JPWO2006106970A1 - 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 - Google Patents
3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006106970A1 JPWO2006106970A1 JP2007511203A JP2007511203A JPWO2006106970A1 JP WO2006106970 A1 JPWO2006106970 A1 JP WO2006106970A1 JP 2007511203 A JP2007511203 A JP 2007511203A JP 2007511203 A JP2007511203 A JP 2007511203A JP WO2006106970 A1 JPWO2006106970 A1 JP WO2006106970A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- human
- human type
- dna
- type
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 37
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 155
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 153
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 26
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 69
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 65
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 55
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 claims description 45
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 claims description 45
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 claims description 38
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 32
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 32
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 31
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 20
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 9
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 8
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 8
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 8
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 4
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000004405 Collectins Human genes 0.000 description 2
- 108090000909 Collectins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003367 anti-collagen effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
〔1〕以下の(a)から(c)の工程を含む、3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法。
(a)3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAをベクターに導入する工程
(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から3重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程
〔2〕3重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト・コラーゲンまたはその部分ペプチドである〔1〕に記載の方法。
〔3〕ヒト・コラーゲンが少なくとも1種類以上のα鎖からなるヒト・コラーゲンである、〔2〕に記載の方法。
〔4〕ヒト・コラーゲンが、ヒト・I型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。
〔5〕ヒト・I型コラーゲンがα1鎖とα2鎖の複合体である〔4〕に記載の方法。
〔6〕ヒト・コラーゲンが、ヒト・II型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。
〔7〕ヒト・コラーゲンが、ヒト・III型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。
〔8〕3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAが、以下の(a)または(b)に記載のDNAから選択される少なくとも1つのDNAである、〔1〕に記載の方法。
(a)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔9〕哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞(HEK293)である、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔11〕3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAが導入されるベクターが、pNOW/CMV−AAである、〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト・コラーゲン。
〔13〕以下の(a)または(b)に記載のDNAから選択される少なくとも1つのDNAが導入されたベクター。
(a)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
〔14〕〔13〕に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。
〔15〕〔13〕に記載のベクター、または〔14〕に記載の哺乳動物細胞を含む、3重螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。
本発明は、以下の(a)から(c)の工程を含む、3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法に関する。
(a)3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAをベクターに導入する工程
(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から3重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程。
さらにコラーゲンのアミノ配列の一部を置換・欠失等改変したものや、コラーゲン由来でないアミノ酸配列を付加したものも本発明のコラーゲンに含まれる。また、ベクターを宿主哺乳動物細胞に導入し、タンパク分子を発現している形質導入細胞を得る方法は公知であり、本発明においても同様の方法を適用することができる。
本発明で宿主細胞として培養に用いられる哺乳動物細胞は特に限定されないが、好ましくは、CHO細胞またはHEK293細胞を挙げることが出来る。
本発明において、「コラーゲンの部分ペプチド」とは、コラーゲンをコードするcDNAの20%以上(例えば20、30、40、50、60、70、80、90%)のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをいう。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改変したものや、非コラーゲンアミノ酸配列を付加したものも含む。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕pNOW/CMV−AAベクターの調製
pNOW/CMV−AAベクターは公知の方法(特開平10−179169号公報)により調製したものを使用した。
