JP6448216B2 - ペプチド組成物の調製方法、細胞培養方法、およびペプチド組成物 - Google Patents

Description

本発明は、コラーゲンにグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加してＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物の調製方法、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐの製造方法、前記コラゲナーゼを使用した細胞培養方法、およびペプチド組成物に関する。

コラーゲンやゼラチンをコラゲナーゼで加水分解して得られる（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドは、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、皮膚コラーゲン合成促進作用、骨折治癒促進作用、腱損傷治癒促進作用等の効果を有する。例えば特許文献１では、コラーゲンペプチドを含む皮膚美容改善用組成物が開示され、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇやＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むコラーゲンペプチドを使用し得る旨が開示されている。

コラーゲンペプチドを利用する技術として、例えば、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表す。）のトリペプチドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤やこれを調製する方法がある（特許文献２）。コラーゲンにクロストリジウム・ヒストリチカムやストレプトマイセス・パルブラス由来のコラゲナーゼを作用させると、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す。）で表されるポリペプチド配列における、グリシン残基のアミノ基末端側を特異的に切断でき、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示されるトリペプチドを得ることができるという。実施例では、高純度ゼラチン５０ｇに１００ｍｇのコラゲナーゼを用い、トリペプチド含量が３０％のコラーゲンペプチド粉末を得ている。

一方、トリペプチド高含有品を製造する方法も開発されているが、例えば、特許文献３は、トリペプチド含有水溶液を非極性吸着剤と接触させて一部の疎水性ペプチドを非極性吸着剤に吸着させ、前記非極性吸着剤に吸着しなかった親水性トリペプチドを回収して濃縮する方法である。２〜２０％のトリペプチド含有水溶液を２５％以上に濃縮するというものである。特許文献４も同様で、トリペプチド含有水溶液をｐＨ８以上１０以下、または４．５以上６．５以下に調整し、強塩基性陰イオン交換樹脂と接触させてトリペプチドを前記イオン交換樹脂に吸着させ、トリペプチドを吸着した前記イオン交換樹脂からトリペプチドを溶出して濃縮する方法である。トリペプチドの含有量が２〜３５％の溶液を４０％以上に高めるというものである。

コラーゲンは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつで、一般に３本のポリペプチド鎖が螺旋状に結合した三重螺旋構造を有し、各ポリペプチド鎖は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示される繰返し配列を含み、かつコラーゲン特有のアミノ酸としてヒドロキシプロリンを含む。例えば、ウシＩ型コラーゲンは１４５種類のトリペプチド配列を含み、三本鎖中に１〜２箇所しか存在しないトリペプチド配列がある一方、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのように１００箇所を超えるものもある。ウシＩ型コラーゲンの三本鎖中に存在するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列を含有率が高い順にアミノ酸の３文字表記を添えて上位１４番まで並べると、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（ＧＰＯ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＧＰＡ）、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ（ＧＡＯ）、Ｇｌｙ−ｌｅｕ−Ｈｙｐ（ＧＬＯ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ（ＧＥＯ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（ＧＥＲ）、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（ＧＡＲ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＧＰＲ）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ（ＧＳＯ）、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＧＡＫ），Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＧＰＫ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（ＧＰＱ）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ（ＧＦＯ）となる。なお、ヒドロキシプロリンは、各ポリペプチド鎖に含まれて三重螺旋構造を安定させることが知られており、前記した−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−で示される繰返し配列と相俟って、各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の自由度は極めて低い。ゆえに、動物種が異なってもＩ型コラーゲンの三重螺旋領域のアミノ酸配列は約９５％の同一性を有することが知られ、コラーゲン由来のペプチド組成物には、少なくとも前記した１４種のトリペプチドが含まれる事が期待されている。

前記した三重螺旋構造のために、コラーゲンはセリンプロテアーゼなどの内在性酵素で分解されにくく、トリペプチドを調製するにはコラゲナーゼが使用されている。コラゲナーゼとして、クロストリジウム属由来コラゲナーゼが多用されているが、ビブリオ属由来のコラーゲン分解酵素（特許文献５）や、グリモンティア・ホリセー由来のコラーゲン分解酵素(特許文献６）も公知である。なお、特許文献６には、グリモンティア・ホリセー由来の１番目のＡＴＧから始まり２３０４番目のＴＡＡで終わる２３０４塩基対からなるコラーゲン分解酵素の遺伝子、当該コラーゲン分解酵素遺伝子を含むバクミドとしてｐＣＣ１ＢＡＣ−２を作成する方法、前記コラーゲン分解酵素遺伝子から当該コラゲナーゼを生産するＢ．ｂｒｅｖｉｓ組み換え体を作成する方法が記載されている。前記バクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２は、グリモンティア・ホリセーのゲノムで作成されたＢＡＣクローンライブラリーから、コラゲナーゼ遺伝子を含むバクミドとして選択されたものであり、平成２１年４月２８日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−７３９として寄託されている。

特表２０１２−５０１３２０号公報 特開２００２−２５５８４７号公報 特許４０９９５４１号公報 特許５０１６８３０号公報 特開平０８−７０８５３号公報 特開２０１０−２６３８８０号公報

