JP2002541793A - 膵臓プロカルボキシペプチダーゼｂ、そのアイソフォームおよび突然変異タンパク質の製造ならびにそれらの使用 - Google Patents

膵臓プロカルボキシペプチダーゼｂ、そのアイソフォームおよび突然変異タンパク質の製造ならびにそれらの使用

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JP2002541793A JP2000611652A JP2000611652A JP2002541793A JP 2002541793 A JP2002541793 A JP 2002541793A JP 2000611652 A JP2000611652 A JP 2000611652A JP 2000611652 A JP2000611652 A JP 2000611652A JP 2002541793 A JP2002541793 A JP 2002541793A
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パウル・ハーバーマン
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アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質の製造方法において（ａ）天然もしくは非天然前駆体型カルボキシペプチダーゼＢを微生物中分泌様式により発現させ、（ｂ）分泌様式で発現された前駆体型を精製しついで（ｃ）精製された前駆体型を酵素処理によって活性なカルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質に変換することからなる方法に関する。本発明はまた、核酸構築体、上述の方法におけるその使用およびその製造ならびに宿主細胞、その製造および膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはそのアイソフォームはもしくは突然変異タンパク質の製造方法におけるその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、カルボキシペプチダーゼＢおよびプロカルボキシペプチダーゼＢの
製造、ならびにバイオテクノロジー法で活性なカルボキシペプチダーゼＢを製造
のためのプロカルボキシペプチダーゼＢの使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
カルボキシペプチダーゼは亜鉛含有酵素（プロテアーゼ）のグループに属し、
分解すべきタンパク質またはペプチドのカルボキシル末端から個々のアミノ酸を
加水分解により段階的に除去することによってタンパク質およびペプチドを分解
する。したがってカルボキシペプチダーゼはエキソペプチダーゼに属する。動物
のカルボキシペプチダーゼは前駆体（プロカルボキシペプチダーゼ）として膵臓
で形成され、腸においてトリプシンによりその活性型に変換され、そこでペプチ
ド、タンパク質の一次切断生成物の消化にきわめて重要である。その基質特異性
により様々なカルボキシペプチダーゼに分類される。
【０００３】 カルボキシペプチダーゼＢはたとえば、もっぱら、アルギニン、リジンおよび
オルニチンのような塩基性アミノ酸を放出する。カルボキシペプチダーゼはカル
ボキシル末端上のアミノを酸をそれらの補助によって同定できるので、ペプチド
およびタンパク質の配列決定の助けになる。さらに、タンパク質はカルボキシペ
プチダーゼＢの使用により所望のようにあつらえることができる。
【０００４】 カルボキシペプチダーゼＢの工業的な使用例には重要な医薬製品インスリンの
製造がある。このペプチドホルモンの製造は欧州特許出願ＥＰ−Ａ ０ ４８９
７８０にとくに記載されている。この出願では、カルボキシペプチダーゼＢはプ
ロインスリン構造をトリプシンで開裂してインスリンへ変換する重要な工程にお
いて使用される。
【０００５】 このタイプの工業的過程において用いられるカルボキシペプチダーゼＢは一般
に、市販品を入手できるカルボキシペプチダーゼＢプレパレーションに由来する
。これらはブタ膵臓から得ることが好ましい（Folk, J.E., Meth. Enzym. 19: 5
04, 1970）。
【０００６】 しかしながら、動物起源の酵素には、それらが動物ウイルスにより汚染されて
いる危険を有する可能性があるという欠点がある。ウイルスを含まないことの検
定は複雑であり、製造経費の計算に重大な因子として算入される。酵素が、大規
