wherein an initiation codon is arranged on the 5 ′ side of the base sequence represented by Formula (1) or Formula (2).
  • Item 4. Item 4. The expression cassette according to any one of Items 1 to 3, wherein a promoter is arranged on the 5 ′ side of the base sequence represented by Formula (1) or Formula (2).
  • Item 5. Item 5. The expression cassette according to any one of Items 1 to 4, wherein a promoter, an initiation codon, and the base sequence represented by the formula (1) or the formula (2) are arranged in this order from the 5 ′ side.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. Item 7.
  • the expression cassette is an expression cassette in which a promoter, an initiation codon, a base sequence represented by formula (1) or formula (2), and an ORF are arranged in this order from the 5 ′ side,
  • the number of nucleotides in the nucleotide sequence between the start codon and the ORF is 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more)
  • the nucleotide sequence represented by XY in the nucleotide sequence represented by the formula (1) Is 3n + 1 (where n is an integer)
  • the base number of the base sequence between the start codon and the ORF is 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more)
  • the base sequence represented by XY in the base sequence represented by 1) has 3n + 2 (where n is an integer)
  • the number of bases in the base sequence between the start codon and the ORF is 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more),
  • the expression cassette is an expression cassette in which an ORF is arranged in order from the 5 ′ side, a promoter comprising the base sequence represented by formula (1) or formula (2), The promoter is deleted by deletion of the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (1) or adjacent to the 5 ′ side of the base sequence represented by the formula (2).
  • the protein expression method according to Item 10. Item 13.
  • Item 13 A method for producing a protein, comprising a step of recovering the protein expressed by the method according to any one of Items 10 to 12.
  • Step a In order from the 5 ′ side, the formula (1): XYXYX (1) [wherein X and Y represent different base sequences having one or more bases. ] Or formula (2): XYX (2) [wherein X and Y are the same as defined above.]
  • Step b Base sequence represented by the above formula (1) in a transformant contacted with a test substance (test transformant) and a transformant not brought into contact with the test substance (control transformant) Of the nucleotide sequence represented by XY, or the rate of insertion of the nucleotide sequence represented by XY adjacent to the 5 ′ side of the nucleotide sequence represented by the formula (2) (insertion rate)
  • step c when the deletion rate or insertion rate in the test transformant is lower than the deletion rate or insertion rate in the control transformant, the test substance is made drug resistant.
  • a method for screening candidate substances for drug resistance inhibitors comprising Item 15.
  • the expression cassette is an expression cassette in which a promoter, a start codon, a base sequence represented by formula (1) or formula (2), and an ORF are arranged in order from the 5 ′ side, wherein X in the formula (1)
  • the base number of the base sequence shown by -Y is 3n + 1 or 3n + 2 (where n is an integer)
  • the base number of the base sequence shown by XY in the formula (2) is 3p + 1 or 3p + 2 (where p Item 15.
  • Item 17. Item 16.
  • Item 18. In the expression cassette, the base sequence represented by the formula (1) is arranged, The number of nucleotides in the nucleotide sequence between the start codon and the ORF is 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more), and the nucleotide sequence represented by XY in the nucleotide sequence represented by the formula (1) Item 16.
  • Item 19 In the expression cassette, the base sequence represented by the formula (1) is arranged, The number of bases in the base sequence between the start codon and the ORF is 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more), and the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (1) Item 16.
  • the base sequence represented by the formula (2) is arranged, The number of bases in the base sequence between the start codon and the ORF is 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more), and the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (2) Item 16.
  • Item 21 In the expression cassette, the base sequence represented by the formula (2) is arranged, The number of nucleotides in the nucleotide sequence between the start codon and the ORF is 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more), and the nucleotide sequence represented by XY in the nucleotide sequence represented by the formula (2) Item 16.
  • the screening method according to Item 15, wherein the number of bases is 3p + 1.
  • Item 22 When the promoter is deleted in the base sequence represented by XY in the base sequence represented by formula (1) or adjacent to the 5 ′ side of the base sequence represented by formula (2), X Item 17.
  • the screening method according to Item 16 which is a promoter whose transcriptional activity is changed by insertion of a base sequence represented by -Y.
  • Item 23. The screening method according to any one of Items 17 to 22, wherein the ORF is an ORF encoding a drug resistance protein.
  • an expression cassette that enables a novel expression induction system, and a protein expression method using the same.
  • This expression induction system aims at sequential deletion from bacteria where deletion of overlapping direct repeats and non-overlapping sequences occurred, or the XYX sequence was inserted adjacent to the 5 'side of the XYX base sequence. It is a system based on an unprecedented principle that protein expression occurs. Therefore, by using the expression cassette of the present invention, it becomes possible to more efficiently express a protein that could not be expressed efficiently by the conventional expression induction system.
  • the above deletion or insertion occurs naturally by culturing the bacterium containing the expression cassette of the present invention, it is possible to induce the expression simply and efficiently without requiring extra operations. It is.
  • the deletion rate of non-overlapping sequences or the insertion rate of the base sequence indicated by XY is used as an index.
  • Candidate substances for resistance inhibitors can be screened.
  • drug resistance inhibitors can be screened more simply and efficiently by designing the expression cassette so that the expression level and activity of the protein from the expression cassette are changed by the deletion or the insertion.
  • screening can be performed using a suitable bacterium from the viewpoint of ease of handling.
  • the drug-resistant candidate substance selected by the screening method of the present invention can suppress the appearance of drug-resistant strains, thus eliminating the so-called “weasel play” problem of drug development and the emergence of resistant bacteria against it. Can do.
  • An overlapping direct repeat (X-Y-X-Y-X) in the mexT gene is shown.
  • the tac promoter sequence (upper part) in pMMB67EH and the modified promoter sequence (lower part) in pSdmexTCM-24bp in which the spacer region (16 bp) of the tac promoter is replaced with a longer sequence (24 bp) are shown.
  • the construction scheme of the assay plasmid of Example 2 is shown.
  • the analysis result of the influence which transcription efficiency has on deletion efficiency is shown (Example 5).
  • Example 6 which shows the expression of the fluorescent protein by deletion of the non-overlapping sequence of the overlapping direct repeats.
  • a creation phenomenon of overlapping direct repeats is shown (Example 7).
  • the “expression cassette” refers to a DNA region that is introduced into a cell and used for the purpose of expressing the target mRNA in the cell (transformant), or a DNA containing the DNA region is introduced into the cell. Means a DNA region capable of expressing mRNA.
  • extracellular expression cassette or“ isolated expression cassette ”
  • intracellular expression cassette or“intracellular expression cassette”.
  • the extracellular expression cassette may not contain elements such as a promoter and ORF.
  • the extracellular expression cassette preferably has a multicloning site (MCS) so that the above-described elements such as a promoter and ORF can be easily inserted.
  • MCS multicloning site
  • the extracellular expression cassette include a DNA region composed of a promoter, a region encoding a protein tag, and MCS for ORF insertion in various commercially available expression vectors. This DNA region does not contain an ORF, but is used by inserting the ORF into the MCS before introduction into the cell.
  • the extracellular expression cassette includes any protein that can be used for the purpose of expressing mRNA encoding the target protein after being finally introduced into the cell even if the protein cannot be expressed as it is.
  • the intracellular expression cassette is not particularly limited as long as the above definition is applied.
  • the extracellular expression cassette means an intracellular expression cassette as it is.
  • the extracellular expression cassette not containing a promoter is introduced into a cell, and the extracellular expression cassette is incorporated downstream of the promoter in the genomic DNA of the cell, the promoter and the extracellular expression cassette are The combined DNA region means an intracellular expression cassette.
  • Expression cassette (extracellular expression cassette)
  • the present invention relates to the formula (1): XYXYX (1) [wherein X and Y represent different base sequences having one or more bases. ] Or formula (2): XYX (2) [wherein X and Y are the same as defined above.] ] It is related with the expression cassette containing the base sequence shown.
  • This expression cassette is a DNA (extracellular expression cassette) used for the purpose of introducing into a cell and expressing the target mRNA in the cell (transformant).
  • this expression cassette may be referred to as “the extracellular expression cassette of the present invention”.
  • the extracellular expression cassette of the present invention for example, using the frame shift caused by the deletion, or utilizing the change in the transcriptional activity of the promoter caused by the deletion, the target protein Can be induced.
  • X and Y are arbitrary base sequences having one or more bases and different base sequences.
  • the number of bases of X is, for example, 2 to 15, preferably 2 to 12, more preferably 2 to 10, more preferably 3 to 9, more preferably 4 to 8, still more preferably 5 to 7, particularly preferably 6.
  • the number of bases of Y is, for example, 2 to 15, preferably 2 to 12, more preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, more preferably 2 to 4, still more preferably 2 to 3, particularly preferably 2.
  • the combination of the number of X bases and the number of Y bases is preferably such that the number of X bases is 3 to 9 and the number of Y bases In which the number of bases of X is 4 to 8 and the number of bases of Y is 2 to 4, more preferably the number of bases of X is 5 to 7 and A combination having 2 to 3 bases, particularly preferably a combination having 6 bases for X and 2 bases for Y can be used.
  • Specific examples of the base sequence represented by the formula (1) include SEQ ID NOs: 1, 12, 13, 14, and 15. Specific examples of the base sequence represented by the formula (2) include SEQ ID NOs: 22 and 23.
  • the extracellular sequence cassette of the present invention is introduced into a cell and used for the purpose of expressing the target mRNA in the cell (transformant)
  • Other elements may be included. Examples of other elements include promoter, start codon, ORF, MCS, operator region, SD sequence and the like.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a sequence necessary for initiation of transcription, and a known promoter can be employed. Examples thereof include stimuli-responsive promoters such as lac promoter, tac promoter, tet promoter, ara promoter and the like. Deletion efficiency of non-overlapping base sequences of overlapping direct repeats is proportional to the level of transcriptional activity, so it is possible to efficiently cause the above deletion by using a promoter with higher transcriptional activity. . In addition, when a stimuli-responsive promoter is used, the deletion can be induced by adding a substance that makes the promoter respond. By inducing the deletion in this way, it is possible to regulate the expression efficiency of the protein.
  • stimuli-responsive promoters such as lac promoter, tac promoter, tet promoter, ara promoter and the like. Deletion efficiency of non-overlapping base sequences of overlapping direct repeats is proportional to the level of transcriptional activity, so it is possible to efficiently cause the above deletion by using a promoter with higher
  • the ORF is not particularly limited as long as it is an ORF that encodes the target protein to be expressed, and more specifically, as long as a reading frame including a codon composed of 3 bases on the most 5 'side of the ORF encodes the target protein.
  • the codon composed of the 3 bases closest to the 5 'side of the ORF is not limited to the start codon.
  • the start codon only needs to be located 3 'to the transcription start point in the expression cassette and 5' to the ORF.
  • the protein encoded by ORF is not particularly limited, and a desired protein can be adopted.
  • modified proteins of these proteins such as enzyme proteins, structural proteins, transport proteins, storage proteins, contractile proteins, defense proteins, regulatory proteins and the like can be mentioned.
  • the modified protein include a deletion protein in which a partial region is deleted, a protein in which amino acids are partially substituted, and the like.
  • the extracellular expression cassette of the present invention for example, deletion of the base sequence represented by XY in formula (1) or XY on the 5 ′ side of formula (2)
  • Examples include an expression cassette in which a frame shift occurs due to insertion of the indicated base sequence. More specifically, for example, the number of bases of the base sequence represented by XY in formula (1) is 3n + 1 or 3n + 2 (where n is an integer, for example, an integer of 1 to 6), or formula (2 ) Is 3p + 1 or 3p + 2 (where p is an integer), and a start codon is arranged on the 5 ′ side of the base sequence represented by formula (1)
  • An expression cassette may be mentioned.
  • the ORF encoding the target protein (the reading frame including the codon composed of the 3 bases at the 5 ′ most side of the ORF encodes the target protein) is an ORF of the base sequence represented by the formula (1). Inserted (or arranged) on the side.
  • a promoter is inserted (or arranged) on the 5 ′ side of the base sequence represented by the formula (1), more preferably in the order from the 5 ′ side, the promoter, the start codon, and the formula (1).
  • the base sequence shown is arranged.
  • the base sequence that is deleted based on the rule that the non-overlapping portions of the overlapping direct repeats are deleted (the base sequence shown by XY), and the insertion on the 5 ′ side of formula (2)
  • the base sequence (base sequence indicated by XY) is not a multiple of 3, so that the sequence 3 ′ side of the start codon is deleted or the sequence is 3 ′ side of the start codon.
  • the reading frame starting from the start codon is shifted in the middle (frame shift).
  • the base sequence number between the start codon and the ORF is 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more), and the formula
  • the base sequence represented by XY in the base sequence represented by (1) is 3n + 1 and the base sequence represented by formula (2) is arranged, the start codon And the ORF has a base sequence number of 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more), and the base sequence of the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (2) Is 3p + 2 (where p is an integer).
  • m is not particularly limited as long as the ORF is translated.
  • m may be, for example, an integer of 3 to 100, preferably an integer of 3 to 50, more preferably an integer of 3 to 25, and still more preferably an integer of 3 to 15. Since the number of bases between the start codon and the ORF is 3m + 1, the ORF frame shift occurs when the sequence indicated by XY is not deleted or when the sequence indicated by XY is not inserted. Therefore, the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases from the third base from the 5 'end of the ORF.