前記特許文献１に記載されるように、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇやＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐは、皮膚美容改善用組成物として有効であるという。しかしながら、特許文献１では、コラーゲンにシステインプロテアーゼ、ペプシン、トリプシンまたはコラゲナーゼなどの酵素を使用すれば目的のペプチドが得られると記載するが、実施例ではＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを製造していない。また、これら複数の酵素を併用すると、アミノ酸やジペプチドの生成率が増加するため、たとえＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐが生成された場合でも、コラーゲン当りの生成率は低下する。従って、生成率に優れる、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物やこれらの調製方法が望まれる。

前記特許文献３では、濃縮トリペプチド組成物に含まれる親水性トリペプチドとして、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｌ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを特定し、疎水性トリペプチドとして、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＳｅｒおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａを特定している。しかしながら、例えばＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇは、コラーゲンのアミノ酸配列中に６番目に高い含有量で存在するが、前記濃縮トリペプチド組成物には含まれていない。Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐも同様である。このため、ペプチド組成物からこれらトリペプチドを単離することもできず、これらのトリペプチドの研究開発を行うにはペプチド合成が一般的となっている。従って、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐに加え、コラーゲンに含まれる主要トリペプチドを含むペプチド組成物の調製方法の開発が望まれる。なお、特許文献５では、ビブリオ属由来のコラーゲン分解酵素を用いてミオシン軽鎖（実施例３）や牛のスネ硬肉(実施例４）、牛上肉(実施例５）に投与して肉のほぐれを観察するに過ぎない。また、特許文献６は、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼ遺伝子、該遺伝子が組み込まれた組換えベクター、該ベクターにより形質転換された宿主細胞およびその利用に関し、遺伝子配列を開示するに過ぎない。

コラーゲンは、生体内で基底膜に含まれること、および抽出したコラーゲンの溶液は、特定条件下でゲル化する特性を有することから、細胞培養プレートにコラーゲンゲルのコートが行われている。近年は、生体環境に近似した培養を可能とすべく、コラーゲンゲル内に細胞を包埋して培養する三次元培養も多用されている。しかしながら、培養後は、コラーゲンゲルから細胞を回収する必要がある。三次元培養する際には、コラーゲン溶液を３７℃に加温してゲル状に固化させればよい。形成されたコラーゲンゲルは４５〜６０℃程度に加熱変性することで可溶化できるが、細胞を含むコラーゲンゲルを加熱することはできない。よって、コラーゲン培地から細胞を傷つけずに回収しうる細胞培養方法の開発が望まれる。

そこで本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドから、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物、およびその調製方法を提供することを目的とする。

また、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドから、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを製造する方法を提供することを目的とする。

更に、コラーゲンゲルから細胞を傷つけずに回収して細胞を培養しうる細胞培養方法を提供することを目的とする。

本発明者等は、コラーゲン由来トリペプチドについて詳細に検討したところ、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼはコラーゲンを分解してＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を高収率で生産することができ、かつ細胞毒性が低いためコラーゲン中で培養された細胞を回収し細胞培養する際にも好適に使用し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、前記基質を分解してペプチド組成物を調製する方法であって、前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質からＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを切り出し、前記Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を調製する方法を提供するものである。

また本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質を分解して、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを切り出すことを特徴とする、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐの製造方法を提供するものである。

また本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質を分解して、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇを切り出すことを特徴とする、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇの製造方法を提供するものである。

また本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加し、前記基質に含まれる−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−（式中、Ｙはアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチド部分から、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとを切り出すことを特徴とする、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐの製造方法を提供するものである。

また本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンをゲル状にした細胞培養用コラーゲンゲルで細胞を培養し、細胞培養後の前記細胞培養用コラーゲンゲルにグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記ポリペプチドを分解し、分解後の細胞培養用コラーゲンゲルから細胞を回収することを特徴とする、細胞培養方法を提供するものである。

更に本発明は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドがグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼで分解されたペプチド組成物であって、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐとの質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が０．３以上であることを特徴とする、ペプチド組成物を提供するものである。

また、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドがグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼで分解されたペプチド組成物であって、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＨｙｐとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとの質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）＋（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が０．６以上であることを特徴とするペプチド組成物を提供するものである。

本発明によれば、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを使用してコラーゲンからＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＨｙｐおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を生成することができる。また、コラーゲンゲルにグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して、コラーゲンゲル中で増殖した細胞を浮遊させ、細胞に与える負荷を少なくして細胞を回収しおよび培養することができる。

実施例１と比較例１の結果を示す図である。本発明で使用するグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは、ウシ由来ペプチド基質Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに２０ｎｇを添加した後６０分の間、直線的上昇でＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇを生成している。一方、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼは３２０ｎｇの添加でもＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇを生成していない。 実施例２と比較例２の結果を示す図である。実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、ウシ由来ペプチド基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに２０ｎｇを添加した後３０分の間、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを生成した。この生成量は、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼを８０ｎｇ添加した場合と略同等であった。 実施例６と比較例６の結果を示す図である。ウシ腱由来酸抽出Ｉ型コラーゲンに実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを作用させると、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを作用させた場合と比較して、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）の生成比率が高いことが示されている。 実施例７と比較例７の結果を示す図である。図３で示したＩ型コラーゲンに対する傾向は、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンでも同様に観察されることを示す。 実施例１０と比較例１０の結果を示す図である。コラーゲン包埋細胞では、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの作用により迅速にコラーゲンが分解され、多数の細胞が遊離した。一方、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを作用させた場合は、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼよりも細胞遊離の程度が緩慢であった。

