CN117304291A - 一种蛋白GsEXLB14及相关生物材料与其在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用 - Google Patents
一种蛋白GsEXLB14及相关生物材料与其在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白GsEXLB14及相关生物材料与其在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用，属于生物技术领域。本发明解决了目前耕地土壤盐渍化程度的加剧及干旱等极端气候条件使大豆生长受到限制、产量与品质降低的问题。所述蛋白GsEXLB14为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白或在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白的N端/C端连接标签得到的融合蛋白。本发明所述的蛋白GsEXLB14及相关生物材料能够应用于培育抗盐和干旱胁迫转基因植物。本发明所述的蛋白GsEXLB14及相关生物材料对于农作物的抗性分子育种具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白GsEXLB14及其编码基因与应用。
背景技术
耕地土壤盐渍化程度的加剧及干旱等极端气候条件的频繁出现使农业生产安全面临作物生长受到限制、产量与品质降低等问题的威胁。大豆是我国尤其是北方重要的主栽经济作物，能够提供大量的蛋白和油料。随着全球对大豆需求量的逐年增加，增产、提质成为现阶段我国大豆产业发展的重点方向。栽培大豆的遗传多样性在长期的人为选择育种中逐渐降低，致使其对盐和干旱等非生物胁迫的抗性较差。土壤盐渍化导致栽培大豆的耕作面积减少，同时限制了其生长发育。同时，干旱胁迫对大豆的影响同样较大，造成产量的降低。面向国家对大豆产业增产与提质的重大需求，迫切需要培育耐盐、耐干旱的大豆品种，以实现在盐渍化土壤耕作大豆的产业要求及增强大豆耐旱性以保证产量。
发明内容
本发明提供一种蛋白GsEXLB14及相关生物材料与其在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用，解决了目前耕地土壤盐渍化程度的加剧及干旱等极端气候条件使大豆生长受到限制、产量与品质降低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种蛋白质，所述蛋白质的名称为GsEXLB14，所述蛋白质为氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的蛋白质或在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白质的N端/C端连接标签得到的融合蛋白质。
与所述蛋白质相关的生物材料，来自下述A1至A8中的任意一种：
A1：编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
A2：含有A1所述核酸分子的表达盒；
A3：含有A1所述核酸分子的重组载体；
A4：含有A2所述的表达盒的重组载体；
A5：含有A1所述核酸分子的重组微生物；
A6：含有A2所述表达盒的重组微生物；
A7：含有A3所述重组载体的重组微生物；
A8：含有A4所述重组载体的重组微生物。
进一步的，A1所述核酸分子为下述B1或B2或B3所述的基因中任意一种：
B1：其核酸序列是如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子；
B2：与B1限定的核酸序列具有75％或75％以上同一性、且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
B3：与B1或B2限定的核苷酸序列杂交、且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述蛋白质在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用。
进一步的，所述的应用为在大豆毛状根中表达所述蛋白质得到转基因大豆毛状根。
进一步的，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导所获得的大豆毛状根。
所述蛋白质在培育抗盐和干旱胁迫转基因植物中的应用。
所述蛋白质相关的生物材料在培育抗盐和干旱胁迫转基因植物中的应用。
本发明发现了一种与植物盐和干旱胁迫抗性相关的扩展蛋白GsEXLB14，本发明的试验结果证明，在大豆毛状根中过表达GsEXLB14基因可增加转基因毛状根对盐和干旱胁迫的耐受性，证明了GsEXLB14蛋白具有提高植物耐盐和干旱胁迫能力的潜质，对于大豆的种质改良，培育耐盐、耐干旱的大豆品种具有重要意义。
附图说明
图1为表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14构建的示意图；
图2为转基因大豆毛状根的分子鉴定；
图3为对照组大豆毛状根(K599空菌诱导)及转基因大豆毛状根分别在正常生长条件下、150mM NaCl模拟盐胁下及100mM Mannitol模拟干旱胁迫下的表型；