模な工業的方法たとえばインスリンの工業的生産に用いられると、さらに凍結膵
臓の取得および保存のための高い論理的経費という欠点がある。
【０００７】 バイオテクノロジーによる製造はそれ自体、膵臓組織の抽出によるカルボキシ
ペプチダーゼＢの製造の別法として提供される。この方法には多数の既知経路が
ある。たとえば、直接細胞内発現、または細菌内における融合タンパク質たとえ
ばβ−ガラクトシダーゼ-カルボキシペプチダーゼＢ融合タンパク質の形態で（J
. Biol. Chem. 267: 2575-2581, 1992）、または酵母における相当する発現があ
る。これのさらに別法としては、カルボキシペプチダーゼＢのアミノ酸配列プラ
ス発現産物の分泌を招来するシグナル配列から構成されるカルボキシペプチダー
ゼＢの前駆体、プロカルボキシペプチダーゼＢの発現がある。適当な発現系とし
てはBacillus subtilis, Streptomyces, E. coliおよび酵母Saccharomyces, Can
dida, Hansenula polymorphusおよびPichia pastorisについて報告があり、それ
らの一部については市販品を入手することが可能である。
【０００８】 カルボキシペプチダーゼＢの製造のための発現システムの使用における前提条
件は、選択された宿主株の生育がそれぞれの場合、発現が最初容易に可能である
ように活性なカルボキシペプチダーゼＢの存在により阻害されないことである。
この性質を有する宿主株は通常、空間および時間を通じて相対的に乏しい収率で
あるので、発酵が困難である。
【０００９】 カルボキシペプチダーゼＢの細胞内発現（直接発現または融合タンパク質とし
ての発現）における１つの問題は、タンパク質が最初は正しい空間的構造で存在
せず、したがって不活性なことである。したがって、それは精製またはプロセッ
シング時にインビトロでフォールディングさせなければならない。この方法では
、酵素の活性および特異性に悪影響のある欠陥のあるフォールディングを生じる
ことがあり、医薬製剤における使用が困難になる。
【００１０】 成熟した活性型の酵素の分泌によるカルボキシペプチダーゼＢの製造にも欠点
を示す。発酵時に、基質として認識される細胞構成成分または栄養メジウム構成
成分のペプチド様フラグメントとの反応によって、カルボキシペプチダーゼＢは
常に不活性化され、収率の低下を生じる。
【００１１】
【発明の開示】
このジレンマからの脱出方法は、空間的に正しい型での不活性なカルボキシペ
プチダーゼＢの発現および分泌である。酵素との反応により、活性なカルボキシ
ペプチダーゼＢはこの前駆体からインビトロで製造することができる。この状況
において「活性なカルボキシペプチダーゼＢ」とは天然に見いだされるカルボキ
シペプチダーゼＢたとえばヒトのカルボキシペプチダーゼＢまたはその天然に存
在するアイソフォームを意味する。「活性なカルボキシペプチダーゼＢ」はまた
、天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢの突然変異タンパク質を意味するこ
ともある。アミノ酸配列の欠失、付加または置換が生じてはいるが、突然変異タ
ンパク質の酵素活性は天然に存在するカルボキシペプチダーゼＢの酵素活性に定
量的に相当する。上述の前駆体は天然のプロカルボキシペプチダーゼＢまたはそ
の誘導体たとえばペプチド配列の付加によって不活性化されたカルボキシペプチ
ダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質であってもよい。付加さ
れたタンパク質配列の性質は以下に詳細に述べる。プロカルボキシペプチダーゼ
Ｂまたはその誘導体は、このタンパク質から驚くほど容易に制御可能な方法で活
性なカルボキシペプチダーゼＢが製造できるので好ましい。さらに、カルボキシ
ペプチダーゼＢの保存時には活性の喪失が観察されるのに対し、プロカルボキシ
ペプチダーゼＢもしくはその上述の誘導体は比較的長期間保存することができる
。
【００１２】 上述のプロカルボキシペプチダーゼＢの誘導体は、カルボキシペプチダーゼＢ
のアミノ酸配列に加えて、発現に用いた宿主生物体からその誘導体を排除するた
めのシグナルペプチドのアミノ酸配列を有するＮ末端に結合したペプチド、１０
０アミノ酸長までの任意所望のアミノ酸配列およびその誘導体のカルボキシペプ
チダーゼＢ部分から付加的なＮ末端に結合したペプチドの酵素的除去を可能にす
るエンドペプチダーゼ認識配列を含有する。このタイプのエンドペプチダーゼ認
識配列の例には、トリプシン、第Ｘａ因子、エラスターゼ、キモトリプシンおよ
