JP2000245463A

JP2000245463A - プロモーター

Info

Publication number: JP2000245463A
Application number: JP11050789A
Authority: JP
Inventors: Tetsuji Yamada; 哲治山田; Yuuki Ichinose; 勇規一瀬; Tomoko Fujiwara; 朋子藤原; Hidenori Ozawa; 英徳小澤
Original assignee: Takasago International Corp; Japan Tobacco Inc; Takasago Perfumery Industry Co
Current assignee: Takasago International Corp; Japan Tobacco Inc
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2000-09-12

Abstract

(57)【要約】【解決手段】以下の式（Ｉ）で表される塩基配列から
なり、かつプロモーター活性を有するDNAである。【化１】Ａ−[Ｘ−Ａ]_n−Ｙ−Ｂ（Ｉ）（式中、Ａは配列番号１記載の塩基配列を表し、Ｂは配
列番号２記載の塩基配列を表す。Ｘ及びＹは塩基数０〜
６の任意の塩基配列を表し、Ｘ及びＹ並びにＸ同士は同
一でも異なってもよい。nは１〜８の整数を表す。）【効果】強力なプロモーター活性を有する。従って、
外来遺伝子を宿主に導入する際のプロモーターとして用
いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術の分野】本発明は、プロモーター活
性を有するDNAに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の植物分子生物学の進歩に伴い、目
的の形質を備えた外来遺伝子を植物へ導入する様々な技
術が開発され、有用物質含量や病害抵抗性等を増大させ
たトランスジェニック植物の研究が盛んに進められてい
る。例えば、タバコモザイクウイルス(TMV)の外被タン
パク遺伝子や、Bacillus thuringiensis由来の鱗翅目昆
虫に対する殺虫性BT毒素遺伝子を植物へ導入した例が報
告されている（P.P.Abel等、Science,vol.232,p.738-74
3,1986；D.A.Fischhoff等、Bio/Technology,vol.5,p.80
7-813,（1987））。これらの例においては、プロモータ
ーとしてカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロ
モーターが用いられており、CaMV35Sプロモーターの下
流に外来遺伝子としてTMV外被タンパク質遺伝子やBT毒
素遺伝子を連結し、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス(Agrobacterium tumefaciens)を介して又はエレク
トロポレーション法を用いて植物に導入し、導入した外
来遺伝子の発現による新規な形質の獲得が確認されてい
る。

【０００３】CaMV35Sプロモーターは、植物へ外来遺伝
子を導入する際に現在最も一般的に利用されているプロ
モーターである。CaMV35Sプロモーターは、CaMVから独
立して機能し、CaMVの宿主であるアブラナ科植物だけで
なく多くの単子葉、双子葉植物において強いプロモータ
ー活性を有する。例えば、タバコにおいて、CaMV35Sプ
ロモーターはノパリン合成遺伝子プロモーター（NOSプ
ロモーター）の少なくとも30倍のプロモーター活性を有
することが示されている。現在、CaMV35Sプロモーター
以外にも非常に多くのプロモーターが単離・同定されて
いる。エンドウのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
（PhenylalanineAmmonia-Lyase）（以下、「PAL」とい
う）遺伝子のプロモーターもそのうちの一つである。

【０００４】PALはフェニルプロパノイド生合成経路の
第一反応を触媒する酵素であり、フェニルプロパノイド
生合成経路においては、植物の生長過程や、傷害、病原
体の侵入、UV照射等の環境ストレスに適応する過程にお
いて重要な機能を発揮する種々の化合物が産生される。
従って、PALは植物の生長や環境ストレスに対する適応
において非常に重要な役割を担っていると考えられ、現
在、PAL遺伝子の構造や発現調節に関し、種々の植物に
おいて研究が進められている。例えば、「シロイヌナズ
ナ（Arabidopsis）」（Mauch-Maniら,Plant Cell 8：20
3-212（1996）；Ohlら,Plant Cell.2：837-848（199
0））、「インゲンマメ（French bean）」（Cramerら,P
lant Mol.Biol.12：367-383（1989）；Sablowskiら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 92：6901-6905（1995）；Shuffle
bottomら,Plant J.3：635-645（1993））、「エンドウ
（pea）」（Yamadaら,Plant Cell Physiol.33：715-725
（1992））、「タバコ(tobacco)」（Fukazawaら,Plant
Mol.Biol.30：711-722（1996））等のPAL遺伝子に関す
る報告がある。

【０００５】エンドウにおいては、PAL遺伝子が多重遺
伝子族（multigene family）を形成していることが報告
されており（Kawamataら,Plant Mol.Biol.20：167-170
（1992））、この多重遺伝子族に属する2種の遺伝子、P
SPAL1及びPSPAL2がクローニングされている（Yamadaら,
Plant Cell Physiol.33：715-725（1992）；特開平5-15
3978）。

【０００６】このPSPAL１及びPSPAL2の発現は、エンド
ウの病原菌であるMycosphaerella pinodesから単離され
るエリシターによって誘導されるが、同菌から単離され
るサプレッサーによって抑制されることが報告されてい
る（Yamadaら,Plant Cell Physiol.35：917-926（199
4））。そして、PSPAL1の5'-nested deletionによる機
能分析により、エリシターを介した活性化に重要なシス
作用エレメントは、PSPAL1の「-340〜+140」（転写開始
点を+1とする）に存在することが示唆されている。

【０００７】また、PSPAL1プロモーターには、プロモー
ター活性に重要な役割を果たすコンセンサス配列モティ
ーフ、「BoxI」（−102〜−91）、「BoxII」（−147〜
−136）、「BoxIV」（−157〜−151）（転写開始点を＋
1とする）が存在することが知られている（Ohlら,Plant
Cell.2：837-848（1990）；Yamadaら,Plant Cell Phys
iol.33：715-725（1992））。さらに、PSPAL1の「+6〜+
140」が、PSPAL1プロモーターのプロモーター活性に非
常に重要であることも報告されている（Kawamataら,Pla
nt Cell Physiol.38（7）：792-803（1997））。

【０００８】このように、PSPAL1プロモーターのプロモ
ーター活性については様々な研究が進められており、こ
れまでに行われてきた研究によって、PSPAL1プロモータ
ーのプロモーター活性に重要な領域やPSPAL1プロモータ
ーのプロモーター活性の発現機構が明らかにされつつあ
る。そして、これらの研究成果は、PSPAL1プロモーター
の固有のプロモーター活性を最大限に発揮させる点にお
いては意義があると考えられる。

