JPS60500043A - 原核細胞又は真核細胞中で合成される融合蛋白質から成熟蛋白質を作る方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 原核細胞又は真核細胞中で合成される 融合蛋白質から成熟蛋白質を作る方法 この発明は、原核細胞又は真核細胞中で合成される融合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ　 ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）　ｄｚら成熟蛋白質（ｒｉｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）を 作る方法に関する。

蛋白質及びペプチドは、全ての生きた細胞中で合成され、この細胞中における基 本的な成分である。更に、蛋白質及びペプチドのあるもの、例えば−（′ノチド ホルモンインシュリン及び成長ホルモンは、細胞間の伝達に重要な役割を演する 。他の蛋白質及びペプチド、例えば免疫グロブリンや血液凝固因子は、高等生物 の防御機構にとって大変重要である。゛ ペプチド及び蛋白質は、それぞれアミノ酸の短鎖及び長鎖ふらなシ、蛋白質のあ るものけ１又は２以上の鎖を含む。そしてここでのアミノ酸は、通常細胞アミノ 酸にある約２０のものから選択される。所定の蛋白質又はペプチド鎖中のアミノ 酸配列順序は、細胞の遺伝子内で特定される。非常に多くの有機体の遺伝子は、 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）の長鎖からなシ、このＤＮＡは、ヌクレオチドト リジレット（コドン）からなる。そして蛋白質の合成は、遺伝暗号を有するＤＮ Ａ領域ｋ　ＩＪ　ｙＮ核酸（ＲＮＡ　）にコピーすることによって、生じる。そ して、リケ核酸トリプレット（間接的にはＤＮＡ鎖中のデオキシリ？核酸トリプ レット）がその遺伝暗号に従って特定のアミノ酸を限定するので、このいわゆる メツセンジャＲＮＡは、蛋白質のツヤターンとして細胞で使用される。

蛋白質の形成についての基本的な分子生物学の原理は、ＤＮＡに基礎をおいてい るが、このことは当業者によく知られていることである。

蛋白質が細胞中で合成される場合、はじめに作られるものは、最終的に作られる 成熟蛋白質とめったに等しくない。多くの場合、例えばやや長いアミノ酸鎖が合 成され、次いで所望の成熟蛋白質の長さに、酵素などによって切断される。切断 したアミノ酸配列順序は、その分解の機能及び回数に従って通常蛋白質のＮ末端 ニ装置され、これは前記列順序（ｐｒｏ−８ｅｑｕｅｎ（！ｅ８　）又は信号配 列順序（ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　）とよばれている。通常、成熟蛋 白質のみが十分な生物活性を持っている。

蛋白質おるいはペプチドの生物合成は、はじめに、製造蛋白質又はペプチド中の Ｎ末端アミノ酸を常にメチオニン（直核細胞中）又はＮ−フォルミルメチオニン Ｎ末端メチオニン（又はフォルミルメチオニン）は、しばしば前記列順序又は信 号配列順序に含まれ、後工程で分解され、成熟蛋白質中には存在しない。

近年分子生物学上の各種発見がなされ、発展したことから、遺伝子（　ＤＮＡセ グメント）ヲ生体外において１つの有機体から他の無関係の有機体へ移すことが 可能となった。このため、人の遺伝子音Ｅ・大腸菌の如きバクテリアに移すこと ができる。仮に人のＤＮＡセグメントをバクテリアＤＮＡに似せるように変形で きれば、バクテリアは、確かに人のＤＮＡセグメントで暗号表示された蛋白質と 同じあるいは類似の蛋白質を合成することができるであろう。しかし通常は、こ の遺伝子工学による生成物が所望の成熟真核蛋白質と同じものとなるようにバク テリアで合成するには、いくつかの大きな問題がある。即ち通常、得られたバク テリア生成物は、バクテリア蛋白質のアミノ酸配列順序と、所望する真核細胞蛋 白質との間の融合蛋白質あるいはＮ末端フォルミルメチオニングルーｆ’ｒ備え た真核細胞蛋白質である。これらの生成物は、バクテリア中では、更に修正され ることはほとんどない。