本発明の第一は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、前記基質を分解してペプチド組成物を調製する方法であって、前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質を分解して、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を調製する方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

（１）グリモンティア・ホリセー(Grimontia hollisae)
コラゲナーゼを産生する微生物としてクロストリジウム属（Chrostridium sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）などが知られているが、本発明で使用するコラゲナーゼは、グリモンティア・ホリセーに由来する。グリモンティア・ホリセーは、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５６４やＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５６５として入手できる。

（２）グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼ
本発明では、グリモンティア・ホリセーが産生するコラゲナーゼの他、当該コラゲナーゼ遺伝子で形質転換された組み換え体から得たコラゲナーゼを使用することもできる。例えば、グリモンティア・ホリセーのゲノムを用いてＢＡＣクローンライブラリーを形成し、コラゲナーゼ遺伝子を含むものとして特定のバクミドを選択することができる。なお、グリモンティア・ホリセーを使用してＢＡＣクローンライブラリーを調製する方法や、このライブラリーを使用してコラゲナーゼを生産するＢ．ｂｒｅｖｉｓ組み換え体を作成する方法は特許文献６に記載されている。

前記グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼ遺伝子を用いて形質転換された組み換え体からコラゲナーゼを得るには、定法によりこれらを培養し、培養液から単離すればよい。ここで使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該菌体が生育可能なものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。なお、窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されないが、例えば窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、無機塩類としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。培地のｐＨは６〜７程度が好ましく、培養温度は２８〜３０℃で、２０〜７２時間振とう培養することが好ましい。

培養物中からの目的物質であるコラゲナーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。すなわち、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、有機溶媒沈澱法、塩析、限外濾過膜による濃縮等を用い、カラムクロマトグラフィー等により精製する方法が挙げられる。

（３）基質
本発明のペプチド組成物の調製方法で使用する基質は、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンやゼラチンである。このようなコラーゲンとしては、サカナ、ウシ、ブタ、ニワトリ、その他の動物のいずれに由来するコラーゲンであってもよい。コラーゲン型は、現在Ｉ型からＸＸＩＸ型までが知られているが、そのいずれであってもよく、将来発見されるコラーゲンであってもよい。コラーゲンは動物種や型に限定されず、アミノ酸配列が近似するからである。

（４）ペプチド組成物の調製方法
コラゲナーゼの使用量は、基質に含まれるコラーゲンやゼラチンに対する比活性を予め測定し、当該比活性に基づいて適量を使用すればよい。なお、至適ｐＨは７〜９であり、至適温度は３０℃〜４０℃である。他は、従来公知のコラゲナーゼの使用条件と同様に選択することができる。反応液には、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化マグネシウムなどを添加してもよい。

本発明で使用するグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを分解してＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドを切り出し、トリペプチド含有量の高いペプチド組成物を調製することができる。従来からコラゲナーゼによってトリペプチドを生成してもトリペプチド生成率は低く、例えば、前記特許文献１では高純度ゼラチンにコラゲナーゼを作用して３０％のトリペプチドを得るに過ぎず、トリペプチド高含有品を得るために、例えば特許文献３や特許文献４では、希釈ペプチド溶液を精製して濃縮していた。Ｉ型コラーゲンを構成する３本のポリペプチド鎖には、約１４５種のトリペプチド配列が含まれる。しかしながらその全てをＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドに切り出すことはできない。このため、トリペプチドの２〜４量体（（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（式中、ｎは２〜４の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）が残存し、これによってペプチド組成物中のトリペプチド含有量が低くなっていた。また、特定のトリペプチドを生成するために複数の酵素を併用すれば、トリペプチドが更に分解したアミノ酸やジペプチドが副生するため、やはりトリペプチド生成量が低減した。本発明のペプチド組成物の調製方法によれば、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼのみを使用し、すなわち、酵素一段反応によってトリペプチド含有量の高いペプチド組成物を調製することができる。より具体的には、前記基質に含まれる（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチド配列の７０％以上、好ましくは７０〜９５％、より好ましくは７５〜９０％をトリペプチドに切り出し、トリペプチド含有率に優れるペプチド組成物を調製することができる。

この点を詳記する。本発明で調製されたペプチド組成物は、トリペプチドの含有量が高く、トリペプチドの２量体（（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_２）や３量体（（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_３）の含有率が低い。後記する実施例に示すように、ウシＩ型コラーゲンに対しグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを１質量％添加したところ、１時間の反応で約７２％、４時間後に約８３％、２０時間後に約９０％、４８時間後に約９３％をトリペプチドに切り出すことができた。なお、当該含有率は、ＧＰＣの面積比に基づく測定結果である。これに対し、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼによる場合には、約２０時間で略平衡に達し、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼの２．５倍量を使用しても、２０時間後に約６２％、４８時間後に約６８％の分解をするに過ぎなかった。クロストリジウム属とグリモンティア・ホリセー属との基質特異性の相違により、分解効率および分解総量が相違したものと推定される。