【０００９】しかし、これまで行われてきたいずれの研
究も、PSPAL1プロモーターのプロモーター活性そのもの
を増強させることを目的とするものではなかった。PSPA
L1プロモーターのプロモーター活性は、CaMV35Sプロモ
ーターのプロモーター活性に比べると十分なものとはい
えないので、植物へ外来遺伝子を導入し発現させる際の
プロモーターとしてPSPAL1プロモーターを利用した場
合、たとえPSPAL1のプロモーター活性を最大限に発揮さ
せることができたとしても、外来遺伝子を十分に発現さ
せることはできないという問題点は、依然、残されたま
まである。このような状況の下、CaMV35Sプロモーター
のように強力なプロモーター活性を有する新規プロモー
ターの開発が切望されている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、強力なプロ
モーター活性を有する新規プロモーターを提供すること
を目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、PSPAL1（配列番号
９）の「−90〜＋140」部分（配列番号２）の５'末端側
に、PSPAL1（配列番号９）の「−157〜−91」部分（配
列番号１）を、一定の方向で繰り返し連結していくこと
により、BoxI、BoxII及びBoxIVを一定の順序及び方向で
繰り返して含むDNA断片を作製することに成功した。そ
して、このDNA断片がPSPAL1プロモーター及びCaMV35Sプ
ロモーターよりも強力なプロモーター活性を有すること
を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、以下の式で表される塩基配列からなり、かつプロ
モーター活性を有するDNAである。

【００１２】

【化２】Ａ−[Ｘ−Ａ]_n−Ｙ−Ｂ（Ｉ）（式中、Ａは配列番号１記載の塩基配列を表し、Ｂは配
列番号２記載の塩基配列を表す。Ｘ及びＹは塩基数０〜
６の任意の塩基配列を表し、Ｘ及びＹ並びにＸ同士は同
一でも異なってもよい。nは１〜８の整数を表す。）

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の式（Ｉ）で表される塩基配列からな
り、かつプロモーター活性を有するDNAである。

【００１４】

【化３】Ａ−[Ｘ−Ａ]_n−Ｙ−Ｂ（Ｉ）ここで、式（Ｉ）中、「Ａ」は配列番号１記載の塩基配
列を表し、「Ｂ」は配列番号２記載の塩基配列を表す。
「Ａ」及び「Ｂ」で表される塩基配列の５'及び３'方向
と式（Ｉ）で表される塩基配列の５'及び３'方向とは一
致する。

【００１５】「Ａ」で表される配列番号１記載の塩基配
列は、PSPAL1（配列番号９）の「−157〜−91」（転写
開始点を＋１とする）に相当する（図１）。また、
「Ｂ」で表される配列番号２記載の塩基配列は、PSPAL1
（配列番号９）の「−90〜+140」（転写開始点を＋１と
する）に相当する（図１）。

【００１６】「Ｘ」及び「Ｙ」は塩基数０〜６の任意の
塩基配列を表し、式（Ｉ）で表される塩基配列からなる
DNAのプロモーター活性を失わせない限り、その塩基配
列は特に限定されないが、「Ｙ」の塩基数が０であるの
が好ましく、「Ｘ」及び「Ｙ」の塩基数がともに０であ
るのがさらに好ましい。式（Ｉ）中の「Ｘ」及び「Ｙ」
並びに「Ｘ」同士は、同一でも異なってもよい。「n」
は１〜８の整数を表す。「n」の範囲は、式（Ｉ）で表
される塩基配列からなるDNAのプロモーター活性を失わ
せない限り特に限定されないが、好ましくは１〜８であ
り、さらに好ましくは５である。

【００１７】本発明のDNAは、例えば、「Ｂ」で表され
る配列番号２記載の塩基配列からなるDNA断片の５'末端
側に、「Ａ」で表される配列番号１記載の塩基配列から
なるDNA断片の３'末端側を、DNAリガーゼを用いて繰り
返し連結することにより作製することができる。「Ａ」
で表される配列番号１記載の塩基配列からなるDNA断
片、及び「Ｂ」で表される配列番号２記載の塩基配列か
らなるDNA断片は、常法に従って化学合成することがで
きる。

【００１８】また、「Ａ」で表される配列番号１記載の
塩基配列からなるDNA断片、及び「Ｂ」で表される配列
番号２記載の塩基配列からなるDNA断片は、PSPAL1（配
列番号９）を含むエンドウゲノムDNAを鋳型とし、配列
番号１又は２記載の塩基配列の５'末端側と相補的な塩
基配列からなるプライマー及び配列番号１又は２記載の
塩基配列の３'末端側と同一の塩基配列からなるプライ
マーを用いてPCRを行うことにより増幅させることがで
きる。

【００１９】この際、PCRの鋳型として使用するPSPAL1
（配列番号９）を含むエンドウゲノムDNAは、エンドウ
から抽出したゲノムDNAを用いてエンドウゲノムDNAライ
ブラリーを作製した後、PSPAL1（配列番号９）に特異的
にハイブリダイズし得るプローブを用いてサザンハイブ
リダイゼーションを行うことにより単離することができ
る。ゲノムDNAを抽出するエンドウは特に限定されず、
例えば、エンドウアラスカやミドリウスイ品種等を使用
することができる。エンドウからのゲノムDNAの抽出及
びゲノムDNAライブラリーの作製は、常法に従って行う
ことができる。サザンハイブリダイゼーションに使用す
るプローブは、PSPAL1の塩基配列（配列番号９）に基づ
いて常法に従って作製することができる。PCRで使用す
るプライマーは、配列番号１及び２記載の塩基配列に基
づいて常法に従って作製することができる。

【００２０】「Ｂ」で表される配列番号２記載の塩基配
列からなるDNA断片と「Ａ」で表される配列番号１記載
の塩基配列からなるDNA断片とのDNAリガーゼを用いた連
結は、常法に従って行うことができる。上記のように、
「Ｂ」で表される配列番号２記載の塩基配列からなるDN
A断片の５'末端側に、「Ａ」で表される配列番号１記載
の塩基配列からなるDNA断片の３'末端側を、DNAリガー
ゼを用いて繰り返し連結する場合には、式（Ｉ）中の
「Ｘ」及び「Ｙ」の塩基数は０である。本発明のDNA
は、「Ｂ」で表される配列番号２記載の塩基配列からな
るDNA断片の５'末端側に、「Ａ」で表される配列番号１
記載の塩基配列からなるDNA断片の３'末端側を、DNAリ
ンカーを介して繰り返し連結することにより作製するこ
ともできる。

【００２１】例えば、PSPAL1（配列番号９）を含むエン
ドウゲノムDNAを鋳型とし、配列番号１又は２記載の塩
基配列の５'末端側と相補的な塩基配列からなるプライ
マー、配列番号１又は２記載の塩基配列の３'末端側と
同一の塩基配列からなるプライマー、或いはこれらのプ
ライマーの５'末端にDNAリンカーを付加したプライマー
を用いてPCRを行うことにより、配列番号１又は２記載
の塩基配列の一端又は両端にDNAリンカーが付加された
塩基配列からなるDNA断片を作製することができる。そ
して、これらのDNA断片の一端又は両端を適当な制限酵
素で切断し、制限酵素切断部位同士を式（Ｉ）に示され
る順序及び方向で連結することにより、「Ｂ」で表され
る配列番号２記載の塩基配列からなるDNA断片の５'末端
側に、「Ａ」で表される配列番号１記載の塩基配列から
なるDNA断片の３'末端側を、DNAリンカーを介して繰り
返し連結することができる。