  • the state shown by XY base number is 3n + 1) arranged between the start codon and ORF is deleted, or the sequence shown by XY (base number is 3p + 2) is inserted
  • the frame shift of the ORF is canceled. Therefore, the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases on the most 5 'side of the ORF.
  • Design 1 a protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases on the 5 ′ most side of the ORF is expressed by deletion or insertion of the base sequence represented by XY. It becomes like this.
  • a planned ORF insertion position such as MCS so that the above design is achieved when the ORF is inserted.
  • the base number of the base sequence between the start codon and the ORF is 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more), and the formula
  • the base sequence represented by XY in the base sequence represented by (1) is 3n + 2 and the base sequence represented by formula (2) is arranged, the start codon And the ORF has a base sequence number of 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more), and the base sequence of the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (2) Is 3p + 1 (where p is an integer).
  • the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases from the second base from the 5 'end of the ORF.
  • a state where the sequence represented by XY (base number is 3n + 2) arranged between the start codon and ORF is deleted, or a sequence represented by XY (base number is 3p + 1) is inserted. In the state, the frame shift of the ORF is canceled.
  • the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases on the most 5 'side of the ORF.
  • a protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases on the 5 ′ most side of the ORF is expressed by deletion or insertion of the base sequence represented by XY. It becomes like this.
  • an expression cassette containing a promoter containing the base sequence represented by formula (1) or formula (2) can be mentioned.
  • this expression cassette there is a base sequence (base sequence represented by XY) that is deleted in the promoter, or a sequence that causes insertion of the base sequence represented by XY (formula (2)) in the promoter. )
  • the deletion or insertion of this sequence changes the promoter structure and changes the transcriptional activity.
  • the base sequence of a promoter element (-35 box, -10 box, other transcription activation elements) important for transcriptional activity due to deletion of the base sequence represented by XY (and the change in the base sequence).
  • transcription activity can be increased by deleting the base sequence represented by XY.
  • the ⁇ 35 box and the ⁇ 10 box are linked via a spacer sequence of about 16 to 19 bp so that transcription is efficiently advanced. Is exemplified. Specifically, the ⁇ 35 box and the ⁇ 10 box are linked via a spacer sequence that is long enough to prevent transcription (for example, 20 bp or more, preferably 24 bp or more) and includes a base sequence represented by the formula (1). If the promoter is designed so that the length of the spacer sequence is about 16 to 19 bp due to deletion of the base sequence represented by XY, the base sequence represented by XY is deleted.
  • transcriptional activity can be enhanced.
  • expression of a protein translated in a reading frame containing a codon composed of the 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF by deletion of the base sequence represented by XY can be made.
  • the extracellular expression cassette of the present invention can be easily obtained according to a known molecular biological technique. For example, it can be prepared using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, and the like.
  • the extracellular expression cassette of the present invention is inserted into a cell for expressing a protein of interest by inserting a promoter, an initiation codon, an ORF encoding the protein of interest, etc., if necessary, and further incorporated into an expression vector. Is done. By using it in this way, for example, by utilizing the frame shift caused by the deletion of the base sequence represented by XY or by the transcriptional activity of the promoter caused by the deletion of the base sequence represented by XY. Using the change, the expression of the target protein can be induced.
  • the present invention comprises, in order from the 5 ′ side, formula (1): XYXYX (1) [wherein X and Y are different base sequences having one or more bases Indicates. ] Or formula (2): XYX (2) [wherein X and Y are the same as defined above.] ]
  • the protein expression method including the process of culture
  • the expression cassette of this method means the intracellular expression cassette contained in a transformant.
  • the expression cassette of the method may be referred to as the “intracellular expression cassette of the present invention”.
  • the “transformant containing an expression cassette” is not particularly limited as long as it is a transformant having the intracellular expression cassette of the present invention on the genome or outside the genome (for example, on a plasmid).
  • the “transformant containing an expression cassette” refers to the extracellular expression cassette of the present invention, in which a promoter, an initiation codon, an ORF encoding a target protein, etc. are inserted as necessary, and further incorporated into an expression vector. It can be obtained by introducing into a cell for expression.
  • bacteria derived from transformants include Gram-negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Serratia, Sphingomonas) Bacteria, Brucella, Neisseria gonorrhoeae, Burkholderia, Shigella, Salmonella, Acinetobacter, Vibrio choleritis, Klebsiella pneumoniae, Legionella, Helicobacter pylori, Campylobacter, etc. , Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, etc.) can be widely used regardless of the type.
  • Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Serratia, Sphingomonas
  • Bacteria Bacteria, Brucella, Neisseria gonorrhoeae, Burkholderia, Shigella, Salmonella, Acinetobacter, Vibrio choleritis, Klebsiella pneumoniae, Legionella
  • Gram-negative bacteria and the like are preferable, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Serratia bacteria, Sphingomonas, and the like are more preferable, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and the like are more preferable, and still more preferable. Is E. coli.
  • the conditions for the culture are not particularly limited as long as deletion or insertion of the base sequence represented by XY occurs in the intracellular expression cassette of the present invention.
  • it can be performed according to a known method according to the type of organism from which the transformant is derived.
  • a method of shaking culture at about 30 to 40 ° C. in an LB liquid medium can be mentioned.
  • the culture time is not particularly limited as long as the above deletion occurs.
  • the culture time may be, for example, about 6 to 36 hours, preferably about 10 to 24 hours.
  • the protein can be produced by recovering the target protein expressed by the above method (a protein translated in a reading frame including a codon composed of 3 bases on the 5 ′ most side of the ORF).
  • Collection can be performed according to a known method.
  • a solution containing the target protein can be obtained by collecting transformants expressing the target protein and dissolving the transformant in an appropriate solution. Thereafter, a target protein with higher purity can be obtained through various purifications such as chromatography.
  • a bacterium in which a sequence of overlapping direct repeats that has not been overlapped or a XYX sequence adjacent to the 5 ′ side of the XYX sequence is inserted from the bacterium.
  • the protein can be expressed by an unprecedented expression induction system in which expression of the target protein occurs. Therefore, by this method, it becomes possible to more efficiently express a protein that could not be expressed efficiently by the conventional expression induction system.
  • the present invention relates to a method for screening candidate substances for drug resistance inhibitors comprising steps a, b and c.
  • Step a in order from the 5 ′ side, the formula (1): XYXYX (1) [wherein X and Y represent different base sequences having one or more bases. ] Or formula (2): XYX (2) [wherein X and Y are the same as defined above.] ] A step of bringing a transformant containing an expression cassette in which an ORF is placed and a test substance into contact with each other.
  • the expression cassette in step a is an intracellular expression cassette contained in the transformant.
  • the base sequence represented by the formula (1) or the formula (2) and the ORF are arranged in order from the 5 'side. Both may be directly connected or may be connected via an arbitrary base sequence.
  • the ORF is not particularly limited as long as it is an ORF that encodes a protein, and more specifically, as long as an open reading frame including a codon composed of 3 bases on the most 5 'side of the ORF encodes a protein.
  • the codon composed of the 3 bases closest to the 5 'side of the ORF is not limited to the start codon.
  • the start codon only needs to be located 3 'to the transcription start point in the expression cassette and 5' to the ORF.
  • the protein encoded by ORF is not particularly limited, and examples thereof include modified proteins of these proteins, such as fluorescent proteins, enzyme proteins, structural proteins, transport proteins, storage proteins, contraction proteins, defense proteins, and regulatory proteins.
  • modified proteins include a deleted protein in which the N-terminal region that does not affect the function of the protein is deleted, or a protein whose function is improved (modified) by partial substitution of the amino acid.
  • Etc. The protein encoded by the ORF is preferably a reporter protein and a drug resistant protein from the viewpoint that the measurement of the deletion rate in the below-mentioned step b can be performed more simply and efficiently.
  • the reporter protein is not particularly limited as long as it is a protein that reacts with a specific substrate to emit light (color development) or a protein that emits fluorescence by excitation light.
  • Specific examples include fluorescent proteins such as GFP, ⁇ -galactosidase, luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, ⁇ -glucuronidase, and the like.
  • a fluorescent protein is preferably used from the viewpoint that the measurement of the deletion rate in the step b described later can be performed more simply and efficiently.
  • the drug resistant protein is not particularly limited as long as it can impart resistance to a drug such as an antibacterial drug to cells expressing the protein.
  • a protein encoded by a chloramphenicol resistance gene chloramphenicol resistance gene
  • tetracycline resistance gene tetracycline resistance protein
  • Neomycin resistance protein a protein encoded by a neomycin resistance gene
  • erythromycin resistance gene erythromycin resistance gene
  • spectinomycin resistance gene spectinomycin resistance gene
  • kanamycin resistance gene kanamycin resistance gene
  • the expression cassette in step a may contain other elements other than the base sequence represented by the formula (1) or the formula (2) and the ORF as necessary in order to express mRNA from the expression cassette.
  • other elements include a promoter, a start codon, MCS, an operator region, and an SD sequence.
  • a promoter is included.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a sequence necessary for initiation of transcription, and a known promoter can be employed. For example, tac promoter, tet promoter, ara promoter and the like can be mentioned.
  • the ORF does not include a start codon, it is preferable to include the start codon on the 5 'side of the ORF as another element.
  • the expression level or activity (fluorescence activity etc.) of the protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF is represented by the formula ( Examples thereof include an expression cassette that changes due to deletion of the base sequence represented by XY in 1) or insertion of the base sequence represented by XY on the 5 ′ side of Formula (2).
  • a protein that is translated in a reading frame containing a codon composed of 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF with the deletion rate or insertion rate of the base sequence represented by XY Can be evaluated using the expression level or activity (fluorescence activity, etc.) as an index.
  • the protein translated in the reading frame containing the codon composed of the 3 bases on the most 5 'side of the ORF is a fluorescent protein or a drug resistant protein
  • the amount of fluorescence and the appearance rate of the drug resistant strain are measured.
  • the deletion rate or insertion rate of the base sequence represented by XY can be measured more easily.
  • the base sequence represented by XY is deleted or inserted to cause a frame shift of the ORF, and it is composed of 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF.
  • a mode (mode 3) in which a protein translated in a reading frame including a codon is expressed (or is not expressed) is exemplified.
  • Another example is an embodiment (embodiment 4) in which the transcription amount from the expression cassette is changed by deletion or insertion of the base sequence represented by XY.
  • modes 3 to 5 will be described in detail.
  • Aspect 3 of the expression cassette in step a is an expression cassette in which a promoter, a start codon, a base sequence represented by formula (1) or formula (2), and an ORF are arranged in this order from the 5 ′ side.
  • the base sequence represented by XY is 3n + 1 or 3n + 2 (where n is an integer, for example, an integer of 1 to 6), or the base sequence represented by XY in formula (2) Is an expression cassette having 3p + 1 or 3p + 2 (where p is an integer).
  • a base sequence (base sequence indicated by XY) that is deleted based on the rule that the overlapping portion of the overlapping direct repeats is deleted, and on the 5 ′ side of the formula (2) Since the number of bases to be inserted (the base sequence shown by XY) is not a multiple of 3, deletion or insertion of this sequence shifts the reading frame of the ORF (ie, frame shift occurs). For this reason, the protein expressed from an expression cassette changes with the presence or absence of this sequence deletion or insertion. Utilizing this, in aspect 3, for example, by designing an expression cassette as shown in Designs 3 to 5 below, the expression cassette is translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF. The protein can be expressed (or not expressed) by deletion or insertion of the base sequence represented by XY.
  • Design 3 is a design in which the number of bases in the base sequence between the start codon and the ORF is 3 m (where m is an integer of 3 or more). Note that m is not particularly limited as long as the ORF is translated. m may be, for example, an integer of 3 to 100, preferably an integer of 3 to 50, more preferably an integer of 3 to 25, and still more preferably an integer of 3 to 15. Since the number of bases between the start codon and ORF is 3 m, the ORF frame shift does not occur when the sequence indicated by XY is not deleted or when the sequence indicated by XY is not inserted. Therefore, the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases on the most 5 'side of the ORF.
  • the state indicated by XY base number is 3n + 1 or 3n + 2) arranged between the start codon and ORF is deleted, or XY (base number is 3p + 1 or 3p + 2) is inserted
  • the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of 2 bases from the 5 'end of the ORF or 3 bases from the 3rd base.
  • a protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases on the 5 ′ most side of the ORF is expressed by deletion or insertion of the base sequence represented by XY. Disappear.
  • the base sequence represented by the formula (1) when the base sequence represented by the formula (1) is arranged, the base sequence number between the start codon and the ORF is 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more), and the formula
  • the base sequence represented by XY in the base sequence represented by (1) is 3n + 1 and the base sequence represented by formula (2) is arranged, the start codon And the ORF has a base sequence number of 3m + 1 (where m is an integer of 3 or more), and the base sequence of the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (2) Is 3p + 2 (where p is an integer).
  • the ORF frame shift occurs when the sequence indicated by XY is not deleted or when the sequence indicated by XY is not inserted. Therefore, the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases from the third base from the 5 'end of the ORF.
  • the state shown by XY base number is 3n + 1) arranged between the start codon and ORF is deleted, or the sequence shown by XY (base number is 3p + 2) is inserted In the state, the frame shift of the ORF is eliminated.
  • the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases on the most 5 'side of the ORF.
  • a protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF is expressed by deletion or insertion of the base sequence represented by XY. It becomes like this.