本発明のペプチド組成物の調製方法によれば、少なくともポリペプチドに含まれる主要１４種のトリペプチドを生成することができる。特に、本発明で使用するグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、ポリペプチドに含まれるトリペプチド配列のＸやＹの種類や配置に関わらず、多種のＹ−Ｇｌｙ間を切断できる。これにより従来のコラゲナーゼでは切り出すことができなかったＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇやＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を調製することができることが判明した。例えば、前記した特許文献３や４では、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇやＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐは含まれておらず、しかもトリペプチド高含有品を得るためにトリペプチド含有水溶液を濃縮している。しかしながら、本発明のペプチド組成物の調製方法によれば、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇやＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を調製することができ、かつ濃縮することなくトリペプチド含有量の高いペプチド組成物を得ることができるため、精製ロスを回避し、歩留まりを向上させることもできる。

前記したように、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼは反応約２０時間で分解率が平衡に達した。そこで、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼとグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼとを用いて、コラーゲンに２０時間作用させペプチド組成を評価した。コラーゲンのポリペプチド鎖３本当りに含まれるトリペプチド配列の個数は、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｈｙｐがもっとも多い。グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼで分解した場合のＧｌｙ-Ｐｒｏ-Ｈｙｐの生成量６３．３０ｇ／ｋｇは、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼによる場合３５．１１ｇ／ｋｇの約２倍であった。そこで得られるペプチド組成物のトリペプチド配合比を特定するため、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｈｙｐの生成量を基準として他のトリペプチドの割合を評価した。するとクロストリジウム属由来のコラゲナーゼで分解した場合には、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇやＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐは検出限界以下であり、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐとを合計した質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）も０であった。これに対し、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを使用した場合は、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐとを、それぞれ１３ｇ／ｋｇ以上の濃度で生成することができ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐとを合計した質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が、０．３以上、好ましくは０．３〜０．６、より好ましくは０．４〜０．５のペプチド組成物を得ることができた。

なお、Ｉ型コラーゲンのポリペプチド３本鎖の３１箇所に、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇで示されるトリペプチドが含まれるが、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇの前後の配列は、各Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇによって相違する。Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐも同様であり、同３６箇所に存在するが、各Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ毎に前後の配列が相違する。このことは、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼが、ＸやＹの種類に関わらず広範囲にトリペプチドを生成しうる優れた分解活性を有することを意味する。このような分解特性は全く知られていなかった。この点、本発明のペプチド組成物の調製方法は、前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを作用させてトリペプチドを切り出し、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを製造する方法といえる。

コラーゲンを基質とするペプチド組成物は、アミノ酸、ジペプチド、未分解のポリマーを含むペプチド組成物として食品その他に使用され、またはペプチド組成物に含まれる特定のジペプチドやトリペプチドの薬効などを期待して使用されることが通常であり、ペプチド組成物に含まれるトリペプチドの組成比を問題とすることが無かった。従来法によれば、コラーゲンに含まれるトリペプチド配列の約半分が未分解であり、複数の酵素を併用すればＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示される以外のトリペプチドやアミノ酸、ジペプチドの含有量が増加するため、トリペプチドの組成比を評価する意義が少ないためである。しかしながら、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼはＸやＹの種類に関わらず広範囲にトリペプチドを生成しうるため、従来法による未分解配列部分も分解することができる。具体的には、コラーゲンに含まれる−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−（式中、Ｙはアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチド部分の残存率が低い。従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼはこの配列を分解できなかったが、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、ＹとＧｌｙとの間、ＡｒｇとＧｌｙとの間、およびＨｙｐとＧｌｙとの間を切断しうることが判明した。これにより、上記ペプチド部分から、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとを生成することができる。なお、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇは抗炎症ペプチドなどとして有用であり、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐは生体コラーゲン合成促進剤として機能しうる。従って、本発明のペプチド組成物の調製方法は、コラーゲン基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを作用させて、前記基質に含まれる−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−（式中、Ｙはアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチド部分から、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとを切り出す方法、およびＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとを製造する方法といえる。

なお、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐはポリペプチドに含まれる配列比が第１２番目であるにも関わらず、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼによる場合は極めて微量に生成されるのみであった。グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼによれば、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを効率的に生産でき、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐの含有量の高いペプチド組成物を製造することができる。Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを、もっとも配列比の高いＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対する質量比（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）で示すと、０．２以上、好ましくは０．２〜０．４、より好ましくは０．２５〜０．３５となるように切り出すことができる。すなわち、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼによれば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対する質量比（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）０．２以上のペプチド組成物を製造することができる。