【００２２】DNAリンカーの塩基数及び塩基配列は、式
（Ｉ）で表される塩基配列からなるDNAのプロモーター
活性を失わせない限り特に限定されない。DNAリンカー
としては、例えば、HindIIIリンカー、BamHIリンカー等
の市販のDNAリンカーを使用してもよいし、適当な制限
酵素認識配列をもったオリゴデオキシリボヌクレオチド
を化学合成して使用してもよい。DNAの一端又は両端を
切断する制限酵素は、DNAリンカーの種類に応じて適宜
選択することができる。制限酵素切断部位同士の結合
は、式（Ｉ）に示される順序及び方向で行う。このよう
な結合を効率的に行うために、制限酵素処理により付着
末端を生じるDNAリンカーを使用するのが好ましい。

【００２３】上記のように、「Ｂ」で表される配列番号
２記載の塩基配列からなるDNA断片の５'末端側に、
「Ａ」で表される配列番号１記載の塩基配列からなるDN
A断片の３'末端側を、DNAリンカーを介して繰り返し連
結する場合には、式（Ｉ）中の「Ｘ」及び「Ｙ」の塩基
数及び塩基配列は、連結したDNAリンカーの塩基数及び
塩基配列に相当する。本発明のDNAは、「Ａ−Ｂ」で表
される配列番号３記載の塩基配列からなるDNA断片の５'
末端側に、「Ａ」で表される配列番号１記載の塩基配列
からなるDNA断片の３'末端側を、上記のようにDNAリガ
ーゼを用いて又はDNAリンカーを介して連結することに
より作製することもできる。

【００２４】「Ａ−Ｂ」で表される配列番号３記載の塩
基配列からなるDNA断片は、「Ｂ」で表される配列番号
２記載の塩基配列からなるDNA断片の５'末端と「Ａ」で
表される配列番号１記載の塩基配列からなるDNA断片の
３'末端とをDNAリガーゼを用いて連結することにより作
製することができる。また、「Ａ−Ｂ」で表される配列
番号３記載の塩基配列からなるDNA断片は、PSPAL1（配
列番号９）を含むエンドウゲノムDNAを鋳型とし、配列
番号３記載の塩基配列の５'末端側に相補的な塩基配列
からなるプライマー及び配列番号３記載の塩基配列の
３'末端側と同一の塩基配列からなるプライマーを用い
てPCRを行うことにより得ることができる。

【００２５】さらに、「Ａ−Ｂ」で表される配列番号３
記載の塩基配列からなるDNA断片は、常法に従って化学
合成することもできる。上記のように、「Ａ−Ｂ」で表
される配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片の
５’末端側に、「Ａ」で表される配列番号１記載の塩基
配列からなるDNA断片の３'末端側を、DNAリガーゼを用
いて又はDNAリンカーを介して連結する場合には、式
（Ｉ）中の「Ｙ」の塩基数は０である。

【００２６】本発明のDNAは、プロモーター活性を有す
る限り、式（Ｉ）中の「Ａ」及び／又は「Ｂ」で表され
る塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換
又は付加されていてもよい。ここで、「１又は複数個の
塩基」とは、式（Ｉ）で表される塩基配列からなるDNA
のプロモーター活性を喪失させない限り、その個数は特
に限定されない。このような欠失、置換若しくは付加
は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部
位特異的変異誘発法(Nucleic Acids Res.10, 6487‐650
0, 1982)により生じさせることができる。

【００２７】本発明のDNAは、強力なプロモーター活性
を有する。従って、本発明のDNA及びその下流に連結し
た目的の遺伝子を含むベクターを宿主に導入することに
より、目的の遺伝子を発現させることができる。ここ
で、目的の遺伝子とは、それにコードされている遺伝子
産物（例えば、タンパク質、ｒRNA、アンチセンスRNA
等）の発現を目的とする遺伝子を意味する。本発明のDN
Aの下流に連結する目的の遺伝子は、特に限定されず、
いかなる遺伝子であってもよい。このような遺伝子とし
ては、例えば、TMVやCMVのコートタンパク質遺伝子等を
例示できる。

【００２８】ベクターを導入した形質転換体の検出を容
易にするために、本発明のDNAの下流に適当な選択マー
カーやレポーター遺伝子を挿入しておいてもよい。選択
マーカーとしては、一般的に使用される選択マーカー、
例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシ
ン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイ
シン等の抗生物質の耐性遺伝子を例示できる。植物を形
質転換する際に使用する好適な選択マーカーとしては、
例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ等をコードする
抗生物質耐性遺伝子を例示できる。また、植物を形質転
換する際に使用するレポーター遺伝子としては、β-グ
ルクロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ（LUX）
等を例示できる。ベクターの構築は、常法に従って行な
うことができる。ベクターの構築には、例えば、pUC1
8、pUC19、pBluescript、pBR322等を使用することがで
きる。

【００２９】ベクターを導入する宿主細胞は、本発明の
ベクターと適合し形質転換され得るものである限り特に
限定されず、一般的に使用される天然細胞、人工的に樹
立された組換え細胞などの種々の細胞を使用することが
できる。例えば、植物細胞（例えば、タバコ、シロイヌ
ナズナ、イネ）、動物細胞（例えば、ラット、ハムスタ
ー、サル、ヒト）、昆虫細胞（例えば、カイコ）、細菌
（例えば、大腸菌）、酵母等を使用することができる。
ベクターの宿主細胞への導入は、公知の方法を用いて行
なうことができる。例えば、プロトプラスト法（Mol.Ge
n.Genet.,168,111（1979））、リチウム法（J.Bacterio
l.,153,163(1983)）、エレクトロポレーション法（Natu
re,319,791(1986)）、リーフディスク法（Science,227,
129(1985)）、パーティクルガン法、塩化カルシウム
法、又はこれらの変法を使用することができる。本発明
のDNAは、特に葉、茎、根等の植物の器官において強力
なプロモーター活性を発揮し、その中でも特に根におい
て強力なプロモーター活性を発揮する。

【００３０】従って、例えば、本発明のDNAの下流に溶
菌タンパク質遺伝子（例えば、立枯病菌ファージの溶菌
遺伝子、卵白リゾチーム遺伝子、キチナーゼ遺伝子、T4
リゾチーム遺伝子）を連結して植物に導入することによ
り、溶菌タンパク質を葉、茎、根等の植物器官において
高度に発現させることができ、これによって、根から侵
入する細菌（例えば、Ralstonia solanacearum、Erwini
a carotovora）、葉や茎の傷から侵入する細菌（例え
ば、Pseudomonas syringae pv syringae、Pseudomonas
syringae pv tabaci）の植物感染を予防することができ
る。この際、植物への遺伝子導入法としては、アグロ
バクテリウムを用いる方法（Horschら.,Science,227,12
9(1985)、Hieiら.,Plant J.,6,271-282（1994））、エ
レクトロポレーション法（Frommら.,Nature,319,791(19
86)）、PEG法（Paszkowskiら.,EMBOJ.,3,2717(198
4)）、マイクロインジェクション法（Crosswayら.,Mol.
Gen.Genet.,202,179(1986)）、微小物衝突法（McCabe
ら.,Bio/Technology,6,923（1988））等を使用すること
ができるが、目的の植物に遺伝子を導入できる方法であ
る限り特に限定されない。また、宿主となる植物種も本
発明のベクターと適合し形質転換され得る植物種である
限り特に限定されず、例えば、双子葉植物では、タバ
コ、アラビドプシス、トマト、キュウリ、ニンジン、ダ
イズ、バレイショ、テンサイ、カブ、ハクサイ、ナタ
ネ、ワタ、ペチュニア等を使用することができ、単子葉
植物では、イネ、トウモロコシ、コムギ等を使用するこ
とができる。