图4为对照组大豆毛状根(K599空菌诱导)及转基因大豆毛状根分别在正常生长条件下、150mM NaCl模拟盐胁下及100mM Mannitol模拟干旱胁迫下表型的量化数据；A表示毛状根数量的相对增长量；B表示毛状根总根长的相对增长量；C表示毛状根总重量的相对增长量。
具体实施方式
实施方式一
本发明所提供的与植物非生物胁迫抗性相关的蛋白名称为GsEXLB14，为下述a、b和c中的任意一种蛋白质：
a氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
b在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白质的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中如SEQ ID NO.2由251个氨基酸残基组成。
上述c中的蛋白质GsEXLB14，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c中的蛋白质GsEXLB14可以人工进行合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c中的蛋白质GsEXLB14的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失1个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变的编码序列得到。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GsEXLB14蛋白相关的生物材料。
本发明提供的与GsEXLB14蛋白相关的生物材料为下述A1至A8中任意的一种：
A1：编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
A2：含有A1所述核酸分子的表达盒；
A3：含有A1所述核酸分子的重组载体；
A4：含有A2所述的表达盒的重组载体；
A5：含有A1所述核酸分子的重组微生物：
A6：含有A2所述表达盒的重组微生物；
A7：含有A3所述重组载体的重组微生物；
A8：含有A4所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，A1所述核酸分子为如下B1或B2或B3所示的基因：
B1：其核酸序列是如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子；
B2：与B1限定的核酸序列具有75％或75％以上同一性且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
B3：与B1或B2限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO.1由756个核苷酸组成，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本领域的普通技术人员可以很容易的采取已知的方法，例如定向进化或点突变的方法对本发明的编码GsEXLB14蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsEXLB14蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsEXLB14蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”是指与天然核苷酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可用百分比(％)表示，用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，(A2)所述的含有编码GsEXLB14蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达GsEXLB14蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsEXLB14转录的启动子，还可包括终止GsEXLB14转录的终止子。所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子、组织或器官或发育特异的启动子及诱导性启动子。
可用现有的表达载体构建含有所述GsEXLB14基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻近区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了方便对转基因植物细胞或植物个体进行筛选与鉴定，可以对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、抗生素抗性基因(如卡那霉素抗性基因NPTII，潮霉素抗性基因hph等)、赋予植物对除草剂的抗性基因(如对膦丝菌素抗性的bar基因，对草甘膦抗性的EPSPS基因等)、抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，也可不添加任何选择性标记基因，直接通过逆境条件筛选转化植株。
上述生物材料中，所述的载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可以为酵母、细菌、藻或真菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