上記の結果、本発明で使用するグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＨｙｐおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐを、もっとも配列比の高いＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対する質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）＋（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が０．６以上、好ましくは０．６〜０．８、より好ましくは０．６５〜０．７５となるように切り出すことができる。すなわち、前記Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＨｙｐとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとの質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）＋（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が０．６以上のペプチド組成物を製造できる。従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼによる場合は、同質量比は０．０１以下である。

なお、本発明で使用するグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、後記する参考例に示すように比活性が高い。しかも、アミノ酸数５〜８の異なる合成ペプチドに対するいずれの比活性、およびコラーゲンに対する比活性のいずれもがクロストリジウム属由来のコラゲナーゼよりも高い。クロストリジウム属由来のコラゲナーゼでは切断しえなかった部位を切断しうることが、高い比活性の一因と推定される。

本発明で得られるペプチド組成物からＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｈｙｐ、その他のトリペプチドを単離するには、公知の方法で精製すればよい。

（５）応用
本発明のペプチド組成物の調製方法を応用し、コラーゲンを含む細胞培地をトリペプチドに分解して細胞を回収し、細胞を培養することができる。

細胞の多くは接着依存性増殖を行い、分化機能や細胞増殖機能を適切に発現させるために、コラーゲンで被覆した培養容器が使用される。コラーゲンは生体内で基底膜として作用するため、細胞の増殖にはこのような基底膜に類似する環境の存在が好ましく、これにより継代培養を含む長期培養が可能となっている。このような培養に使用されるコラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンが使用され、浮遊培養や包埋培養が行われている。培養後に培地から細胞を回収するには、細胞への負荷なくコラーゲンを分解する必要がある。本発明で使用するグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、コラーゲンやゼラチンなどの基質に対して比活性が高く、コラーゲンを分解して迅速にトリペプチドを生成することができる。このため、コラーゲン上で増殖し、またはコラーゲンゲル中に包埋されて増殖する細胞の回収に好適に使用することができる。しかも、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、細胞毒性が低い。培地から短時間で細胞を回収しうるため、回収後の細胞の生育状態に与える影響も少なく、回収後の細胞の成育率に優れる。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

（実施例１）
グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを調製するため、そのコラゲナーゼ遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２（ＮＩＴＥ Ｐ−７３９）を使用した。当該バクミドには、配列番号４に示す１番目のＡＴＧから始まり２３０４番目のＴＡＡで終わる２３０４塩基対からなるコラーゲン分解酵素の遺伝子の全領域が含まれている。番号前記バクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２を鋳型として、挿入されているコラゲナーゼ遺伝子の成熟体領域２０４０ｂｐのＤＮＡ断片の５’側にＮｃｏ Ｉサイトを、３’側にＨｉｎｄ ＩＩＩサイトを付加し、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により増幅した。増幅された断片をＮｃｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理して回収した当該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＮＹ３２６のサイトに挿入して、ｐＮＹ３２６−Ｃｏｌ２を作製した。さらに組換プラスミドｐＮＹ３２６−Ｃｏｌ２をＢ．ｂｒｅｖｉｓＳ５株に形質転換して、コラゲナーゼを大量に生産するＢ．ｂｒｅｖｉｓ組換え体を作製した。

当該Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ組換え体を２ＳＹＮ培地（４％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、２％グルコース、０．００１％ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００１％ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０００１％ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５０μｇ／ｍｌネオマイシン）中で、３０℃、４８時間培養した。

前記培養上澄みの硫安分画を分取し、これをＱセファロースカラムクロマトグラフィー、次いでゲル濾過法により精製してコラゲナーゼを得た。これをグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼとした。得られたコラゲナーゼについてＳＤＳポリアクリルアミドによる電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと称する）を行い、特許文献６記載のコラゲナーゼと同様のコラゲナーゼ分子を含むものであることを確認した。

５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液にウシI型コラーゲン由来ペプチド基質Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ（以下、ＧＥＲＧＦＯと称す。）を溶解させて２ｍＭ ＧＥＲＧＦＯ液を調製した。１０ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液０．２３ｍｌに前記ＧＥＲＧＦＯ液０．２５ｍｌを混合し、予め３７℃で加温した後、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのＣａＣｌ_２で１μｇ/ｍｌに稀釈した前記コラゲナーゼ２０μｌ（反応系中に２０ｎｇ添加)を加えて反応液とした。この反応液を３７℃に保温し、経時的に０．０５ｍｌをサンプリングした。得られたサンプル液は０．０５ｍｌの１％ギ酸と混合して反応停止した後、ＬＣ−ＭＳにてＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（ＧＥＲ）を検出および定量し、ＧＥＲＧＦＯ分解活性を評価した。反応系１ｍｌにおいて、１ｍｇの酵素が１分あたり１μｍｏｌｅの前記ペプチドを分解する活性を比活性１Ｕ／ｍｇとし算出し、得られた比活性を表１に示し、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ生成の経時変化を図１に示す。