【００３１】

【実施例】〔実施例１〕PSPAL1の単離（１）エンドウゲノムDNAの単離精製エンドウアラスカ種の種子をバーミキュライトに播種
し、暗黒下20℃で７日間培養して平均７cmの実生を得
た。この実生の胚軸部分を液体窒素下で磨砕し、E.Rich
ardsらの方法(Current Protocols in Molecular Biolog
y,２.3.1〜2.3.3, Green Publishing Associates and W
iley-Interscience, 1987)に従って可能な限り無傷のエ
ンドウゲノムDNAを抽出精製した。40ｇの実生から約７m
gのエンドウゲノムDNAが得られ、アガロースゲル電気泳
動で分析した結果、得られたエンドウゲノムDNAは比較
的無傷であることが確認された。

【００３２】（２）エンドウゲノムDNAライブラリーの
作製得られたエンドウゲノムDNAを用いて、制限酵素Sau3AＩ
（東洋紡績株式会社製)による部分消化反応を行った。
まず、予備実験として、１μgのエンドウゲノムDNAを用
いて、約20kbの断片が最も多く得られる部分消化反応の
条件を決定した。すなわち、１μgのエンドウゲノムDNA
にTris-Cl緩衝液(pH7.5)10mM、塩化マグネシウム10mM及
び食塩100mMを加えたチューブを７本用意し、各々のチ
ューブにSau3AＩを1.5、1.5^-2、1.5^-4、1.5^-8、1.
5^-16、1.5^-32、1.5^-64ユニット添加して37℃で正確に１
時間反応させた後、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)50m
M、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)0.5％を加えて反応を
停止した。これらについてアガロースゲル電気泳動で分
析し、最適と思われる条件を検討した結果、1.５^-4ユニ
ット添加したものが最適であったので、本実験として、
15μgのエンドウゲノムDNAを用いてこの条件で部分消化
反応を行った。

【００３３】次いで、ショ糖密度勾配遠心分離により、
部分消化反応を行ったエンドウゲノムDNAの中から約20k
bのDNA断片を分画した。20分画した各画分の一部を用い
てそのサイズをアガロースゲル電気泳動で分析した結
果、第５画分を選びだし、この画分をエタノール沈澱
(約2.5倍容量のエタノールを加えて約−20℃に冷却後、
遠心分離を行い沈澱を得る)により濃縮精製した。

【００３４】上記部分消化反応の結果、ベクターに連結
可能なエンドウゲノムDNAが10μg得られ、そのうち3.0
μgを用いて置換型ファージベクターEMBL3 DNA(STRATAG
ENE社製)との連結反応を行った。２本のチューブ各々に
1.5μgのエンドウゲノムDNA及び10μgのEMBL3 DNAを加
えて混和し、これにTris-Cl緩衝液(pH7.5)10mM、塩化マ
グネシウム10mM、ジチオトレイトール(DTT)10mM、アデ
ノシン三リン酸(ATP)１mM及びT4 DNAリガーゼ(Boehring
er Mannhrim社製)２ユニットを加え20℃で１時間、次い
で４℃で16時間反応させた後、68℃で５分間熱処理を行
い反応を停止した。

【００３５】次に、得られた組換えDNAをλファージの
外被タンパク (in vitro packagingkit^TM(Amersham社
製))と混和して20℃で２時間放置することにより、組換
えDNAを持つ組換えλファージを得た。一方、大腸菌711
8株を20mlのLBMM培地(トリプトン１％、食塩１％、酵母
エキス0.5％、硫酸マグネシウム10mM及びマルトース0.4
％を含有する培地)に接種し、30℃で10時間振とう培養
した。培養後、菌体を遠心分離により集め、あらかじめ
４℃に冷却しておいた10mlの硫酸マグネシウム10mMに懸
濁して、ファージが感染しやすい状態とした。こうして
得られた大腸菌に上記組換えλファージを混和後、37℃
で25分間放置して組み込ませ、0.７％の寒天を含むLBMM
培地に懸濁した。次いで、1.5％の寒天を含むLBMM培地
上に広げ、37℃で12時間培養した。

【００３６】（３）調節遺伝子を含むPAL遺伝子の選抜上記の結果、１μgのエンドウゲノムDNA当たり3.5×10⁵
個のプラークが得られ、これを用いてプラークハイブリ
ダイゼーションによりエンドウPAL遺伝子を有する組換
えλファージの選択を行った。まず、プラークが現れた
LBMM寒天培地上にナイロン膜(Hybond-N(Amersham社製))
を載せ１分間放置した後、プラーク吸着面を上側にして
変性溶液 (食塩1.5M、水酸化ナトリウム0.5M)を浸透さ
せた濾紙(3MMペーパー(Whatman社製))上に置き７分間放
置した。次いで中和溶液(食塩1.5M、Tris-Cl緩衝液 (pH
7.2)0.5M)を浸透させた濾紙上に同様に置き７分間放置
した。この中和処理を更に１回行った後、２倍SSC溶液
(食塩300mM、クエン酸ナトリウム30mM)でナイロン膜を
洗浄し、80℃で２時間放置して組換えDNAの固定を行っ
た。

【００３７】得られたナイロン膜を用いて、ラジオアイ
ソトープでラベルしたエンドウPALcDNAをプローブとし
たハイブリダイゼーションを行った。プローブのラベル
反応にはDNA labeling kit (Boehringer Mannhrim社製)
を用いランダムプライマーラベリング法 (J.Sambrook
等編、Molecular Cloning a laboratory manual,10.13
〜10.15,Cold Spring Harbor,1989)で行った。また、ハ
イブリダイゼーションは、J.Sambrook等編、Molecular
Cloning a laboratory manual,2.114〜2.117,Cold Spri
ng Harbor,1989記載の方法に従った。

【００３８】1.１×10⁶個のプラークから、最終的に４
個の陽性プラーク (♯１,♯７,♯11,♯12と識別した。)
が得られた。このものから常法に従って組換えλファー
ジのDNAを回収し、制限酵素SalI(東洋粉績株式会社製)
により消化反応を行った後、アガロースゲル電気泳動で
分析した結果、11.7Kb、12Kb、13Kb、及び13Kbの挿入DN
A断片が含まれていた。この挿入DNA断片について数種類
の制限酵素で消化反応を行い制限酵素地図を作成したと
ころ、得られた４個のクローンは２種のクローンである
ことかわかり、その一方をgPALlと名付けた。なお、得
られた制限酵素地図を図２に示した。

【００３９】（４）選抜した遺伝子の塩基配列の決定及
び調節遺伝子領域の推定 gPALl DNA断片に含まれるエンドウPAL構造遺伝子（PSPA
L1）とその5'上流域の塩基配列を、ダイデオキシヌクレ
オチド鎖終結法の原理に基づくSEQENASE^TMversion2.0
(U.S.B.社製)を用いてその説明書に従って決定した。PS
PAL1の塩基配列を配列番号９に示す。