びコラーゲナーゼの相当する既知の認識配列がある。
【００１３】 驚くべきことにさらに、プロカルボキシペプチダーゼＢはワンポット反応でプ
ロインスリンおよびトリプシンと反応することが可能であり、新たに形成された
活性なカルボキシペプチダーゼＢを直ちに認識して、生成したインスリンＢ鎖の
カルボキシ末端アルギニンを加水分解することが見いだされたのである。この過
程で生成したカルボキシペプチダーゼＢは、以前に保存されついでプロインスリ
ンとの反応に加えられたカルボキシペプチダーゼＢよりも活性が高い。反応混合
物中に存在するトリプシンはプロカルボキシペプチダーゼＢの活性化に働くのみ
でなくプロインスリンを特異的に切断して成熟インスリンの放出に寄与する。
【００１４】 トリプシンによる活性化の反応速度論は驚くべきことに、プロカルボキシペプ
チダーゼＢまたは上述の誘導体のＮ末端におけるテトラ−His配列の付加によっ
て有害に影響されることがない。このような付加の利点は、それによりタンパク
質が、ニッケルキレートとの複合によるアフィニティクロマトグラフィーにおけ
る容易な精製を可能にするという事実にある。このような修飾されたカルボキシ
ペプチダーゼＢの使用は同じく本発明の主題である。
【００１５】 本発明の例示のためにヒト膵臓プロカルボキシペプチダーゼＢのｃＤＮＡ配列
を発現させた。しかしながら、ＤＮＡおよびタンパク質プレーンの両者において
ヒト酵素とたとえばウシ、ラット、ブタまたは他の種からの膵臓組織を形成する
相当する酵素とでは配列の相同性が高いこと、このような種のＤＮＡ配列もヒト
ＤＮＡ配列の代わりに同様に使用できることは明らかである。カルボキシペプチ
ダーゼＢの突然変異タンパク質をコードする相当するＤＮＡも使用することがで
きる。同様に、天然のまたは人工的に産生されたカルボキシペプチダーゼＢまた
はプロカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームをコードするＤＮＡ配列も使
用することができる。さらに、天然には存在しない、遺伝暗号の縮重によってカ
ルボキシペプチダーゼＢまたはプロカルボキシペプチダーゼＢをコードする上述
のＤＮＡ配列または各場合のそれらの突然変異タンパク質における配列を置換で
きるすべてのＤＮＡ配列が使用できることは当然である。
【００１６】 ヒトプロカルボキシペプチダーゼＢの製造のために異種タンパク質の分泌の例
としては、Invitrogen社から入手可能な市販品、Pichia pastorisの発現系が同
様に使用できる。本技術分野の熟練者には明らかなように、細菌の系たとえば欧
州特許出願ＥＰ−Ａ ０ ４４８ ０９３号に記載された大腸菌セクリーター突然
変異体も、そこに記載されたヒルジン配列をプロカルボキシペプチダーゼＡの配
列で置換すれば使用することができる。更なる変法として、たとえば欧州特許出
願ＥＰ−Ａ ０ ５０４ ７９８号に記載されたグルタリルアミダーゼの発現の場
合のようにストレプトマイセスにおいてヒトプロカルボキシペプチダーゼＢを発
現することが可能であると考えられる。 比較的大量の酵素の単離方法の大規模工業的使用において先行技術としての例
に記載した以外の他のタンパク質の精製に使用できることも同様に明らかである
。
【００１７】 したがって、本発明の１つの主題は、膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはカ
ルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質の製造方
法において、 (ａ) カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフ
ォームもしくは突然変異タンパク質の天然のまたは非天然前駆体型を、微生物中
分泌様式により発現させ、 (ｂ) 分泌様式により発現された前駆体型を精製し、および (ｃ) 精製された前駆体型を酵素処理によって、活性なカルボキシペプチダー
ゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパ
ク質に変換する方法に関し、とくに膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはそのア
イソフォームはヒト起源であるタイプの方法、好ましくは天然に存在する前駆体
型はプロカルボキシペプチダーゼＢまたはそのアイソフォームに相当するタイプ
の方法に関する。
【００１８】 記載された方法に言及する場合に一般に「このタイプの方法」としての表現は