（比較例１）
コラゲナーゼとしてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した。このコラゲナーゼを０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭのＣａＣｌ_２で稀釈し、酵素溶液２０μｌ中に各々酵素量８０ｎｇ、１６０ｎｇ、３２０ｎｇとなるよう調製した。実施例１と同様、１０ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液０．２３ｍｌとＧＥＲＧＦＯ液０．２５ｍｌを混合し、予め３７℃で加温した後、この酵素液２０μｌを混合し、反応液とした。この反応液を３７℃に保温し、経時的に０．０５ｍｌをサンプリングした。得られたサンプル液は０．０５ｍｌの１％ギ酸と混合して反応停止した後、ＬＣ−ＭＳにてＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇを経時的に検出および定量し、分解活性を評価した。実施例１と同様にして比活性を算出し、得られた比活性を表１に、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ生成の経時変化を図１に示す。なお、図１において「ＧＨ２０」は実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを２０ｎｇ、「Ｃｌ ８０」は前記クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを８０ｎｇ、「Ｃｌ １６０」は同コラゲナーゼを１６０ｎｇ、「Ｃｌ ３２０」は同コラゲナーゼを３２０ｎｇ添加した際の結果である。

図１に示すように、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、ウシI型コラーゲン由来ペプチド基質ＧＥＲＧＦＯに作用してＡｒｇとＧｌｙとの間を切断し、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇを産生することができた。これに対し、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼは反応６０分でもＡｒｇとＧｌｙとの間を切断することができず、よってＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇは生成されなかった。

（実施例２）
ペプチドとして、実施例１で使用したウシI型コラーゲン由来ペプチド基質ＧＥＲＧＦＯに代えてウシI型コラーゲン由来ペプチド基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（以下、ＧＰＯＧＰＯと称す。）を使用し、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇに代えてＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐを検出した以外は実施例１と同様に操作して分解活性を評価した。結果を表１、図２に示す。

（比較例２）
コラゲナーゼとしてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した以外は、実施例２と同様に操作して分解活性を評価した。結果を表１、図２に示す。なお、図２において「ＧＨ２０」は実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを２０ｎｇ、「Ｃｌ ８０」は前記クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを８０ｎｇ、「Ｃｌ １６０」は同コラゲナーゼを１６０ｎｇ、「Ｃｌ ３２０」は同コラゲナーゼを３２０ｎｇ添加した際の結果である。

図２に示すように、ＧＰＯＧＰＯに対する分解活性は、実施例１のグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼ２０μｇ／ｍｌとクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ８０μｇ／ｍｌとが、略同等の活性であった。

（実施例３）
ペプチドとして、実施例１で使用したウシI型コラーゲン由来ペプチド基質ＧＥＲＧＦＯに代えてＮ−（３［２−ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（以下、ＦＡＬＧＰＡと称す。）を使用し、Ｖａｎ Ｗａｒｔ，Ｈ．Ｅ．らの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３，３５６−３６５，（１９８１））により比活性を測定した。結果を表１に示す。

（比較例３）
コラゲナーゼとしてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した以外は、実施例３と同様に比活性を評価した。結果を表１に示す。

（実施例４）
ペプチドとして、実施例１で使用したウシI型コラーゲン由来ペプチド基質ＧＥＲＧＦＯに代えて合成基質４−Ｐｈｅｎｙｌａｚｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（以下、Ｐｚ−ＰＬＧＰ−Ｄ−Ａｒｇと称す。）を使用し、Ｗuｎｓｃｈ法（Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆuｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ，３３３，１４９−１５１（１９６３））により比活性を測定した。結果を表１に示す。

（比較例４）
コラゲナーゼとしてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した以外は、実施例４と同様に操作して比活性を評価した。結果を表１に示す。

表１に示すように、４種の基質に対するグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼの比活性は、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼの比活性よりも高値であった。

（実施例５）
コラーゲン分解活性は、細胞外マトリックス研究法（１） 第ＩＩ部 免疫学的・酵素学的研究法（ｐ７７−８２，１９９８，コラーゲン技術研修会発行）に記載の方法に準じて測定した。すなわち、蛍光標識したＩ型コラーゲン（以下、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌｌａｇｅｎと称す。）０．０５％、５ｍＭのＣａＣｌ_２、２００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）に、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼ０．５μｇを混合して３０℃に加温した。３０分後、ＥＤＴＡを添加して酵素反応を停止した。反応液を７０％のエタノールを含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）で抽出し、蛍光分光光度計で定量した。比活性を表２に示す。

（比較例５）
実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼに代えて、クロストリジウム・ヒストリティカム由来のコラゲナーゼ（天野酵素社製）を使用して、実施例５と同様にして比活性を算出した。結果を表２に示す。

表２に示すように、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、Ｉ型コラーゲンを分解し、その際の比活性は、クロストリジウム・ヒストリティカム由来の比活性の約４．１倍と高値であった。

（実施例６）
予め５ｍＭ酢酸に１ｍｇ／ｍｌで溶解したウシ腱由来酸抽出Ｉ型コラーゲン０．５ｍｌを、０．４ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ_２を含む０．１ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）からなる基質中和液０．５ｍｌに混和して０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を調製した。また、前記基質中和液の２倍希釈液１ｍｌに実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを５μｇ溶解し、０．２μｍのフィルターでろ過し、酵素液を調製した。前記コラーゲン溶液０．１ｍｌに酵素液０．１ｍｌを混合し温度３０℃で２０時間反応させた。反応終了後に、ｍｉｌｌｅｘ ＬＨ０．４５μｍでろ過し、ＧＰＣ分析を行った。結果を図３に示す。
また、反応液の一部を取り、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐの含有量をＬＣ−ＭＳで定量したところ、それぞれ３．２８μｇ／ｍｌ、４．３０μｇ／ｍｌであった。