为了解决上述技术问题，本发明还提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
本发明提供了GsEXLB14蛋白或上述相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。
上述应用中，所述调控为提高。
本发明还提供了GsEXLB14蛋白或上述相关生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种培育抗逆性提高的转基因材料。
本发明提供的培育抗逆性提高的转基因材料的方法包括在大豆毛状根中过表达GsEXLB14蛋白，得到转基因大豆毛状根的具体步骤；所述转基因大豆毛状根的抗逆性高于受体大豆毛状根。
上述方法中，所述转基因大豆毛状根的抗盐胁迫和抗干旱胁迫能力高于所述受体大豆毛状根的体现在：转基因毛状根的毛状根数量的相对增长量大于受体大豆毛状根、并且转基因大豆毛状根的总根长的相对增长量大于受体大豆毛状根、并且转基因大豆毛状根的总重量的相对增长量大于受体大豆毛状根。上述方法中，所述提高受体植物中GsEXLB14蛋白质活性的方法为在受体材料中过表达GsEXLB14蛋白。
上述方法中，所述过表达的方法为将GsEXLB14蛋白的编码基因导入受体材料。所述GsEXLB14蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述方法中，所示大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。
在本发明的一个实施方式中，GsEXLB14蛋白的编码基因即SEQ ID NO.1所示的核苷酸通过含有GsEXLB14蛋白的编码基因的表达盒的重组载pCAMBIA1302-GsEXLB14导入发根农杆菌K599中。所述重组表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14为将SEQ ID NO.1所示的分子插入pCAMBIA1302载体的PmlI酶切位点之间，且保持pCAMBIA1302载体的其它序列不变得到的表达载体。所述重组载体pCAMBIA1302-GsEXLB14表达GsEXLB14蛋白。
上述方法中，所述抗逆性为抗盐胁迫、抗干旱胁迫，所述抗盐胁迫具体为抗NaCl(氯化钠)胁迫，所述抗干旱胁迫具体为抗Mannitol(甘露醇)胁迫。体现为在NaCl和Mannitol胁迫的条件下：转基因大豆毛状根的毛状根数量的相对增长量、毛状根的总根长的相对增长量及毛状根的总重量的相对增长量均高于受体大豆毛状根。
上述方法中，所述受体大豆毛状根为通过发根农杆菌所诱导的大豆毛状根。
上述方法中，所述转基因大豆毛状根可以理解为将所述GsEXLB14基因转化到目的植物子叶节得到的转基因毛状根。也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整的植株和细胞。
扩增编码上述GsEXLB14蛋白的核酸分子全长或其片段的引物也属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值，数据表示为平均值±标准差。
下述实施例中的野生大豆W05种子在文献“Feng X,Li C,He F,et al.Genome-Wide Identification of Expansin Genes in Wild Soybean(Glycine soja)andFunctional Characterization of Expansin B1(GsEXPB1)in Soybean Hair Root.Int JMol Sci.
2022；23(10):5407.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的发根农杆菌及pCAMBIA1302表达载体在文献“李翠婷,王琳琳,李凤兰,等.野生大豆GsEXPA3基因的生物信息学、逆境转录及毛状根转化分析[J].大豆科学,2023,42(03):268-275.”中公开过，公众可从东北农业大学获得。
下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell是北京全式金生物技术股份有限公司的产品。
实施例1、野生大豆GsEXLB14基因的克隆
(1)、植物材料的处理
选取饱满、大小均一的野生大豆W05种子，经98％浓硫酸浸泡10min后用无菌水冲洗3次，放入铺有滤纸的无菌培养皿中，始终保持滤纸处于湿润状态于25℃条件下暗培养。待胚根突破种皮1cm左右后移入营养钵(9cm直径，100％蛭石+霍格兰营养液)中培养30d(25/22℃昼夜温度，16/8h光照周期)，选取长势一致的野生大豆植株，对植株根部进行取样(0.2g)，用无菌锡箔纸包裹，液氮速冻后置于-80℃保存备用。
(2)、RNA的提取
采用Plant RNA Kit(北京全式金生物技术股份有限公司)对上述野生大豆植株根系样本进行总RNA的提取。
(3)、cDNA的获得
以上述步骤中获得的RNA为基础，采用IV One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术股份有限公司)对RNA进行反转录获得cDNA。
(4)、PCR扩增