  • the base sequence represented by the formula (1) when the base sequence represented by the formula (1) is arranged, the base sequence number between the start codon and the ORF is 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more), and the formula
  • the base sequence represented by XY in the base sequence represented by (1) is 3n + 2 and the base sequence represented by formula (2) is arranged, the start codon And the ORF has a base sequence number of 3m + 2 (where m is an integer of 3 or more), and the base sequence of the base sequence represented by XY in the base sequence represented by the formula (2) Is 3p + 1 (where p is an integer).
  • the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases from the second base from the 5 'end of the ORF.
  • a state where the sequence represented by XY (base number is 3n + 2) arranged between the start codon and ORF is deleted, or a sequence represented by XY (base number is 3p + 1) is inserted. In the state, the frame shift of the ORF is eliminated.
  • the reading frame of the ORF in this state is a reading frame including a codon composed of three bases on the most 5 'side of the ORF.
  • a protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases on the 5 ′ most side of the ORF is expressed by deletion or insertion of the base sequence represented by XY. It becomes like this.
  • Example 4 of the expression cassette in step a includes an expression cassette in which the promoter and ORF including the base sequence represented by formula (1) or formula (2) are arranged in this order from the 5 'side.
  • this expression cassette there is a base sequence (base sequence represented by XY) that is deleted in the promoter, or a sequence that causes insertion of the base sequence represented by XY (formula (2)) in the promoter. ) Is present, the deletion or insertion of this sequence changes the promoter structure and changes the transcriptional activity.
  • a promoter designed such that the base sequence represented by XY constitutes all or part of a promoter element important for transcriptional activity (-35 box, -10 box, other transcriptional activation elements).
  • transcription activity can be reduced by deletion of the base sequence represented by XY.
  • the ⁇ 35 box and the ⁇ 10 box are linked via a spacer sequence of about 16 to 19 bp so that transcription is efficiently advanced.
  • the ⁇ 35 box and the ⁇ 10 box are linked via a spacer sequence that is long enough to prevent transcription (for example, 20 bp or more, preferably 24 bp or more) and includes a base sequence represented by the formula (1).
  • the promoter is designed so that the length of the spacer sequence is about 16 to 19 bp due to deletion of the base sequence represented by XY, the base sequence represented by XY is deleted. By doing so, transcriptional activity can be enhanced. Utilizing such a change in transcriptional activity, expression of a protein translated in a reading frame containing a codon composed of the 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF by deletion of the base sequence represented by XY (Or prevent it from appearing).
  • Example 5 of the expression cassette in step a includes an expression cassette in which an ORF including a promoter and a base sequence represented by formula (1) or formula (2) is arranged in this order from the 5 'side.
  • this expression cassette there is a base sequence (base sequence indicated by XY) that is deleted in the ORF, or a sequence that causes insertion of the base sequence indicated by XY in the ORF (formula (2)) ),
  • the deletion or insertion of this sequence changes the activity of the protein encoded by the ORF. This change in activity may occur without a frame shift. For example, it is known that fluorescence activity disappears when an amino acid is inserted into a specific site in a fluorescent protein such as EGFP.
  • the “transformant containing an expression cassette” in step a is not particularly limited as long as it is a transformant having the expression cassette on the genome or outside the genome (for example, on a plasmid).
  • Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Serratia, Sphingomonas
  • Bacteria Brucella, Neisseria gonorrhoeae, Burkholderia, Shigella, Salmonella, Acinetobacter, Vibrio choleritis, Klebsiella pneumoniae, Legionella, Helicobacter pylori, Campylobacter, etc.
  • Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, etc. can be widely used regardless of the type.
  • Gram negative bacteria etc.
  • Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Serratia bacteria, Sphingomonas etc. are mentioned more preferably, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli etc. are mentioned more preferably.
  • a transformant containing an expression cassette can be easily obtained according to a known molecular biological technique. For example, it can be obtained by introducing an extracellular expression cassette prepared using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technique, etc. into bacteria according to a known method.
  • the test substance is not particularly limited.
  • it may be a compound such as a low molecular compound or a high molecular compound (including biopolymer compounds such as peptides, proteins and sugar chains).
  • the composition which mixed not only the refined compound but various compounds, and the extract of animals and plants can also be used.
  • the method for bringing the transformant containing the expression cassette into contact with the test substance may be any method as long as they are in contact with each other.
  • a typical example is a method of mixing a test substance with a solution containing a transformant containing an expression cassette (such as a culture solution).
  • the transformant containing the expression cassette After such contact, it is preferable to further culture the transformant containing the expression cassette.
  • the deletion rate of the base sequence represented by XY in the expression cassette is increased. Accordingly, it is easy to detect a decrease in the deletion rate due to the test substance.
  • Culturing can be performed according to a known method according to the type of organism from which the transformant is derived. For example, in the case of Escherichia coli, a method of shaking culture at about 30 to 40 ° C. in an LB liquid medium can be mentioned.
  • the culture time is not particularly limited, but may be, for example, 6 to 36 hours, preferably about 10 to 24 hours.
  • Step b is a base sequence represented by the formula (1) in a transformant contacted with a test substance (test transformant) and a transformant not brought into contact with the test substance (control transformant) Of the nucleotide sequence represented by XY, or the rate of insertion of the nucleotide sequence represented by XY adjacent to the 5 ′ side of the nucleotide sequence represented by the formula (2) (insertion rate) ).
  • the test transformant is a transformant containing the expression cassette brought into contact with the test substance in the above step a.
  • a control transformant is a transformant containing the expression cassette not contacted with a test substance.
  • the control transformant is preferably subjected to the same treatment as the test transformant except that it is not contacted with the test substance.
  • the method for measuring the deletion rate or insertion rate of the base sequence represented by XY is not particularly limited as long as it can evaluate the change in the deletion rate or insertion rate due to contact with the test substance.
  • the following method is mentioned. First, the test transformant group and the control transformant group (transformants in which the base sequence represented by XY is deleted or inserted, and the sequence is not deleted) Alternatively, DNA containing an expression cassette is extracted from a mixture of inserted transformants) and digested with an appropriate restriction enzyme. Next, this digested fragment is developed on a gel by electrophoresis.
  • a band on the gel that appears due to deletion or insertion of the base sequence indicated by XY (a band of digested fragments shortened or lengthened by the number of bases of the base sequence indicated by XY)
  • the ratio of transformants in which the base sequence represented by XY is deleted or inserted in the population of transformants, that is, the deletion rate or the insertion rate can be measured. it can.
  • the expression level of a protein translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF is used as the expression cassette of step a.
  • an expression cassette that changes due to deletion
  • the deletion rate can be measured more easily using the expression level as an index.
  • the following method is mentioned. First, from each of the test transformant group and the control transformant group, a fraction containing a protein to be translated in an open reading frame containing a codon composed of 3 bases on the 5 ′ most side of the ORF is extracted. Next, this fraction is developed on a gel by electrophoresis, and then Western blotting is performed with an antibody capable of specifically detecting the protein. Finally, by measuring the intensity of the band detected by Western blotting, the proportion of transformants in which the base sequence represented by XY has been deleted or inserted in the population of transformants, that is, lacking. Loss rate or insertion rate can be measured.
  • the protein translated in the reading frame containing the codon composed of the 3 bases at the most 5 ′ side of the ORF is a fluorescent protein or a drug resistant protein
  • the amount of fluorescence or the appearance of a drug resistant strain appears.
  • the deletion rate or insertion rate of the base sequence represented by XY can be measured more easily.
  • the measurement can be performed as follows. First, each of the test transformant population and the control transformant population is plated on a solid medium (such as an agar medium) containing a drug. Next, by measuring the number of colonies (drug resistant strains) appearing on the medium, the proportion of transformants in which the base sequence represented by XY is deleted or inserted in the population of transformants That is, the deletion rate or insertion rate can be measured.
  • DNA extraction DNA extraction, restriction enzyme digestion, electrophoresis, protein extraction, western blotting, acquisition of drug resistant strains and measurement of the number thereof
  • Techniques used for the above-described deletion rate or insertion rate measurement method can be performed according to known methods. it can.
  • Process c Step c selects the test substance as a drug resistance inhibitor candidate substance when the deletion rate or insertion rate in the test transformant is lower than the deletion rate or insertion rate in the control transformant. It is a process.
  • Judgment on whether or not “low” may be made based on a certain standard, for example, a statistical standard. Specifically, a method of determining a significant difference when the p value is obtained by measuring a plurality of times and the p value is not more than a certain value, for example, not more than 0.05, may be mentioned. As a result of the determination, if there is a significant difference, the test substance is selected.
  • a certain standard for example, a statistical standard. Specifically, a method of determining a significant difference when the p value is obtained by measuring a plurality of times and the p value is not more than a certain value, for example, not more than 0.05, may be mentioned. As a result of the determination, if there is a significant difference, the test substance is selected.
  • the test substance selected in step c is a phenomenon of “deletion of overlapping direct repeat non-overlapping sequence (base sequence shown by XY)” which is the cause of drug resistance, or XY— Since it is a substance selected using as an index the inhibition of the rule that a base sequence represented by XY is inserted adjacent to the 5 ′ side of the sequence X and an overlapping direct repeat is created, drug resistance It is useful as a candidate substance for inhibitor of anti-oxidation, particularly as a candidate substance for inhibiting drug resistance of Pseudomonas aeruginosa.
  • the obtained drug resistance inhibitor candidate substance may be further subjected to screening for drug resistance inhibitors.
  • Example 1 Analysis of drug resistance mechanism
  • the NfxC type mutant strain which is a drug resistant bacterium, expresses an RND type drug efflux pump (MexEF-OprN), and as a result, it is known to acquire drug resistance performance.
  • the ORF of the mexT gene is deleted by 8 bp and the frame is shifted, and the active MexT protein (transcription factor) expressed as a result activates the expression of the RND type drug efflux pump ( Non-patent document 2).
  • the pMMB67EH vector was modified so that the chloramphenicol resistance gene was inserted into the MCS of the vector and the PsiI site was introduced into the promoter region of the gene (the plasmid name after modification was “pSCm” ).
  • the pSCm vector is cleaved at the Psi I site, and a synthetic nucleic acid is inserted into the cleaved site using In-fusion HD Cloning Kit (Clontech), so that the ⁇ 35 of the tac promoter upstream of the chloramphenicol resistance gene.
  • the spacer region between the box and the -10 box was modified so as to be a 24 bp sequence (Sequence 1: Table 1) in which 2 bp (CT) was added to the 22 bp direct repeat of the mexT gene (Fig. 2, Table 1).
  • the modified plasmid name is “pSdmexTCM-24bp”).
  • the spacer region is a sequence in which the non-overlapping sequence (CGGCCAGC) in the direct repeat overlapped in sequence 1 is deleted (sequence 2 (16 bp): Table 1).
  • E. coli introduced with pSdmexTCM-24bp had extremely low resistance to chloramphenicol, while E. coli introduced with pSdmexTCM-16bp, 17bp, and 18bp acquired resistance.
  • Escherichia coli into which pSdmexTCM-24bp was introduced was inoculated into 5 ⁇ mL of a liquid medium (1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM mM IPTG), and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • a liquid medium 1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM mM IPTG
  • the culture solution was diluted to 1/100, and 100 ⁇ L of the diluted solution was added to agar medium containing chloramphenicol (10 ⁇ g / mL chloramphenicol, 1.5% agar, 1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ IPTG) and control agar medium (chloramphenicol-containing agar medium without chloramphenicol, or 50 ⁇ g / mL CAR instead of chloramphenicol) Having a composition containing) and culturing at 37 ° C. for 22 hours.
  • chloramphenicol 10 ⁇ g / mL chloramphenicol, 1.5% agar, 1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ IPTG
  • control agar medium chloramphenicol-containing agar medium without chlor
  • the appearance frequency of the chloramphenicol resistant strain was calculated from the number of colonies that appeared in each of the chloramphenicol-containing agar medium and the control agar medium. Furthermore, 100 colonies were picked up at random, and FASMAC was requested to sequence DNA extracted from the colonies according to a standard method, and the sequence between -35 box and -10 box was determined.
  • chloramphenicol resistant strains appeared at a frequency of 1.28 ⁇ 10 ⁇ 3 %.
  • sequence between the -35 box and the -10 box is sequence 2 in all 100 colonies, that is, a sequence in which the non-overlapping sequence (CGGCCAGC) in the direct repeat overlapped in the original sequence (sequence 1) is deleted. Met. From the above, it was shown that there is a rule that if there are overlapping direct repeats, the non-overlapping sequences are deleted.
  • DH5 ⁇ introduced with pSdmexTCM-24bp in Table 2 does not show resistance to chloramphenicol, the above deletion is caused by liquid culture of E. coli introduced with pSdmexTCM-24bp. It was suggested that this was a natural occurrence.
  • Example 2 Preservability in the general bacteria of the rule that the overlapping non-overlapping sequences of the direct repeats are deleted It was investigated whether the law shown in Example 1 above occurs in general bacteria. Specifically, it was performed as follows.
  • an assay plasmid was constructed according to the scheme shown in FIG. From the 5 ′ side, GAATTC (EcoR I site), 19 bp sequence (CCTGGAAACGAGGAACGCC), and the sequence from the start codon of the mexT gene derived from the genomic DNA of Pseudomonas aeruginosa wild strain to the sal I site of the gene (SEQ ID NO: 6) (Including overlapping direct repeats) linked to the sequence (fragment 1) and from the 5 'side, GTCGAC (Sal I site), one codon from the codon next to the ORF start codon of the chloramphenicol resistance gene
  • the sequence up to the previous codon, the sequence encoding 6 ⁇ His tag, TAA (termination codon), and the sequence linked to AAGCTT (Hind site III) (fragment 2) are the MCS EcoR site of pMMB67EH vector and Using the Hind ⁇ III site and the Sal I site at the 3 ′ end of fragment 1 and the Sal I
  • Escherichia coli or Serratia fungus assay vector obtained above was treated with EcoR I and Hind III to cut out the ligation sequence of fragment 1 and fragment 2, and the ligation sequence was introduced into MCS of pVLT33 (Sphingomonas bacterium). Assay vector).
