JP2010509929A - 活性化カルボキシペプチダーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｋｅｘ２部位がカルボキシペプチダーゼのプロ配列に導入されているカルボキシペプチダーゼのプロ型をコードするＤＮＡ配列を導入し、プロカルボキシペプチダーゼの発現に適した条件下で真菌細胞を培養し、細胞内でプロ配列を切断し、遊離の活性型のカルボキシペプチダーゼを放出させることを含む、真菌細胞において活性化したカルボキシペプチダーゼを製造する方法に関する。また本発明は、活性化したカルボキシペプチダーゼ酵素を使用することによる、成熟ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログを製造する方法に関する。

Description

本発明は、活性化カルボキシペプチダーゼの製造方法及び真菌細胞での成熟ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログの生産のための活性化カルボキシペプチダーゼの使用方法に関する。

インスリンは、ランゲルハンス島のベータ細胞で生産されるポリペプチドホルモンである。活性なインスリン分子は、２つのジスルフィド架橋により結合しているＢ及びＡ鎖からなる２本鎖分子である。インスリンは構造Ｂ-Ｃ-Ａを有する前駆体分子プロインスリンとして合成され、ここでＣペプチド鎖は、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸残基をＡ鎖のＮ末端アミノ酸残基に連結させている。成熟２本鎖インスリンは、Ａ及びＢ鎖の接合部に位置する塩基性アミノ酸残基対にてＣペプチドをインビボで切断することにより形成される。Ａ及びＢ鎖は、それぞれＡ７とＢ７、及びＡ２０とＢ１９Ｃｙｓ残基の間の２つのジスルフィド架橋により互いに保持されている。さらに、生物学的に活性なインスリン分子は、Ａ６及びＡ１１位にあるＣｙｓ残基間に内部ジスルフィド架橋を有している。

組換えＤＮＡ技術の発展後、遺伝的に改変された宿主細胞中でインスリン及びその前駆体を生産するための多くの方法が記載されている。大腸菌は、発現されたポリペプチドを折り畳むための細胞機構を有しておらず、成熟インスリンにおいてＡ及びＢ鎖を連結するジスルフィド架橋を確立するために、この方法は、多くのインビトロプロセシング工程、例えば再折り畳み中でのジスルフィド架橋のインビトロでの確立と、続くＣペプチドの切断を含む。

大腸菌と比較して、真核生物は、折り畳み及びジスルフィド架橋の確立に必要な機構を有しており、よって、遺伝的に改変された生物での成熟インスリンの生産のための良好な候補であると思われる。Thimら, FEBS Letters, 第212巻, 2号, 307-312には、ヒトプロインスリンの発現、及びある種の修飾Ｃペプチドを有する多くのインスリン前駆体が開示されている。米国特許第４９１４０２６号には、酵母α−因子リーダー配列に結合したヒトプロインスリン遺伝子を酵母宿主細胞に挿入することにより、酵母において成熟インスリンを作製し、プロインスリンが発現し成熟型で分泌させる条件下で、形質転換された酵母細胞を栄養培地中で増殖させる方法が開示されている。

国際公開第９７／０３０８９号には、式ＢＺＡを有するインスリン前駆体の発現が開示されており、ここでＢ及びＡは、少なくとも一のジスルフィド結合により結合したヒトインスリンのＡ及びＢペプチド鎖であり、Ｚは少なくとも一のタンパク分解的切断部位を有するポリペプチドである。国際公開第９０／１００７５号には、発酵ブロスからの最初の回収に続いて、成熟インスリン又はインスリンアナログに酵素的に転換されるインスリン及びインスリンアナログを、酵母中でのインスリン又はインスリンアナログの前駆体の発現をベースにして製造する方法が開示されている。前駆体分子はある種の修飾Ｃペプチドを含んでおり、インスリンＢ鎖のＮ末端伸長部をさらに含んでいてもよい。修飾Ｃペプチド及びＢペプチドの可能なＮ末端伸長部は、酵母細胞中で切断されないように設計され、よって前駆体は、Ａ及びＢ鎖が修飾Ｃペプチドにまだ結合しているが、正確に位置付けされたジスルフィド架橋は有している単鎖ペプチドとして分泌される。ついで、成熟インスリン又はインスリンアナログ産物が、Ｃペプチドと場合によってはＮ末端伸長部を切断する複数の後続するインビトロ酵素的工程により得られる。これらの酵素的工程は、時間がかかり、多くの場合はコストが高く、高価なクロマトグラフィー工程等、さらなる下流プロセス工程で除去しなければならない付加的な汚染物質が入り込むおそれがある。

天然には分泌顆粒を形成できない遺伝子操作動物細胞において成熟インスリンを製造する方法は米国特許第６３４８３２７号に開示されている。

本発明の目的は、プロテイナーゼＡ及びＢとは独立して細胞内的に活性化させるカルボキシペプチダーゼを生産可能な真菌株を開発すること、さらに、高価で時間のかかる下流精製プロセス工程が回避されるように別法で活性化されたカルボキシペプチダーゼにより、十分にプロセシングされた成熟インスリン又はインスリンアナログを製造する方法を開発することにある。

一態様では、本発明は、挿入Ｋｅｘ２切断部位を含むカルボキシペプチダーゼの修飾されたプロ型（プロフォーム）をコードするＤＮＡ配列を真菌細胞中で発現させることを含む活性化したカルボキシペプチダーゼを製造する方法に関し、ここでカルボキシペプチダーゼのプロ型が細胞内で切断されて、遊離の活性型カルボキシペプチダーゼが放出される。
本発明の一実施態様では、本方法は、真菌細胞から活性型のカルボキシペプチダーゼを単離する工程をさらに含む。
本発明のさらなる実施態様では、真菌細胞は、非機能性ＰＥＰ４遺伝子(プロテイナーゼＡをコードする遺伝子)を有する。
本発明の一実施態様では、真菌細胞は欠失したＰＥＰ４遺伝子を有する。
Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼのプロ型の、カルボキシペプチダーゼのプロ型が効果的に切断されてカルボキシペプチダーゼの活性化成熟型を形成させる位置に挿入される。

本発明の一実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、野生型カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に直接結合している。
他の実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基の比較的近接した位置に導入される。しかしながら、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して、好ましくは約３０以下のアミノ酸残基上流又は下流に存在すべきである。

本発明の一実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して、１〜約３０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
本発明の一実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して、１〜約３０アミノ酸残基上流の距離に導入される。
本発明のさらなる実施態様では、Ｋｅｘ２切断部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して、２-３０アミノ酸残基上流の距離に導入される。
本発明のさらなる実施態様では、Ｋｅｘ２切断部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して、５-３０アミノ酸残基上流の距離に導入される。
本発明のさらなる実施態様では、Ｋｅｘ２切断部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して、５-２０アミノ酸残基上流の距離に導入される。

他の実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の、２-３０、２-２９、２-２８、２-２７、２-２６、２-２５、２-２４、２-２３、２-２２、２-２１、又は２-２０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の、３-３０、３-２９、３-２８、３-２７、３-２６、３-２５、３-２４、３-２３、３-２２、３-２１、又は３-２０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の、４-３０、４-２９、４-２８、４-２７、４-２６、４-２５、４-２４、４-２３、４-２２、４-２１、又は４-２０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の、５-３０、５-２９、５-２８、５-２７、５-２６、５-２５、５-２４、５-２３、５-２２、５-２１、又は５-２０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の３アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の４アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の５アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の６アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の７アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の８アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の９アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１２アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１３アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１４アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１５アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１６アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１７アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１８アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の１９アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２１アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２２アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２３アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２４アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２５アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２６アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２７アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２８アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の２９アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。
さらなる実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端酸残基の３０アミノ酸残基上流又は下流の距離に導入される。