この問題を解消するために、ダンマーク特許明細書Ａ１６１６／８１では、バク テリアの信号配列順序を直接真核細胞蛋白質に継ぎ合わせ、次いで・々クチリア 自体で信号配列順序を所望の如く分解させる方法が提案されている。しかしこれ は普遍的に有効な方法とはいえない。というのは、分解もまた真核細胞蛋白質の アミノ酸配列順序に依存することが予想されるためである。

更にダンマーク特許明細書Ａ　８　８　８　／　８　１では、蛋白質のバクテリ ア部分と真核細胞部分との間の境界に特定の蛋白分解位置（　ｓｉｔｅｓ　）又 は化学的分解位置を組込むことが提案されている。しかしこの方法の不利益な点 け、所望真核細胞蛋白質が同じ蛋白分解又は化学的分解位置を含まなければなら ないという、制限があるということである０ 融合蛋白質は、特定のアミノ酸で化学的に分解できる（例えばＢｒＣＮ’ｉｉ使 用するメチオニンの後に）。

しかし、この方法は、問題となる特定のアミノ酸が成熟蛋白質中に存在しないこ とが必要で、ＢｒＣＮの毒性による危険をともなう。

新しい合成蛋白質は、・々クチリア中で合成された場合、上述の如く常にＮ末端 Ｎフォルミルメチオニンと、場合により真核細胞の蛋白質には存在しない前記列 順序とを含む。従ってこれらは、・々クチリア合成蛋白質が例えば人から作られ る所望の蛋白質と根本的に同じアミノ酸配列順序を持たなければならない場合、 常に取除かなければならない。

同様に真核細胞で形成される蛋白質は、常にＮ末端メチオニンを含んでいる。

更に加えて、適当なりＮＡ配列順序全遺伝子工学にこの結果、表現された融合蛋 白質が特定のＮ末端アミノ酸配列順序を含むようにするととができる。このアミ ノ酸配列順序は、例えば融合蛋白質の精製峰容易に行うために選択され、所望蛋 白分解分解位置を得るために選択され、あるいは、融合蛋白質を・々クチリアの 外に移すのに選択される。このようなＮ−末端アミノ酸配列順序は、むろん所望 の成熟蛋白質を得る際には、取除かれなければならない。

一般に、バクテリアで所望蛋白質を直接作ることができない場合、得られる融合 蛋白質を酵素的あるいは化学的に処理して、その反応が所望の蛋白質に影響を与 えることなく付加したＮ末端アミノ酸を除去しなければならないと言うことがで きる。

酵素による融合蛋白質の分解処理は欧州特許明細書ＡＯＯ２０２９０に示されて いる。すなわちこの処理ではコラ−ダン分解酵素（　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　 ）は、融合蛋白質の信号配列順序又は前記列順序中の結合、すなわちｘ，　−　 ａｔｙの結合を分解するために用いられる。

ただしＸｙ７は前記列順序中に組込まれたペプチド鎖である。そして次に前記列 順序中の残りのアミノ酸又は酸を、酵素によシ取り除く。

しかしコラーゲン分解酵素と他のエンドベゾチターゼは特異性が十分でないこと が知られている（生化頁、参照）。更にコラーゲン分解酵素は、特定原子配列構 造の蛋白質と結合した時にのみ活性となる（被プチド１．９８０　、第１６回欧 州ペプチドシン？ジウム融事録、　Ｅｄ、　Ｋ、ブルンフェルド、スクリノター 　コインバーダン　１９８１年、参照）。

蛋白分解酵素（プロテアーゼ）は、所定の環境で蛋白質（及びペプチド）中のア ミノ酸間のペプチド結合を加水分解できる特性がある。蛋白質分解酵素け、操作 のモードとアミノ酸配列順序を分解するときの特異性のいずれにも関して、大変 大きくかつ特異的なグループの蛋白質からなる。要約すれば、蛋白質分解酵素は 、２つの主なグループ、即ちエクソプロテアーゼとエンドプロテアーゼとに分割 される。その名前が示すように、エクソプロテアーゼは、蛋白質鎖の端部からア ミノ酸全分解し、これに対しエンドプロテアーゼは、蛋白質の内部全直接分解す ることができる。アミノペプチダーゼは、エンドロテアーゼで、蛋白質鎖のＮ末 端からアミノ酸を分解するものである。プロテアーゼは、特定のアミノ酸配列順 序中の結合を主に分解する時、しばしば高い特異性を示す。この分解はアミノ酸 配列順序に依存するのみならず、基質の原子配列構造もまた分割速度に大きな影 響を与える。特定の方法で蛋白質全分解するという能力全プロテアーゼが持つた めプロテアーゼは、ここ数年来蛋白質の特性化、分析及び修正に使用されていた 。