  • Escherichia coli or a Serratia bacteria assay vector was introduced into Escherichia coli according to a conventional method.
  • the bacteria were inoculated into 5 ml of a liquid medium (1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 1 mM mM IPTG) and cultured at 37 ° C. for 16 hours. Dilute the culture to 1/1000, and add 100 ⁇ L of the diluted solution to an agar medium containing chloramphenicol (5 ⁇ g / mL chloramphenicol, 1.5% agar, 1% Tryptone, 0.5% Yeast on a 10 cm dish.
  • chloramphenicol 5 ⁇ g / mL chloramphenicol, 1.5% agar, 1% Tryptone, 0.5% Yeast on a 10 cm dish.
  • chloramphenicol-containing agar medium excluding chloramphenicol, or replaced with chloramphenicol contains 50 ⁇ g / mL CAR And cultured at 37 ° C. for 22 hours.
  • Example 1 If the law shown in Example 1 is preserved in each bacterium, an 8-bp deletion should occur during culture of the bacterium, and a chloramphenicol resistant strain should appear.
  • overlapping direct repeat is a sequence ⁇ ′ (6 bases) in which an arbitrary sequence ⁇ (8 bases or more) (for example, ABCDEFGH) is followed twice and then the 3 ′ base of ⁇ is deleted.
  • ⁇ ′ (6 bases)
  • ⁇ 8 bases or more
  • ⁇ 3 ′ base of ⁇
  • Table 3 shows the search results.
  • Example 4 Analysis of Overlapping Direct Repeats Derived from Various Organisms It was examined whether or not deletion of non-overlapping sequences occurred from the overlapping direct repeats found in Example 3. Specifically, it was performed as follows.
  • an assay plasmid was constructed. From the 5 ′ side, GAATTC (EcoR ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ I site), 19 bp sequence (CCTGGAAACGAGGAACGCC), start codon, CTGCAG (PstI site), GCGGCCGC (Not I site), GTCGAC (Sal I site), a sequence from the codon next to the start codon of the ORF of the chloramphenicol resistance gene to the codon before the end codon, a sequence encoding 6 ⁇ His tag, A sequence in which TAA (end codon) and AAGCTT (Hind III site) were linked was obtained.
  • This sequence was inserted between the EcoR I site and Hind III site of MCS of the pMMB67EH vector using a restriction enzyme site.
  • the obtained vector (pLCM) was cleaved with Pst I and Sal I, and from there, CTGCAG (Pst I site), any of sequences 5 to 9 in Table 4 below, and GTCGAC (Sal I site)
  • CTGCAG Pst I site
  • GTCGAC Sac II site
  • the ORF of the chloramphenicol resistance gene of the expression cassette is not translated in a normal reading frame, but overlapped in sequences 5 to 9 If a frameshift occurs due to deletion of a non-overlapping sequence (8 bp), the ORF of the chloramphenicol resistance gene is translated in a normal reading frame.
  • the assay plasmid was introduced into E. coli according to a conventional method.
  • the E. coli was plated and cultured on a chloramphenicol-containing agar medium in the same manner as in Example 1.
  • the frequency of appearance of the chloramphenicol resistant strain was calculated from the number of colonies that appeared after the cultivation (colony of chloramphenicol resistant strain).
  • 10 colonies were picked up at random, and DNA extracted from the colonies according to a conventional method was sequenced to identify the deleted sequence.
  • the appearance frequency of resistant strains is as shown in Table 5.
  • the non-overlapping sequence (sequence indicated by the underline of “Sequence” in Table 4) in the overlapping direct repeats was deleted in all colonies. From the above, it has been shown that even in the case of overlapping direct repeats derived from various organisms, deletion of non-overlapping sequences occurs in the same manner as the repeats derived from the mexT gene.
  • Example 5 Analysis of the effect of transcriptional activity on deletion efficiency The effect of transcriptional activity on deletion efficiency was analyzed. Specifically, it was performed as follows.
  • IPTG 1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0
  • Example 6 Expression of fluorescent protein by deletion of non-overlapping sequences of overlapping direct repeat An assay plasmid was obtained. Specifically, it was performed as follows.
  • MCS (SEQ ID NO: 18) of pEGFP-C3 (Clontech) was removed by inverse PCR, and a 9-bp sequence (agcggccgc) containing NotI site was inserted at the position where MCS was removed. Insert a sequence consisting of tgaccaccc from the 5 'side adjacent to the upstream of the 14 bp sequence (SEQ ID NO: 19) in the EGFP ORF, and combine the 14 bp sequences together to overlap the direct repeat (SEQ ID NO: 20). Created. The EGFP ORF thus modified was cloned into pMMB67EH at the EcoR I-Hind III site.
  • the 9-bp sequence (tgaccaccc) is inserted into the EGFP ORF of the above-described assay plasmid.
  • EGFP expressed from the ORF has collapsed the three-dimensional structure of the active center and thus does not show fluorescence.
  • the non-overlapping sequence (9 bp) in the overlapping direct repeat (SEQ ID NO: 20) created by the insertion of the 9 bp sequence is deleted, normal EGFP protein is expressed.
  • Pseudomonas aeruginosa into which the assay plasmid was introduced was inoculated in 5 mL of a liquid medium (1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2 mM IPTG, pH 7.0) and cultured at 37 ° C. for 14 hours. Dilute the culture to 1 / 100,000 and add 100 ⁇ L of the diluted solution to an agar medium (1.5% agar, 1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2 mM IPTG, pH 7.0) on a 10 cm dish. And cultured at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, the dish was observed with a blue LED transilluminator (Optbord, LEDB-SBOXH) (excitation wavelength: 470 nm, using the attached orange filter).
  • a blue LED transilluminator Optbord, LEDB-SBOXH
  • Example 7 Discovery of the creation of overlapping direct repeats
  • non-overlapping sequences in the overlapping direct repeats are deleted and the active MexT protein is expressed.
  • strains that do not show the NfxC type phenotype In such strains, it has been clarified that the MexS protein suppresses the active MexT protein and exhibits a wild type phenotype.
  • NfxC type mutants appeared from the clinical isolates as described above by further mutation. Specifically, it was performed as follows.
  • the above clinical isolates (8380 strains: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol.39, No.3, p645-649, and 1995.) in liquid medium (1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0) And inoculated at 37 ° C. for 15 hours. Plate 100 ⁇ L of the culture solution on an agar medium (1.5% agar, 1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 800 ⁇ g / mL chloramphenicol, pH 7.0) at 37 ° C For 20 hours. Since NfxC type mutants are highly resistant to chloramphenicol, the colonies obtained by this culture are considered to be NfxC type mutants that emerged from the above clinical isolates.
  • NfxC type mutants appeared at a rate of 2.1 ⁇ 10 ⁇ 5 %.
  • all of the NfxC type mutants showed mutations in the mexS gene. This revealed that MexS was mutated and could not suppress the functional MexT, so that the MexEF-OprN drug efflux pump was expressed, indicating an NfxC type phenotype.

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Abstract

　本発明は、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む新規発現カセット、並びにこれを用いた発現誘導システム、及び薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法を提供する。

Description

発現カセット
　本発明は、新規発現誘導システムを可能にする発現カセット、並びにこれを利用したタンパク質の発現方法、及び薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
　現在、多様な分野において組換えタンパク質の発現技術が利用されている。例えば、医薬分野においては、インスリン等のタンパク質製剤を、大腸菌や酵母に導入した遺伝子から発現させることによって生産している。また、抗体作製、タンパク質の機能解析、タンパク質の立体構造解析等に用いられるタンパク質の調製にも、組換えタンパク質の発現技術が利用されている。
　ただ、目的タンパク質を例えば大腸菌等の細菌内で発現させる場合、該タンパク質の機能により細胞の増殖が阻害され、結果として効率的に目的タンパク質を得られないことがある。したがって、通常、ある程度細菌が増殖した段階で目的タンパク質の発現が誘導されるようなシステムを利用する（非特許文献1）。
　例えば、細菌の対数増殖期にIPTGを添加することにより、IPTG応答性のプロモーター（lacプロモーター等）を活性化させ、タンパク質の発現を誘導するというシステムが知られている。また、別の例としては、2種類の炭素源を含む培地で培養することによって、細菌の増殖に伴う利用炭素源の切替えによってタンパク質の発現が誘導されるというシステムが知られている。
　上記各種発現誘導システムそれぞれは、その原理が異なるが故に、発現の誘導時期、誘導される細菌の割合、発現誘導が細菌の増殖に与える影響等が異なる。例えば、IPTGによる発現誘導システムは、IPTG添加により培養中の細菌全てにおいて一斉にタンパク質の発現が誘導されるので、誘導が比較的急激に起こる。また、利用炭素源の切り替えによる発現誘導システムは、利用炭素源の切り替えが起こった細菌から順次タンパク質の発現が誘導されるので、誘導が比較的緩やかに起こる。このような各発現誘導システムの特徴は、目的タンパク質の最終的な収率や、変性しない状態で回収できるか等に影響を与えると考えられる。
　一方、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、自然環境中に存在する常在菌であり、日和見感染症の原因菌である。消毒剤や抗生物質等の薬剤に対する抵抗性が元来高いことが知られており、このため、緑膿菌に対して抗菌効果を発揮する薬剤の種類は、他の細菌に比べて少ない。具体的には、ペニシリンやセフェム系などのβラクタム系抗菌薬は、緑膿菌に対しては抗菌効果を発揮しないことが知られている。
　緑膿菌は、薬剤への曝露により容易に高度に耐性化することが知られている。例えば、野生株には抗菌効果を発揮するニューキノロン系抗菌薬、クロラムフェニコール、イミペネム等に対して耐性を示す変異株の存在、さらにはこれらの3種の抗菌薬全てに対して耐性を示す多剤耐性株（NfxC型変異株）の出現が問題となっている。このような薬剤の開発とそれに対する耐性菌の出現といういわゆる“イタチごっこ”の問題は、元来有効な薬剤が少ない緑膿菌においては極めて深刻な問題である。
　NfxC型変異株は、欧米人の2500人に1人が有する遺伝病である嚢胞性線維症（CF:Cystic Fibrosis）の患者からしばしば分離される耐性菌の1つである。NfxC型変異株は、RND型薬剤排出ポンプ（MexEF-OprN）を発現しており、その結果薬剤耐性能を獲得することが知られている。該変異株においては、mexT遺伝子のORFが8 bp欠失してフレームシフトしており、その結果発現する活性型MexTタンパク質（転写因子）が、RND型薬剤排出ポンプの発現を活性化している（非特許文献2）。
　しかしながら、該8 bpの欠失がランダムに起こる欠失によるものなのか否かについては全く知られていなかった。さらに、何らかの配列が関与しているとしても、該8 bpの欠失にどのような配列が寄与しているのか、該欠失が他の生物でも起こる現象なのか、さらには該欠失に寄与する配列を有してさえいれば欠失が起こるのか等の、薬剤耐性化機構の詳細については全く知られていなかった。