さらなる実施態様では、本発明は、上述した実施態様のいずれかの方法により生成されたカルボキシペプチダーゼと、Ｂ鎖のＣ末端伸長部を有するヒトインスリン又はそのアナログの前躯体とを反応させることによる、成熟ヒトインスリン又はそのアナログを製造する方法であって、Ｃ末端伸長部が切断されて、成熟ヒトインスリン又はそのアナログが得られる方法に関する。

一態様では、本発明は、成熟ヒトインスリン又はそのアナログを製造する方法であって、真菌細胞において、
ｉ）Ｂ鎖のＣ末端伸長部を有するヒトインスリン又はそのアナログの前躯体をコードするＤＮＡ配列と、
ｉｉ）そのプロ型に挿入Ｋｅｘ２切断部位を有するカルボキシペプチダーゼのプロ型をコードするＤＮＡと
を同時発現させることを含み、
ヒトインスリン前駆体分子におけるＢ鎖のＣ末端伸長部を、同時発現され活性化されたカルボキシペプチダーゼにより真菌細胞内で切断し、成熟ヒトインスリン又はそのアナログを培養培地から単離する方法に関する。
カルボキシペプチダーゼは、任意の適切なカルボキシペプチダーゼであってよい。しかしながら、本発明の一実施態様では、カルボキシペプチダーゼは宿主真菌細胞に内在している。さらなる実施態様では、カルボキシペプチダーゼはＣＰＹである。

本方法の一実施態様では、ヒトインスリン又はそのアナログの前躯体は、ヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖、ヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖、及びＢ鎖とＡ鎖を連結するＣペプチドを含有し、ここでＣペプチドは少なくとも一のＫｅｘ２切断部位を含有し、Ｂ鎖は真菌細胞内におけるＣペプチドのより効果的なＫｅｘ２切断を促進させ、さらにカルボキシペプチダーゼを用いた切断が可能なＣ末端伸長部を含む。

Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸残基に結合するアミノ酸配列は比較的短く、典型的には、１-４又は１-３のアミノ酸残基、特に２のアミノ酸残基を有するであろう。この配列におけるアミノ酸残基は疎水性アミノ酸残基であり、典型的にはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択されるであろう。
Ｂ鎖のＣ末端伸長部の非限定的例は、Ｌｅｕ-Ｇｌｙ；Ｌｅｕ-Ａｌａ；Ｌｅｕ-Ｌｅｕ；Ｌｅｕ-Ｍｅｔ及びＬｅｕ-Ｉｌｅである。

本発明の一実施態様では、インスリン前駆体におけるＣペプチドは、Ａ鎖においてＮ末端アミノ酸残基に直接結合した単一のＫｅｘ２部位を含み、この位置で確実に切断される。
本発明のさらなる実施態様では、Ｃペプチドは、２つのＫｅｘ２部位の間に挿入されてペプチド配列を有する、２つのＫｅｘ２切断部位を含む。２つのＫｅｘ２部位の間のペプチド配列の長さ及びアミノ酸組成は、発現した単鎖インスリン前駆体の折り畳みが可能であり、インスリン前駆体分子内に、正確に位置付けされたジスルフィド架橋が確立可能であるならば、変えてもよい。
天然Ｃペプチドの大きさは、３５アミノ酸残基である。よって本発明の一態様では、２つのＫｅｘ２部位の間のペプチド配列は、天然Ｃペプチドとほぼ同じ長さである。

一実施態様では、２つのＫｅｘ２部位の間のペプチド配列は、１-３５、１-３４、１-３３、１-３１、１-３０、１-２９、１-２８、１-２７、１-２６、１-２５、１-２４、１-２３、１-２２、１-２１、１-２０、１-１９、１-１８、１-１７、１-１６、１-１５、１-１４、１-１３、１-１２、１-１１、１-１０、１-９、１-８、１-７、１-６、１-５、１-４、１-３又は１-２アミノ酸残基長である。

本発明の一実施態様では、ヒトインスリン前駆体は、次のアミノ酸配列：
Ｂ(１-３０)-Ｘ_１-Ｘ_２-Ｚ-Ｘ_３-Ｘ_４-Ａ(１-２１)
[上式中、Ｂ(１-３０)は、ヒトインスリンのＢ鎖又はそのアナログであり、Ａ(１-２１)はヒトインスリンのＡ鎖又はそのアナログであり、Ｘ_１は、真菌細胞内でのさらに効果的なＫｅｘ２切断を促進するであろう、１-５のアミノ酸残基のペプチド配列であり、Ｘ_２はＫｅｘ２切断部位であり、Ｚは、１〜約３５のアミノ酸残基を有するペプチド配列又はペプチド結合であり、Ｘ_３はＫｅｘ２切断部位又はペプチド結合であり、Ｘ_４はアミノペプチダーゼ切断部位又はペプチド結合である]
を有する。

本発明の一実施態様では、Ｘ_３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｚはペプチド配列であり、Ｘ_４はペプチド結合である。
本発明の他の実施態様では、Ｘ_３及びＺはペプチド結合であり、Ｘ_４はアミノペプチダーゼ切断部位である。

Ｘ_１は、典型的には、１-４又は１-３のアミノ酸残基長であり、一実施態様では、Ｘ_１は、２つのアミノ酸残基のペプチド配列である。Ｘ_１におけるアミノ酸残基は、好ましくは疎水性アミノ酸残基であり、典型的にはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｓｐ及びＧｌｙからなる群から選択される。
他の実施態様では、Ｘ_１におけるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｓｐ及びＧｌｙからなる群から選択される。
本発明の一実施態様では、Ｘ_１はＬｅｕ-Ａｌａである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ_１はＰｈｅ-Ｌｅｕである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ_１はＬｅｕ-Ｇｌｙである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ_１はＬｅｕ-Ｌｅｕである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ_１はＬｅｕ-Ｍｅｔである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ_１はＬｅｕ-Ｉｌｅである。

図１はプラスミドＥＳＩ４２-３３を示す。 図２はプラスミドｐＲＣ１を示す。 図３はプラスミドｐＳＡ１６０を示す。 図４は、菌株包含ｐＳＡ１６０を２４時間培養した上清のデコンボリューション質量スペクトルを示す。質量５７６３は、十分にプロセシングされたＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈインスリンに相当する。 図５は、一つのＫｅｘ２部位を有するインスリン前駆体の切断の概略図を示す。 図６は、一つのＫｅｘ２部位とアミノペプチダーゼ部位を有するインスリン前駆体の切断を示す。 図７は、２つのＫｅｘ２部位を有するインスリン前駆体の切断を示す。

カルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)は、酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において、不活性なプロ型(プロＣＰＹ)として合成される。小胞体(ＥＲ)内におけるタンパク質の転座後、それは液胞に運搬される。到着時、それは、プロテイナーゼＡにより開始されるタンパク質分解事象であるプロペプチドの除去により活性化される。２つのシナリオが、プロＣＰＹのＣＰＹへの効果的な転換を防止する：１）ＰＥＰ４遺伝子(プロテイナーゼＡをコードする遺伝子)が欠失しているか又は不活性であるならば、全てのＣＰＹは不活性なプロ型のままであるだろう。２）ＰＲＣ１(ＣＰＹをコードする遺伝子)が過剰発現しているならば、多量のプロＣＰＹが発酵ブロスに分泌されるであろう。プロテイナーゼＡが液胞に位置しており、よって分泌されたプロＣＰＹから分離しているために、これはプロ型で残存しているであろう。これらの状況で、プロＣＰＹを十分に活性化可能とするために、代替となる活性経路が必要とされている。