、以下、言及がとくに他の方法を指していない場合に用いられる。カルボキシペ
プチダーゼＢの「天然」および「非天然」前駆体型は、天然に存在するタイプの
分子（「天然前駆体型」）またはこのタイプの天然前駆体型からアミノ酸の置換
、付加または欠失によって生じるタイプの分子（「非天然前駆体型」）である。
しかしながら、非天然前駆体型は酵素処理により活性な膵臓カルボキシペプチダ
ーゼＢまたはそのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質に変換できる。
【００１９】 とくに好ましい方法は、非天然前駆体型が以下の構造： Ｓ−(Ａｓ)x−Ｅ−ＣＢ （Ｉ） （式中、 Ｓは、発現時に形成される融合タンパク質の各微生物からの分泌をもたらすシ
グナルペプチドであり、 Ａｓは任意所望の遺伝子によってコード可能なアミノ酸であり、 Ｅはエンドペプチダーゼ認識配列から構成されるペプチドリンカーであり、 ＣＢは、カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソ
フォームもしくは突然変異タンパク質のアミノ酸配列であり、 ｘは０〜１００の整数である）を有するタイプの方法である。
【００２０】 さらに本発明は、ペプチド配列がアフィニティクロマトグラフィーによる前駆
体型の精製を可能にする天然または非天然前駆体型に結合するタイプの方法、と
くに好ましくはアフィニティクロマトグラフィーによる精製のために結合してい
る配列が１〜６個、好ましくは４個のヒスチジン残基であるタイプの方法に関す
る。
【００２１】 本発明はまた同様に、酵母Pichia pastoriaが発現のための微生物として用い
られるタイプの方法に関する。 本発明のさらに他の主題は、酵素トリプシン、エラスターゼ、第Ｘａ因子、キ
モトリプシンまたはコラーゲナーゼ、好ましくはトリプシンを酵素処理に使用す
るタイプの方法である。
【００２２】 さらに本発明は、工程（ｃ）がインスリンのＢ、ＣおよびＡ鎖からなるインス
リン前駆体型またはインスリン誘導体の存在下に適当な反応条件で進行させ、こ
の過程において成熟インスリンまたは成熟インスリン誘導体が形成され、これを
反応混合物から単離する方法に関する。 本発明の更なる主題は、プロカルボキシペプチダーゼＢおよびカルボキシペプ
チダーゼＢのこのタイプの方法における使用である。
【００２３】 さらに、本発明はカルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢ
のアイソフォームもしくは突然変異タンパク質の天然もしくは非天然前駆体型を
コードするＤＮＡ配列からなり、上述のコード配列は適当な微生物中における前
駆体型の発現を可能にするプロモーターに機能性に連結されている核酸構築体に
関する。好ましくは、本発明はＤＮＡ配列が式Ｉのタンパク質をコードする核酸
構築体に関する。さらに本発明は、１〜６個好ましくは４個のヒスチジン残基を
コードするＤＮＡ配列がさらにカルボキシペプチダーゼＢの天然または非天然の
前駆体型またはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合している核酸構築体に関する。 記載された核酸構築体に言及する場合に一般に「このタイプの核酸構築体」と
いう表現は、以下、言及がとくに他の核酸構築体を指していない場合に用いられ
る。
【００２４】 本発明は同様に、このタイプの核酸構築体の製造方法において、 (ａ) 上述のＤＮＡ配列を単離または調製し、ついで (ｂ) 適当な方法でベクター中に挿入することからなる方法に関する。
【００２５】 さらに本発明は、膵臓カルボキシペプチダーゼＢの上述の製造方法におけるこ
のタイプの核酸構築体の使用に関する。 本発明はまた、上述の核酸構築体からなる宿主細胞、および適当な微生物に上
述の核酸構築体が包含されているこのタイプの宿主細胞の製造方法に関する。 本発明はまた、膵臓カルボキシペプチダーゼＢの上述の製造方法におけるこの
タイプの宿主細胞の使用に関する。
【００２６】 以下の実施例は、プロカルボキシペプチダーゼＢおよび(Ｈｉｓ)4−プロカル
ボキシペプチダーゼＢの発現および精製方法を例示を意図するものである。さら
に、プロカルボキシペプチダーゼＢのトリプシンによる、すなわちいずれも単離
型での活性化方法ならびにインスリンの製造のためのトリプシンとプロカルボキ
シペプチダーゼＢの併用について説明する。
【００２７】 実施例１ この実施例は、ヒトプロカルボキシペプチダーゼＢの分泌のための組換え P.