（比較例６）
コラゲナーゼとしてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を１２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用した以外は、実施例６と同様に操作してＧＰＣ分析を行った。結果を、図３に示す。
また、実施例６と同様にして反応液に含まれるＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐの含有量を定量したところ、前者は検出されず、後者は０．０６８μｇ／ｍｌであった。

図３に示すように、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼにより、Ｉ型コラーゲンに作用して生成する（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）で示すトリペプチドの含有比率は、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼによる場合よりも高値であり、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_３や（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_２を分解して、高濃度のトリペプチドが生成されることが判明した。

（実施例７）
ウシ腱由来酸抽出Ｉ型コラーゲンに代えて、ペプシン抽出で調製したＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンを使用し、実施例６と同様にＧＰＣ分析を行った。結果を図４に示す。

（比較例７）
コラゲナーゼとしてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した以外は、実施例７と同様に操作してＧＰＣ分析を行った。結果を図４に示す。

図４に示すように、コラゲナーゼを分解して（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_３や（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_２よりトリペプチド（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）を効率的に生成する実施例１のコラゲナーゼによる活性は、Ｉ型コラーゲンに限定されず、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型コラーゲンに対しても同様に観察された。

（実施例８）
予め５ｍＭ酢酸に溶解したウシ腱由来酸抽出Ｉ型コラーゲン液に、０．４ＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＣａＣｌ_２とを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）基質中和液を同量添加し、前記基質中和液の２倍希釈液を添加してコラーゲン濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整し、コラーゲン溶液とした。また、前記２倍希釈液１ｍｌに実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを５μｇ溶解し、０．２μｍのフィルターでろ過し、濃度５μｇ／ｍｌの酵素液を調製した。前記コラーゲン溶液０．１ｍｌに酵素液０．１ｍｌを混合し温度３０℃で２０時間反応させた。反応終了後に、−２０℃で凍結保存した。凍結保存したサンプルは、溶解後０．１％ギ酸で希釈した後、ＬＣ−ＭＳにてトリペプチド生成量を測定した。表３に、ウシ腱由来酸抽出Ｉ型コラーゲンを構成するＩ型コラーゲンのポリペプチド鎖３本当りのトリペプチド配列の個数を数の多い順に記載し、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼによって生成した各トリペプチドの生成量を示した。なお、表３においてＮＤは検出限界以下を示す。

（比較例８）
また、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼに代えて、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した。実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼのｋ_ｃａｔは、前記グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼの１．２９倍である。両酵素液のｋ_ｃａｔを等しくするには、質量換算で実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼの２．５倍量の前記クロストリジウム属由来のコラゲナーゼが必要となる。よって、コラゲナーゼのｋ_ｃａｔを等しくするために１２．５μｇ／ｍｌのクロストリジウム属由来のコラゲナーゼの酵素液を調製した。この酵素液を使用し、上記と同様に反応させてトリペプチド生成量を測定した。結果を表３に示す。
更に、コラゲナーゼ液に代えて実施例８で使用した２倍希釈液を使用し、上記と同様に操作し、コラゲナーゼ無添加の系としてトリペプチド量を測定した。結果を表３に示す。

表３に示すように、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、コラーゲンを分解し、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼでは生成し得なかったＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを生成することができた。また、もっとも存在比の高いＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの生成量は、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼが３５．１１ｇ／ｋｇであるのに対し、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは６３．３０ｇ／ｋｇと約２倍も高い結果となった。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐの比は、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼが０であるのに対し、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは０．４１と極めて生成率に優れた。このコラーゲンに由来するＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリペプチド存在比第１２番目の１つはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐであり、従来のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼでは０．２７ｇ／ｋｇの生成量であるが、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは１７．２２ｇ／ｋｇと極めて高収率に当該トリペプチドを生成することができた。この結果、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＨｙｐおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ合計の比は、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼが０．０１であるのに対し、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは０．６９と極めて生成率に優れた。グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼは、従来切断しえなかったアミノ酸配列を切断してトリペプチドを生成できるため、トリペプチド生成率にも優れた。