プロペプチドと成熟したＣＰＹとの間に界面に、プロテイナーゼＡにより認識可能な配列モチーフが位置しており、よって特異的な切断に至る。切断時に、プロペプチドは成熟したＣＰＹから分離する。本発明において、多くの変異体が作製され、ここでプロペプチドと成熟したＣＰＹとの間の界面に近接した残基は、Ｋｅｘ２により認識される二塩基性切断部位が挿入される方法で変異される。これにより、Ｋｅｘ２ｐが位置するコルジ体において、プロＣＰＹからＣＰＹへの転換が確実になる。これで、ＣＰＹの活性化におけるプロテイナーゼＡの必要性はなくなる。さらに、多量の活性化ＣＰＹを分泌可能とするために、変異した遺伝子は過剰発現している。

以下、野生型酵素の天然Ｎ末端アミノ酸残基の３１上流の位置から野生型ＣＰＹカルボキシペプチダーゼのプロ配列のアミノ酸配列、及び野生型酵素のＮ末端から最初の９のアミノ酸残基、及びＫｅｘ２部位(ＫＲ)が、Ｎ末端アミノ酸残基に対して、種々の位置の上流又は下流に挿入されている変異体Ａ-Ｇの対応する配列を示す。プロ配列が切断される切断位置を矢印で示す。
野生型：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＶＫＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮ↓ＫＩＫＤＰＫＩＬＧ(配列番号：１)。
変異体Ａ：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＶＫＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮＫＩＫＲ↓ＤＰＫＩＬＧ(配列番号：２)。
変異体Ｂ：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＶＫＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＬＧＫＲ↓ＤＰＫＩＬＧ(配列番号：３)。
変異体Ｃ：ＬＧＫＲ↓ＥＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＶＫＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮＫＩＫＤＰＫＩＬＧ(配列番号：４)。
変異体Ｄ：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＲ↓ＤＷＤＦＶＶＫＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮＫＩＫＤＰＫＩＬＧ(配列番号：５)。
変異体Ｅ：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＫＲ↓ＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮＫＩＫＤＰＫＩＬＧ(配列番号：６)。
変異体Ｆ：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＶＫＬＤＫＲ↓ＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮＫＩＫＤＰＫＩＬＧ(配列番号：７)。
変異体Ｇ：ＫＰＫＦＰＥＡＩＫＴＫＫＤＷＤＦＶＶＫＮＤＡＩＥＮＹＱＬＲＶＮＫＩＫＤＰＫＲ↓ＧＧＩＬＧ(配列番号：８)。

ここで使用される場合、用語「プロペプチド」又は「プロ配列」は、その機能が、折り畳み、及び発現したポリペプチドの、小胞体から、分泌経路内又は細胞外におけるその最終的な目的地までの運搬を促進させるものである、ポリペプチド配列を意味する。さらにプロペプチドは、カルボキシペプチダーゼの酵素活性を阻害する。
用語「プロ型」は、プロ配列と活性化ポリペプチド配列の融合産物を意味する。

カルボキシペプチダーゼは、真菌細胞で発現可能であり、真菌細胞で発現した内在性Ｋｅｘ２ｐ酵素により活性化可能な任意のカルボキシペプチダーゼであってよい。
カルボキシペプチダーゼの代表例は、カルボキシペプチダーゼＡ(ＥＣ３.４.１７.１)、カルボキシペプチダーゼＡ２(ＥＣ３.４.１７.１５)、カルボキシペプチダーゼＢ(ＥＣ３.４.１７.２)、カルボキシペプチダーゼＥ(ＥＣ３.４.１７.１０)、カルボキシペプチダーゼＭ(ＥＣ３.４.１７.１２)、カルボキシペプチダーゼＴ(ＥＣ３.４.１７.１８)、カルボキシペプチダーゼＵ(ＥＣ３.４.１７.２０)、及びカルボキシペプチダーゼＹ(ＥＣ３.４.１６.５)である。
本発明の一実施態様では、カルボキシペプチダーゼはＣＰＹである。

導入されたＫｅｘ２部位が、カルボキシペプチダーゼにおいてＮ末端アミノ酸残基に直接結合しているならば、活性型は、カルボキシペプチダーゼの天然形態であろう。
Ｋｅｘ２部位が、天然Ｎ末端アミノ酸に直接結合していないならば、放出されたカルボキシペプチダーゼは可変長のＮ末端伸長部を有するか、又はＫｅｘ２部位の位置に応じて、Ｎ末端における一又は複数の天然アミノ酸残基が欠失しているであろう。

活性化カルボキシペプチダーゼは、任意の種類の融合タンパク質のプロセシングに使用可能である。
カルボキシペプチダーゼは、それ自身のプロモーターを含む、任意の適切なプロモーターから発現してよい。しかしながら、カルボキシペプチダーゼレベルが、インスリン前駆体の異常なプロセシングに至しめる、あまりの高さになるおそれがあることがわかっている。インスリン前駆体と活性化カルボキシペプチダーゼとの間の適切な比率を発見するため、カルボキシペプチダーゼ変異体の発現レベルが、カルボキシペプチダーゼそれ自身のプロモーターを、代替プロモーターで置き換えることにより調節されてもよい。
カルボキシペプチダーゼがＣＰＹ酵素であるならば、適切な代替プロモーターは、ＣＹＣ１、ＫＥＸ２、ＭＦ(アルファ)１及びＭＰＤ１の遺伝子からのプロモーター領域である。

また、カルボキシペプチダーゼのプロ型の量は、当該問題におけるプロモーターの転写因子の量を変えることにより、そのプロモーターからの発現性を調節することで調整されうる。
本発明の一実施態様では、カルボキシペプチダーゼのプロモーターはＫｅｘ２プロモーターである。

カルボキシペプチダーゼの修飾されたプロ型とヒトインスリン前駆体を、真菌細胞において同時発現させることで、さらなる高価な下流プロセシング工程を必要とすることなく、十分にプロセシングされたヒトインスリンを、発酵ブロスに分泌させることができるであろう。第１の工程として、発現したヒトインスリン前駆体を、ゴルジプロテアーゼＫｅｘ１ｐ及びＫｅｘ２により、細胞内でプロセシングするであろう。ヒトインスリン前駆体は、インスリンのＢ鎖において、Ｃ末端アミノ酸残基に外部アミノ酸残基(Ｘ)を付加することにより修飾されているＣペプチドを含む。これらの外部アミノ酸残基は、真菌細胞内において、インスリン分子のＡ及びＢ鎖からの、Ｃペプチドの効果的な切断を促進させるように設計されている。Ｋｅｘ１ｐ及びＫｅｘ２ｐによる完全なプロセシングにより、Ｂ鎖のＣ末端の伸長部Ｘを有する、２本鎖ヒトインスリン前駆体分子になる。前駆体は形態Ｂ-(Ｘ)ｎ・・・Ａを有し、ここでＢはヒトインスリンのＢ鎖であり、ＡはヒトインスリンのＡ鎖であり、Ｘは外部アミノ酸残基であり、Ａ及びＢ鎖はヒトインスリンのように、２つのジスルフィド架橋で結合している。

ついで、このＣ末端で伸長している２本鎖ヒトインスリンは、Ｂ鎖Ｃ末端伸長部を切断するカルボキシプロテアーゼを同時発現及び活性化させることによる切断で、成熟ヒトインスリン又はそのアナログに転換され、成熟した２本鎖ヒトインスリン又はそのアナログが得られるであろう。

Ｂ３０位にあるアミノ酸残基に応じて、カルボキシペプチダーゼはＢ３０アミノ酸残基を離し、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンアナログになってもよい。さらにカルボキシペプチダーゼはＢ鎖のＣ末端から５までのアミノ酸残基が離れ、ｄｅｓＢ(２９-３０)-、ｄｅｓＢ２８-３０)-、ｄｅｓＢ(２７-３０)-、又はｄｅｓＢ(２６-３０)ヒトインスリンアナログになったもよい。