以上述步骤获得的野生大豆cDNA为模板，采用GsEXLB14-Clone-FW和GsEXLB14-Clone-RV引物及DNA Polymerase(北京全式金生物技术股份有限公司)试剂盒进行PCR扩增，得到包含GsEXLB14基因的扩增产物，引物序列如下：
GsEXLB14-Clone-FW：5’-3’CCCTGTGCTTGACACTTTTG(SEQ ID NO.3)
GsEXLB14-Clone-RV：5’-3’CGACTCACCACAAAGGAACA(SEQ ID NO.4)
PCR扩增条件：94℃5min，94℃30sec，57℃30sec，72℃45sec，30个循环，72℃7min，4℃终止反应。
将PCR扩增产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，对目的大小片段(895bp)通过PCR Purification Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)进行纯化回收，回收产物通过/>-T3Cloning Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)与T3克隆载体进行连接得到重组质粒，将其命名为pEASY-T3-GsEXLB14。将构建好的质粒转化至大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中，并送交测序公司进行测序。
测序结果表明：PCR扩增获得大小为895bp的片段，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO.5所示，该序列完整包含序列表中SEQ ID NO.1所示序列，ORF(开放阅读框)为SEQ IDNO.5的第30-785位，ORF序列与SEQ ID NO.1所示序列的一致性为100％，所获得的基因即为野生大豆GsEXLB14基因。
实施例2、转基因大豆毛状根的获得及其在盐与干旱胁迫下的表型分析
一、表达载体的构建
1.包含酶切位点GsEXLB14基因的获得
以pEASY-T3-GsEXLB14克隆载体为模板，采用GsEXLB14-SmaI-FW和GsEXLB14-SmaI-RV引物以及DNA Polymerase(北京全式金生物技术股份有限公司)试剂盒进行PCR扩增，得到在上下游分别添加SmaI限制性内切酶位点的GsEXLB14基因，引物序列如下：
GsEXLB14-SmaI-FW：5’-3’TCCCCCGGGATGGAACTTAATTTTA(SEQ ID NO.6)
GsEXLB14-SmaI-RV：5’-3’TCCCCCGGGACCAAGCTGAATTTCG(SEQ ID NO.7)
PCR扩增条件：94℃5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃45sec，30个循环，72℃7min，4℃终止反应。
将上述PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后利用PCRPurification Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)进行纯化回收，回收产物通过/>-T3Cloning Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)与T3克隆载体进行连接得到重组质粒，将其命名为pEASY-T3-GsEXLB14-SmaI。将构建好的质粒转化至大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中，并送交测序公司进行测序。
测序结果表明：PCR扩增获得大小为771bp的片段，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO.8所示，已经在GsEXLB14基因的上下游分别添加了SmaI酶切位点，且下游已经去掉了终止密码子TAA。
2.表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14的构建
采用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs LTD)对pEASY-T3-GsEXLB14-SmaI载体进行酶切，酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测后利用PCRPurification Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)对小片段(759bp大小)进行纯化回收。采用限制性内切酶PmlI(New England Biolabs LTD)对pCAMBIA1302表达载体进行单酶切，酶切产物经小牛肠碱性磷酸酶(CIP，New England Biolabs LTD)去磷酸化处理后经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并进行纯化回收。pEASY-T3-GsEXLB14-SmaI及pCAMBIA1302载体的经纯化后的目标酶切产物通过T4 DNA连接酶(New England Biolabs LTD)进行连接(SmaI及PmlI酶切位点均为平末端，可连接)，得到重组表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14，连接产物转化至大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中，用于载体扩繁及检测。
