JP7045166B2 - コラーゲン結合材、その製造方法、ドラッグデリバリーシステム、および担持体 - Google Patents
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Description
少なくとも前記リンカーの一部と前記リンカーに連続して配列されるPPCとを含むアミノ酸配列(I)で示されるペプチドを含み、
前記アミノ酸配列(I)が配列番号3で示されるペプチドである、コラーゲン結合材を提供するものである。
(b)I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびV型コラーゲンと結合する、および
(c)温度25~95℃に加熱した後もコラーゲン結合性を維持している、前記コラーゲン結合材を提供するものである。
細菌性プロテアーゼの中で、コラゲナーゼは主としてM9に分類され、M9は更に、M9Aのビブリオ(Vibrio)種由来コラゲナーゼと、M9Bのバチルス種及びクロストリジウム種由来コラゲナーゼとに大別される。特許文献2や特許文献4で使用されるColHやColGはいずれもM9Bコラゲナーゼであり、いずれもCD、PKD、CBDの3種のドメインを含む。一方、M9Aコラゲナーゼは、ビブリオ種由来コラゲナーゼであり、非特許文献2や特許文献5に記載されるグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼが含まれる。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメイン構造は、N末端からC末端に向かって、プレプロ領域-CD-リンカー-PPCでありCBDを有しない。しかしながら、本発明者等は、グリモンティア・ホリセーなどのM9AコラゲナーゼのPPCがコラーゲン結合性を有すること、ペプチドでありながら耐熱性に優れることなどを見出した。
細菌性M9Aコラゲナーゼとしてグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼがある。グリモンティア・ホリセー1706B株由来コラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号1に、全コーディング領域のDNA配列を配列番号2に示し、アミノ酸配列のドメイン構造を図1Aに示す。このコラゲナーゼは、767個のアミノ酸で構成され、分子量は84kDaである。N末端からC末端に向かって、アミノ酸番号第1~第87のプレプロ領域、アミノ酸番号第88~第615の触媒ドメイン領域(CD)、アミノ酸番号第616~第687のリンカー、アミノ酸番号第688~第749のPPCを含む。また、ビブリオ・パラヘモリティカス(NP_797719)由来コラゲナーゼや、ビブリオ・アルギノリチカス(CAA44501)由来コラゲナーゼは、非特許文献2に示すように、N末端からC末端に向かって、CD、リンカー、PKD、リンカー、PPCを含む。
本発明のコラーゲン結合材は、細菌性M9Aコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、少なくともリンカーの一部と前記リンカーと結合しているプレペプチダーゼC末端ドメインとを含むアミノ酸配列(I)、または該配列(I)において1~20個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有するアミノ酸配列(II)で示されるペプチドを含む。以下、便宜のため、グリモンティア・ホリセー1706B株コラゲナーゼで説明する。
本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、グリモンティア・ホリセーなどの細菌性M9Aコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部に由来する。特許文献4に記載されるように、ColHやColGなどの細菌性M9BコラゲナーゼのCBDが、部分的にねじれていないか又はねじれが不十分なコラーゲン部位をターゲットとして結合することは公知である。また、コラゲナーゼのCDが、触媒活性の発現に際しコラーゲンに結合することも公知である。しかしながら、細菌性M9AコラゲナーゼのPPCがコラーゲン結合性を有することは全く知られていなかった。前記したPPCを含むアミノ酸配列(I)について詳細に検討したところ、そのコラーゲン結合能は極めて特異的であることが判明した。すなわち、本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドのコラーゲン結合能は、コラーゲン三重螺旋に依存することが判明した。