インスリン前駆体の種々のプロセシングパターンを、図５-７において概略的に例証する。
図５において、インスリン前駆体コンストラクトは、単一のＫｅｘ２部位、ＫＲ、及び結合ペプチドにおいて配列ＸＸにより例証されるＢ鎖のＣ末端伸長部を有する。第１のプロセシング工程では、Ｋｅｘ２により、Ｋｅｘ２部位で切断されて、単鎖構造が、Ｂ鎖に結合した配列ＸＸＫＲを有する２本鎖構造に転換される。続いて、酵素Ｋｅｘ１がＫＲ配列を切断し、最終的に、カルボキシペプチダーゼがＢ鎖のＸＸ伸長部を切断し、成熟した２本鎖インスリン生成物が得られる。

図６には他の実施態様が例証されており、ここでインスリン前駆体は、単一のＫｅｘ２部位及びアミノペプチダーゼ切断部位、ＹＹを結合ペプチド中に有する。図５のように、Ｋｅｘ２ｐ、Ｋｅｘ１ｐ及びカルボキシペプチダーゼにより、ＸＸ-ＫＲ配列が除去されるであろう。しかしながら、この実施態様では、最後のアミノペプチダーゼ切断により、ＹＹ配列が除去されて、成熟した２本鎖インスリン生成物が得られる。
図７に例証した実施態様では、インスリン前駆体は、ペプチド鎖Ｚにより結合した２つのＫｅｘ２切断部位を有する。Ｋｅｘ２を用いた第１の切断によりＺ-ＫＲ配列が除去され、Ｋｅｘ１によりＫＲ配列が除去され、最終的に、カルボキシペプチダーゼによりＸＸ配列が除去される。

真菌細胞から、成熟ヒトインスリン又はインスリンアナログが大量に生成されると、製薬目的のために、十分高純度のインスリン生成物を生成するのに必要な、下流精製工程の数をかなり減少させることができる。例えば、米国特許第４９１６２１２号に開示されている酵母においてインスリンを製造する方法では、インスリン前駆体は２つの工程、すなわち単鎖インスリン前駆体Ｂ(１-２９)-Ａｌａｌ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ａ(１-２１)をヒトインスリンのエステルへ転換させるペプチド転移、ついで、インスリンエステルのヒトインスリンへの加水分解において、ヒトインスリンに転換される。各転換工程は、最初の分離工程と、後続する少なくとも一の精製工程が必要である。よって、成熟インスリンの生成には、少なくとも一の酵素転換を含む、少なくとも６つの付加的な工程が必要である。

欧州特許出願第０１６３５２９Ａ号、ＰＣＴ特許出願、国際公開第９５／０２０５９号及び国際公開第９０／１００７５号には、酵母において、インスリン又はインスリンアナログの前駆体を発現させ、続いて、発酵ブロスからの最初の回収物を成熟インスリン又はインスリンアナログに酵素的に転換させることに基づいた、インスリン及びインスリンアナログを製造する方法が開示されている。前駆体分子は所定の修飾されたＣペプチドを含有しており、インスリンＢ鎖のＮ末端伸長部をさらに含有していてもよい。修飾されたＣペプチド、及び場合によってはＢペプチドのＮ末端伸長部は、酵母細胞において切断されないように設計されており、よって前駆体は単鎖ペプチドとして分泌され、ここでＡ及びＢ鎖は修飾されたＣペプチドにより結合しているが、正確に位置付けされたジスルフィド架橋は有している。ついで、成熟インスリン又はインスリンアナログ生成物は、Ｃペプチド、及び場合によってはＮ末端伸長部を切断する、複数の後続するインビトロ酵素的工程により得られる。これらの酵素的工程は、時間がかかり、多くの場合はコストが高く、高価なクロマトグラフィー工程等、さらなる下流プロセス工程で除去しなければならない付加的な汚染物質が入り込む。

酵素的切断では、製薬用生成物の場合は効果的に除去されなければならない残存する未切断の不純物又は部分的に切断された不純物の１００％切断には達しないことはよく知られている。よって、各切断工程には、少なくとも一の単離又は精製工程、典型的には交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によるクロマトグラフィー精製が続くであろう。
商業的規模で使用されているクロマトグラフィー用カラム材料は、非常に高価であり、よって、このようなクロマトグラフィー工程の数を減らすことは、生産経済において、かなりの影響を有するものである。下流の転換及び精製工程を減らすと、労働者の仕事量及びプロセスに費やされる時間がさらに減少し、よって生産経済がさらに改善される。

本プロセスにおいて、成熟インスリン又はそのアナログは、培養ブロスから直接単離することができ、製薬用途に十分な純度の生成物を生成させるのに必要な下流のプロセス工程がさらに減少する。

インスリン分子は、修飾が得られるインスリンアナログのインスリン活性に悪影響を及ぼさない限りは、Ａ及び／又はＢ鎖でさらに修飾されていてもよい。
よって、ここで使用される場合、「インスリンアナログ」とは、天然インスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び／又は置換することにより、及び／又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンの構造から形式的には誘導することができる分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加された及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れでもよい。
インスリンアナログは、ヒトインスリンと比較して、典型的には約７を越える変異、より典型的には５を越える変異、最も典型的には最大３の変異を含まない。

長年にわたって、インスリンＡ及び／又はＢ鎖におけるかなり多数の変異が開示されている。例えば、Ｂ鎖の２８位は、天然のＰｒｏ残基から、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、又はＩｌｅに修飾されていてもよく、またＢ２９位のＬｙｓはＰｒｏに修飾されていてもよい。
また、Ａ２１位のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、特にＧｌｙに修飾されてもよい。さらに、Ｂ３位のＡｓｎは、Ｌｙｓ又はＡｓｐに修飾されてもよい。インスリンアナログのさらなる具体例は、ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｂ１及びＢ２の一方又は双方が欠失したインスリンアナログ；Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ末端伸長を有するインスリンアナログ、及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ末端伸長を有するインスリンアナログである。またＡ１８位にある天然アミノ酸残基はＧｌｎ残基に変化していてもよく、またＢ２６-Ｂ３０位にある一又は複数のアミノ酸残基は欠失している。

本方法で生成可能なインスリンアナログの具体例は、Ｇｌｙ^Ａ２１ヒトインスリン、Ｇｌｙ^Ａ２１ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓＢ１ヒトインスリン、ｄｅｓ Ｂ３０ヒトインスリン、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、及びＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリンである。
インスリンアナログのさらなる具体例は、Ａ２１、Ｂ１０、Ａ８、Ａ１４、Ｂ２５、Ｂ２７及びＢ１の一又は複数の位置に変異を含む、ヒトインスリンアナログである。

真菌細胞は、全ての真菌が、提供された種類のインスリン前駆体分子を切断し、結合ペプチドを切断し、２本鎖分子をライゲーションさせるのに必須のタンパク質分解活性を有するならば、任意の真菌細胞であってよい。しかしながら、長年にわたって、酵母が、インスリンサイズの小ペプチドの発現及び分泌に有効な細胞腫であることがわかっている。特に、酵母サッカロミセス・セレビシエが有用であることが判明している。
よって、本発明の一実施態様における真菌細胞は酵母細胞であり、さらなる実施態様では、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエである。

本発明で使用されるＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のものでよく、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF及びManiatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York、1989)に従い、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリッド形成により、ポリペプチドの全体又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより得られる。またインスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されたホスホアミジト(phosphoamidite)法、又はMatthesら, EMBO Journal 3 (1984), 801-805により記載された方法により合成的に調製されてもよい。さらに、ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４６８３２０２号、又はSaikiら, Science 239 (1988), 487-491に記載されたようにして、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製されてもよい。

ＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ手順にかけられうる任意のベクターに挿入されてよく、多くの場合、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存する。例えば、ベクターは自己複製可能なベクターであってよく、すなわちベクターは染色体外実体として存在しており、その複製は染色体複製、例えばプラスミドとは独立している。また、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれる染色体(群)と共に複製される。

ベクターは好ましくは発現ベクターであり、そこでインスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列は、プロモーター等、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合する。プロモーターは宿主細胞の選択において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞と相同又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導されてよい。

酵母宿主細胞への使用に適したプロモーターの例には、酵母解糖遺伝子(Hitzemanら, J. Biol. Chem. 255(1980), 12073-12080; Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1(1982), 419-434、又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Youngら, Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaenderら編), Plenum Press, New York, 1982)、又はＴＰＩ１(米国特許第４５９９３１１号)又はＡＤＨ２-４ｃ(Russellら, Nature 304(1983), 652-654)プロモーターが含まれる。

所望の生成物をコードするＤＮＡ配列は、もし必要ならば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に結合していてもよい。さらに本発明の組換えベクターは、当該問題においては、ベクターが宿主細胞内で複製可能なＤＮＡ配列をさらに含んでよい。

宿主細胞の分泌経路にインスリンを方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても公知)は、組換えベクター内に提供されてもよい。分泌シグナル配列は正確なリーディングフレームにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し、５'に位置している。シグナルペプチドは、天然に生じるシグナルペプチド、又はその機能的部分であってよく、又は合成ペプチドであってもよい。
酵母における効果的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列は、シグナル配列の下流と所望の生成物をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されてよい。

異種ＤＮＡで酵母細胞を形質転換させ、異種ポリペプチドを生成させる方法は、例えば米国特許第４５９９３１１号、米国特許第４９３１３７３号、同第４８７０００８号、同第５０３７７４３号、及び同第４８４５０７５号に記載されている。形質転換細胞は、選択可能マーカーにより決定されたフェノタイプ、一般的には薬剤耐性、又は特定の栄養素、例えばロイシンの不在下で成長する能力によって選択される。酵母に使用される好ましいベクターは、米国特許第４９３１３７３号に記載のＰＯＴ１ベクターである。

発酵プロセスにおいて細胞培養に使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の従来からの培地、例えば適切なサプリメントを含有する最小又は複合培地であってよい。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。例えば、培地は、少なくとも一の炭素源、一又は複数の窒素源、カリウム、ナトリウム、マグネシウムの塩、リン酸塩、硝酸塩及び硫酸塩を含む必須の塩、微量金属、水溶性ビタミン類、限定されるものではないが、プロセス補助剤、例えばプロテアーゼインヒビター、安定剤、リガンド、消泡剤及び誘導因子を含有する。培地は、熱による滅菌を含む、いくつかの操作条件において、液体培地に部分的に沈殿又は分散する成分を含有していてもよい。培地は、いくつかの液体とガス状溶液とを混合することにより作製可能である。これらの溶液は発酵タンクに入れる前に混合することもできるし、所定の比率で添加された別々の液体流として、発酵タンクに供給される。培地成分の異なる液体溶液の比率は、発酵プロセスの様々な段階で変化し、これは培地の全ての成分が、発酵の経過によって変化し得ることを意味する。

ついで、細胞により生成されるペプチドは、遠心分離又は濾過、硫酸アンモニウム等の塩により上清又は濾液のタンパク質様成分を沈殿させることによって、培地から宿主細胞を分離させ、当該分野のタンパク質の種類に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー手順により精製することを含む従来からの手順により、培養培地から回収されてよい。

培養ブロスから単離させた後、成熟インスリン又はインスリンアナログを、特にＢ２９Ｌｙｓ残基のε-アミノ基をアシル化することにより、例えばアシル化形態に転換させてもよい。インスリンをアシル化させる方法は当該技術でよく知られており、例えば欧州特許第７９２２９０号及び同第８９４０９５号、米国特許第５６９３６０９号、同第５６４６２４２号、同第５９２２６７５号、同第５７５０４９７号及び同第６０１１００７号に開示されている。

アシル化されたインスリンの例は、Ｎ^εＢ２９-テトラデカノイルｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-リトコロリル-γ-グルタミルｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、又はＮ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１６ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンである。

「ｄｅｓＢ３０」又は「Ｂ(１-２９)」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インスリンＢ鎖又はそのアナログを意味する。
Ｂ(１-３０)はヒトインスリンの天然Ｂ鎖を意味し、「Ａ(１-２１)」は天然インスリンＡ鎖を意味する。Ａ１８Ｑヒトインスリンは、ヒトインスリンＡ鎖のＡ１８位にＧｌｎを有するインスリンアナログである。Ｂ１０Ｅ、Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅは、それぞれＢ１０位にＧｌｕ、Ａ８位にＨｉｓ、及びＡ１４位にＧｌｕを有するインスリンアナログである。
「Ｂ１」、「Ａ１」等とは、それぞれインスリンのＢ鎖の１位(Ｎ末端から数える)のアミノ酸残基及びインスリンのＡ鎖の１位(Ｎ末端から数える)のアミノ酸残基を意味する。特定の位置にあるアミノ酸残基は、例えばＢ１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味するＰｈｅ^Ｂ１として表されてもよい。

「Ｃペプチド」とは、インスリン分子のＡ及びＢペプチド鎖を互いに結合させるペプチド配列を意味する。
「成熟インスリン」とは、正しいアミノ酸残基組成と、天然のヒトインスリン分子と同様の立体構造、すなわちＣｙｓ^Ａ７とＣｙｓ^Ｂ７との間、及びＣｙｓ^Ａ２０とＣｙｓ^Ｂ１９との間のジスルフィド架橋、及びＣｙｓ^Ａ６とＣｙｓ^Ａ１１との間の内部ジスルフィド架橋、及びインスリン活性を有する２本鎖インスリンを意味する。よって、本発明の成熟インスリンはヒトインスリンである。成熟ヒトインスリンアナログは、Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、Ａ１４Ｇｌｕ、Ｂ２５Ｈｉｓヒトインスリン、及びＢ３１Ｌｅｕ、Ｂ３２Ａｌａヒトインスリンであってよい。
ここで使用される場合、「インスリン誘導体」とは、天然に生じるインスリン、又は、例えばインスリン骨格の一又は複数の位置に側鎖が導入されることにより、もしくはインスリンのアミノ酸残基の基を酸化又は還元することにより、もしくは遊離のアミノ基又はヒドロキシ基をアシル化することにより化学的に修飾されたインスリンアナログを意味する。

「Ｋｅｘ２」又は「Ｋｅｘ２ｐ」とは、２つの塩基性残基(リジン又はアルギニン)の配列の後に、好ましくは切断を触媒するサブチリシン様エンドプロテアーゼを意味する(Rockwell, NC, Krysan、DJ、Komiyama, T & Fuller, RS 2002 Precursor Processing by Kex2/Furin Proteases. Chem. Rev. 102: 4525-4548)。
「Ｋｅｘ１」又は「Ｋｅｘ１ｐ」とは、好ましくはＣ末端のリジル及び／又はアルギニル残基の除去を触媒するセリンカルボキシペプチダーゼを意味する(Shilton BH, Thomas DY, Cygler M 1997 Crystal structure of Kex1deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry 36: 9002-9012)。
ＣＰＹとは、好ましくは疎水性又は大きなＣ末端アミノ酸残基、例えばＰｈｅ及びＬｅｕの除去を触媒するカルボキシペプチダーゼである、カルボキシペプチダーゼＹを意味する(Remington, S.J. & Breddam, K. (1994) Carboxypeptidases C and D. Methods Enzymol. 244、231-248)。ＣＰＹのアミノ酸配列は、「Vallsら, 1987, Cell, 48(5)：887-897」に開示されている。