pastoris株の調製を記載する。使用した出発原料は、ヒト膵臓組織から単離され
たＲＮＡより既知の方法で調製されるｃＤＮＡプレパレーションである。このタ
イプのｃＤＮＡプレパレーションは市販品たとえばClontech社（カタログ番号７
４１０−１）から入手できる。所望のｃＤＮＡ標的配列の増幅のためには、２つ
のプライマーを合成する。このための配列は遺伝子バンクのデータベースから採
用した。ヒト膵臓カルボキシペプチダーゼＢのｃＤＮＡ配列は「受入番号」Ｍ81
057でそこから入手できる。順行プライマー配列 P-CPBf22 は領域２２bp〜３２b
pに相当し、逆行プライマー配列 P-CPBrev1271 は領域１２７１bp〜１２５０bp
に相当する。増幅のためには、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施
する。ＰＣＲの反応産物をゲル電気泳動によって分離し、期待された長さ約１２
５０bpの得られたＤＮＡバンドを溶出し、InvitrogenからのオリジナルＴＡクロ
ーニング（登録商標）キットのｐＣＲ（登録商標）ベクターとのライゲーション
反応で反応させる。キットの構成成分として付加的に供給された大腸菌株ＩＮＶ
αＦ′のコンピテント細胞をライゲーション混合液でトランスフォームし、プレ
ート上にプレーティングし、２５mg／Ｌのアンピシリンを含むＮＡプレート上３
７℃でインキュベートする。生育したコロニーから採取した細胞を翌朝、滅菌水
２０μｌに再懸濁して、９４℃で１０分間インキュベートする。各場合につき、
０.２μgの２種のプライマー P-CPBf22 および P-CPBrev1271を含有するＰＣＲ
反応緩衝液を、ついで標準的ＰＣＲ反応を１００μｌの反応容量で実施できる懸
濁液に加える。ついで反応産物をゲル電気泳動によって分析する。増幅すると約
１２５０bpのフラグメントを与えることができるＤＮＡを含有するトランスフォ
ーマントが正しいとして認識される。この方法で特定されるクローンの１つから
プラスミドＤＮＡを単離し、挿入されたｃＤＮＡ配列を配列分析に付し、その特
性を完全に明らかにする。測定された配列は Aloyら（Biol.Chem. 379: 149-155
, 1988）により報告された配列と完全に同一であることが分かる。報告に従い、
プロカルボキシペプチダーゼのアミノ酸−９５〜３０７をコードするコドンを発
現に用いる。使用した発現ベクターはCregg, J.M.ら（Bio／Technologie 11: 90
5-910, 1993）およびScorer, C.A.ら（Bio／Technologie 12: 181-184, 1994）
により記載されたプラスミドｐＰＩＣ９である。このためには、プラスミドｐＰ
ＩＣ９ を制限酵素ＸhoＩおよびＥcoＲＩを用いて開裂させる。ベクターへのｃ
ＤＮＡ配列の挿入には２つのプライマーを合成する。順行プライマー PPICCPBf
は配列： ＸhoＩ プロカルボキシペプチダーゼ→ 5′TTTTTTCTCGAGAAAAGACATCATGGTGGTGAGCAC 3′ （配列番号：１）
を有し、逆行プライマー PPICCPBrev は構造： ＥcoＲＩ プロカルボキシペプチダーゼ 5′TTTTTTGAATTCCTTACTACTAGTACAGGTGTTCCAGGAC 3′ （配列番号：２）
を有する。
【００２８】 標準的ＰＣＲ反応では２つのプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、得られた
フラグメントを精製後、酵素ＸhoＩおよびＥcoＲＩで消化する。この方法であつ
らえたフラグメントを反応混合物から沈殿させ、水中に取り、開裂したベクター
フラグメントとリガーゼ反応で反応させる。コンピテントなＩＮＶαＦ′細胞を
ライゲーション混合液を使用してトランスフォームし、選択プレート上で培養器
で培養する。所望の発現プラスミドを含有するコロニーを記載のようにＰＣＲ法
で同定する。正しいとして認識されるクローンからプラスミドＤＮＡが得られる
。このＤＮＡをヒスチジンの栄養要求株のP.pastoris株ＧＳ115（Scorer C.A.ら