このため、コラーゲン線維に結合するが、コラーゲン分解物であるゼラチンには結合することができない。この点、部分的にねじれているコラーゲンをターゲットとするColHやColGと相違する。また、コラーゲンであれば、I型に限定されず、II型、III型、IV型、V型にも結合する。コラーゲンはいずれの型も、コラーゲン分子からコラーゲン細線維で構成されるが、最終形態は線維状に限定されず細網板状なども存在する。本発明のコラーゲン結合材は、コラーゲンの三重螺旋構造を認識して結合するため、I型に限定されず、他の型のコラーゲンにも結合することができる。実施例では、I型からV型までの結合実験をおこなっているが、コラーゲン三重螺旋構造を有すればいずれのコラーゲンにも結合することができる。すなわち、コラーゲン三重螺旋構造を有すれば線維状に限定されず細網板状その他でも結合能を発揮する。
本発明のコラーゲン結合材を構成するペプチドは、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼを自己分解させ、CDとPPCとを切り離すことで調製することができる。自己分解は、図1Bに示すように、第624と第625との間や第646アミノ酸と第647アミノ酸との間を切り離す。この方法によれば、第625~第767で示すアミノ酸配列のペプチドや第647~第767で示すアミノ酸配列を製造することができる。
本発明のコラーゲン結合材は、コラーゲン結合性を有し、融合タンパク質や、生物活性剤、医薬剤の一部に組み込むことができる。コラーゲン結合材は、そのまま使用することもでき、他のペプチドや化合物に共有結合によって結合してもよく、また水素結合などによって結合させることもできる。
以下の方法で、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのリンカー以降のアミノ酸配列の15.4kDaのペプチド(84kDaコラゲナーゼの第616~第767アミノ酸からなるペプチド)を製造した。得られたペプチドのアミノ酸配列を配列番号3に示す。
(1)グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドpCC1BAC-2(受託番号;NITE BP-00739:原寄託2009年4月28)を鋳型として、配列番号3のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列(長さ456bp)を、下記プライマーセットを使用してPCR反応を使って単離した。プライマーの配列のうち、直鎖状プラスミドベクターpBIC2の両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー:
Fwd: GATGACGATGACAAAaccgaggcgctggcgaag(配列番号4)
Rvs: CATCCTGTTAAGCTTttactgacgacactggtt(配列番号5)
実施例1で得たペプチドの円偏光二色性(CD)スペクトルを測定した。
実施例1で得たペプチドを、濃度0.1mg/ml、20mMリン酸バッファー、pH7.5に溶解して測定用サンプルを調製した。この溶液について、波長190~260nmのCDスペクトルを測定した。また、実施例1のペプチドに代えて、岡山大学大学院医歯薬学総合研究科病原細菌学分野 松下治教授から供与されたColGのCBD(s3b)、及びColGのCBD(s3a3b)を使用して同様に操作し、CDスペクトルを測定した。これらの結果を図3に示す。
以下の方法で、コラーゲン線維に対する結合実験を行った。
ウシのアキレス腱をホモジナイズして乾燥した不溶性I型コラーゲン線維5mgをスピンカラムに入れ、400μLの結合バッファー(50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM CaCl2、pH7.5)を加え、室温で30分放置した。遠心(10,000xg、2分)により結合バッファーを除き、これを繰り返し、計3回コラーゲン線維を洗浄した。洗浄したコラーゲン線維にタンパク質混合液50μL(実施例1で得たペプチド:0.2mg/ml、BSA:0.2mg/ml)を加え、室温で30分放置して実施例1で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この溶液を遠心(10,000xg、10分)し、上清を回収した。上清にはコラーゲン線維に結合しなかったペプチドが含まれている。さらに50μLの結合バッファーを沈殿物に添加して洗浄および遠心し、計100μLの上清を回収した。この上清と、コラーゲン線維との結合処理を行っていない上記タンパク質混合液とを共に電気泳動で分析した。結果を図4(A)に示す。同図において、Collagenの文字の下部の「+」は上記上清であり、Collagenの文字の下部の「-」は結合処理を行っていないタンパク質混合液を使用したことを意味する。