この発明は、エクソ波ブチダーゼ、即ち融合蛋白質の前記列順序中のアミノ酸グ ルーゾを１つずつ分解して１最終的にＹ　−Ｐｒｏ基のみが残るようにするエク ソベプチダーゼの使用に基礎をおくのである。なおここでＹは任意のアミノ酸で ある。

使用されるエクソベグチダーゼは、アミノペプチダーゼで、このうちリューシン アミノペプチダーゼが好適である。

この発明の目的は、原核細胞又は真核細胞中で遺伝子工学的に合成される任意の 蛋白質について、酵素的処理を生体外で行ない、選択した真核細胞蛋白質と同質 のアミノ酸配列順序を持つ蛋白質に変換するに際し、成熟蛋白質の製造における 以下の問題を解消することにある。

ａ）フォルミルメチオニン又はメチオニングルゾの除去。

ｂ）成熟蛋白質の前記列順序からの解放。

この発明によれば、プロテアーゼ特にアミノペプチダーゼが必要によシフオルミ ルメチオニン及び場合によっては合成成熟蛋白質中の他のＮ末端アミノ酸の分解 に使用される。

従ってこの発明は、以下のアミノ酸配列順序の融合蛋白質を酵素的に分解するこ とにより成熟蛋白質を作る方法に関する。

（Ｙｍ　”’　Ｙ２−Ｙｌ）−（Ｐｒｏ）、−（Ｘ＋−ｘ２＝−ｘｎ）ここで、 （Ｙｍ−Ｙ２ｙ、　）　（Ｐｒｏ）ｐは、前記列順序であり、残、Ｉｕ成熟蛋白 質で、ｍは２よシ大きな整数、Ｙは任意のアミノ酸である。またｐばＸｌ又はＸ ２がＰｒｏの場合０ＮＸＩ又はＸ２がＰｒｏと異なる場合には１である。Ｘは任 意のアミノ酸でｎは４又はそれ以上の整数である。そしてこの処理は、ｐ＝１又 はＸ１＝Ｐｒ。

の場合アミノ酸グループＹｍ・・・Ｙ２の分解を、あるいはＸ２＝Ｐｒｏの場合 Ｙｍ・・・ｙ２−ｙ１グループの分解をアミノペプチダーゼにより徐々に行うて 酵素的分解を行なう。

次いでｐ＝ｌの場合２つのアミノ酸ＹＩ　Ｐｒｏｅ公知の方法で１又は２段階で 酵素的に分解し、そして同様にＸ１＝＝ｐｒＯの場合Ｙｌ単独を分解することを 特徴とする。

この発明によれば段階（１）で述べた融合蛋白質は、フォルミルメチオニングル ープを含まないが、例えば次の方法により得られる。

１）信号配列順序を含むあるいはこれを構成する適当な原核細胞Ｎ−末端前記列 順序のＤＮＡ暗号配列順序は、遺伝子レベルで所望蛋白質の暗号配列順序上に継 ぎ合すことができる。この前記列順序に関するＤＮＡ配列順序は、自然に生じる 数多くの配列順序ふら選択され、あるいはヌクレオチドとアミノ酸レベルの構造 が知られているときは生体外で合成される。