【００４０】決定した塩基配列について検索したとこ
ろ、5'上流域には、転写開始点を＋１とした時、真核生
物の調節遺伝子に共通するTATAボックスが−34塩基目
に、CATAボックスが−64塩基目にそれぞれ存在してい
た。又、真核生物の転写を調節する重要な働きを持つと
考えられているSV40のエンハンサーに相当する配列や、
フェニルプロパノイド代謝に関与する遺伝子の調節領域
に見出される共通の配列も存在することが明らかとなっ
た。更に、gPALl DNA断片に含まれるエンドウPAL遺伝子
は、先に出願した明細書(特開平4-330285号)に記載され
ているエリシターで発現を誘導したPALcDNAの塩基配列
と相同であった。このことから、 gPALl DNA断片の5'上
流域のDNAは、エリシターによる誘導を受ける調節遺伝
子（PSPAL1プロモーター）であることが推定された。PS
PAL1プロモーターの塩基配列を配列番号８に示す。な
お、gPALlを常法により、大腸菌7118株に組み込んだ当
該形質転換体Escherichia coli 7118(p11E11)は、工業
技術院微生物工業技術研究所にFERM P-12608として寄託
されている（寄託日：平成3年11月18日）。

【００４１】〔実施例２〕BOX6リピートプロモーターの
構築（１）実施例１で単離したPSPAL1の「-1394〜+140」部
分（転写開始点を+1とする）とCATレポーター遺伝子と
をTakaRa Ligation Kit ver,2を用いて連結し、pUC18
（宝酒造株式会社）にクローニングしてpKY-03を構築し
た。次にこれをPstI及びXbaIで消化した後、Erase α-S
ystem（プロメガ）のエキソヌクレアーゼIII及びS1ヌク
レアーゼを用いて５'末端デリーションを行い、「-33
9」まで塩基を削った。こうして、PSPAL1の「-339〜+14
0」部分にCATレポーター遺伝子が連結した発現カセット
を有するプラスミドPSPAL1-15：CAT（in pUC18）を構築
し（図３及び図４）、以下のPCRの鋳型として用いた。

【００４２】（２）PSPAL1のうち、「−157〜＋140」部
分と「−157〜−91」部分とをPCRによって増幅するため
に、以下の3種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合
成した。なお、PSPAL1の「−157〜−91」部分内に含ま
れる「-102〜-91」部分（BoxI）、「-147〜-136」部分
（BoxII）及び「-157〜-151」部分（BoxIV）は、PSPAL1
プロモーター（配列番号８）のプロモーター活性に重要
な役割を果たしていることが知られている（Yamadaら,P
lant Cell Physiol.335：917-926（1994））。

【００４３】プライマー1：cccctgcagtaattaatattcaaca
aacc（配列番号４）プライマー2：cccatgcatggtaggtgaggaaagacaa（配列番
号５） CATプライマー：tagcttccttagctcctgaa（配列番号６）プライマー1はセンスプライマーである。プライマー1の
塩基配列のうち、「ctgcag」部分（下線部）は、PstI認
識配列であり、「taattaatattcaacaaacc」部分は、PSPA
L1の「−157〜−138」部分と同一の塩基配列である（図
３）。

【００４４】プライマー２はアンチセンスプライマーで
ある。プライマー2の塩基配列のうち、「atgcat」部分
（下線部）は、EcoT22I認識配列であり、「tggtaggtgag
gaaagacaa」部分は、PSPAL1の「−91〜−110」部分と相
補的な塩基配列である（図３）。CATプライマーはアン
チセンスプライマーであり、CATレポーター遺伝子にハ
イブリダイズする（図３）。PSPAL1-15（in pUC18）内
におけるプライマー１、プライマー２及びCATプライマ
ーの位置関係を図３及び図４に示す。

【００４５】（３）PSPAL1-15（in pUC18）を鋳型と
し、プライマー１及びCATプライマーを用いてPCRを行
い、PSPAL1の「−157〜＋140」部分を含むDNA断片（347
bp）を増幅した。このDNA断片には、BoxI、II及びIVの
組が１つ含まれている。PCR反応液の組成は以下の通り
である。

【００４６】 PSPAL1-15 (in pUC18) (10ng/ μL) ３μL 10×PCR buffer ５μL dNTP (2mM) ５μL プライマー1 (100pmol/μL) １μL CAT プライマー (100pmol/μL) １μL Taq DNA polymerase (1.25U/μL) １μL 滅菌水 34μL 合計 50μL

【００４７】PCRは、熱変性（94℃で2分）を１サイク
ル、熱変性（94℃で１分）、アニーリング（58℃で１
分）及び伸長反応（72℃で１分）を30サイクル、伸長反
応（72℃で10分）を１サイクル行い、その後4℃で保存
した。PCRによって得られたDNA断片（347bp）をPstIとB
amHIで消化した後（307bp）、pUC19（宝酒造株式会社
製）のPstI、BamHI切断部位に挿入した。このようにし
てPSPAL1の「−157〜＋140」部分を含むプラスミドを得
た。このプラスミドには、BoxI、II及びIVの組が１つ含
まれている。

【００４８】（４）次に、PSPAL1-15（in pUC18）を鋳
型とし、プライマー１及びプライマー２を用いて上記と
同様の条件下でPCRを行い、PSPAL1の「−157〜−91」部
分を含むDNA断片（84bp）を増幅した。このDNA断片に
は、BoxI、II及びIVの組が１つ含まれている。このDNA
断片（84bp）をPstIとEcoT22Iで消化した後（76bp）、E
coT22I切断部位とpUC19に連結したDNA断片（307bp）のP
stI切断部位とを連結した。なお、PstI切断部位とEcoT2
2I切断部位とは連結可能であり、連結した後はPstI及び
EcoT22Iでは切断されなくなる。このようして、PSPAL1
の「−157〜＋140」部分と「−157〜−91」部分とを含
むプラスミドを構築した（図５）。このプラスミドに
は、BoxI、II及びIVの組が２つ含まれており、PSPAL1の
「−157〜＋140」部分と「−157〜−91」部分との間に
は、連結の際に利用したDNAリンカーの配列「tgcag」が
存在する。

【００４９】同様にして、PSPAL1の「−157〜−91」部
分を含むDNA断片（76bp）のEcoT22I切断部位とpUC19に
連結したDNA断片のPstI切断部位とを連結していき、Box
I、II及びIVの組の数を３、４、５、６と増やしてい
き、最終的にはBoxI、II及びIVの組を６つ含むプラスミ
ドを作製した。BoxI、II及びIVの組を1つ含むDNA断片
（76bp）を１つ連結する毎に、塩基数が72bpずつ大きく
なるので、BoxI、II及びIVの組を６つ含むDNA断片の塩
基数は667bpとなった。繰り返し連結したPSPAL1の「-15
7〜−91」部分同士の間には、連結の際に利用したDNAリ
ンカーの配列「tgcag」が存在する。このBoxI、II及びI
Vの組を６つ含むDNA断片を以下では「BOX６リピートプ
ロモーター（BOX6 repeat promoter）」という。BOX6リ
ピートプロモーターを含むプラスミドを制限酵素（SphI
及びBamHI）で消化した後、得られたDNA断片をアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、BOX６リピートプロモータ
ー（673bp）のみを抽出・精製した。そして、得られたB
OX６リピートプロモーターの塩基配列を決定し、正しい
塩基配列であることを確認した。