「正確にプロセシング」とは、正確なアミノ酸残基配列を有する所望の生成物が得られるように、所望の切断点で酵素的に切断することを意味する。
「効果的な切断」とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９５％の切断を意味することを意図している。
「ＰＯＴ」は、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「ＴＰＩ１」はサッカロミセス・セレビシエ・トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
「リーダー」とは、プレペプチド(シグナルペプチド)及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。

「シグナルペプチド」なる用語は、タンパク質の前駆体形態において、Ｎ末端配列として存在するプレペプチドを意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質の小胞体への転座を促進できることである。シグナルペプチドはこのプロセス中に通常は切断される。シグナルペプチドはタンパク質を生成する宿主生物体に対して異種又は同族であってもよい。
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼに対する遺伝子から得られる。本発明のＤＮＡコンストラクトと共に使用され得る多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド、又は任意の機能的アナログ(Egel-Mitaniら、(1990) YEAST 6:127-137及び米国特許第５７２６０３８号)、ＭＦα１遺伝子のα-因子シグナル(Thorner(1981), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern等編, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、及び米国特許第４８７０００８号)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchleら, Nature 289、1981, pp. 643-646を参照)、修飾されたカルボキシペプチダーゼのシグナルペプチド(L.A. Vallsら, Cell 48,1987, pp. 887-897を参照)、及び酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(国際公開第８７／０２６７０号を参照)が含まれる。

本発明は、選択された微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、本発明のインスリン生成物をコードするポリヌクレオチド配列を担持するベクターを包含する。組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクター、染色体複製とは独立した複製、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。さらに、単一のベクター又はプラスミド又は宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを合わせて含む２以上のベクター又はプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用されうる。ベクターは直鎖又は閉環プラスミドであってよく、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定した組込、又はゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント(類)を好ましくは含む。
一実施態様では、組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。

またベクターは、選択可能なマーカー、例えば遺伝子、宿主細胞における欠失を補完する生成物、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等の薬剤に対する耐性を付与するものをさらに含んでもよい。
酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。酵母とって好ましい選択可能なマーカーはシゾサッカロミセス・ポンベＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエＭＦα１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは典型的には適切なターミネーターに作用可能に結合しているであろう。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alberら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。

インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、及び場合によってはターミネーター、及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照)。
ベクターは、まず本発明のインスリン前駆体をコードする全ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを調製し、続いて適切な発現ベクターにこのフラグメントを挿入するか、又は個々のエレメントについての遺伝的情報を含むＤＮＡフラグメントを挿入し、続いてライゲーションすることにより構築されると理解されるであろう。

本発明で使用される宿主細胞は真菌細胞である。ここで使用される場合、「真菌」には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、及び接合菌門(Hawksworthらによる定義, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK)、並びに卵菌門(Hawksworth, 1995, 上掲, 171頁を引用)及び全ての栄養胞子形成菌(Hawksworthら, 1995, 上掲)が含まれる。

一実施態様では、真菌宿主細胞は酵母細胞である。ここで使用される「酵母」には、有子嚢胞子(ascosporogenous)酵母(エンドマイセス属)、担子胞子形成(basidiosporogenous)酵母、及び不完全菌類に属する酵母(ブラストミセス属)が含まれる。有子嚢胞子酵母はスペルモフトラ科(Spermophthoraceae)とサッカロミセス科(Saccharomycetaceae)に分けられる。後者は、４つの亜科、すなわちスキゾサッカロミセス(Schizosaccharomycoideae)亜科（例えばスキゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces) 属) 、ナドソニオイデ(Nadsonioideae)亜科 、リポミコイデー(Lipomycoideae) 亜科、及びサッカロミセス(Saccharomycoideae) 亜科（例えばピキア(Pichia)、クルイベロミセス(Kluyveromyces) 及びサッカロミセス(Saccharomyces) 属）からなる。担子胞子形成酵母には、ロイコスポリジウム(Leucosporidim)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、スポリジオボラス(Sporidiovolus)属、フィロバシジウム(Filobasidium)属、及びフィロバシジエラ(Filobasidiella)属が含まれる。不完全菌類に属する酵母は、２つの科、つまりスポロボロミセス(Sporobolomycetaceae) 科（例えばスポロボロミセス(Sorobolomyces) 属及びブレラ(Bullera) 属) 及びクリプトコッカス(Cryptococcaceae) 科（例えばカンジダ(Candida) 属）に分けられる。酵母の分類は今後変更されることがあり得るので、本発明の目的のためには、酵母はBiology and Activities of Yeast （Skinner, F.A. 、Passmore, S.M.及びDavenport, R.R.編、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No.9, 1980）に記載されたように定義される。酵母の生物学及び酵母遺伝子の操作は、当該技術分野においてよく知られている(例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., 及びStopani, A.O.M.編, 第2版, 1987；The Yeasts, Rose, A.H., 及びHarrison, J.S.編, 第2版, 1987；及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathernら編, 1981を参照)。

酵母宿主細胞は、カンジダ、クルイベロミセス、サッカロミセス、スキゾサッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ又はヤロウィア(Yarrowia)属の種の細胞から選択されうる。一実施態様では、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスバージェンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ダグラシ(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、サッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)、シゾサッカロミセス・ポンベ、 サッカロミセス・ウバルム(Sacchoromyces uvarum)、ピキア・クルイベリ(Pichia kluyveri)、ヤロイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、トルラ酵母(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、及びゲオトリクム・ファーメンタンス(Geotrichum fermentans)である。他の有用な酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ヤロイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、シゾサッカロミセス・ポンベ、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilgo maylis)、カンジダ・マルトース(Candida maltose)、ピキア・ギリエルモンデイ(Pichia guillermondii)及びピキア・メタノリオール(Pichia methanoliol)である(Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp.3459-3465；米国特許第４８８２２７９号及び同第４８７９２３１号を参照)。

「コード可能なアミノ酸」又は「コード可能なアミノ酸残基」なる表現は、ヌクレオチドのトリプレット(「コドン」) によりコード可能なアミノ酸又はアミノ酸残基を示すために使用される。
本記載において、アミノ酸の３文字又は１文字表記は、それらの従来からの意味で使用される。明確に示されない限りは、ここに挙げたアミノ酸はＬアミノ酸である。さらにペプチドのアミノ酸配列の左及び右端は、特に記載しない限りは、それぞれＮ及びＣ末端である。

ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに説明されるかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解してはならない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。 この発明は、適用される法律に容認される場合、ここに付加される請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。

一般的手順
全ての発現プラスミドは、欧州特許第171,142号に記載されているものと同様の、Ｃ-ＰＯＴ型のものである。これらは、プラスミドの選択、及びサッカロミセス・セレビシエの安定化の目的のために、シゾサッカロミセス・ポンベ・トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含有することにより特徴付けられる２μベースの発現ベクターである。また、プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ・トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーター(図１)を含む。これらの配列は、次の：１）インスリン生成物とリーダーの融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ-Ｘｂａｌフラグメントの配列、及び２）発現ベクターの２μ領域におけるＮｃｏＩ部位の除去に帰するサイレント変異の導入、を除き、全ての配列である場合、プラスミドｐＫＦＮ１００３(国際公開第９０１００７５号に記載)における対応配列に類似している。種々の融合タンパク質のクローニングを促進させるために、ＭＦα１プレプロリーダーをコードするＤＮＡ配列を変化させてＮｃｏＩ部位を導入し(図２を参照)、ＭＦα１^＊プレプロリーダーと称する。このようにＮｃｏＩ-Ｘｂａｌフラグメントは、関心あるインスリンコンストラクトをコードするＮｃｏＩ-Ｘｂａｌフラグメントで、簡単に置き換えられる。このようなＮｃｏＩ-Ｘｂａｌフラグメントは、標準的な技術に従い、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用して合成されてよい。アルファ-リーダーに加えて、他のリーダーを使用することもできる。