東端啓貴、「大腸菌を宿主とした異種タンパク質高発現のイロハ」、生物工学 第91巻2号 第96～100頁 FEMS Microbiology Letters, Vol.192, Issue.1, 2000, pp107-112
　本発明は、新規発現誘導システムを提供することを目的とする。さらには、該システムを利用したタンパク質の発現方法を提供することも目的とする。
　また、本発明は、薬剤の開発とそれに対する耐性菌の出現といういわゆる“イタチごっこ”の問題を解消するために、薬剤耐性化抑制剤候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。さらには、該スクリーニングをより簡便且つ効率的に行う方法を提供することをも目的とする。
　本発明者等は、細菌の薬剤耐性化機構について解析していたところ、驚くべきことに、細菌一般においては、X-Y-Xという配列とX-Y-Xという配列がXにおいて重なり合った配列（X-Y-X-Y-X；以下、このような配列を「重なり合ったダイレクトリピート」と示すこともある）中の重なっていない配列（X-Y）が欠失するという法則が存在することを見出した。また、X-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入され、重なり合ったダイレクトリピートが創出されるという法則が存在することをも見出した。さらに、重なり合ったダイレクトリピート又はX-Y-Xという配列を含む発現カセットを用いることにより、例えば上記欠失又は挿入により引き起こされるフレームシフトを利用して、又は上記欠失又は挿入により引き起こされるプロモーターの転写活性の変化、又は上記欠失又は挿入により引き起こされるアミノ酸の欠失又は挿入を利用して、目的タンパク質の発現誘導が可能であることを見出した。
　さらに、上記欠失又は挿入は薬剤耐性化の原因であったことから、上記欠失又は挿入を阻害することを指標として、薬剤耐性化抑制剤の候補物質をスクリーニングできることが明らかとなった。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．
式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む発現カセット。
項２．
前記式（１）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、項１に記載の発現カセット。
項３．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に開始コドンが配置されている、項１又は２に記載の発現カセット。
項４．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側にプロモーターが配置されている、項１～３のいずれかに記載の発現カセット。
項５．
５’側から順に、プロモーター、開始コドン、前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列が配置されている、項１～４のいずれかに記載の発現カセット。
項６．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列を含むプロモーターを含む、項１に記載の発現カセット。
項７．
前記プロモーターが刺激応答性プロモーターである、項４～６のいずれかに記載の発現カセット。
項８．
前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の３’側にＯＲＦが配置されている、項１～７のいずれかに記載の発現カセット。
項９．
項１～８のいずれかに記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
項１０．
５’側から順に、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む形質転換体を培養する工程を含むタンパク質発現方法。
項１１．
前記発現カセットが５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、
式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１（ただし、ｎは整数）であるか、或いは
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、
式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるか、或いは
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）である、
項１０に記載のタンパク質発現方法。
項１２．
前記発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、
該プロモーターが、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列が欠失することにより、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入されることにより、転写活性が変化するプロモーターである、
項１０に記載のタンパク質発現方法。
項１３．
項１０～１２のいずれかに記載の方法で発現させたタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
項１４．
（工程ａ）５’側から順に、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む形質転換体と、被検物質とを接触させる工程、
（工程ｂ）被検物質と接触させた形質転換体（被検形質転換体）、及び被検物質を接触させない形質転換体（対照形質転換体）における、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入される率（挿入率）を測定する工程、及び
（工程ｃ）被検形質転換体における欠失率又は挿入率が、対照形質転換体における欠失率又は挿入率よりも低い場合に、前記被検物質を薬剤耐性化抑制剤候補物質として選択する工程、
を含む薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
項１５．
前記発現カセットが、５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、前記式（１）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、項１４に記載のスクリーニング方法。
項１６．
前記発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている発現カセットである、項１４に記載のスクリーニング方法。
項１７．
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ（但し、ｍは３以上の整数）である、項１５に記載のスクリーニング方法。
項１８．
前記発現カセットにおいて、式（１）で示される塩基配列が配置されており、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１である、項１５に記載のスクリーニング方法。
項１９．
前記発現カセットにおいて、式（１）で示される塩基配列が配置されており、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２である、項１５に記載のスクリーニング方法。
項２０．
前記発現カセットにおいて、式（２）で示される塩基配列が配置されており、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２である、項１５に記載のスクリーニング方法。
項２１．
前記発現カセットにおいて、式（２）で示される塩基配列が配置されており、
前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１である、項１５に記載のスクリーニング方法。
項２２．
前記プロモーターが、式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列が欠失することにより、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入されることにより、転写活性が変化するプロモーターである、項１６に記載のスクリーニング方法。
項２３．
前記ＯＲＦがレポータータンパク質をコードするＯＲＦである、項１７～２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項２４．
前記工程ｂにおける欠失率又は挿入率の測定が、レポーターシグナルを発する形質転換体の割合を測定することにより行われる、項２３に記載のスクリーニング方法。
項２５．
前記ＯＲＦが薬剤耐性タンパク質をコードするＯＲＦである、項１７～２２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項２６．
前記工程ｂにおける欠失率又は挿入率の測定が、薬剤耐性を示す形質転換体の割合を測定することにより行われる、項２５に記載のスクリーニング方法。
　本発明によれば、新規発現誘導システムを可能にする発現カセット、及びこれを利用したタンパク質の発現方法を提供することができる。この発現誘導システムは、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失現象、又はX-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入される現象が起こった細菌から順次目的タンパク質の発現が起こるという従来にない原理に基づいたシステムである。したがって、本発明の発現カセットを用いることにより、従来の発現誘導システムでは効率的に発現させることができなかったタンパク質を、より効率的に発現させることが可能となる。また、上記欠失又は挿入は、本発明の発現カセットを含む細菌を培養することにより自然と起こるものであるため、余分な操作を要さずに簡便且つ効率的に発現誘導を行うことが可能である。
　また、本発明によれば、重なり合ったダイレクトリピート又はX-Y-Xという配列を有する発現カセットを含む形質転換体において、重なっていない配列の欠失率又はX-Yで示される塩基配列の挿入率を指標として、薬剤耐性化抑制剤の候補物質をスクリーニングすることができる。さらに、発現カセットからのタンパク質の発現量や活性が該欠失又は該挿入により変化するように発現カセットを設計することによって、薬剤耐性化抑制剤をより簡便且つ効率的にスクリーニングすることができる。また、上記欠失は細菌一般で起こるため、取り扱いの容易さ等の観点から好適な細菌を用いてスクリーニングを行うことができる。
　本発明のスクリーニング方法により選別された薬剤耐性化候補物質は、薬剤耐性株の出現を抑えることができるため、薬剤の開発とそれに対する耐性菌の出現といういわゆる“イタチごっこ”の問題を解消することができる。
mexT遺伝子中の重なり合ったダイレクトリピート（X-Y-X-Y-X）を示す。 pMMB67EH中のtacプロモーター配列（上部）と、該tacプロモーターのスペーサー領域（16 bp）をより長い配列（24 bp）に置換したpSdmexTCM-24bp中の改変プロモーター配列（下部）を示す。 実施例2のアッセイプラスミドの構築スキームを示す。 転写効率が欠失効率に与える影響の解析結果を示す（実施例5）。 重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現を示す（実施例6）。 重なり合ったダイレクトリピートの創出現象を示す（実施例7）。
　本発明において、「発現カセット」とは、細胞に導入して該細胞（形質転換体）内で目的ｍＲＮＡを発現させる目的に用いられるＤＮＡ領域、又は該ＤＮＡ領域を含むＤＮＡを細胞内に導入することによって形成される、ｍＲＮＡ発現可能なＤＮＡ領域を意味する。以下、便宜上、前者を「細胞外発現カセット（或いは「単離された発現カセット」）」、後者を「細胞内発現カセット」と示す。
　細胞外発現カセットは、上記目的に用いられる限りにおいて、プロモーター、ＯＲＦ等のエレメントを含んでいなくとも良い。該エレメントを含んでいない場合は、該エレメントを挿入してから細胞に導入することが好ましい。この観点から、細胞外発現カセットは、プロモーターやＯＲＦ等の上記エレメントが容易に挿入可能なように、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有することが好ましい。細胞外発現カセットとしては、例えば各種市販されている発現ベクターにおける、プロモーター、タンパク質タグをコードする領域、及びＯＲＦ挿入用のＭＣＳで構成されるＤＮＡ領域が挙げられる。このＤＮＡ領域にはＯＲＦが含まれないが、細胞に導入する前に、ＭＣＳにＯＲＦを挿入して用いられる。このように、細胞外発現カセットには、そのままではタンパク質を発現させることができなくとも、最終的に細胞に導入して目的タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現させる目的で用いられるものであれば包含される。
　細胞内発現カセットは、上記定義に当てはまる限りにおいて特に限定されない。例えば、ｍＲＮＡを発現させることができる状態の細胞外発現カセットを細胞に導入した場合、細胞外発現カセットがそのまま細胞内発現カセットを意味する。別の例としては、プロモーターを含まない細胞外発現カセットを細胞に導入し、該細胞外発現カセットが細胞のゲノムＤＮＡ中のプロモーター下流に組み込まれて存在する場合、該プロモーター及び細胞外発現カセットを併せたＤＮＡ領域が細胞内発現カセットを意味する。
　（１）発現カセット（細胞外発現カセット）
　本発明は、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む発現カセットに関する。なお、この発現カセットは、細胞に導入して該細胞（形質転換体）内で目的ｍＲＮＡを発現させる目的に用いられるＤＮＡ（細胞外発現カセット）である。以下、この発現カセットを「本発明の細胞外発現カセット」と示すこともある。後述するように、本発明の細胞外発現カセットを用いることにより、例えば上記欠失により引き起こされるフレームシフトを利用して、又は上記欠失により引き起こされるプロモーターの転写活性の変化を利用して目的タンパク質の発現誘導が可能となる。
　式（１）及び式（２）中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の任意の塩基配列であって、互いに異なる塩基配列である。Ｘの塩基数は、例えば２～１５、好ましくは２～１２、より好ましくは２～１０、より好ましくは３～９、より好ましくは４～８、さらに好ましくは５～７、特に好ましくは６であることができる。Ｙの塩基数は、例えば２～１５、好ましくは２～１２、より好ましくは２～１０、より好ましくは２～５、より好ましくは２～４、さらに好ましくは２～３、特に好ましくは２であることができる。Ｘの塩基数とＹの塩基数の組み合わせ（好ましくは式（１）におけるＸの塩基数とＹの塩基数の組み合わせ）は、好ましくはＸの塩基数が３～９であり且つＹの塩基数が２～５である組み合わせ、より好ましくはＸの塩基数が４～８であり且つＹの塩基数が２～４である組み合わせ、さらに好ましくはＸの塩基数が５～７であり且つＹの塩基数が２～３である組み合わせ、特に好ましくはＸの塩基数が６であり且つＹの塩基数が２である組み合わせであることができる。
　式（１）で示される塩基配列として、具体的には、配列番号１、１２、１３、１４、及び１５が挙げられる。式（２）で示される塩基配列として、具体的には、配列番号２２及び２３が挙げられる。
　本発明の細胞外発現カセットは、細胞に導入して該細胞（形質転換体）内で目的ｍＲＮＡを発現させる目的に用いられる限りにおいて、式（１）又は式（２）で示される塩基配列以外の他のエレメントを含んでいても良い。他のエレメントとしては、プロモーター、開始コドン、ＯＲＦ、ＭＣＳ、オペレーター領域、ＳＤ配列等が挙げられる。
　プロモーターとしては、転写開始に必要な配列である限り特に限定されず、公知のプロモーターを採用することができる。例えば、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araプロモーター等の刺激応答性プロモーター等が挙げられる。重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない塩基配列の欠失効率は、転写活性の高さに比例するため、より転写活性の高いプロモーターを用いることにより、効率的に上記欠失を起こすことが可能となる。また、刺激応答性プロモーターを用いれば、該プロモーターを応答させる物質を添加することによって、上記欠失を誘導することができる。このように上記欠失を誘導することにより、タンパク質の発現効率を調節することが可能である。
　ＯＲＦは、発現させる目的タンパク質をコードするＯＲＦである限り、より詳細にはＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠が目的タンパク質をコードする限り特に限定されない。なお、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンは、開始コドンに限定されない。該コドンが開始コドンでない場合は、発現カセット中の転写開始点の３’側であって且つＯＲＦの５’側に開始コドンが配置されていればよい。
　ＯＲＦにコードされるタンパク質は、特に限定されず、所望のタンパク質を採用することができる。例えば、酵素タンパク質、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、収縮タンパク質、防御タンパク質、調節タンパク質等、これらタンパク質の改変タンパク質が挙げられる。改変タンパク質の例としては、一部の領域を欠失させた欠失タンパク質や、アミノ酸が一部置換されたタンパク質等が挙げられる。
　本発明の細胞外発現カセットの好ましい一態様（態様１）としては、例えば式（１）におけるＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失、又は式（２）の５’側におけるＸ－Ｙで示される塩基配列の挿入によりフレームシフトが起こる発現カセットが挙げられる。より具体的には、例えば、式（１）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数、例えば１～６の整数）であり、又は式（２）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列の５’側に開始コドンが配置されている発現カセットが挙げられる。態様１において、目的タンパク質をコードする（ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠が目的タンパク質をコードする）ＯＲＦは、式（１）で示される塩基配列の３’側に挿入（或いは配置）される。態様１においては、好ましくは、式（１）で示される塩基配列の５’側にプロモーターが挿入（或いは配置）され、より好ましくは５’側から順に、プロモーター、開始コドン、式（１）で示される塩基配列が配置されている。
　態様１においては、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない部分が欠失するという法則に基づいて欠失する塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）、及び式（２）の５’側に挿入される塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）の塩基数が３の倍数ではないので、開始コドンの３’側の該配列が欠失する、又は開始コドンの３’側に該配列が挿入されると開始コドンから始まる読み枠が途中でずれる（フレームシフトする）。これを利用して、態様１においては、例えば下記設計１～２のように発現カセットを設計することにより、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現を、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって誘導することができる。