（実施例９、比較例９）
予め５ｍＭ酢酸に溶解した３ｍｇ／ｍｌ濃度のウシ皮由来酸抽出Ｉ型コラーゲン液に、０．４ＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＣａＣｌ_２とを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）基質中和液を１：１の割合で添加してコラーゲン濃度を１．５ｍｇ／ｍｌに調整し、コラーゲン溶液とした。
また、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼに、前記基質中和液を２倍希釈して調製した基質希釈液を添加して溶解し、０．２μｍのフィルターでろ過し、濃度０．１ｍｇ／ｍｌの酵素液を調製した。前記コラーゲン溶液０．１ｍｌに酵素液０．１５ｍｌを混合し、温度３０℃で反応させた。反応後１、２、４、２０、２８および４８時間の反応液をサンプリングし、５分のヒートショック処理を行った後に−２０℃にて凍結保存し、分析用試料とした。これを実施例９とする。）
同様に、前記基質希釈液を使用してクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）の０．２５ｍｇ／ｍｌを調製し、前記コラーゲン溶液０．１ｍｌに酵素液０．１５ｍｌを混合し、温度３０℃で反応させ、分析用試料を調製した。これを比較例９とする。なお、コラゲナーゼの添加量は、反応系中で同等の活性となるようそれぞれの分子量およびｋ_ｃａｔ値から算出したものであり、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼはコラーゲンに対し１％濃度に、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼは２．５％濃度となっている。
各分析試料について、ＧＰＣを用い、定法に従って、生じたトリペプチドの生成面積比（％）の経時変化を測定した。結果を表４に示す。

コラーゲン１ｋｇにグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを１時間反応させると７１７ｇのトリペプチドを生成することができ、４８時間の反応で９３５ｇのトリペプチドを生成することができるが、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを使用した場合には４８時間反応させた場合でも６８７ｇのトリペプチドを生成しうるに過ぎない。しかも、グリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼによれば、例えば表３に示すように、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇなどのクロストリジウム属由来のコラゲナーゼで生成することができないトリペプチドを得ることができ、更に、生成率が５％を下回るＧｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌなどのトリペプチドも効率的に得ることができる。

（実施例１０）
（１）２４ウェルプレートの各ウェルに対し、氷冷下、ニッピゲルカルチャーキット（株式会社ニッピ社製、商品名「Ｔｒｉ・Ｄ」）のコラーゲン試薬（３ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ、コラーゲン稀釈用水０．１ｍｌを添加し、これに３倍濃縮培地０．１ｍｌを加えた。これを３７℃のＣＯ_２インキュベーターで１時間静置し、ゲル化した。
（２）デッシュに通常培養した線維芽細胞をトリプシン処理して剥離し、細胞を遠心分離で回収し、細胞培養培地による懸濁液を調製した。
（３）前記（１）で調製したゲルを形成したウェルに、５×１０^４細胞／ウェルとなるように上記（２）の細胞懸濁液を注ぎ、３７℃のインキュベーターで１時間インキュベートした。
（４）上記（２）で使用した細胞培養培地を各ウェルに１．２ｍｌ加え、１時間培養を行った。
（５）培地を取り除き、再度、前記細胞培養培地を１．２ｍｌ添加し、２４時間培養を行った。
（６）２４時間後、ウェルに滅菌ろ過水４ｍｌに実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼ２０ｍｇを溶解した酵素液を２００μｌずつ添加した。コラゲナーゼ終濃度は０．７１ｍｇ／ｍｌである。
（７）３７℃で３０分、４０分、５０分、または６０分間インキュベートした後、ウェル内の溶液を遠心分離して細胞を回収した。
（８）細胞を培地ですすぎ、２ｍｌの培地に再分散し、１２ウェルプレートに全量播種した。
（９）２４時間後、細胞形態を観察した。結果を表５および図５に示す。

（比較例１０）
実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼに代えて、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用して、実施例１０と同様にして細胞形態を観察した。結果を表５および図５に示す。

表５に示すように、細胞を包埋するコラーゲンに実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを作用させると、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼよりも迅速にコラーゲンを分解した。コラーゲン投与３０〜６０分で回収された細胞を観察すると、実施例１で得たグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを使用した場合は、３０〜６０分のいずれにおいてもクロストリジウム属由来のコラゲナーゼを使用した場合よりも細胞数が多い結果となった。

Claims (7)

1. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、前記基質を分解してペプチド組成物を調製する方法であって、
   前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質からＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを切り出し、前記Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇおよび／またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを含むペプチド組成物を調製する方法。
2. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、
   前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質を分解して、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐを切り出すことを特徴とする、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐの製造方法。
3. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、
   前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記基質を分解して、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇを切り出すことを特徴とする、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇの製造方法。
4. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンを基質とし、
   前記基質にグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加し、
   前記基質に含まれる−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−（式中、Ｙはアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチド部分から、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとを切り出すことを特徴とする、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐの製造方法。
5. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドを含むコラーゲンまたはゼラチンをゲル状にした細胞培養用コラーゲンゲルで細胞を培養し、
   細胞培養後の前記細胞培養用コラーゲンゲルにグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼを添加して前記ポリペプチドを分解し、
   分解後の細胞培養用コラーゲンゲルから細胞を回収することを特徴とする、細胞培養方法。
6. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドがグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼで分解されたペプチド組成物であって、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐとの質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が０．３以上であることを特徴とする、ペプチド組成物。
7. −（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−（式中、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるポリペプチドがグリモンティア・ホリセー由来のコラゲナーゼで分解されたペプチド組成物であって、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対するＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＡｒｇとＧｌｙ−Ｇｌｕ−ＨｙｐとＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐとの質量比（（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ）＋（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｙｐ）＋（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ）／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）が０．６以上であることを特徴とするペプチド組成物。