酵母形質転換を、宿主菌株であるサッカロミセス・セレビシエ株ＭＴ６６３又はＭＥ１７１９の形質転換により調製した。酵母菌株ＭＴ６６３(ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ ＨＩＳ４／ｈｉｓ４ Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Ｃｉｒ’)は、国際公開第９２ｌ１１３７８号に関連して、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されており、寄託番号ＤＳＭ６２７８が付与されている。サッカロミセス・セレビシエ菌株ＭＥ１７１９(ＭＡＴａ／α ｌｅｕ２／ｌｅｕ２ ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Δｕｒａ３／Δｕｒａ３ Δｙｐｓ１：：ＵＲＡ３／Δｙｐｓ１：：ｕｒａ３ Ｃｉｒ＋)は国際公開第９８／０１５３５号に記載されている。

ＭＴ６６３又はＭＥ１７１９を、６００ｎｍでの光学密度が０．６になるまで、ＹＰＧａＬ(１％のBacto酵母抽出物、２％のＢａｃｔｏペプトン、２％のガラクトース、１％のラクタート)において増殖させた。遠心分離により１００ｍｌの培養体を収集し、１０ｍｌの水で洗浄し、再度遠心分離にかけ、１．２Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＮａ_２ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌのジチオトレイトールを含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で１５分インキュベートし、遠心分離にかけ、細胞を、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ０５．８、及び２ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍＣ３２３４を含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で３０分インキュベートし、遠心分離により細胞を収集し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトールと１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのトリスＨＣＩ(トリス＝トリス(ヒドロキシメチル１)-アミノメタン)ｐＨ＝７．５)で洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁させた。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ懸濁細胞を、約０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１５分放置した。１ｍｌの(２０％のポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、１０ｍＭのトリスＨＣＩ、ｐＨ＝７．５)を添加し、混合物を室温でさらに３０分放置した。混合物を遠心分離にかけ、ペレットを０．１ｍｌのＳＯＳ(１．２Ｍのソルビトール、３３％ｖｌｖのＹＰＤ、６．７ｍＭのＣａＣｌ_２)に再懸濁させ、３０℃で２時間インキュベートした。ついで、懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁させた。ついで、６ｍｌの上層寒天(１．２Ｍのソルビトールと２．５％の寒天を含有する、Shermanら (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor LaboratoryのＳＣ培地)を５２℃で添加し、同様の寒天固形化されたソルビトール含有培地を含むプレートの頂部に懸濁液を注いだ。

実施例１
ヒトインスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリン用の酵母発現システムの構築
図１には、ｐＥＳＩ４２-３３と称される酵母プラスミドが示されている。プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ遺伝子の転写プロモーターと転写ターミネーターとの間のプラスミドに挿入されたＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントを含有する発現カセットを含む。プラスミドｐＥＳＩ４２-３３において、ＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントは、ＭＦα１^＊プレプロリーダー、二塩基プロセシングエンドペプチダーゼＫｅｘ２に対するＬｙｓ-Ａｒｇ切断部位、及びインスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリンからなる融合産物をコードする。

インスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリンをコードする配列を含有するＤＮＡフラグメントを、合成オリゴヌクレオチド及び標準的なＰＣＲ増幅を使用して構築した。得られたＰＣＲフラグメントを精製し、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、修飾されたｃＰＯＴ型の発現ベクターのＮｃｏＩ-ＸｂａＩベクターフラグメントにライゲーションさせた(図１)。
発現プラスミドを、アンピシリンの存在下で成長させた大腸菌にて増殖させ、標準的な技術を使用し単離させた(Sambrookら, 1989)。プラスミドＤＮＡを適切な制限ヌクレアーゼにより挿入についてチェックし(例えば、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ)、配列分析により、インスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリンの適切な配列を含有することが示された。
プラスミドをサッカロミセス・セレビシエ菌株ＭＴ６６３において形質転換させた。プラスミドを包含する酵母形質転換体を、ＹＰＤ(１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のグルコース)寒天(２％)プレートにおける炭素源としてのグルコース利用によって選択した。

実施例２
ＣＰＹ活性変異体用の酵母発現システムの構築
図２には、ｐＰＲＣ１と称される酵素プラスミドが示されている。プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ遺伝子の転写プロモーターと転写ターミネーターとの間のプラスミドに挿入されたＣｌａＩ-ＮｈｅＩフラグメントを含有する発現カセットを含む。プラスミドｐＰＲＣ１、ＣｌａＩ-ＮｈｅＩフラグメントは、野生型プレプロＣＰＹをコードする。全てのＣＰＹ変異プラスミドは、関連点変異が、二塩基性Ｋｅｘ２切断モチーフの導入用に作製されていることを除けば、ｐＰＲＣ１と同一である。
Ｋｅｘ２切断部位の挿入により変異したＰＲＣ１をコードする配列を含有するＤＮＡフラグメントを、合成オリゴヌクレオチド、テンプレートとしてゲノム酵母ＤＮＡ、及び標準的なＰＣＲ増幅を使用して構築した。得られたＰＣＲフラグメントを精製し、ＣｌａＩ及びＮｈｅＩで消化し、修飾されたｃＰＯＴ型の発現ベクターのＣｌａＩ-ＮｈｅＩベクターフラグメントにライゲーションさせた。

発現プラスミドを、アンピシリンの存在下で成長させた大腸菌にて増殖させ、標準的な技術を使用し単離させた(Sambrookら, 1989)。プラスミドＤＮＡを適切な制限ヌクレアーゼにより挿入についてチェックし、配列分析により、ＰＲＣ１の適切な配列を含有することが示された。
プラスミドをサッカロミセス・セレビシエ菌株ＭＴ６６３において形質転換させた。プラスミドを包含する酵母形質転換体を、ＹＰＤ(１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のグルコース)寒天(２％)プレートにおける炭素源としてのグルコース利用によって選択した。

実施例３
インスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリン及びＣＰＹ活性変異体の同時発現用の酵母発現システムの構築
図３には、ｐＳＡ１６０と称される酵母プラスミドが示されている。プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエＴＰＩ遺伝子の転写プロモーターと転写ターミネーターとの間のプラスミドに挿入されたＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントを含有する発現カセットを含む。プラスミドｐＳＡ１６０において、ＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントは、ＭＦα１^＊プレプロリーダー、二塩基プロセシングエンドペプチダーゼＫｅｘ２に対するＬｙｓ-Ａｒｇ切断部位、及びインスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリンからなる融合産物をコードする。またプラスミドは、サッカロミセス・セレビシエＰＲＣ１遺伝子の転写プロモーターの後のプラスミド中に挿入されるＫｐｎＩ-ＳａｃＩフラグメントを含むＣＰＹ変異体「Ｆ」をコードする発現カセットも含む。
インスリンカセットを、適切なｃＰＯＴ型の発現ベクターにおいてサブクローニングした。続いて、ＰＲＣ１プロモーターを、テンプレートとしてゲノム酵母ＤＮＡを使用するＰＲＣにより増幅し、ＳａｌＩ-ＫｐｎＩフラグメントとして、上述したプラスミドにおいてクローニングした。最終的に、ターミネータープラスＣＰＹ変異体をコードするＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅させ、プラスミドにおいてクローニングした。

発現プラスミドを、アンピシリンの存在下で成長させた大腸菌にて増殖させ、標準的な技術を使用し単離させた(Sambrookら, 1989)。プラスミドＤＮＡを適切な制限ヌクレアーゼにより挿入についてチェックし、配列分析により、ＰＲＣ１オープンリーディングフレームの適切な配列を含有することが示された。
プラスミドをサッカロミセス・セレビシエ菌株ＭＴ６６３において形質転換させた。プラスミドを包含する酵母形質転換体を、ＹＰＤ(１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のグルコース)寒天(２％)プレートにおける炭素源としてのグルコース利用によって選択した。