3.表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14的检测
以包含pCAMBIA1302-GsEXLB14重组表达载体的Trans1-T1大肠杆菌的单克隆菌落为模板，利用GsEXLB14-identify-FW及GsEXLB14-identify-RV引物以及DNAPolymerase(北京全式金生物技术股份有限公司)试剂盒进行PCR扩增，以鉴定GsEXLB14基因与pCAMBIA1302表达载体连接的准确性，引物序列如下：
GsEXLB14-identify-FW：5’-3’AACACGGGGGACTCTTGAC(SEQ ID NO.9)
GsEXLB14-identify-RV：5’-3’GGGACCAAGCTGAATTTCG(SEQ ID NO.10)
PCR扩增条件：94℃5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃45sec，30个循环，72℃7min，4℃终止反应。
上述PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，正确目标条带大小应为1116bp，对鉴定结果正确的Trans1-T1大肠杆菌单菌落进行扩繁与保存，并利用PlasmidMiniPrep Kit试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)对pCAMBIA1302-GsEXLB14表达载体进行提取，备用。
二、表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14转化发根农杆菌K599
采用冻融法将表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14转化至发根农杆菌K599中，发根农杆菌K599由上海唯地生物技术有限公司提供，具体操作步骤详见说明书。
三、转基因大豆毛状根的获得
1.农杆菌的培养
取出保存的含有表达载体pCAMBIA1302-GsEXLB14的发根农杆菌K599和不含任何表达载体的发根农杆菌K599(空菌，作为对照)，使用移液枪分别吸取200μl菌液加入到20ml液体YEB培养基中(发根农杆菌的抗性为链霉素；表达载体的抗性为卡那霉素)，28℃，200rpm，震荡培养12h进行第一次活化。首次活化的菌液按照1：20的比例加入到新的添加相应抗生素的YEB培养基中，28℃，200rpm，震荡培养5h。将二次活化后的发根农杆菌菌液进行离心，4500rpm离心15min，弃上清。以1/2MS液体培养基为重悬液，调节OD600值在0.6-0.8之间用于后续试验。
2.农杆菌遗传转化大豆毛状根
(1)将挑选的大豆种子用自来水连续冲洗15min，去除种子表面附着的杂质。在超净无菌工作台中用75％酒精浸泡1min，浸泡期间轻轻摇晃，再用0.1％的氯化汞水溶液浸泡7min，最后，无菌水冲洗4次备用；
(2)将消毒后的大豆种子种脐朝下用镊子按入萌发培养基(0.75％琼脂糖+蒸馏水)中，放入光照培养箱中培养7d左右，至子叶变绿。培养条件为：恒温25℃，光照周期16/8h；
(3)取出萌发培养基中的大豆苗并检查是否污染，再用无菌手术刀将大豆子叶从子叶节下方2mm处切下，沿中轴线方向将子叶分开，用手术刀划伤子叶节与胚轴连接处。切好的大豆外植体放入250mL锥形瓶中，倒入2.6.1准备好的发根农杆菌悬浮液，轻轻摇晃侵染30min。侵染后取出外植体，伤口朝下放置于1/10MS固体培养基(1/10MS+蔗糖+琼脂糖+蒸馏水)上，28℃，暗培养5d，待培养基中长满农杆菌；
(4)将共培养的外植体取出置于灭菌的锥形瓶中，先用无菌水冲洗1-2次，去掉子叶上附着的大部分农杆菌，再用含有头孢克肟和卡那霉素的1/2MS液体培养基除菌四次，最后用蒸馏水冲洗4-5次，无菌滤纸吸干水分。将除菌后的外植体斜插到诱导培养基(1/2MS+蔗糖+琼脂糖+蒸馏水)中，至光照培养箱28℃培养，光照周期为16/8h，大概10d左右诱导形成完整的毛状根。
3.转基因大豆毛状根的分子鉴定
采用GsEXLB14-transgenosis-FW及GsEXLB14-transgenosis-RV引物通过RT-PCR法对转基因大豆毛状根进行鉴定，RNA的提取、cDNA的合成及PCR的方法与使用的试剂盒同前文所述，同时使用大豆内参基因Actin克隆引物Actin-FW及Actin-RV通过RT-PCR法对所提取的cDNA进行质量鉴定，PCR的方法同上，引物序列如下所示：
GsEXLB14-transgenosis-FW：5’-3’GTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCC(SEQ ID NO.11)
GsEXLB14-transgenosis-RV：5’-3’ACCAAGCTGAATTTCGGAGTCAAA(SEQ ID NO.12)
Actin-FW：5’-3’AGGATTTGCTGGTGACGATG(SEQ ID NO.13)
Actin-RV：5’-3’TTTGACCCATCCCAACCAT(SEQ ID NO.14)