　設計１は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるという設計である。なお、ｍは、ＯＲＦが翻訳される限り特に限定されない。ｍは、例えば３～１００の整数、好ましくは３～５０の整数、より好ましくは３～２５の整数、さらに好ましくは３～１５の整数であることができる。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋１であるので、Ｘ－Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ－Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から３番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ－Ｙ（塩基数は３ｎ＋１）で示される配列が欠失した状態、又はＸ－Ｙ（塩基数は３ｐ＋２）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消される。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計１においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。なお、本発明の細胞外発現カセットがＯＲＦを含まない場合は、ＯＲＦを挿入した時に上記設計になるように、ＭＣＳ等のＯＲＦ挿入予定位置を設計することが好ましい。
　設計２は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）であるという設計である。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋２であるので、Ｘ－Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ－Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から２番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ－Ｙ（塩基数は３ｎ＋２）で示される配列が欠失した状態、又はＸ－Ｙ（塩基数は３ｐ＋１）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消される。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計２においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。なお、本発明の細胞外発現カセットがＯＲＦを含まない場合は、ＯＲＦを挿入した時に上記設計になるように、ＭＣＳ等のＯＲＦ挿入予定位置を設計することが好ましい。
　本発明の細胞外発現カセットの別の好ましい一態様（態様２）としては、例えば、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーターを含む発現カセットが挙げられる。この発現カセットにおいては、プロモーター内に欠失する塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）が存在する、或いはプロモーター内にＸ－Ｙで示される塩基配列の挿入を引き起こす配列（式（２））が存在するので、この配列の欠失又は挿入によりプロモーター構造が変化して、転写活性が変化する。例えば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失（及びそれによる塩基配列の変化）によって、転写活性に重要なプロモーターエレメント（－３５ボックス、－１０ボックス、その他の転写活性化エレメント）の塩基配列が現れるように設計されたプロモーターであれば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を高めることができる。別の例としては、－３５ボックス及び－１０ボックスは、約１６～１９ｂｐ程度のスペーサー配列を介して連結されることによって、転写を効率的に進めることが知られているので、これを利用して設計することが例示される。具体的には、－３５ボックスと－１０ボックスとが、転写が起こらない程度に長く（例えば２０ｂｐ以上、好ましくは２４ｂｐ以上）且つ式（１）で示される塩基配列を含むスペーサー配列を介して連結されていて、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失により該スペーサー配列の長さが１６～１９ｂｐ程度になるように設計されたプロモーターであれば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を高めることができる。このような転写活性の変化を利用して、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失によって、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を発現させることができる。なお、本発明の細胞外発現カセットがＯＲＦを含まない場合は、ＯＲＦを挿入した時に上記設計になるように、ＭＣＳ等のＯＲＦ挿入予定位置を設計することが好ましい。
　本発明の細胞外発現カセットは、公知の分子生物学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術等を利用して作製することができる。
　本発明の細胞外発現カセットは、必要に応じてプロモーター、開始コドン、目的タンパク質をコードするＯＲＦ等が挿入され、さらに発現ベクター内に組み込まれ、目的タンパク質を発現させるための細胞に導入して使用される。このようにして用いることにより、例えばＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失により引き起こされるフレームシフトを利用して、又はＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失により引き起こされるプロモーターの転写活性の変化を利用して目的タンパク質の発現誘導が可能となる。
　（２）タンパク質発現方法
　本発明は、５’側から順に、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む形質転換体を培養する工程を含むタンパク質発現方法に関する。なお、該方法の発現カセットは、形質転換体に含まれる細胞内発現カセットを意味する。以下、該方法の発現カセットを「本発明の細胞内発現カセット」を示すこともある。
　「発現カセットを含む形質転換体」は、本発明の細胞内発現カセットをゲノム上又はゲノム外（例えばプラスミド上）に有する形質転換体であれば特に限定されない。
　「発現カセットを含む形質転換体」は、本発明の細胞外発現カセットを、必要に応じてプロモーター、開始コドン、目的タンパク質をコードするＯＲＦ等を挿入し、さらに発現ベクター内に組み込み、目的タンパク質を発現させるための細胞に導入することによって得ることができる。
　重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失という法則は、細菌一般において保存されているため、形質転換体の由来生物としては、例えばグラム陰性菌（緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌、ブルセラ菌、淋菌、バークホルデリア、赤痢菌、サルモネラ菌、アシネトバクター、コレラ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、ピロリ菌、カンピロバクター等）、グラム陽性菌（結核菌、マイコプラズマ菌、黄色ブドウ球菌、放線菌、枯草菌、炭疽菌等）等、種類を問わず広く採用することができる。これらの中でも、好ましくはグラム陰性菌等が挙げられ、より好ましくは緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌等が挙げられ、さらに好ましくは緑膿菌、大腸菌等が挙げられ、よりさらに好ましくは大腸菌が挙げられる。
　培養は、本発明の細胞内発現カセット中でＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入が起こる限りにおいて、その条件は特に限定されない。例えば、形質転換体の由来生物の種類に応じた公知の方法に従って行うことができる。一例として、大腸菌であれば、ＬＢ液体培地中、約３０～４０℃で振盪培養する方法が挙げられる。培養時間も、上記欠失が起こる限りにおいて特に限定されない。培養時間としては、例えば６～３６時間、好ましくは１０～２４時間程度であればよい。
　斯かる培養により、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入が起こり、それによりＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現を誘導することができる。細胞内発現カセットとして、例えば、上記「（１）発現カセット（細胞外発現カセット）」で説明した態様１（例えば設計１～２など）や態様２の発現カセットを用いることにより、効率的に上記タンパク質の発現を誘導することができる。
　さらに、上記方法によって発現させた目的タンパク質（ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質）を回収することにより、該タンパク質を製造することができる。
　回収は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、目的タンパク質を発現している形質転換体を集め、適当な溶解液で溶解することにより目的タンパク質を含む溶液を得ることができる。その後、各種クロマトグラフィー等の精製を経て、より高純度の目的タンパク質を得ることができる。
　上記タンパク質発現方法によれば、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失が起こった細菌、又はX-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入された細菌から順次目的タンパク質の発現が起こるという従来にない発現誘導システムによりタンパク質を発現させることができる。したがって、該方法により、従来の発現誘導システムでは効率的に発現させることができなかったタンパク質を、より効率的に発現させることが可能となる。
　（３）薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法
　本発明は、工程ａ、工程ｂ、及び工程ｃを含む薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
　工程ａ
　工程ａは、５’側から順に、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む形質転換体と、被検物質とを接触させる工程である。
　工程ａの発現カセットは、形質転換体に含まれる細胞内発現カセットである。
　工程ａの発現カセットには、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている。両者は、直接連結されていても良いし、任意の塩基配列を介して連結されていてもよい。
　ＯＲＦは、タンパク質をコードするＯＲＦである限り、より詳細にはＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠がタンパク質をコードする限り特に限定されない。なお、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンは、開始コドンに限定されない。該コドンが開始コドンでない場合は、発現カセット中の転写開始点の３’側であって且つＯＲＦの５’側に開始コドンが配置されていればよい。
　ＯＲＦにコードされるタンパク質は、特に限定されず、例えば、蛍光タンパク質、酵素タンパク質、構造タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、収縮タンパク質、防御タンパク質、調節タンパク質等、これらタンパク質の改変タンパク質が挙げられる。改変タンパク質の例としては、そのタンパク質の機能に影響を与えないＮ末端側の領域を欠失させた欠失タンパク質や、そのアミノ酸が一部置換されることにより機能が向上（改変）されたタンパク質等が挙げられる。ＯＲＦにコードされるタンパク質としては、後述の工程ｂにおける欠失率の測定をより簡便且つ効率的にできるという観点から、好ましくはレポータータンパク質、及び薬剤耐性タンパク質が挙げられる。
　レポータータンパク質は、特定の基質と反応して発光（発色）するタンパク質、或いは励起光によって蛍光を発するタンパク質である限り特に限定されない。具体的には、例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼ等が挙げられる。これらの中でも、後述の工程ｂにおける欠失率の測定をより簡便且つ効率的にできるという観点から、好ましくは蛍光タンパク質が挙げられる。
　薬剤耐性タンパク質は、それを発現する細胞に抗菌薬などの薬剤に対する耐性を付与できる限り特に限定されない。具体的には、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子にコードされるタンパク質（クロラムフェニコール耐性タンパク質）、テトラサイクリン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（テトラサイクリン耐性タンパク質）、ネオマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（ネオマイシン耐性タンパク質）、エリスロマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（エリスロマイシン耐性タンパク質）、スペクチノマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（スペクチノマイシン耐性タンパク質）、カナマイシン耐性遺伝子にコードされるタンパク質（カナマイシン耐性タンパク質）等が挙げられる。
　工程ａの発現カセットは、発現カセットからｍＲＮＡを発現させるために必要に応じて、式（１）又は式（２）で示される塩基配列及びＯＲＦ以外の他のエレメントを含んでいてもよい。他のエレメントとしては、例えばプロモーター、開始コドン、ＭＣＳ、オペレーター領域、ＳＤ配列等が挙げられる。これらの中でも、プロモーターを含んでいることが好ましい。プロモーターとしては、転写開始に必要な配列である限り特に限定されず、公知のプロモーターを採用することができる。例えば、tacプロモーター、tetプロモーター、araプロモーター等が挙げられる。また、ＯＲＦに開始コドンが含まれない場合は、他のエレメントとして、ＯＲＦの５’側に開始コドンを含むことが好ましい。
　工程ａの発現カセットの好ましい一態様としては、例えばＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現量或いは活性（蛍光活性等）が、式（１）におけるＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失、又は式（２）の５’側におけるＸ－Ｙで示される塩基配列の挿入により変化する発現カセットが挙げられる。このような発現カセットを用いることにより、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率を、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現量或いは活性（蛍光活性等）を指標にして評価することができる。特に、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、蛍光タンパク質や薬剤耐性タンパク質である場合には、蛍光量や薬剤耐性株の出現率を測定することによって、より簡便にＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率を測定することができる。このような発現カセットの態様としては、例えば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されることにより、ＯＲＦのフレームシフトが起こり、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が発現するようになる（或いは発現しないようになる）態様（態様３）が挙げられる。別の例としては、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されることにより、発現カセットからの転写量が変化する態様（態様４）が挙げられる。また別の例としては、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されることにより、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の活性が変化する態様（態様５）が挙げられる。以下、態様３～５について詳述する。
　工程ａの発現カセットの態様３は、５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、式（１）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数、例えば１～６の整数）である、又は式（２）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である発現カセットである。この発現カセットにおいては、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない部分が欠失するという法則に基づいて欠失する塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）、及び式（２）の５’側に挿入される塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）の塩基数が３の倍数ではないので、この配列の欠失又は挿入により、ＯＲＦの読み枠がずれる（すなわちフレームシフトが起こる）。このため、該配列の欠失又は挿入の有無で、発現カセットから発現するタンパク質が変化する。これを利用して、態様３においては、例えば下記設計３～５のように発現カセットを設計することにより、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現させる（或いは発現させないようにする）ことができる。
　設計３は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ（但し、ｍは３以上の整数である）であるという設計である。なお、ｍは、ＯＲＦが翻訳される限り特に限定されない。ｍは、例えば３～１００の整数、好ましくは３～５０の整数、より好ましくは３～２５の整数、さらに好ましくは３～１５の整数であることができる。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍであるので、Ｘ－Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ－Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトは起こらない。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ－Ｙ（塩基数は３ｎ＋１又は３ｎ＋２）で示される配列が欠失した状態、又はＸ－Ｙ（塩基数は３ｐ＋１又は３ｐ＋２）が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から２又は３番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計３においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現しなくなる。
　設計４は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるという設計である。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋１であるので、Ｘ－Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ－Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から３番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ－Ｙ（塩基数は３ｎ＋１）で示される配列が欠失した状態、又はＸ－Ｙ（塩基数は３ｐ＋２）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消する。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計４においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。
