JPH0494681A - 低温培養による大腸菌内での蛋白質生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は蛋白質の生産方法に関するものであり、更に詳
細には、遺伝子操作によって大腸菌の菌体内で外来蛋白
質遺伝子を発現させて該蛋白質を生産させるに際して、
該蛋白質を変性させることなく効率的に生産せしめる方
法に関するものである。

（技術的背景及び問題点） 大腸菌は遺伝子操作を行なううえで有用であり。

外来の遺伝子を発現させることにも使われている。

近年、大腸菌内で生産させた酵素、蛋白質、ホルモン等
を産業的に用いることがしばしば行なわれている。その
ため効率良く酵素、蛋白質、ホルモン等を生産すること
ができることが望まれている。

しかしながら、強いプロモーターによって外来遺伝子を
発現させて蛋白質を大腸菌内で生産させる場合、しばし
ばそれらが不溶化してしまい活性のある状態で回収でき
ないことがある。

すなわち、菌体内でせっかく蛋白質を発現させても、菌
体内に多量に蓄積した結果、蛋白質の三次元構造等が変
化して変性を生じ、菌体内で不溶化して菌体外へ取出せ
なかったり、たとえ取り出しても本来の蛋白質とは性質
が変化しており、例えば酵素等にあっては活性が低下な
いし消失してしまうことが多々生じるのである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記問題点を解決するためになされたもので
あって、各方面から検討の結果、形質転換微生物である
大腸菌の培養条件に着目し、通常行われている３７℃程
度での培養について全く逆の発想を行い、これを２０℃
という低温で行ってみたところ、全く予測せざることに
、酵素活性等本来の性質を全く損うことなく効率的に目
的とする蛋白質を生産させることに成功した。

本発明は、上記した新規にして有用な知見に基き更に検
討の結果、完成されたものである。

以下、本発明について更に詳しく説明する。

遺伝子操作技術における常法にしたがい、目的とする蛋
白質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作成し、
これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）か
らなる宿主微生物にカルシウム法等常法にしたがって導
入し、組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物（大腸
菌）を得る。

このようにして目的とする蛋白質生産能を獲得した形質
転換大腸菌を得、これを培地で培養する。

培養法自体としては温度以外は格別のものはなく、静置
培養、通気攪拌培養、固体培養、液体培養等既知の方法
が適宜利用される。

通常は、液体培地を用いて通気攪拌培養を行う。

培地としては、該微生物の通常の培養に用いられるもの
であればいずれでもよいが、例えば、炭素源としては澱
粉、液化澱粉、グルコース、グリセリン、糖蜜、廃糖蜜
などがあり、窒素源としては各種蛋白分解物、大豆粉、
肉エキス、ペプトン、尿素、硝酸塩、アンモニウム塩、
酵母エキス、コーンステイープリカーなどがある。その
化ビオチンなどの栄養素や微量金属などが適宜使用され
る。

通常、大腸菌の培養は、３７℃といった高温で行われる
のであるが、本発明においては、このような温度よりは
大幅に低い温度で培養を行う点に非常に大きな特徴を有
するものである。つまり本発明においては、形質転換し
た大腸菌は低温で培養しなければ所期の目的が達成され
ないのである。

本発明における培養温度は、２８℃以下とするものであ
るが、過度の低温は好ましくなく１０℃以上は必要であ
る。したがって培養温度は、１０〜２８℃であり、好適
には１２〜２０℃であり、更に好適には１３〜１８℃で
ある。

培養後、目的蛋白質が菌体内にあるので培養液を遠心分
離して菌体を得、超音波、フレンチプレスや細胞壁溶解
酵素等で処理し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗蛋白
液とする。

得られた粗蛋白液から、塩析、透析、イオン交換樹脂、
アフィニティクロマトグラフイー処理等−船釣精製法に
より目的とする蛋白質を単離することができる。もちろ
ん粗製のままで使用することも可能である。

このようにして形質転換大腸菌を低温で培養することに
より、各種の外来蛋白質を、変性させたり不溶化させた
り、失活させたりすることなく、効率よく生産せしめる
ことができる。本発明方法によって生産できる外来蛋白
質としては、酵素、ホルモン（インスリン、成長ホルモ
ン、セクレチンその他）、リンホカイン及びモノ力イン
（ＩＦＮ、ＩＬ、　ＢＣ叶、ＢＣＧＦ、　ＴＮＦ、　Ｔ
ＰＡその他）、その他の各種生理活性物質等、蛋白系物
質、ペプチド系物質が広く包含される。

以下、本発明を実施例により更に説明するが、本発明は
実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ （１）試薬及び材料 Ａ）試薬 制限酵素ＥｃｏＲ１，ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＫｌ
ｅｎｏｗは東洋紡から購入した。ｐＥＴ３ａ及び大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）はブロックへブン国立研究所のＦ、
　Ｗ、　５ｔｕｄｉｅｒ博士より入手した。