以下の方法で、ゼラチンに対する結合実験を行った。
実施例3で使用した不溶性I型コラーゲン線維5mgの代わりに、ゼラチンセファロース50μLを用いて同様に操作した。結果を図4(B)に示す。同図において、Gelatinの文字の下部の「+」は結合処理を行った上清であり、Gelatinの文字の下部の「-」は結合処理を行っていないタンパク質混合液を使用したことを意味する。
コラーゲン線維と実施例1で得たペプチドとの結合を、免疫染色にて確認した。
スライドグラスへのペプチドの吸着を防ぐために、あらかじめスライドグラスを1%BSA/PBS(-)にてブロッキングした。洗浄後、PBS(-)に溶解した0.2mg/mlの酸抽出コラーゲンを滴下し、37℃で1時間保温してゲルを作製した。乾燥後、結合バッファー(50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM CaCl2、pH7.5)で洗浄した。これに、実施例1の(4)で調製したN末端にHisタグが結合した配列番号3で示すペプチド(ペプチド0.2μg/ml)溶液を50μL滴下してコラーゲン再生線維に結合させた。次いで、蛍光標識された抗Hisタグ抗体を添加し、免疫染色を行った。免疫染色の結果を図5に示す。図5左図は位相差顕微鏡像であり、図5右図は免疫染色像である。免疫染色像には、コラーゲン線維に淡色の点で示される蛍光発色が観察され、実施例1で得たペプチドがコラーゲン線維に結合することが免疫染色にて確認された。
実施例1で得たペプチドの量を変えて結合実験を行い、不溶性I型コラーゲン線維に対する最大結合量(Bmax)および解離定数(Kd)を算出した。
不溶性I型コラーゲン線維2.5mgをスピンカラムに入れ、400μLの結合バッファー(50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM CaCl2、pH7.5)を加え、室温で30分放置した。遠心(10,000xg、2分)して上清を除去し、これを繰り返し計3回行ってコラーゲン線維を洗浄した。洗浄したコラーゲン線維にタンパク質混合液50μL(実施例1で得たペプチド:5、10、25、50、75、100μg、BSA:2.5μg)を加え、室温で30分放置して実施例1で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。遠心(10,000xg、10分)し、上清50μLを回収した。この上清を用いて電気泳動を行い、バンドの濃さより結合しなかった実施例1で得たペプチドの量を定量した。用いた実施例1で得たペプチド量から結合しなかった実施例1で得たペプチド量を減じることで、結合量を算出した。スキャッチャードプロットによりKd及びBmaxを算出した。スキャッチャードプロットの結果を図6に示す。実施例1で得たペプチドは、Kd=2.7×10-5M、Bmax=1.94nmol/mgコラーゲンであった。
実施例1のペプチドのコラーゲン線維結合に対するカルシウム依存性を調べた。
不溶性I型コラーゲン線維2.5mgをスピンカラムに入れ、400μLの結合バッファー(50mM Tris-HCl、200mM NaCl、5mM CaCl2、pH7.5)を加え、室温で30分放置した。遠心(10,000xg、2分)により結合バッファーを除き、これを繰り返し、計3回コラーゲン線維を洗浄した。次いで、タンパク質混合液50μL(実施例1で得たペプチド:0.1mg/ml、BSA:0.1mg/ml)を、前記洗浄したコラーゲン線維に加え、室温で30分放置して実施例1で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この混合液を遠心(10,000xg、10分)し、上清を回収した。
また、前記タンパク質混合液50μL(実施例1で得たペプチド:0.1mg/ml、BSA:0.1mg/ml)にEGTA10mMを加えて、室温で30分間プレインキュベートした。前記洗浄したコラーゲン線維にこのタンパク質混合液50μLを加え、室温で30分放置して実施例1で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この混合液を遠心(10,000xg、10分)し、上清を回収した。
また、コラーゲン線維との結合処理を行っていない前記タンパク質混合液とを共に電気泳動で分析した。結果を図7(A)に示す。