バクテリアで融合蛋白質を合成した後は、信号配列順序（Ｎ末端ｆ−Δ１ｅｔ− に含む）全生体内のバクテリアで分解する。

２）選択した前記列順序のＤＮＡ暗号配列順序を所望蛋白質の暗号配列順序に結 合する。バクテリア中で合成された融合蛋白質（Ｎ末端フォルミルメチオニンを 持つ）を細胞又はバクテリア浮遊物（５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　）から完全に又 は部分的に隔離する。次いで融合蛋白質をアミノペプチダーゼＩ　（ＡＰＩ　） 　（ＦＪ、　Ｃ，３，４゜１１、１２　）　（パシルス　ステアロテルモフィラ スＢａｃｉｌｌｕｓ　ｇｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られる）で 処理する（ロンカリ＆ズペラ２国際Ｊ、プロティンリサーチｎ　、１９１（１９ ７０））。このアミノ−２ｆチダーゼは、多くの他のアミン被ブチダーゼのよう に同じような広い特異性を持っている。しかし更に上述した融合生成物中のＮフ ォルミルメチオニンに分解することができる。この分解反応は、長い潜伏期の場 合、アミノペプチダーゼＩが所望生成物のアミノ酸をも加水分解することができ るので時間と酵素濃度に関して最も効果的となるようにすべきである。

この問題は、配列順序中に１ズ１４２以上のアミノ酸配列順序Ｇｔｙ　−Ａｔａ 　、　Ｇｔｙ　−ＧＡｙ又はＬｙｓ　−Ｌｅｕ　ｆ組込むことにより、減少させ ることができる。というのけ、これらの被ノテド結合は、上述したアミノペどチ ダーゼ■によりゆっくりとし力１加水分解されないためである。

３）前記列順序のＤＮＡ暗号配列順序をこのように形成すると、前記列順序はト リプシン（Ｅ、　Ｃ，３，４゜２１、４．　）又はトリプシンに類似するプロテ アーゼに対して高い活性分解位置を含むようになる。このような分解位置は、例 えばアミノ酸配列順序ＡｒｇＡｒｇ　ｒＬｙｓ　−Ｌｙｓ　＋　Ｌｙｓ　−Ａｒ ｇ及び／又はＡｒｇ　−Ｌｙｓからなる。融合蛋白質を合成した後、これを生体 中で全部又は一部を隔離し、トリプシン又はトリプシンに類似するプロテアーゼ を用いて生体外で処理する。

上述しｆｃ３種類の手順を行なえば、それぞれこの発明に従ってフォルミルメチ オニンのないＮ末端前記列順序とともに所望蛋白質に応じたアミノ酸配列順序を 含む蛋白質を提供することができる。この前記列順序では、Ｃ末端アミノ酸は、 所望蛋白質中のＮ末端アミノ酸に直接結合しているが、所望蛋白質自体がＮ末端 又は最外部のとなりのＮ末端アミノ酸としてゾロリンを含んでいない場合は、こ のアミノ酸はゾロリンでなければならない。次いで前記列順序は、融合蛋白質を 適当なアミノペプチダーゼ例えばりューシンアミノペプチダーゼ（Ｅ、、　Ｃ， ３，４，１１，１）で処理することによシ生体外で特異的に除去される。この商 業的に有用なアミノペプチダーゼは、配列順序を分解するが、ジベゾチドＸ　− Ｐｒｏの直前の結合を加水分解した後停止する。リューシンアミノペプチダーゼ を除去し、あ、るいは不活性化した後、得られる残りの融合蛋白質につきＸ及び 随意的なＰｒｏ　ｋ分解する場合、次の方法の１つによって処理する＠ ａ）　Ｘがａｔｙと異なる場合 まずアミノ酸Ｘを、例えばアミノペプチダーゼＰ（３，４，１１，９）又はプロ テアーゼで分解する。次いで所望によりプロリンをプロリンイミノペゾチダーゼ で分解する。

ｂ）　ｘがａｔｙの場合 ここではａｔｙはａ項で記載され、・だのと同じ方法で分解できる。しかし例え ばＧｔｙ　−Ｐｒｏ加水分解ジベプチディルベゾチダーゼＩＶ　（３，４，１４ ，−）を用いた場合、全てのジ啄プチドＧｌｙ　−Ｐｒｏは一段階で分解できる 。

実施例１ 人の成長ホルモンｈＧＨのアミノ酸配列順序全持つ蛋白質のクローンＤＮＡ配列 順序暗号（１９１のアミノ酸残基のうちはじめの４つのアミノ酸はＰｈｅ　−Ｐ ｒｏ　−Ｔｈｒ　−１１ｅである）を、以下に合成される二本鎖ＤＮＡ配列順序 に結合する。即ちゆるやかな末端結合により＋鎖（＋　５ｔｒａｎｄ　）の３′ 末端を上述した遺伝子の＋５′末端に結合し、合成りＮＡ配列順序の一鎖（−５ ｔｒａｎｄ　）の５′末端を上述した遺伝子の３′末端に結合する。