【００５０】〔実施例２〕BOX６リピートプロモーター
とGUSレポーター遺伝子との連結 GUSレポーター遺伝子を含むpBI101.2（東洋紡）のBamHI
切断部位にBOX６リピートプロモーターを挿入し、プロ
モーター活性測定のためのベクターを構築した。 PSPAL1-15：CAT（in pUC18）をSphI及びBamHIで消化し
て、CATレポーター遺伝子を含むベクター断片（3.8kb）
を切り出し、アクリルアミドゲル電気泳動に供して抽出
・精製した。

【００５１】このCATレポーター遺伝子を含むベクター
断片とBOX６リピートプロモーターとを連結し、BOX６リ
ピートプロモーターの下流にCATリポーター遺伝子が連
結したベクターを構築した（図６）。また、M4^*プライ
マー：cccggatccgttttcccagtcacgac（配列番号７）を合
成した。M4^*プライマーのうち、「ggatcc」部分（下線
部）はBamHI切断部位であり、「gttttcccagtcacgac」部
分はpUC18の一部と相補的な塩基配列である（図６）。

【００５２】M4^*プライマーとCATプライマーを用いて上
記と同様の条件下でPCRを行い、得られた増幅DNA断片を
BamHIで消化して両端の余分な部分を除去した後、BOX6
リピートプロモーター部分のみを精製し、pBI101.2のBa
mHI切断部位に挿入した。pBI101.2内のBOX6リピートプ
ロモーターの方向性を制限酵素処理又はPCRにより確認
し、正しい方向に挿入されたもののみを選抜した。この
ようにしてBOX6リピートプロモーターとGUSレポーター
遺伝子とが連結したDNA断片を含むベクターを構築し
た。

【００５３】〔実施例３〕BOXリピートプロモーターの
プロモーター活性の測定実施例２で構築したベクターをタバコ植物に導入して、
BOX6リピートプロモーターのプロモーター活性測定を行
った（２例）。ベクターのタバコ植物への導入は、リー
フディスク法を用いて行った。すなわち、タバコ種子を
5％次亜塩素酸ナトリウムで10分間、70％エタノールで1
0分間表面殺菌して、組織培養用固形培地（MS培地：Phy
siol.Plant 15：473-497.（1962））に播種して無菌的
にタバコを育成した。得られた無菌タバコ葉片又は茎切
片を上記ベクターに導入したアグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス LBA4404培養懸濁液に10分間浸漬し、余分
な液をろ紙で取り除いた後にベンジルアミノプリン、ナ
フタレン酢酸の入った組織培養用固形培地に暗所で2日
間置床した。次いで、除菌用抗生物質セファタキシムと
選択用抗生物質カナマイシンとを含む組織培養用固形培
地に移植し、培養を続けた。

【００５４】そして、培養ボトルでタバコ植物を生長さ
せ、背丈が約8cmとなったところで、第２位葉（上
葉）、第６位葉（中葉）及び第９位葉（下葉）の葉の中
央部、茎頂から約１cmの茎部分（上茎）、根元から約１
cmの茎部分（下茎）、並びに根を採取し、これらの部分
におけるGUS発現量を4-MU（4-methylumbelliferylβ-D-
glucuronide）を基質として蛍光定量法で測定した。タ
バコ植物の各部分におけるGUS発現量の定量結果（２
例）を以下の表１に示す。

【００５５】

【表１】

【００５６】PSPAL1プロモーター（配列番号８）を使用
して既に上記と同様の実験が行われており、PSPAL1プロ
モーター（配列番号８）を使用した場合のGUS発現量
は、上葉では1450、上茎では3500、下茎では10840、根
では20120であったことが報告されている（単位は4MUpm
ol/min/mg protein）（引用文献：Plant Cell Physiol.
38(7):792-803(1997)）。また、CAMV35Sプロモーターを
使用して上記と同様の実験を行ったところ、上葉では99
80であった（単位は4MUpmol/min/mg protein）。

【００５７】BOX6リピートプロモーター、PSPAL1プロモ
ーター（配列番号８）及びCAMV35Sプロモーターを使用
した場合の各器官におけるGUS発現量の比較を図７に示
す。さらに、PSPAL1プロモーターに対するBOX6リピート
プロモーターの比活性を以下の表2に示す。なお、表２
中、「PSPAL」はPSPAL1プロモーターを使用した場合、
「BOX6」はBOX6リピートプロモーターを使用した場合を
表す。

【００５８】

【表２】

【００５９】また、PSPAL1プロモーター（配列番号８）
の上葉における活性を１としたときの比活性を以下の表
３に示す。

【００６０】

【表３】

【００６１】図７及び表１〜３に示すように、BOX6リピ
ートプロモーターは、PSPAL1プロモーター及びCAMV35S
プロモーターよりも、すべて器官においてプロモーター
活性が高かった。また、BOX6リピートプロモーターは、
下茎及び根におけるプロモーター活性が特に高かった。
このことから、BOX6リピートプロモーターは、強力なプ
ロモーター活性を有していることが判明した。

【００６２】なお、第１例及び第２例のタバコから抽出
したDNAをBamHI又はEcoRIで切断し電気泳動した後、ラ
ンダムプライマーラベリングキットを用いて標識したGU
Sレポーター遺伝子断片（1.02kb）をプローブとしてサ
ザンハイブリダイゼーションを行った結果、第１例にお
いては１本のバンドが検出されたが、第２例においては
２本のバンドが検出された（図８）。図８中、レーン１
は第１例のタバコから抽出したDNAをBamHIで切断した場
合、レーン２は第１例のタバコから抽出したDNAをEcoRI
で切断した場合、レーン３は第２例のタバコから抽出し
たDNAをBamHIで切断した場合、レーン４は第２例のタバ
コから抽出したDNAをEcoRIで切断した場合の結果を示
す。第１例及び第２例はほぼ同じGUS発現量であること
から、GUS遺伝子が２コピー存在していても、BOX６リピ
ートプロモーターは１つのGUS遺伝子にしか機能しない
か、又はBOX６リピートプロモーターの活性がかなり高
いので転写活性が最大であると考えられる。

【００６３】

【発明の効果】本発明のDNAは、強力なプロモーター活
性を有する。従って、本発明のDNAをプロモーターとし
て用いて外来遺伝子を宿主に導入すれば、宿主内におい
て外来遺伝子を効率よく発現させることができる。ま
た、本発明のDNAは、葉、茎、根等の植物器官における
プロモーター活性が特に高く、その中でも根におけるプ
ロモーター活性が特に高い。従って、例えば、本発明の
DNAの下流に溶菌タンパク質遺伝子を連結して植物に導
入することにより、葉、茎、根等の植物器官において溶
菌タンパク質遺伝子を高度に発現させることができ、こ
れによって、根から侵入する病原菌や葉、茎等の傷から
侵入する病原菌の感染を防止することができる。