実施例1のペプチドの、加熱への影響を調べた。
タンパク質混合液50μL(実施例1で得たペプチド:0.1mg/ml、BSA:0.1mg/ml)をあらかじめ室温、50℃、70℃、90℃で30分間インキュベートし、その後、室温で30分間放置した。実施例7と同様に処理して得た洗浄したコラーゲン線維に、前記タンパク質混合液50μLを加え、室温で30分放置して実施例1で得たペプチドをコラーゲン線維に結合させた。この混合液を遠心(10,000xg、10分)し、上清を回収した。また、コラーゲン線維との結合処理を行っていない前記タンパク質混合液とを共に電気泳動で分析した。結果を図8に示す。同図において、コラーゲン(+)はコラーゲン結合処理をおこなったもの、コラーゲン(-)は結合処理を行っていない試料を意味する。
I型以外の代表的なコラーゲンにも結合するか調べるため、各種ペプシン可溶化コラーゲン(I、II、III、IV、V型)をセファロースビーズに固定化し、結合実験を行った。
(1)200μLのNHS活性化セファロースビーズを1mLの1mM HClで3回洗浄した。0.5M NaCl、4% sucroseを含む0.2M NaHCO3に溶解した上記各種コラーゲンの溶液(濃度1.5mg/ml)500μLを洗浄したビーズに添加し、4℃で40時間、撹拌しながら反応させた。反応後、遠心して未反応のコラーゲンを除去し、500μLのバッファー(I)(0.1M Tris-HCl、pH8.0)、更に500μLのバッファー(II)(0.1M酢酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH4.0)で洗浄した。上記バッファー(I)および(II)での洗浄をそれぞれ3回繰り返し、コラーゲン固定化ビーズを得た。各コラーゲンのビーズへの固定化率は、I型:20.7%、II型:19.4%、III型:20.7%、IV型:29.9%、V型:30.1%であった。
(2)実施例3で使用した不溶性コラーゲン線維に代えて上記(1)のコラーゲン固定化ビーズ100μLを用いて同様の結合実験を行った。結果を図9に示す。
(3)比較例のため、上記(1)のコラーゲン固定化ビーズに代えてトリスバッファー処理セファロースビーズを使用して同様に操作した。結果を図9に併記する。
実施例1で得たペプチドを還元処理した後のコラーゲン結合性を評価した。
予め、実施例1で得たペプチド5μgに還元剤ジチオスレイトール1mMを添加して、ペプチドの分子内ジスルフィド結合を切断した。
このサンプルを使用し、非還元サンプルと共に実施例3と同様に操作して結合実験を行った。結果を図10に示す。実施例1で得たペプチドは、ジチオスレイトールによる還元処理の有無にかかわらず、コラーゲン線維に結合した。よって、実施例1で得たペプチドの分子内ジスルフィド結合が、コラーゲン結合性に関与する可能性は低いと考えられた。
Claims (7)
- N末端からC末端に向かって、触媒ドメインとリンカーとプレペプチダーゼC末端ドメインとをこの順に含む細菌性M9Aコラゲナーゼのアミノ酸配列の一部であって、
少なくとも前記リンカーの一部と前記リンカーに連続して配列されるプレペプチダーゼC末端ドメインとを含むアミノ酸配列(I)で示されるペプチドを含み、
前記アミノ酸配列(I)が配列番号3で示されるペプチドである、コラーゲン結合材。 - (a)カルシウムが存在しない環境下でコラーゲンと結合する、
(b)I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンおよびV型コラーゲンと結合する、および(c)温度25~95℃に加熱した後もコラーゲン結合性を維持している、請求項1に記載の、コラーゲン結合材。 - 請求項1記載のコラーゲン結合材を構成するペプチドをコードするDNA配列、または前記配列において1~45個のDNA残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも1つを有する、核酸を含んでなる組換えDNA。
- 請求項3記載の組換えDNAにより形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項4記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1のコラーゲン結合材の製造方法。
- 請求項1に記載のコラーゲン結合材を使用するドラッグデリバリーシステム。
- 請求項1に記載のコラーゲン結合材を担持した担持体。
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