＋５’　ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＡＡＧＣ３’−３’　ＴＡＣＧＡＣ ＣＧＡＣＡＴＴＣＧ　５’ここで十鎖中の５つの最初のヌクレオチドは、Ｂａｍ Ｈ６限定位置の一部分であり、これに続くヌクレオチド配列順序は、アミノ酸Ｍ ｅｔ　、　Ｌｅｕ　ｒ　Ａｔａ　、　ｖａ／−。

Ｓｅｔの暗号である。

上述した遺伝子は、通常遺伝子クローン技術を用いて発現プラスミド、即ちＳＤ 配列順序ＡＧＧＡとともに融合Ｔｒｐ　−Ｌａｃゾロモータを含む発現プラスミ ド内に導入される。従ってこの構造は、Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ　−ＡＡａ−ＶａＬ　 −Ｓｅｒ　−ｈＧＨで表現される。

次いでこのグラスミド構造を従来技術によシＥ。

大腸菌細胞内に導入する。上述した構造を含む適当なりローンを隔離し、３０ノ 容器中で培養する。細胞を遠心分離機で採取し、小容積内で懸濁せしめ、いわゆ る「フレンチプレス」を用いて溶解する。

所望融合蛋白質については、ｈＧＨ抗体を用いた免疫学的方法によって上述のバ クテリア抽出物内で調べることができる。

この抽出物から融合生成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫酸アンモニ ウム沈澱、グルろ過及びイオン交換によｐ精製した。融合蛋白質を含む留分につ いては、ｈＧＨ抗体を用いて免疫学的に決定した。

精製融合蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣによ って分析した結果、９８係以上の純度であった。３０．７培養基カ）ら１５ｍ９ を隔離した。精製融合蛋白質中のジスルフィドブリッジを還元しかつＳ−カルバ ミドメチラート化した。その原理ばり、グラフ等に述べられている（　ＦＥＢＳ レター６６（２）。

２３３（１９７６））。精製、還元及びＳ−カルバミドメチラート化した融合蛋 白質Ｎ末端配列順序をエドマンに従って調べると、予期したアミノ酸配列順序Ｍ ｅｔ　−Ｌｅｕ　−Ａｔａ　−Ｖａｔ−であった。

次いで還元及びＳ−カルバミドメチラート化した生成物をリューシンアミノペプ チダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３゜４、１１．１　）で処理した。この処理については、 Ｄ、Ｈ。

スヘレクマン等−生化学ジャーナル　２１２，２５５（１９５５）及びＡ、ライ ト：イン：酵素処理Ｉ　ＶＯｌ、　Ｍ　ＩＣ，Ｈ，Ｗ、　ヒ＃ス（１９６７）編 集、アカデミツクプレス。

４２６頁に述べられている。しふし酵素加水分解は、尿素及びアプロチニンの存 在下で、行なわれる。

反応混合物全イオン交換器で分留し、ｈＧＨ免疫反応物を含む留分から得た蛋白 質を隔離した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣにより 蛋白質を調べた結果、純度９８係以上であった。エドマンによシＮ末端を調べた 結果、主成分がＰｈｅであった。

実施例２ 人プロインシュリンの製造 へゾロインシュリンのアミノ酸配列順序を持つ蛋白質の遺伝子暗号（８６アミノ 酸残基のうちはじめの４つのアミノ酸はＰｈｅ　−Ｖａｔ−Ａｓｎ　−Ｇｔｎ　 ）を以下に示す合成二本鎖ＤＮＡ配列順序に結合した。即ち、ゆるやかな末端結 合によシ＋鎖の３′末端を上述の遺伝子の＋鎖の５′末端に結合し、合成りＮＡ 配列順序の一部の５１末端全上述の遺伝子の３′末端に結合した。

Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ＶａｔＡｔａ　ＧＬｙ　Ｐｒ。

＋　５’　ＡＴＴＣＡＴＧ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＣＡ　３’− Ｇ　ＴＡＣＡＡＣＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＧＴ＋鎖中のはじめの５つのヌク レオチドは、ＥｏｏＲ■限定位置の一部である。これに次ぐヌクレオチド配列順 序は、アミノ酸Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ　−ｖａｌ　−Ａｔａ　−Ｃｒｙ　−Ｐｒｏの 暗号を有している。

上述した遺伝子は、通常の遺伝子クローン技術によυ、３−７オスフオグリセラ ートキナーゼのプロモータとＥＬＰ遺伝子のターミネータ−とを含む発現プラス ミド内に導入される（いずれもＳ、セレビシアエ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）から得られる）〕。（ヒノツマン等（１９８３）、サ イエンス２１９，６２０〜６２５頁参照）。

次いでプラスミド構造を、従来技術により、Ｓ。

セレビシアエ細胞内に導入する。上述した構造を含むＳ、セレビシアエクローン を隔離し、適当な容器にて培養する。イースト細胞をいわゆる「フレンチプレス 」を用いて採収し、溶解した。

期待される融合蛋白質とおもわれる蛋白質をプロインシュリン抗体を用いた免疫 学的方法によシ抽出物的で調べる。

融合蛋白質を疎水性相互反応クロマトグラフィーを用いて精製する。

融合蛋白質を、ポリアクリルアミド電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣで調べたと ころ、９０チ以上の純度に精製されている。エドマンによ５ＮＮ末端外順序を調 べたところ、所期のアミノ酸配列順序（Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｔ−Ａｔａ　 −Ｇｔｙ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−に相当）であることが確証される。

この精製生成物をり−−シンアミノペノチダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，４，１１，１ −）で処理する。これについては、Ｄ、　Ｈ，スルワクマン等、生化学ジャーナ ル、２１２゜２２５頁（１９５５）及びＡ、ライト：イン：酵素処理。

Ｖｏｔ、■、　：　Ｃ，Ｈ，Ｗ、ヒルス（１９６７’）編集、アカデミツクプレ ス、４２６頁に述べられている。次いでイオン反応物をイオン交換器で分留し、 プロインシュリン免疫活性物を含む留分からの蛋白質を隔離する。この純度をポ リアクリルアミド電気泳動及びイオン交換Ｔ（ＰＬＯで調べたところ、９０係以 上の純度である。エドマンによる３つの連続したＮ末端分解により隔離生成物中 にＧｔｙ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　ｆ見出す。

この生成物からそれ自体知られている方法でａｔｙ−Ｐｒｏ　’ｃ酵素的に取除 く。即ち、１段階の反応によりポストグロリンジベグチディルアミノ波ブチダー ゼ（Ｅ、　Ｃ，３，４，１４，−）を用いる（Ｒ，ワルター。

Ｗ、Ｉ（、シモンズ及びＴ、ヨシモト：分子及び細胞生化学３０（２）（１９８ ０）、１１１〜１２７頁。あるいは２段階の処理により、人プロインシュリンを 作る（Ｒ，１，プランジ及びＥ、Ｌ、スミス、［酵素Ｊ　、　Ｐ、Ｄ。ボイヤー 。

アカデミツクプレス（１９７１）、１１５頁）。

実施例３ バッファーを用いる。このバッファー２ＭｎＣ１２゜４Ｈ２０に加え、Ｍｎ２＋ イオン濃度ｆ　０．５　ｍＭとする。リューシンアミノペゾチダーゼ（シグマ） ３７℃で４５分間上述したバッファ（１：９）に潜伏せしめる。

９５０頁モル〜１ｍ９のＧｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ｔｈｒ　− Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ　−（Ａ、／＝ａ）　ｆ上述したパック７−２ｍｌに溶解する 。この混合物２１＋＋＋Ｉ！の潜伏酵素溶液２２単位のりューシンアミノペゾチ ダーゼに混合する。混合物を３７℃に保持する。３０．６０．９０及び１２０分 後、３００μｌ　（−９，５ｎモル）を取９．５０μｌ　ＥＤＴＡ　（１２ｍｑ ／ｍｌ）及び１０μｌ濃塩酸を加えて反応を停止した。