【００６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN TOBACOO INC. <120> promoter <130> J99-0024 <160> 9 <210> 1 <211> 67 <212> DNA <213> Pisum sativum L. <400> 1 taattaatat tcaacaaacc acttttcttt ttttctactt gtgcaacttg tctttcctca 60 cctacca 67 <210> 2 <211> 230 <212> DNA <213> Pisum sativum L. <400> 2 aactcacata tcacaccaac acacatgcaa tgcacaatac tacatttcaa agtctctata 60 taaagcttaa ccactcttcc ttcacatctc aggaaactca taactctttc attttctttc 120 ataatcattt gagtttccat tctcttgaaa ttcttgcaac caattctcaa caaagaaaca 180 ttagttactt tagtatcaat taaaatggaa acagtagcag cagccataac 230 <210> 3 <211> 297 <212> DNA <213> Pisum sativum L. <400> 3 taattaatat tcaacaaacc acttttcttt ttttctactt gtgcaacttg tctttcctca 60 cctaccaaac tcacatatca caccaacaca catgcaatgc acaatactac atttcaaagt 120 ctctatataa agcttaacca ctcttccttc acatctcagg aaactcataa ctctttcatt 180 ttctttcata atcatttgag tttccattct cttgaaattc ttgcaaccaa ttctcaacaa 240 agaaacatta gttactttag tatcaattaa aatggaaaca gtagcagcag ccataac 297 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 cccctgcagt aattaatatt caacaaacc 29 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 cccatgcatg gtaggtgagg aaagacaa 28 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 tagcttcctt agctcctgaa 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 cccggatccg ttttcccagt cacgac 26 <210> 8 <211> 1508 <212> DNA <213> Pisum sativum L. <400> 8 aaaaatgtac ttgggacatt agagatcatt acgaaattaa ggaacttttt tactcgagat 60 gtgatgtcta cctttttgac acacttgggg gtgctataat tacttggatt agaaaatgat 120 cacgttcctg ttggatatgt gaagatatat ttcaagagct tattgtttat taaaattctg 180 ataactttaa gcaaatatct ggagaaaaaa aaacataaag catctaaagt tggcggctgc 240 aactacgcat cattaagtat taatgttgtt gaggttagcc cgaaggattg taaatttatt 300 tattttttaa ttaaattttt atttagattt tagattaatt aaatataatt attattttta 360 attatgtttt catttaatta gcgtgaagac cggagtataa ttctgtttct taatgagatc 420 catgcggaga ctcatatcaa gaaaaataag gagtatgtac aagaaaaaat aaagcatgtt 480 cttttgatat ttagttattt tttgacaaac ctaatttatt taaattatga taatatcttc 540 ttttttatag gagaagtatg ataaagaact ccccatttat ctatcagaga atcctagatt 600 acatgcaccg ccaccaagat atcctacttt ctagtgtgtc attcaagact tattatggtg 660 tatcatacgg aaagaagaaa aataggagag tgtatggtgt tgaattattg accatacaaa 720 acaaaatgag gttagatttg cgaaggataa aacctttgac aattaccaat gcgataaatc 780 cctcacgaat atttattttg tgatgaattt ttgcacttgt gagagattta accctcacaa 840 aagagtctta tagtgttatt tttatattaa tttgttaatt aatatgtagg aatgtagtat 900 aattaaaaag gtgtagtcat ttatcctatt acttacaata ttgtgatttg agacactctt 960 taagtaaatg atgattgata agtatagtag tataaaaatt tataaataat ataatgtatg 1020 cattgggttg accgacattt agagttgaat ctaaagtcat ggtcatgcat ggttgcttcc 1080 accatatttc ttgccaacta cctcgtgttt ctcttagtct attgccatcc acccatatgc 1140 atctatctac caacccaaaa acaaagaaaa ccaaaaccct agattgccac gttacaaaat 1200 cttaactgtt cattagtaag tgatgatcaa acggccataa ttaatattca acaaaccact 1260 tttctttttt tctacttgtg caacttgtct ttcctcacct accaaactca catatcacac 1320 caacacacat gcaatgcaca atactacatt tcaaagtctc tatataaagc ttaaccactc 1380 ttccttcaca tctcaggaaa ctcataactc tttcattttc tttcataatc atttgagttt 1440 ccattctctt gaaattcttg caaccaattc tcaacaaaga aacattagtt actttagtat 1500 caattaaa 1508 <210> 9 <211> 4415 <212> DNA <213> Pisum sativum L. <400> 9 aaaaatgtac ttgggacatt agagatcatt acgaaattaa ggaacttttt tactcgagat 60 gtgatgtcta cctttttgac acacttgggg gtgctataat tacttggatt agaaaatgat 120 cacgttcctg ttggatatgt gaagatatat ttcaagagct tattgtttat taaaattctg 180 ataactttaa gcaaatatct ggagaaaaaa aaacataaag catctaaagt tggcggctgc 240 aactacgcat cattaagtat taatgttgtt gaggttagcc cgaaggattg taaatttatt 300 tattttttaa ttaaattttt atttagattt tagattaatt aaatataatt attattttta 360 attatgtttt catttaatta gcgtgaagac cggagtataa ttctgtttct taatgagatc 420 catgcggaga ctcatatcaa gaaaaataag gagtatgtac aagaaaaaat aaagcatgtt 480 cttttgatat ttagttattt tttgacaaac ctaatttatt taaattatga taatatcttc 540 ttttttatag gagaagtatg ataaagaact ccccatttat ctatcagaga atcctagatt 600 acatgcaccg ccaccaagat atcctacttt ctagtgtgtc attcaagact tattatggtg 660 tatcatacgg aaagaagaaa aataggagag tgtatggtgt tgaattattg accatacaaa 720 acaaaatgag gttagatttg cgaaggataa aacctttgac aattaccaat gcgataaatc 780 cctcacgaat atttattttg tgatgaattt ttgcacttgt gagagattta accctcacaa 840 aagagtctta tagtgttatt tttatattaa tttgttaatt aatatgtagg aatgtagtat 900 aattaaaaag gtgtagtcat ttatcctatt acttacaata ttgtgatttg agacactctt 960 taagtaaatg atgattgata agtatagtag tataaaaatt tataaataat ataatgtatg 1020 cattgggttg accgacattt agagttgaat ctaaagtcat ggtcatgcat ggttgcttcc 1080 accatatttc ttgccaacta cctcgtgttt ctcttagtct attgccatcc acccatatgc 1140 atctatctac caacccaaaa acaaagaaaa ccaaaaccct agattgccac gttacaaaat 1200 cttaactgtt cattagtaag tgatgatcaa acggccataa ttaatattca acaaaccact 1260 tttctttttt tctacttgtg caacttgtct ttcctcacct accaaactca catatcacac 1320 caacacacat gcaatgcaca atactacatt tcaaagtctc tatataaagc ttaaccactc 1380 ttccttcaca tctcaggaaa ctcataactc tttcattttc tttcataatc atttgagttt 1440 ccattctctt gaaattcttg caaccaattc tcaacaaaga aacattagtt actttagtat 1500 caattaaaat ggaaacagta gcagcagcca taacaaaaaa caacggttac gagtcatttt 1560 gcgtgacaaa tgctaagaat aataacatga aagttaacag tgctgatcct ttgaattggg 1620 gtgttgccgc cgaggcaatg aaagggagtc acttggatga ggtgaagcgt atggtggagg 1680 agtacaggaa gccggtggtc cgccttggtg gcgagacact gacgatttct caggtggctg 1740 ccattgccgc acatgatcat ggtgttaagg tggagttgtc agaatctgct agggctggcg 1800 ttaaggcgag cagtgactgg gtgatggaga gtatgaacaa aggcacagac agttacggtg 1860 ttactaccgg tttcggcgcc acctctcacc ggagaaccaa acaaggtggt gctttgcaga 1920 aagaactcat caggtaatgt atactttttt tctttcttaa tttgcatata agtatctcct 1980 tatagataaa tatcatggat ttattattaa agccaactat tttaattatt tagccacaaa 2040 taaaaattct ttgcatgtat ataaattaaa tccattcaat atatatattt ctaaaaaatt 2100 tccttattgt tatgagtaca ttaaatattt gataattttt ttgttgtttt ggtacagcta 2160 tttgaaactt ttttaattag ttaatacata ttaaagtgtt tttttttcaa cgcagtactc 2220 aaaaataaaa acaagcggta gggtattcta accactactg ataaatacca taaagtgcgt 2280 tttattttgt ggaatgttat gaatttttca agtttactta aagcttcaac taattattaa 2340 gtaacatttt tttatgagta aacatttgtt aacttacatt ttttagttta ttcaataaaa 2400 aaactttttt tgtagtgtat gggtaacaaa aaatatattt ttaaattttt tttaattact 2460 tactctactt aattcttgat ttcaggtttt tgaatgctgg aatatttgga aatggaactg 2520 agtcaagcca tacactacca cacacagcaa caagagctgc catgcttgtg agaatcaaca 2580 cacttctcca aggttattca ggaattagat ttgaaatctt ggaagctata accaaactca 2640 ttaacaacaa cgtcacccca tgtttactcc gtggtacaat cacagcttcc ggagatttag 2700 tccctctttc ttatattgct ggtttactaa cgggaagacc aaattcaaaa gctcatggga 2760 cctctgggga aattcttaat gcaaaagaag cttttcagtc agctgaaatc aatgatggtt 2820 tctttgaatt gcaaccaaaa gaaggtcttg cacttgttaa tggaactgct gttggttctg 2880 gtttagcttc tattgttcta tttgaagcta acatattggc tgtcttgtct gaagtcctat 2940 ccgctatttt tgctgaagtt atgcaaggga aacctgagtt tactgatcat ttgacacata 3000 aattgaagca ccatcctggt caaattgagg ctgctgctat tatggaacac attttggatg 3060 gaagtgctta tgtcaaagca gctaagaagt tgcatgagat ggatcctttg cagaaaccaa 3120 aacaagatag atatgcactt agaacttcac cgcaatggct tggtcctctt attgaagtca 3180 ttagattctc tactaagtca attgagaggg agatcaactc tgttaatgat aaccctttga 3240 ttgatgtttc aagaaacaag gctttgcatg gtggaaactt tcaaggaaca cctattggtg 3300 tatccatgga taatacacgt ttggctcttg cgtcaattgg taaactcttg tttgctcaat 3360 tctctgaact cgtcaatgat ttttacaaca acgggttgcc ttcgaatctc tcagctagta 3420 gaaatcccag cttggattat ggattcaagg gatccgaaat tgccatggct tcttattgtt 3480 ctgagttaca atatcttgca aacccagtta caactcatgt tcaaagtgct gagcaacaca 3540 accaagatgt gaactctttg ggtttgatat cttctaggaa aacatatgaa gccattgaga 3600 tccttcaact catgtcttcc acattcttga ttgcactttg ccaagcagtt gacttaagac 3660 atttggagga gaatttgaaa aactcagtta agaacattgt aagccaagtt gctaaaagga 3720 cccttacaac aggtgtgaat ggagaacttc atccttcaag gttttgtgaa aaggacttgt 3780 tgagagtggt tgatagggag catgtgtttg cctatattga tgatccttgt agtgctacat 3840 atccattgat gcaaaaattg aggcaggtgt tagtggatca tgcattagta aatggtgaat 3900 ctgagaagaa tttgaacaca tcaatcttcc aaaagattgc aacatttgag gatgagttaa 3960 agaccctttt gccaaaagag gtagaaagta ctagggctgc atatgagagt ggaaatccaa 4020 cagttccaaa caagataaat ggatgcagat cttatccact ttataggttt gtgagacaag 4080 agttgggaac tggtttgcta acaggagaaa aggtcatttc accaggtgag gagtgtgata 4140 agttgttcac agctatatgt caaggaaaga tcatcgatcc tcttcttcaa tgcttgggag 4200 actggaacgg tgctcctctt ccaatttctt aactttaggt tattttaaga aaaattattt 4260 gtatctatat atgcatgtat tgcaataatc actaggtttg tcatgctttt aacaattaat 4320 atggaaatct ccatttcaat ttcttttaat gtcaatgtga aacttgtaat ttacttttat 4380 aatagaactt catttgtttg acatagcttt taata 4415