実施例４
複数のＣＰＹ変異体を構築した。プラスミドを酵母において形質転換させ、研究室規模のバッチ発酵を、３０℃で７２時間、定められた培地における培養により実施した。合成基質Ｎ-(３-[２-フリル]アクリロイル)-Ｐｈｅ-Ｐｈｅを使用し、ＣＰＹ活性について発酵ブロスをアッセイした。この基質を使用すると、３３７ｎｍでの吸光度における変化として、ＣＰＹ活性を分光学的に追跡することができる。既知の濃度のＣＰＹ標準体の活性度に対して、活性度を相互比較することにより、上清における濃度を推定することができる。これらのアッセイに基づき、９つの変異体が、０-２．３ｍｇ／Ｌの濃度で存在することが推定された。

プロセシングの度合いを調査するために、発酵上清をウエスタンブロット分析にかけ、ＣＰＹ抗体で探索した。プロセシングされていないＣＰＹ(プロＣＰＹ)とプロセシングされたＣＰＹとの間の比率を、ブロットから推定した。これにより、ほとんどの変異体において、成熟したＣＰＹへの〜８０％の転換率が示された。

実施例５
ヒトインスリン前駆体(Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリンとＣＰＹ活性変異体「Ｆ」との同時発現用のプラスミドｐＳＡ１６０を、酵母において形質転換させ、研究室規模のバッチ発酵を、３０℃で定められた培地における培養により実施した。インスリン種の培養２４時間後、発酵ブロスをＬＣ-ＭＳにより分析した。これにより、分泌されたインスリン種の＞９０％が、十分にプロセシングされたＡ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈヒトインスリンアナログであったことが示された。図４には、分泌された活性ＣＰＹにより、インスリンＢ鎖のＣ末端から、ＬＡ伸長部が成功裏に除去されたことが示されている。

実施例６
図３に記載された同時発現プラスミドを包含する酵素菌株の連続発酵により、ＣＰＹレベルがあまりに高まり、ヒトインスリン前駆体の異常なプロセシングに至ることが示された。ヒトインスリン前駆体と活性ＣＰＹとの間の適切な比率を見出すために、ＰＲＣ１プロモーターを代替プロモーターに置き換えることにより、ＣＰＹ変異体の発現レベルを調節した。
ＣＹＣ１、ＫＥＸ２、ＭＦ(アルファ)１、及びＭＰＤ１の遺伝子からのプロモーター領域をＰＣＲにより増幅させ、ＰＲＣ１プロモーター配列を、それぞれ代替ＣＹＣ１、ＫＥＸ２、ＭＦ(アルファ)１、及びＭＰＤ１のプロモーター配列と交換することで得られた、実施例３に記載の同時発現プラスミドのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ部位においてクローニングした。得られたプラスミドをサッカロミセス・セレビシエ菌株ＭＴ６６３において形質転換させた。プラスミドを包含する酵母形質転換体を、ＹＰＤ(１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のグルコース)寒天(２％)プレートにおける炭素源としてのグルコース利用によって選択した。

実施例７
研究室規模のバッチ発酵を、実施例６に記載したプラスミドを包含する新規の酵母菌株を用いて実施した。菌株を定められた培地において、３０℃で培養した。７２時間後、発酵ブロス中の活性ＣＰＹの濃度を、発色基質ＦＡ-Ｐｈｅ-Ｐｈｅを使用し、活性度を測定することにより決定した。結果は広範囲の発現レベルを示した。

実施例８
連続発酵を、実施例６に記載のＣＰＹ活性変異体と、ヒトインスリン前駆体Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号：９)-(Ａ１-２１)、(Ａ１４Ｅ，Ｂ２５Ｈ)ヒトインスリンとを同時発現させるための、同時発現プラスミドを包含する酵母菌株を用いて実施した。ＫＥＸ２プロモーターにより、異常にプロセシングされたＡ１４，Ｂ２５ヒトインスリンのパーセンテージがかなり低下する結果となるＣＰＹの発現レベルとなった。

Claims (15)

1. 挿入Ｋｅｘ２切断部位を含むカルボキシペプチダーゼの修飾されたプロ型をコードするＤＮＡ配列を、カルボキシペプチダーゼの修飾されたプロ型の発現に適した条件下で発現させ、プロ配列を細胞内で切断し、遊離の活性型のカルボキシペプチダーゼを放出させる、真菌細胞における活性化カルボキシペプチダーゼの製造方法。
2. 真菌細胞から活性型のカルボキシペプチダーゼを単離する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
3. 真菌細胞が、非機能性ＰＥＰ４遺伝子(プロテイナーゼＡをコードする遺伝子)を有する請求項１又は２に記載の方法。
4. カルボキシペプチダーゼが宿主真菌細胞に内在している請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
5. Ｋｅｘ２部位が、カルボキシペプチダーゼのプロ型の、野生型カルボキシペプチダーゼの天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して０〜約３０のアミノ酸残基上流又は下流の位置に、挿入されている請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
6. Ｋｅｘ２切断部位が、プロ配列の、カルボキシペプチダーゼの野生型形態の天然Ｎ末端アミノ酸残基に対して５-２０、５-１５又は５-１０アミノ酸残基上流の距離に、導入される請求項５に記載の方法。
7. Ｋｅｘ２切断部位が、野生型カルボキシペプチダーゼ酵素のＮ末端アミノ酸残基に対して２-２０、２-１５又は２-１０アミノ酸残基上流の位置に挿入される請求項５に記載の方法。
8. カルボキシペプチダーゼがＣＰＹである請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｂ鎖のＣ末端伸長部を有するヒトインスリン又はそのアナログの前躯体を、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法により製造されたカルボキシペプチダーゼと反応させることによる、成熟ヒトインスリン又はそのアナログを製造する方法であって、Ｂ鎖のＣ末端伸長部が切断されて、成熟ヒトインスリン又はそのアナログが得られる方法。
10. 成熟ヒトインスリン又はそのアナログを製造する方法であって、真菌細胞において、
    ｉ）Ｂ鎖のＣ末端伸長部を有するヒトインスリン又はそのアナログの前躯体をコードするＤＮＡ配列と、
    ｉｉ）そのプロ型に挿入Ｋｅｘ２切断部位を有するカルボキシペプチダーゼのプロ型をコードするＤＮＡと
    を同時発現させることを含み、
    ヒトインスリン前駆体分子におけるＢ鎖のＣ末端伸長部を、同時発現され活性化されたカルボキシペプチダーゼにより真菌細胞内で切断し、成熟ヒトインスリン又はそのアナログを培養培地から単離する方法。
11. ヒトインスリン前駆体分子が、ヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖、ヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖、及びＢ鎖とＡ鎖を連結するＣペプチドを含み、Ｃペプチドが少なくとも一のＫｅｘ２切断部位を含み、Ｂ鎖が、真菌細胞内におけるＣペプチドのより効果的なＫｅｘ２切断を促進させるＣ末端伸長部を含む請求項１０に記載の方法。
12. Ｂ鎖のＣ末端伸長部が４までのアミノ酸残基を有する請求項９ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
13. Ｂ鎖のＣ末端伸長部が、Ｌｅｕ-Ａｌａ、Ｐｈｅ-Ｌｅｕ、Ｌｅｕ-Ｇｌｙ、Ｌｅｕ-Ｌｅｕ、Ｌｅｕ-Ｍｅｔ及びＬｅｕ-Ｉｌｅからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
14. カルボキシペプチダーゼのプロ型が、それ自身のプロモーターとは異なるプロモーターの調節下で発現される請求項１０ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
15. カルボキシペプチダーゼが酵母ＣＰＹ酵素であり、プロモーターがＫｅｘ２プロモーターである請求項１４に記載の方法。

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