１００μ７（２６，４ｕモルに相当）につき、前述の酸加水分解なしにアミノ酸 分析を行った。分析によれば、ｎモルでＧＡｙ　２８．７　、　Ｔｙｒ　２２． ６及びＴｈｒ　４３．９であった。Ｔｈｒ　１ｌ−ｔアミノ酸分析にょ９調べら れなかった。

実施例４ ０．８ｍ９（１，０μモル）のＩＬｅ　−Ｓｅｔ　−Ｐｒｏ　−５ｅｒ−Ａｒｇ 　−Ｓｅｒ　−Ｇｔｎ　ｆ実施例１で述べたバッファ２ゴに溶解する。１ｄ（２ ２単位）の潜伏り−−シンアミノペゾチダーゼを実施例１と同じように加える。

混合物を３７℃に保持する。３０．６０．９０及び１２０分後３ｏ０μｌ（約１ ００ｎモル）を取除いた。実施例１で述べたように反応を停止する。アミノ酸分 析を１００μ！（２７，７８ｎモルに相当）について予じめ加水分解することな しに行なう。全試料中に１８ｎモルのＩｔｅが見出される。

実施例５ 合成ペプチド０．９ｍ９　（９３ｎモ／ｌ／　）　Ｔｙｒ　−Ｐｒｏ　−Ａｔａ 　−ＧＡｎ　−Ｌｔｅ　−Ｌｙｓ−Ｖａｔｑ実施例１で述べたりューシンアミノ ペプチダーゼで処理する。３０．６０及び２４０分後に３００μＩ！’ｚ除去す る。反応を実施例１に述べたようにして停止する。アミノ酸分析を予じめ加水分 解することなしに１００μ１（２５，８ｎモルに相当）行なう。Ｔｈｒ又はＳｅ ｒ　、　ＧＬｕ　、　Ａｔａ　、　Ｖａｔ　。

Ｉｔｅ及びＴｙｒがＯ〜ｌｌｎモルの間で検知される。このことは、合成波プテ ドが全く純粋でなく、ゾロリンが多分ないと思われる。

国際調査報告 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／　Ｃ１２Ｎ　１５／ＤＯ７１ １５−４Ｂｏ発　明　者　パルシュミット、ペル　テン０ ■発明者　ダール、ハンスーヘンリツク・　デンマルストランド　ルヌ ■発　明　者　ヘジネス、キム・リイ　デンウ マーク国　ディ・ケイ−３０６０エスペルガルデ、チッペラパレマーク国　ディ ・ケイ−２８２０ゲントフテ、プリンス、バルデマヴエジ　１１ マーク国　ディ・ケイ−２８００リングビイ、プレデボヴエジ　２９′イ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １１．　成熟蛋白質をアミノ酸配列順序（Ｙｍ−Ｙ２Ｙｔ）−（Ｐｒｏ）ｐ−（ Ｘ＋　Ｘ２・−・ｘｎ）ここで、（Ｙｍ”’Ｙ２−Ｙｌ　）　−（Ｐｒｏ　）ｐ 　は前記列順序及び残シは成熟蛋白質２ｍは２よシ大きい整数、Ｙは任意のアミ ノ酸、ｐはＸ１又けＸ２がＰｒｏのとき０でＸｌ又はＸ２がＰｒｏ以外のとき１ ．Ｘけ任意のアミノ酸。 及びｎは４又はそれ以上の整数。 の融合蛋白質を酵素分解する方法において、アミノペプチダーゼによシ、ｐ−１ 又はＸ１＝Ｐｒｏのときアミノ酸グループＹｍ・・・Ｙ２ｅ酵素分解にょシ徐々 に分解し、次いでｐ＝ｌのとき２つのアミノｅ　Ｙ＋　−Ｐｒｏ　ｋ公知の１又 は２段階で酵素的に分解し、又同様にＸ　１　＝　Ｐ　ｒ　ｏのときＹｌ単独を 分解することを特徴とする方法。 ２、アミノペプチダーゼがリューシンアミノペプチダーゼである請求の範囲第１ 項記載の方法。 ３、融合蛋白質は、人の成長ホルモン中で生じるアミノ酸配列順序を含む請求の 範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、融合蛋白質は、プロインシュリンを含む請求の範囲第１項又は第２項に記載 の方法。