上述PCR扩增条件均为：94℃5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃45sec，30个循环，72℃7min，4℃终止反应。
上述PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，随机选取的6条转基因大豆毛状根的检测结果均为阳性，K599空菌诱导的大豆毛状根则为阴性(对照)，全部毛状根内参的检测结果均为阳性，表明GsEXLB14基因已经在转基因大豆毛状根中开始转录表达，可用于进行下一步的试验分析。
四、转基因大豆毛状根在盐和干旱胁迫下的表型分析
挑选鉴定为阳性的转GsEXLB14基因大豆毛状根和生长状况与阳性毛状根基本一致的K599空菌诱导的大豆毛状根(对照组)为试验材料，去除从发根诱导培养基中移出的毛状根上残留的固体培养基，再将单个毛状根移入到正常发根诱导培养基及分别含有150mmol/L NaCl(盐胁迫)和100mmol/L Mannitol(甘露醇，干旱胁迫)的发根诱导培养基中培养，7d后分别统计NaCl和Mannitol胁迫处理下转GsEXLB14基因和K599空菌诱导的大豆毛状根的毛状根数量、总根长和根重，分别计算毛状根数量、总根长及总根重的相对增长量，同时拍照保存。
结果如图3和图4所示，在正常条件下，K599空菌诱导的大豆毛状根及转GsEXLB14基因大豆毛状根均有较为明显的增长，但转基因大豆毛状根的生长状况显著比对照组好，其毛状根的数量、总根长和根重的相对增长量均显著高于K599对照组，分别是对照组的2.07倍、2.04倍和1.75倍。说明在大豆毛状根中过表达GsEXLB14基因能够增加新生毛状根的数量，并促进其生长。
在盐胁迫(NaCl)下，大豆毛状根的生长量均明显降低，但转GsEXLB14基因大豆毛状根的耐盐能力较K599组相比较强。K599对照组中毛状根的数量在处理后7d仅增加了8.96根，而转基因毛状根的数量增加了21.34根。相比于K599对照组，转基因毛状根的总根长和根重分别增加了2.37倍和3.05倍，证明了GsEXLB14基因能够显著提高转基因大豆毛状根对盐胁迫的耐受性。
在干旱胁迫(Mannitol)下，转基因组和K599对照组大豆毛状根的生长量较无胁迫处理均有所减少，但转基因大豆毛状根受到抑制的程度较低，生长状态较好。转基因大豆毛状根及K599对照组大豆毛状根在处理7d后，毛状根的数量分别增加了26.91根和14.54根；毛状根总长度相对增加了52.76cm和22.73cm；毛状根总重量相对增加了3.38g和1.07g。上述数据表明，GsEXLB14基因能够显著促进转基因大豆毛状根在干旱胁迫下的生长，能够提高转基因大豆毛状根对干旱胁迫的耐受性。
虽然本发明已经以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的名称为GsEXLB14，所述蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质或在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示蛋白质的N端/C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，来自下述A1至A8中的任意一种：
A1：编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
A2：含有A1所述核酸分子的表达盒；
A3：含有A1所述核酸分子的重组载体；
A4：含有A2所述的表达盒的重组载体；
A5：含有A1所述核酸分子的重组微生物；
A6：含有A2所述表达盒的重组微生物；
A7：含有A3所述重组载体的重组微生物；
A8：含有A4所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，A1所述核酸分子为下述B1或B2或B3所述的基因中任意一种：
B1：其核酸序列是如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子；
B2：与B1限定的核酸序列具有75％或75％以上同一性、且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
B3：与B1或B2限定的核苷酸序列杂交、且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在大豆毛状根中表达权利要求1所述蛋白质得到转基因大豆毛状根。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导所获得的大豆毛状根。
7.权利要求1所述蛋白质在培育抗盐和干旱胁迫转基因植物中的应用。
8.权利要求2或3所述蛋白质相关的生物材料在培育抗盐和干旱胁迫转基因植物中的应用。
Priority Applications (1)
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| CN202311289806.2A CN117304291A (zh) | 2023-10-08 | 2023-10-08 | 一种蛋白GsEXLB14及相关生物材料与其在提高植物耐盐和干旱胁迫中的应用 |
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