【図面の簡単な説明】

【図１】PSPAL1の塩基配列のうち、転写開始点を＋1と
した場合に「−157〜−91」及び「−90〜＋140」で表さ
れる部分を表す図である。

【図２】PSPAL1の制限酵素地図を表す図である。

【図３】PSPAL1-15：CAT（in pUC18）におけるプライマ
ー１、プライマー２及びCATプライマーの結合部位を表
す図である。

【図４】構築したプラスミドの模式図である。

【図５】構築したプラスミドの模式図である。

【図６】構築したプラスミドの模式図である。

【図７】PSPAL1プロモーター、BOX6リピートプロモータ
ー及びCAMV35Sプロモーターを使用した場合のGUS発現量
を比較した図である。

【図８】電気泳動写真を表す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年３月１８日（１９９９．３．１
８）

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】

【書類名】受託番号変更届

【整理番号】Ｊ９９−００２４

【提出日】平成１１年４月１４日

【旧寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１２６０８

【新寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−６６９８

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者一瀬勇規岡山県岡山市津島４−18−Ｈ２−205 (72)発明者藤原朋子広島県広島市安佐南区長束西１−12−22 (72)発明者小澤英徳静岡県磐田郡豊田町東原700 日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所磐田駐在内Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 DA01 EA04 FA02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の式（Ｉ）で表される塩基配列から
なり、かつプロモーター活性を有するDNA。【化１】Ａ−[Ｘ−Ａ]_n−Ｙ−Ｂ（Ｉ）（式中、Ａは配列番号１記載の塩基配列を表し、Ｂは配
列番号２記載の塩基配列を表す。Ｘ及びＹは塩基数０〜
６の任意の塩基配列を表し、Ｘ及びＹ並びにＸ同士は同
一でも異なってもよい。nは１〜８の整数を表す。）
【請求項２】前記Ｙの塩基数が０であることを特徴と
する請求項１記載のDNA。
【請求項３】前記Ａ及び／又はＢで表される塩基配列
において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加さ
れていることを特徴とする請求項１又は２記載のDNA。
【請求項４】前記nが５であることを特徴とする請求
項１〜３のいずれか１項に記載のDNA。