　設計５は、式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、開始コドンとＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２であるという設計であり、式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）であるという設計である。開始コドンとＯＲＦの間の塩基数が３ｍ＋２であるので、Ｘ－Ｙで示される配列が欠失しない状態、又はＸ－Ｙで示される配列が挿入されない状態ではＯＲＦのフレームシフトが起こる。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの５’末端から２番目の塩基から３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。一方、開始コドンとＯＲＦの間に配置されているＸ－Ｙ（塩基数は３ｎ＋２）で示される配列が欠失した状態、又はＸ－Ｙ（塩基数は３ｐ＋１）で示される配列が挿入された状態ではＯＲＦのフレームシフトが解消する。したがって、この状態のＯＲＦの読み枠は、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠である。このように、設計５においては、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入によって発現するようになる。
　工程ａの発現カセットの態様４は、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている発現カセットが挙げられる。この発現カセットにおいては、プロモーター内に欠失する塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）が存在する、或いはプロモーター内にＸ－Ｙで示される塩基配列の挿入を引き起こす配列（式（２））が存在するので、この配列の欠失又は挿入によりプロモーター構造が変化して、転写活性が変化する。例えば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が転写活性に重要なプロモーターエレメント（－３５ボックス、－１０ボックス、その他の転写活性化エレメント）の全部又は一部を構成するように設計されたプロモーターであれば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を低下させることができる。別の例としては、－３５ボックス及び－１０ボックスは、約１６～１９ｂｐ程度のスペーサー配列を介して連結されることによって、転写を効率的に進めることが知られているので、これを利用して設計することが例示される。具体的には、－３５ボックスと－１０ボックスとが、転写が起こらない程度に長く（例えば２０ｂｐ以上、好ましくは２４ｂｐ以上）且つ式（１）で示される塩基配列を含むスペーサー配列を介して連結されていて、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失により該スペーサー配列の長さが１６～１９ｂｐ程度になるように設計されたプロモーターであれば、Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失することによって転写活性を高めることができる。このような転写活性の変化を利用して、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失によって、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を発現させる（或いは発現させないようにする）ことができる。
　工程ａの発現カセットの態様５は、５’側から順に、プロモーター、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むＯＲＦが配置されている発現カセットが挙げられる。この発現カセットにおいては、ＯＲＦ内に欠失する塩基配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）が存在する、或いはＯＲＦ内にＸ－Ｙで示される塩基配列の挿入を引き起こす配列（式（２））が存在するので、この配列の欠失又は挿入によりＯＲＦにコードされるタンパク質の活性が変化する。この活性の変化は、フレームシフトが無くとも起こる場合がある。例えば、EGFP等の蛍光タンパク質中の特定部位にアミノ酸が挿入されることにより、蛍光活性が消失することが知られている。
　工程ａの「発現カセットを含む形質転換体」は、上記発現カセットをゲノム上又はゲノム外（例えばプラスミド上）に有する形質転換体であれば特に限定されない。
　重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失という法則は、細菌一般において保存されているため、形質転換体の由来生物としては、例えばグラム陰性菌（緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌、ブルセラ菌、淋菌、バークホルデリア、赤痢菌、サルモネラ菌、アシネトバクター、コレラ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、ピロリ菌、カンピロバクター等）、グラム陽性菌（結核菌、マイコプラズマ菌、黄色ブドウ球菌、放線菌、枯草菌、炭疽菌等）等、種類を問わず広く採用することができる。これらの中でも、好ましくはグラム陰性菌等が挙げられ、より好ましくは緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌等が挙げられ、さらに好ましくは緑膿菌、大腸菌等が挙げられる。
　発現カセットを含む形質転換体は、公知の分子生物学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術等を利用して作成した細胞外発現カセットを、公知の方法に従って細菌に導入することにより得ることができる。
　被検物質は、特に制限されない。例えば、低分子化合物、高分子化合物（ペプチド、タンパク質、糖鎖等の生体高分子化合物を含む）等の化合物であり得る。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。
　発現カセットを含む形質転換体と被検物質とを接触させる方法は、両者が接触する限り、いかなる方法でもよい。典型的には、発現カセットを含む形質転換体を含む溶液（培養液等）と被検物質とを混合する方法が挙げられる。
　斯かる接触後、発現カセットを含む形質転換体をさらに培養することが好ましい。発現カセットを含む形質転換体を培養することにより、該発現カセット中のＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失率が高まる。したがって、被検物質による欠失率の低下が検出し易くなる。培養は、形質転換体の由来生物の種類に応じた公知の方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌であれば、ＬＢ液体培地中、約３０～４０℃で振盪培養する方法が挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、例えば６～３６時間、好ましくは１０～２４時間程度であればよい。
　工程ｂ
　工程ｂは、被検物質と接触させた形質転換体（被検形質転換体）、及び被検物質を接触させない形質転換体（対照形質転換体）における、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入される率（挿入率）を測定する工程である。
　被検形質転換体は、上記工程ａにおいて被検物質と接触させた前記発現カセットを含む形質転換体である。対照形質転換体は、被検物質を接触させていない前記発現カセットを含む形質転換体である。対照形質転換体は、被検物質と接触させていない以外は、被検形質転換体と同様の処理を施されたものが好ましい。
　Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率の測定方法は、被検物質の接触による欠失率又は挿入率の変化を評価できる方法である限り特に限定されない。例えば次の方法が挙げられる。まず、被検形質転換体の集団及び対照形質転換体の集団それぞれ（Ｘ－Ｙで示される塩基配列が欠失している又は挿入されている形質転換体、及び該配列が欠失していない又は挿入されている形質転換体が混在する）から発現カセットを含むＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを適当な制限酵素で消化する。次に、この消化断片を電気泳動によりゲル上に展開する。最後に、ゲル上の、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失又は挿入により表れるバンド（Ｘ－Ｙで示される塩基配列の塩基数の分だけ短くなった又は長くなった消化断片のバンド）の濃さを測定することにより、形質転換体の集団内においてＸ－Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されている形質転換体の割合、すなわち欠失率又は挿入率を測定することができる。
　好ましい一態様としては、工程ａの発現カセットとして、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質の発現量が、Ｘ－Ｙで示される塩基配列の欠失により変化する発現カセット（態様３～５等）を用いることにより、該発現量を指標にしてより簡便に欠失率を測定することができる。例えば次の方法が挙げられる。まず、被検形質転換体の集団及び対照形質転換体の集団それぞれから、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質を含む画分を抽出する。次に、この画分を電気泳動でゲル上に展開後、該タンパク質を特異的に検出できる抗体でウェスタンブロットを行う。最後に、ウェスタンブロットで検出されたバンドの濃さを測定することにより、形質転換体の集団内においてＸ－Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されている形質転換体の割合、すなわち欠失率又は挿入率を測定することができる。
　上記好ましい態様において、ＯＲＦの最も５’側の３塩基で構成されるコドンを含む読み枠で翻訳されるタンパク質が、蛍光タンパク質や薬剤耐性タンパク質である場合には、蛍光量や薬剤耐性株の出現率を測定することによって、より簡便にＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失率又は挿入率を測定することができる。例えば薬剤耐性タンパク質を採用する場合は次のように測定することができる。まず、被検形質転換体の集団及び対照形質転換体の集団のそれぞれを、薬剤を含む固形培地（寒天培地等）にプレーティングする。次に、該培地上に出現するコロニー（薬剤耐性株）数を測定することにより、形質転換体の集団内においてＸ－Ｙで示される塩基配列が欠失又は挿入されている形質転換体の割合、すなわち欠失率又は挿入率を測定することができる。
　上記欠失率又は挿入率の測定方法に用いる手法（ＤＮＡ抽出、制限酵素消化、電気泳動、タンパク質抽出、ウェスタンブロット、薬剤耐性株の取得及びその数の測定等）は公知の方法に従って行うことができる。
　工程ｃ
　工程ｃは、被検形質転換体における欠失率又は挿入率が、対照形質転換体における欠失率又は挿入率よりも低い場合に、前記被検物質を薬剤耐性化抑制剤候補物質として選択する工程である。
　「低い」か否かの判断は、一定の基準、例えば統計学的基準に基づき判断すればよい。具体的には、複数回測定してｐ値を求め、ｐ値が一定値以下、例えば０．０５以下である場合に有意に相違すると判断する方法等が挙げられる。判断の結果、有意に相違している場合は、その被検物質を選択する。
　工程ｃで選択された被検物質は、薬剤耐性化の原因である「重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（Ｘ－Ｙで示される塩基配列）の欠失」という現象、又はＸ－Ｙ－Ｘという配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入され、重なり合ったダイレクトリピートが創出されるという法則を阻害することを指標として選択される物質であるので、薬剤耐性化抑制剤候補物質として、特に緑膿菌の薬剤耐性化抑制剤候補物質として有用である。得られた薬剤耐性化抑制剤候補物質は、さらに薬剤耐性化抑制剤のスクリーニングに供してもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、下記に示す発現ベクターの調製は、公知の遺伝子工学的手法に従って行った。
　実施例1．薬剤耐性化機構の解析
　薬剤耐性菌であるNfxC型変異株は、RND型薬剤排出ポンプ（MexEF-OprN）を発現しており、その結果薬剤耐性能を獲得することが知られている。該変異株においては、mexT遺伝子のORFが8 bp欠失してフレームシフトしており、その結果発現する活性型MexTタンパク質（転写因子）が、RND型薬剤排出ポンプの発現を活性化している（非特許文献2）。しかしながら、該8 bpの欠失が必ず起こるものなのか、或いは6 bpや7 bpの欠失も起こりうるのかについては全く知られていなかった。そこで、該欠失のメカニズムを調べた。
　1-1．重なり合ったダイレクトリピートの発見
　野生株mexT遺伝子配列中の、NfxC型変異株において欠失が起こる配列の周辺を解析したところ、図1に示すような、X-Y-Xという配列と、X-Y-Xという配列が、Xにおいて重なり合った配列（配列番号1、重なり合ったダイレクトリピート）が見出された。そして、NfxC型変異株においては、この重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列(X-Y)が欠失していることが見出された（図1）。
　これらの発見から、重なり合ったダイレクトリピートがあれば、その重なっていない配列が欠失するという法則の存在が推測された。
　1-2．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列が欠失することの実証試験
　上記推測の実証試験を行った。概要としては、重なっていない部分の欠失により初めてプロモーターが機能し、その結果薬剤耐性遺伝子が発現する大腸菌を作製し、該大腸菌の薬剤耐性を測定することによって欠失の有無を調べた。具体的には次のように行った。
　まず、pMMB67EHベクターを、該ベクターのMCSにクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、且つ該遺伝子のプロモーター領域にPsi Iサイトが導入されるように、改変した（改変後のプラスミド名は「pSCm」）。次に、pSCmベクターをPsi Iサイトで切断し、In-fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いて該切断サイトに合成核酸を挿入することによって、クロラムフェニコール耐性遺伝子上流のtacプロモーターの-35ボックスと-10ボックスの間のスペーサー領域が、mexT遺伝子の重なり合ったダイレクトリピート22 bpに2 bp（CT）付加した24 bpの配列（配列1：表1）となるように改変した（図2、改変後のプラスミド名は「pSdmexTCM-24bp」）。また、これとは別に、該スペーサー領域が、配列1において重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（CGGCCAGC）が欠失した配列（配列2（16 bp）：表1）、配列2において5’末端に1 bp（G）付加された配列（配列3（17 bp）：表1）、又は配列2において5’末端に2 bp（GA）付加された配列（配列4（18 bp）：表1）となるように改変したプラスミドも、pSdmexTCM-24bpと同様の方法で作製した（表1）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　pSdmexTCM-24bpは、-35ボックスと-10ボックスの間の配列が長すぎるため、転写が起こらず、結果として該プロモーター下流のクロラムフェニコール耐性遺伝子が発現しないことが予想される一方、pSdmexTCM-16bp, 17bp, 18bpは、-35ボックスと-10ボックスの間の配列の長さが正常範囲であるため、クロラムフェニコール耐性遺伝子が発現することが予想される。このことを確かめるために、これら4種類のプラスミドを大腸菌DH5αに定法に従って導入し、次いで、これらの大腸菌に対するクロラムフェニコールの最小発育阻止濃度（MIC）を定法に従って測定した。結果を表2に示す。表2に示されるように、予想通り、pSdmexTCM-24bpを導入した大腸菌はクロラムフェニコールに対する耐性が極めて低い一方、pSdmexTCM-16bp, 17bp, 18bpを導入した大腸菌は耐性を獲得していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、pSdmexTCM-24bpを導入した大腸菌を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM IPTG）5 mLに植菌し、37℃で16時間培養した。該培養液を1/100に希釈し、該希釈液100 μLを、10 cmディッシュ上のクロラムフェニコール含有寒天培地（10 μg/mL クロラムフェニコール, 1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0.5 mM IPTG）及びコントロール寒天培地（クロラムフェニコール含有寒天培地からクロラムフェニコールを除いた組成、又はクロラムフェニコールに替えて50 μg/mL CARを含有する組成を有する）にプレーティングし、37℃で22時間培養した。培養後、クロラムフェニコール含有寒天培地及びコントロール寒天培地それぞれで出現したコロニー数から、クロラムフェニコール耐性株の出現頻度を算出した。さらに、ランダムに100個のコロニーをピックアップし、コロニーから定法に従って抽出したDNAのシークエンシングをFASMAC社に依頼し、-35ボックスと-10ボックスの間の配列を決定した。
　その結果、1.28×10-3％の頻度でクロラムフェニコール耐性株が出現した。また、-35ボックスと-10ボックスの間の配列は100個のコロニー全てにおいて配列2、すなわち元の配列（配列1）において重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（CGGCCAGC）が欠失した配列であった。以上より、重なり合ったダイレクトリピートがあれば、その重なっていない配列が欠失するという法則の存在が示された。また、表2のpSdmexTCM-24bpが導入されたDH5α（液体培養を経ていない）は、クロラムフェニコールに対する耐性を示さないことから、上記欠失は、pSdmexTCM-24bpを導入した大腸菌を液体培養している際に自然に生じたものであることが示唆された。
　実施例2．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列が欠失するという法則の、細菌一般における保存性
　上記実施例1で示された法則が細菌一般で起こるものかどうかを調べた。具体的には次のように行った。