ＩＰＴＧ　；イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノサイド Ａ液；　５０ｍＭ　トリス塩酸、１０％グリセロール、
０．１％ツイーン２０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　０．５
Ｍ　ＮａＣＱ（ｐＨ７，５） Ｂ）材料 外来蛋白質としては、酵素、特にイネ・リボキシゲナー
ゼをターゲットとした。

イネ・リポキシゲナーゼ遺伝子としては、本発明者らに
より、以下のような方法によって単離されたｃＤＮＡを
用いた。

先ず、イネ（日本晴）からｍＲＮＡを抽出し、その逆転
写によって得られるｃＤＮＡライブラリーからりポキシ
ゲナーゼ遺伝子の全長をコードしているｃＤＮＡをｐＲ
Ｌｃ１１クローンとして単離し、これを用いて大腸菌を
形質転換した。形質転換体は、微工研にＦＥＲＭ　Ｐ−
１１６３５として寄託した。これを大量培養し、得られ
たｐＲｃＬｌｌを用いてリポキシゲナーゼ遺伝子の塩基
配列及びアミノ酸配列を決定した（第１図）。

また、得られたＰＲＬＣＩＩを下記（２）の方法で発現
ベクターと接続し、得られたクローンで大腸菌ＢＬ２１
　（ＤＥ３）を形質転換し、これを微工研にＦＥＲＭ　
Ｐ−１１６３６として寄託した。

（２）イネ・リポキシゲナーゼ発現ベクターの作成イネ
・リポキシゲナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）　（ｐＲＬｃｌ
ｌ）を制限酵素ＡｓｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化してから
Ｋｌｅｎｏ％ｉを用いてフィルイン反応を行い、１％ア
ガロースゲル電気泳動でこの断片を単離した。これをＢ
ａｍＨＩで消化してからフィルインした発現ベクターｐ
Ｅ７３ａ　とライゲーションさせた。これを用いて大腸
菌Ｈ８１０１株を形質転換させ、リポキシゲナーゼ遺伝
子がＴ７プロモーターの下流に５′→３′の方向に入っ
ているものを選択した。このクローンをｐＥＴ３ａ／　
ＲＬＯＸ２　と命名した。このクローンＤＮＡを用いて
大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）株を形質転換した。このク
ローン（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１６３６、以下クローンと呼
ぶ）を以下に用いた。

（３）大腸菌の培養 クローンを３ｍＱの５０μｇ／ｍｎのアンピシリンを含
むＬＢ培地（以下、培地と呼ぶ）に接種し３７℃で一晩
培養した。この１ｍＱを５０ｆｆＩＱの培地に加え６０
０ｎｍでのＯＤが１．０に達するまで培養した。これに
０　、４ｍｇ／■ＱとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド）を加え、２０
℃以下、例えば１８℃や１５℃で１６時間培養を続けた
。この培養液から遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分）
により、大腸菌を回収した。これをＡ液の５０ｍＱに懸
濁して、フレンチプレスあるいは超音波破砕器で菌体を
破壊した。

これを遠心分離して上清液を回収し酵素液とした。

（４）酵素の生産 上記によって得た各酵素液について、リポキシゲナーゼ
活性をリノール酸を基質として酸素電極法によって測定
した。

その結果、培養液１１ＩＱあたりの力価は、２５℃では
７．２．２０℃では１３．０．１５℃では１４．４の結
果が得られた。

一方、常法にしたがって３７℃で培養した場合の酵素液
については、その力価は０．０であった。

したがって、この対照に比して、２５℃、２０℃、１５
℃の場合はそれぞれその５０％、９０％、１００％とな
り、本発明に係る低温培養法の効果が確認された。

（発明の効果） 遺伝子操作のひとつの大きな目的は、外来蛋白質の生産
、採取である。

しかるに大腸菌を形質転換した場合は、通常、菌体内に
蛋白質を蓄積するが、菌体内で変性することが多々生じ
、たとえこれを菌体外に取り出しても本来の用途に用い
ることができない場合が多発する。

この点の解決にはじめて成功したのが本発明であって、
本発明によってはじめて、菌体内に分泌、蓄積された各
種蛋白質をそのまま取り出すことが可能となったのであ
る。しかもそのための方法は低温で培養するというシン
プルなものであるので、きわめて工業的であるばかりで
なく、大腸菌を宿主とする蛋白質の生産であればいずれ
の場合にも広範に利用することができ、汎用性が高いと
いう著効も併せ得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はイネ・リポキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列とア
ミノ酸配列を図示したものである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）外来蛋白質遺伝子を発現させて大腸菌（Ｅｓｃｈ
   ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の菌体内で蛋白質を生産させ
   るに際して、形質転換された大腸菌を低温で培養するこ
   とを特徴とする大腸菌による蛋白質の生産方法。
2. （２）大腸菌の培養温度が１０〜２８℃の低温であるこ
   とを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. （３）大腸菌の培養温度が１２〜２０℃の低温であるこ
   とを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. （４）大腸菌の培養温度が１３〜１８℃の低温であるこ
   とを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. （５）蛋白質が酵素であることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載の方法。