, Biotech-nology 12: 181-184, 1994）中にCregg J.M.らによって記載された方
法により導入する。トランスフォーメーション後に、ヒスチジンに原栄養株にな
ったコロニーをプロカルボキシペプチダーゼタンパク質の発現について詳細に調
べる。このためには、Clare, J.J.ら（Gene 105: 205-212, 1991）によって記載
されたように５０のクローンを発現させる。発現の終了時に１mlの培養メジウム
を採取し、細胞を遠心分離により除去して澄明な上清を凍結乾燥する。上清のア
リコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。クマシー
ブルー染色後、一部の上清サンプル中には澄明なバンドを４５,０００dt分子量
の範囲に見ることが可能であり、これは非誘導培養の上清サンプル中には観察さ
れない。このバンドは、Chemicon（注文番号ＡＢ1801）からの抗−ブタカルボキ
シペプチダーゼＢ抗体のウエスタンブロット分析において明瞭に認識される。プ
ロカルボキシペプチダーゼＢを発現し、実施例２によって単離された、この実験
で最高の収率で産生されたクローンの培養液１００mlを２Ｌのクロスバフル（cr
ossbaffle）シェーカーフラスコ中で培養する。
【００２９】 実施例２ この実施例は、実施例１による培養ブロスの上清からのヒトプロカルボキシペ
プチダーゼＢの精製を記載する。最初に細胞を遠心分離で除去する。澄明な上清
をついで硫酸アンモニウムで約55％濃度の飽和が達成されるまで処理する。沈殿
したタンパク質を遠心分離で除き、ペレットを１mMのＥＤＴＡからなる５mlの５
０mMトリス塩酸塩溶液（ｐＨ７.５）に溶解する。タンパク質懸濁液をついで、
ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーで分離する。溶出クロマトグラムを０〜
０.５Ｍ ＮａＣｌの勾配にわたってプロットする。所望のタンパク質を含有する
分画をウエスタンブロット分析で同定する。それらの分画を合わせて限外ろ過に
よって濃縮する。残留液中のタンパク質濃度をBradfordによるタンパク質定量方
法で測定する。この方法で濃縮されたプロカルボキシペプチダーゼをついで保存
のために凍結乾燥するか、または実施例４に従ってトリプシン処理により直接活
性化する。ゲル電気泳動により分離した物質のクマシーブルー染色では約60％の
物質が約４５,０００dt分子量のタンパク質バンド中に見いだされることを示す
。このバンドは、ウエスタンブロットで同定された領域に相当する。
【００３０】 実施例３ この実施例は(His)4−プロカルボキシペプチダーゼＢの合成のための発現ベク
ターの調製を記載する。構築は実施例１に記載の経路に従って実施する。プライ
マーPPICCPBrevを使用する（実施例１参照）。順行プライマーはそれがヒスチジ
ンの付加的な４個のコドンを含むように修飾される。プライマーPCPBHisfの配列
はしたがって以下のように読める： ＸhoＩ プロカルボキシペプチダーゼ→ 5′TTTTTTCTCGAGAAAAGACACCATCACCACCATCATGGTGGTGAGCAC 3′ (His)4 （配列番号：３）
【００３１】 この方法で構築されるP. pastoris株を発現に使用し、HIS−プロカルボキシペ
プチダーゼＢタンパク質は溶液中硫酸アンモニウムで沈殿させたのちにニッケル
親和性クロマトグラフィー工程によって直接精製する。使用したクロマトグラフ
ィー支持材料は「ProBond」（登録商標）ニッケルキレーティング樹脂（Invitro
genカタログ番号Ｒ８０１−０１）であり、製造業者の詳細な説明書に従って使
用した。クマシーブルー染色後、ゲル電気泳動による分析は実際、分子量約４５
,０００dtを有するただ１個の可視バンドを示す。このバンドはウエスタンブロ
ット実験に用いた抗体により認識される。この方法で精製された物質を限外ろ過
して、Bradfordの方法でタンパク質を定量したのち、保存のために凍結乾燥する
か、または実施例４によって直接活性化する。
【００３２】 実施例４ この実施例は、トリプシンとの反応によるプロカルボキシペプチダーゼＢの活
性化を記載する。これには、実施例２からの凍結乾燥物質２２mgを０.１モルの