　まず、図3に示すスキームに従ってアッセイプラスミドを構築した。5’側から、GAATTC（EcoR Iサイト）、19 bpの配列（CCTGGAAACGAGGAACGCC）、及び緑膿菌野生株のゲノムDNA由来のmexT遺伝子の開始コドンから該遺伝子のsal Iサイトまでの配列（配列番号6、重なり合ったダイレクトリピートを含む）が連結した配列（断片1）と、5’側から、GTCGAC（Sal Iサイト）、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFの開始コドンの次のコドンから終始コドンの一つ前のコドンまでの配列、6×His tagをコードする配列、TAA（終始コドン）、及びAAGCTT（Hind IIIサイト）が連結した配列（断片2）とを、pMMB67EHベクターのMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイト、及び断片1の3’末端のSal Iサイトと断片2の5’末端のSal Iサイトを利用して、該ベクターのMCS中に連結した状態で導入した（大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクター）。断片1の開始コドンと断片2のクロラムフェニコール耐性遺伝子のORFとの間の塩基数は635 bp（3m＋2）であるため、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFは正常な読み枠で翻訳されないが、断片1中の重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（8 bp（3n＋2））が欠失することによりフレームシフトが起これば、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFが正常な読み枠で翻訳されることになる。さらに、上記で得られた大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクターをEcoR I及びHind IIIで処理して、断片1及び断片2の連結配列を切り出し、該連結配列をpVLT33のMCSに導入した（スフィンゴモナス菌用アッセイベクター）。
　次に、大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクターを大腸菌に定法に従って導入した。該細菌を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 1 mM IPTG）5 mLに植菌し、37℃で16時間培養した。該培養液を1/1000に希釈し、該希釈液100 μLを10 cmディッシュ上のクロラムフェニコール含有寒天培地（5 μg/mL クロラムフェニコール, 1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 1 mM IPTG）及びコントロール寒天培地（クロラムフェニコール含有寒天培地からクロラムフェニコールを除いた組成、又はクロラムフェニコールに替えて50 μg/mL CARを含有する組成を有する）にプレーティングし、37℃で22時間培養した。
　上記と同様の方法で、セラチア菌（Serratia marcescens）及びスフィンゴモナス菌（Sphingomonas paucimobilis）についても実験を行った。
　各細菌において上記実施例1で示された法則が保存されていれば、該細菌の培養中に8 bpの欠失が起こり、クロラムフェニコール耐性株が出現するはずである。
　培養の結果、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌全てについて、コロニー（クロラムフェニコール耐性株）が出現した。さらに、各コロニーから定法に従って抽出したDNAのシークエンシングを行った結果、各コロニーにおいて、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（8 bp）が確かに欠失していることを確認した。以上より、上記実施例1で示された法則は細菌一般で保存されていることが示された。
　実施例3．各種生物における重なり合ったダイレクトリピートの探索
　各種生物のゲノム中の、重なり合ったダイレクトリピートを検索した。この検索においては、「重なり合ったダイレクトリピート」は、任意の配列α（8塩基以上）（例えばABCDEFGH）が2回続いた後、αの3’側の塩基が欠失した配列α’（6塩基以上）（例えばABCDEF）が続く、ααα’からなる配列と定義される。検索結果を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表3に示されるように、グラム陰性菌及びグラム陽性菌等の細菌のみならず、真核生物においても重なり合ったダイレクトリピートが存在することが明らかとなった。
　実施例4．各種生物由来の重なり合ったダイレクトリピートの解析
　実施例3で見出された重なり合ったダイレクトリピートからも、重なっていない配列の欠失が起こるか調べた。具体的には次のように行った。
　まずアッセイプラスミドを構築した。実施例2で得られた「大腸菌又はセラチア菌アッセイ用ベクター」を基に、5’側から、GAATTC（EcoR Iサイト）、19 bpの配列（CCTGGAAACGAGGAACGCC）、開始コドン、CTGCAG（PstIサイト）、GCGGCCGC（Not Iサイト）、GTCGAC（Sal Iサイト）、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFの開始コドンの次のコドンから終始コドンの一つ前のコドンまでの配列、6×His tagをコードする配列、TAA（終始コドン）、及びAAGCTT（Hind IIIサイト）が連結した配列を得た。この配列を、制限酵素サイトを利用して、pMMB67EHベクターのMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイトの間に挿入した。得られたベクター（pLCM）をPst I及びSal Iで切断し、そこへ、5’側から、CTGCAG（Pst Iサイト）、下記表4の配列5～9のいずれか、及びGTCGAC（Sal Iサイト）が連結された配列をPst I及びSal Iで切断して得られた断片を挿入して、アッセイプラスミドを得た。配列5～9の塩基数はいずれも「3の倍数＋2」であるため、該発現カセットのクロラムフェニコール耐性遺伝子のORFは正常な読み枠で翻訳されないが、配列5～9中の重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列（8 bp）が欠失することによりフレームシフトが起これば、クロラムフェニコール耐性遺伝子のORFが正常な読み枠で翻訳されることになる。
　次に、アッセイプラスミドを定法に従って大腸菌に導入した。該大腸菌を、実施例1と同様にクロラムフェニコール含有寒天培地にプレーティングして、培養した。培養後、出現したコロニー（クロラムフェニコール耐性株のコロニー）数から、クロラムフェニコール耐性株の出現頻度を算出した。さらに、ランダムに10個のコロニーをピックアップし、コロニーから定法に従って抽出したDNAをシークエンシングし、欠失した配列を同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　耐性株の出現頻度は表5に示すとおりである。また、シークエンシングの結果、全てのコロニーで、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（表4の「配列」の下線で示される配列）が欠失していることが確認できた。以上より、各種生物由来の重なり合ったダイレクトリピートについても、mexT遺伝子由来の該リピートと同様に、重なっていない配列の欠失が起こることが示された。
　実施例5．転写活性が欠失効率に与える影響の解析
　転写活性が欠失効率に与える影響を解析した。具体的には次のように行った。
　緑膿菌野生株のゲノムDNAから、制限酵素サイトを付加したプライマーセット（mexT1-Bam（配列番号16）、及びmexT2-Hin（配列番号17））を用いたPCRにより、mexT遺伝子（重なり合ったダイレクトリピートを含む）を含むDNA断片を増幅した。該断片のプライマー由来の制限酵素サイトを切断し、得られた断片をpMMB67EHのtacプロモーターの下流にライゲーションし、アッセイプラスミドを得た。アッセイプラスミドを、緑膿菌（PAO1S-Lac）に導入した。
　該緑膿菌のアッセイプラスミドのmexT遺伝子内には重なり合ったダイレクトリピートが存在するため、該遺伝子からは、正常な読み枠で翻訳される活性型MexTタンパク質が発現しない。ただ、該ダイレクトリピート中の重なっていない配列（8 bp）が欠失することによりフレームシフトが起これば、正常な読み枠で翻訳される活性型MexTタンパク質が発現し、これによりRND型薬剤排出ポンプが発現する（すなわち薬剤耐性が獲得される）。一方、mexT遺伝子の上流のtacプロモーターはIPTGによって正に調節されるため、IPTG添加の有無により転写活性を調節することができる。したがって、IPTG無添加の場合（転写活性低い）とIPTG添加の場合（転写活性高い）とで、薬剤耐性株の出現率を比較することにより、転写活性が欠失効率に与える影響を調べることができる。
　アッセイプラスミドを導入した緑膿菌を2 mM IPTGを含む液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0）、又はIPTGを含まない液体培地5 mLに植菌し、37℃で14時間培養した。該培養液を1/10に希釈し、該希釈液100 μLを10 cmディッシュ上のクロラムフェニコール含有寒天培地（500 μg/mL クロラムフェニコール, 1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0, 0 or 2 mM IPTG）及びコントロール寒天培地（クロラムフェニコール含有寒天培地からクロラムフェニコールを除いた組成、又はクロラムフェニコールに替えて150 μg/mL CARを含有する組成を有する）にプレーティングし、37℃で24時間培養した。得られたコロニー数から、薬剤耐性株（NfxC変異株）の出現率を求めた。一方で、液体培養液100 μLからRNAを抽出し、mexT遺伝子の転写量をリアルタイムPCR法によって測定した。
　結果を図4に示す。図4に示されるように、IPTG添加によって転写量（転写活性）が高まると、欠失効率も高まることが明らかとなった。
　実施例6．重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現
　まず、EGFP発現ベクターにおいて、EGFPのORF内に重なり合ったダイレクトリピート創り出し、このORFを緑膿菌アッセイ用ベクターに挿入して、アッセイプラスミドを得た。具体的には次のように行った。
　inverse PCRでpEGFP-C3（クロンテック社製）のMCS（配列番号18）を除去し、MCSを除去した位置に、Not Iサイトを含む9 bpの配列（agcggccgc）を挿入した。EGFP ORF内の14 bpの配列（配列番号19）の上流に隣接して5’側からtgaccacccからなる配列を挿入して、該14 bpの配列を合わせて重なり合ったダイレクトリピート（配列番号20）を創り出した。このように改変したEGFP ORFを、pMMB67EHにEcoR I－Hind IIIサイトにクローニングした。この際、EGFP ORFの開始コドンの上流に隣接して、pET21(a)のribosome binding site＋8 bp（T7 tagの上流域）の配列（配列番号21）を挿入した。得られたアッセイプラスミドを緑膿菌に導入した。
　上記アッセイプラスミドのEGFPのORF内には9 bpの配列（tgaccaccc）が挿入されており、これにより該ORFから発現するEGFPは活性中心の立体構造が崩れてしまっているので、蛍光を示さない。ただ、上記9 bpの配列の挿入により創り出された重なり合ったダイレクトリピート（配列番号20）中の重なっていない配列（9 bp）が欠失すれば、正常なEGFPタンパク質が発現する。
　アッセイプラスミドを導入した緑膿菌を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2mM IPTG, pH 7.0）5 mLに植菌し、37℃で14時間培養した。該培養液を1/100000に希釈し、該希釈液100 μLを10 cmディッシュ上の寒天培地（1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 2mM IPTG, pH 7.0）にプレーティングし、37℃で24時間培養した。培養後、ディッシュを青色LEDトランスイルミネーター（オプトコード社製、LEDB-SBOXH）で観察した（励起波長：470 nm、付属のオレンジフィルターを使用）。
　結果を図5に示す。図5に示されるように、重なり合ったダイレクトリピートの重なっていない配列の欠失による、蛍光タンパク質の発現（図5の下方に光る1つのコロニー）が観察できた。また、シークエンシングの結果、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列（tgaccaccc）が欠失していることが確認できた。
　実施例7．重なり合ったダイレクトリピートの創出現象の発見
　緑膿菌の臨床分離株の一部では、mexT遺伝子において、重なり合ったダイレクトリピート中の重なっていない配列が欠失し、活性型MexTタンパク質を発現しているにも関わらず、NfxC型のフェノタイプを示さない株が存在する。このような株では、活性型MexTタンパク質をMexSタンパク質が抑制することにより、野生型のフェノタイプを示すことが明らかになっている。
　そこで、上記のような臨床分離株から、さらなる変異によりNfxC型変異株が出現するかどうか調べた。具体的には次のように行った。
　上記臨床分離株（8380株：Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol.39, No.3, p645-649, 1995.）を液体培地（1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0）5 mLに植菌し、37℃で15時間培養した。該培養液100 μLを10 cmディッシュ上の寒天培地（1.5% agar, 1％ Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 800 μg/mL クロラムフェニコール, pH 7.0）にプレーティングし、37℃で20時間培養した。NfxC型変異株はクロラムフェニコールに対して高度に耐性を示すので、この培養により得られたコロニーは、上記臨床分離株から出現したNfxC型変異株であると考えられる。
　その結果、2.1×10-5%の割合でNfxC型変異株が出現することが明らかとなった。また、シークエンシングの結果、全てNfxC型変異株でmexS遺伝子に変異が認められた。このことから、MexSが変異し、機能型のMexTを抑制できなくなった為にMexEF-OprN薬剤排出ポンプが発現し、NfxC型のフェノタイプを示していることが明らかとなった。
　また面白いことに、出現したNfxC型変異株の中には、mexS遺伝子内部の特定の配列（配列番号22及び23）の上流に隣接して塩基配列（配列番号24及び25）が挿入されており、これにより重なり合ったダイレクトリピート配列（配列番号26及び27）が創られることにより、MexSが機能を失っていることが明らかとなった（図6）。

Claims (15)

  1. 式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列を含む発現カセット。
  2. 前記式（１）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、請求項１に記載の発現カセット。
  3. 前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に開始コドン及び／又はプロモーターが配置されている、請求項１又は２に記載の発現カセット。
  4. ５’側から順に、プロモーター、開始コドン、前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列が配置されている、請求項１～３のいずれかに記載の発現カセット。
  5. 前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列を含むプロモーターを含む、請求項１に記載の発現カセット。
  6. 前記プロモーターが刺激応答性プロモーターである、請求項３～５のいずれかに記載の発現カセット。
  7. 前記式（１）又は前記式（２）で示される塩基配列の３’側にＯＲＦが配置されている、請求項１～６のいずれかに記載の発現カセット。
  8. 請求項１～７のいずれかに記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
  9. ５’側から順に、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む形質転換体を培養する工程を含むタンパク質発現方法。
  10. 前記発現カセットが５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、
    式（１）で示される塩基配列が配置されている場合は、
    前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１（ただし、ｎは整数）であるか、或いは
    前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、
    式（２）で示される塩基配列が配置されている場合は、
    前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋１（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）であるか、或いは
    前記開始コドンと前記ＯＲＦの間の塩基配列の塩基数が３ｍ＋２（但し、ｍは３以上の整数）であり、且つ前記式（２）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１（ただし、ｐは整数）である、
    請求項９に記載のタンパク質発現方法。
  11. 前記発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、
    該プロモーターが、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列が欠失することにより、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入されることにより、転写活性が変化するプロモーターである、
    請求項９に記載のタンパク質発現方法。
  12. 請求項９～１１のいずれかに記載の方法で発現させたタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の製造方法。
  13. （工程ａ）５’側から順に、式（１）：Ｘ－Ｙ－Ｘ－Ｙ－Ｘ　（１）［式中、Ｘ及びＹは塩基数が１以上の異なる塩基配列を示す。］、又は式（２）：Ｘ－Ｙ－Ｘ　（２）［式中、Ｘ及びＹは前記に同じ。］で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットを含む形質転換体と、被検物質とを接触させる工程、
    （工程ｂ）被検物質と接触させた形質転換体（被検形質転換体）、及び被検物質を接触させない形質転換体（対照形質転換体）における、前記式（１）で示される塩基配列中のＸ－Ｙで示される塩基配列の欠失率、又は前記式（２）で示される塩基配列の５’側に隣接してＸ－Ｙで示される塩基配列が挿入される率（挿入率）を測定する工程、及び
    （工程ｃ）被検形質転換体における欠失率又は挿入率が、対照形質転換体における欠失率又は挿入率よりも低い場合に、前記被検物質を薬剤耐性化抑制剤候補物質として選択する工程、
    を含む薬剤耐性化抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
  14. 前記発現カセットが、５’側から順にプロモーター、開始コドン、式（１）又は式（２）で示される塩基配列、ＯＲＦが配置されている発現カセットであって、前記式（１）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｎ＋１又は３ｎ＋２（ただし、ｎは整数）であり、前記式（２）中のＸ－Ｙで示される塩基配列の塩基数が３ｐ＋１又は３ｐ＋２（ただし、ｐは整数）である、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
  15. 前記発現カセットが、５’側から順に、式（１）又は式（２）で示される塩基配列を含むプロモーター、ＯＲＦが配置されている発現カセットである、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
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