ＨＣｌ溶液（ｐＨ７.８）１４mlに溶解し、２６℃に加熱してトリプシン溶液（
０.１Ｕ／ml）１５μlと混合し、撹拌しながら３時間インキュベートする。つい
で溶液を大豆トリプシンインヒビターと混合し、トリプシン、このインヒビター
、プロペプチドフラグメントをカルボキシペプチダーゼＢから除去し、他の構成
成分は分子量排除限界３０,０００dtのCentriprep（登録商標）フィルターユニ
ット（アミコン（Amicon）によってマイクロろ過してカルボキシペプチダーゼＢ
から分離する。活性なカルボキシペプチダーゼＢを５mMのトリス緩衝液（ｐＨ７
.５）中で凍結させて保存する。Folk, J.E. の操作（Meth. Enzym. 19: 504-508
, 1970）によってタンパク質の濃度を測定したのちに比活性を測定する。実施例
３によって調製された出発原料を使用する場合は活性化には１５mgのみの出発原
料を使用する。
【００３３】 実施例５ この実施例は、モノ−Ａrgインスリンからインスリンの製造のためにトリプシ
ンとプロカルボキシペプチダーゼＢの併用を記載する。欧州特許出願ＥＰ−Ａ
０ ３４７ ７８１号の実施例６には１個の同じ反応容器中でのモノ−Ａrgインス
リンのトリプシンおよびプロカルボキシペプチダーゼＢの反応が記載されている
。この実施例では、欧州特許出願ＥＰ−Ａ ０ ３４７ ７８１号の実施例６にお
けるカルボキシペプチダーゼＢが本出願の実施例２からのプロカルボキシペプチ
ダーゼＢ １５μgまたは本出願の実施例３からのプロカルボキシペプチダーゼＢ
１０μgによって置換される。両反応とも、２.５μlの保存溶液(欧州特許出願
ＥＰ−Ａ ０ ３４７ ７８１号の実施例６による）の代わりに３μlのトリプシン
を使用してトリプシン濃度を上昇させる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 BA14 CA04 CA06 CA07 CA10 DA12 EA04 FA18 GA11 HA03 4B050 CC03 DD07 LL05 4B064 AG16 CA21 CC24 DA07 4B065 AA77X AA93Y AB01 BA02 CA33 CA44

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダー
    ゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質の製造方法において、 (ａ) 天然もしくは非天然前駆体型カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキ
    シペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質を微生物中分泌
    様式により発現させ、 (ｂ) 分泌様式により発現された前駆体型を精製し、および (ｃ) 精製された前駆体型を酵素処理によって活性型カルボキシペプチダーゼ
    ＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク
    質に変換することからなる方法。
  2. 【請求項２】 膵臓カルボキシペプチダーゼＢまたはそのアイソフォームは
    ヒト起源である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 天然の前駆体型は、プロカルボキシペプチダーゼＢまたはプ
    ロカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームに相当する請求項１または２記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 非天然前駆体型は以下の構造： Ｓ−(Ａｓ)x−Ｅ−ＣＢ （Ｉ） （式中、 Ｓは、発現時に形成される融合タンパク質の各微生物からの分泌をもたらすシ
    グナルペプチドであり、 Ａsはいずれか所望の遺伝学的にコード可能なアミノ酸であり、 Ｅはエンドペプチダーゼ認識配列から構成されるペプチドリンカーであり、 ＣＢは、カルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダーゼＢのアイソ
    フォームもしくは突然変異タンパク質のアミノ酸配列であり、 ｘは０〜１００の整数である）を有する請求項１または２記載の方法。
  5. 【請求項５】 ペプチド配列は天然または非天然前駆体型に結合し、それが
    前駆体型のアフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能にする請求項１〜
    ４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 アフィニティクロマトグラフィーによる精製のために結合す
    る配列は１〜６個、好ましくは４個のヒスチジン残基である請求項５記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 発現に用いられる微生物は酵母のPichia pastorisである請
    求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 酵素トリプシン、エラスターゼ、第Ｘａ因子、キモトリプシ
    ンまたはコラーゲナーゼ、好ましくはトリプシンが酵素処理に使用される請求項
    １〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 工程（ｃ）はインスリンのＢ、ＣおよびＡ鎖からなるインス
    リン前駆体型またはインスリン誘導体の存在下に適当な反応条件で進行させ、こ
    の過程において成熟インスリンまたは成熟インスリン誘導体が形成され、これを
    反応混合物から単離する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の方法におけるプロカルボキシペプチダーゼ
    ＢおよびカルボキシペプチダーゼＢまたはそれらのアイソフォームもしくは突然
    変異タンパク質の使用。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜９のいずれかに記載の過程において使用する核
    酸構築体において、カルボキシペプチダーゼＢの天然または非天然前駆体型また
    はカルボキシペプチダーゼＢのアイソフォームもしくは突然変異タンパク質をコ
    ードするＤＮＡ配列からなり、上述のコード配列は適当な微生物中における前駆
    体型の発現を可能にするプロモーターに作動的に連結されている核酸構築体。
  12. 【請求項１２】 ＤＮＡ配列は式Ｉのタンパク質をコードする請求項１１記
    載の核酸構築体。
  13. 【請求項１３】 １〜６個好ましくは４個のヒスチジン残基をコードするＤ
    ＮＡ配列はさらにカルボキシペプチダーゼＢの天然または非天然前駆体型をコー
    ドするＤＮＡ配列に結合する請求項１１または１２に記載の核酸構築体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸構築体の製造方
    法において、 (ａ) 上述のＤＮＡ配列を単離または調製し、ついで (ｂ) 適当な方法でベクター中に挿入することからなる方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜９のいずれかに記載の方法における請求項１１
    〜１３のいずれかに記載の核酸構築体の使用。
  16. 【請求項１６】 請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸構築体からなる
    宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 請求項１６記載の宿主細胞を調製する方法において、適当
    な微生物に請求項１〜９のいずれかに記載の核酸構築体を包含させる方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜９のいずれかに記載の方法における請求項１６
    記載の宿主細胞の使用。
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