ヒトI型α1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされ、その塩基配列が報告されている(EMBL遺伝子データベース登録名NM 000088)。その配列を配列番号:1に示す。ヒトI型α1cDNAはヒト精巣由来cDNAよりポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)法("PCR Technology", Stockton Press 発行 (1989))により増幅された。すなわち、ヒト精巣由来cDNA(ベクトン・ディッキンソン社)を鋳型として配列番号:2のオリゴヌクレオチド(GCGGCCGCCACCATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG)と配列番号:3のオリゴヌクレオチド(TTCTAGATTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA)をプライマーとして配列番号:1の全長の配列をPCR法により増幅した。すなわち、市販のPCR増幅キット(TaKaRa LA Taq with GC Buffer:タカラバイオ社)を用い、94℃、5分間の加熱処理後、変性(94℃、20秒)、プライマーアニーリング(60℃、30秒)、増幅(72℃、3分30秒)の3ステップを35回繰り返し、更に72℃、7分間の処理をして反応を終了した。以後、本実施例に記載のPCR反応はすべて同様の反応サイクルにて実施した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、PCR産物クローニングベクター(pT7Blue kits:Novagen社)とライゲーションキット(DNA ligation kit ver.2:タカラバイオ社)を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後、LB寒天培地(ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有するコロニーを培養することによりプラスミドDNAが得られた。このプラスミドDNAより切り出したヒトI型α1鎖コラーゲンをコードするDNA断片と実施例1で調製した外来遺伝子高発現ベクターpNOW/CMV−AAのNot IとXba I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後、LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する1コロニーを培養することによりプラスミドDNA(pNOW−hColIa1、図1)が得られた。
ヒトI型α2鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされその塩基配列が報告されている(EMBL遺伝子データベース登録名NM 000089)。その配列を配列番号:4に示す。ヒトI型α2cDNAはヒト肝臓由来cDNAよりPCR法により増幅された。すなわち、ヒト肝臓由来cDNA(和光純薬工業)を鋳型として配列番号:5のオリゴヌクレオチド(GCGGCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGA)と配列番号:6のオリゴヌクレオチド(ACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAAT)をプライマーとして配列番号:4の全長の配列をPCR法により増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、PCR産物クローニングベクター(pT7Blue kits:Novagen社)とライゲーションキット(DNA ligation kit ver.2:タカラバイオ社)を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後、LB寒天培地(ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する4コロニーを培養することによりプラスミドDNAが得られた。このプラスミドDNAより切り出したヒトI型α2鎖コラーゲンをコードするDNA断片と外来遺伝子高発現ベクターpNOW/CMV−AAのNot IとXba I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する1コロニーを培養することによりプラスミドDNA(pNOW−hColIa2、図2)が得られた。
ヒトII型α1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされその塩基配列が報告されている(EMBL遺伝子データベース登録名NM 001844.1)。その配列を配列番号:7に示す。ヒトII型α1cDNAはヒト精巣由来cDNAよりPCR法により増幅された。すなわち、ヒト精巣由来cDNA(ベクトン・ディッキンソン社)を鋳型として配列番号:8のオリゴヌクレオチド(GGCCCCGCGGTGAGCCATGATTCGCCTCG)と配列番号:9のオリゴヌクレオチド(TCTAGATTACAAGAAGCAGACCGGCCCTAT)をプライマーとして配列番号:7の全長の配列をPCR法により増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、PCR産物クローニングベクター(pT7Blue kits:Novagen社)とライゲーションキット(DNA ligation kit ver.2:タカラバイオ社)を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後、LB寒天培地(ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する4コロニーを培養することによりプラスミドDNAが得られた。このプラスミドDNAより切り出したヒトII型α1鎖コラーゲンをコードするDNA断片と外来遺伝子高発現ベクターpNOW/CMV−AAのNot IとXba I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する1コロニーを培養することによりプラスミドDNA(pNOW−hColIIa1、図3)が得られた。
ヒトIII型α1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローニングされその塩基配列が報告されている(EMBL遺伝子データベース登録名X14420)。その配列を配列番号:10に示す。ヒトIII型α1cDNAはヒト肝臓由来cDNAよりPCR法により増幅された。すなわち、ヒト肝臓由来cDNA(和光純薬工業)を鋳型として配列番号:11のオリゴヌクレオチド(GCGGCCGCCACCATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGGA)と配列番号:12のオリゴヌクレオチド(TCTAGATTATAAAAAGCAAACAGGGCCAAC)をプライマーとして配列番号:10の全長の配列をPCR法により増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、PCR産物クローニングベクター(pT7Blue kits:Novagen社)とライゲーションキット(DNA ligation kit ver.2:タカラバイオ社)を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後、LB寒天培地(ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する4コロニーを培養することによりプラスミドDNAが得られた。このプラスミドDNAより切り出したヒトIII型α1鎖コラーゲンをコードするDNA断片と外来遺伝子高発現ベクターpNOW/CMV−AAのNot IとXba I切断物とをDNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌XL−I Blue株に連結されたDNAを導入後LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する1コロニーを培養することによりプラスミドDNA(pNOW−hColIIIa1、図4)が得られた。
実施例2および3で得られたpNOW−hColIa1とpNOW−hColIa2の各々1μgをリポフェクチン法(キアゲン社製エフェクテントランスフェクション試薬)を用いて、25cm2の培養フラスコ中の150万個のDHFR欠損CHO細胞(CHO細胞DG44株;Dr.Gail Urlaubから譲受)に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後、50万個の細胞を100mLの0.8mg/mLのG418を含む10%透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dalbecco’s Medium培地にて希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート10枚(960ウェル)中に播き、5%炭酸ガス存在下で37℃、約3週間培養し、197ウェル中の生存細胞を1mLの0.8mg/mLのG418を含む10%透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dalbecco’s Medium培地とともに24ウェルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後PBS(インビトロジェン社)1mLを各ウェルに加え再び培養上清を廃棄した。これに0.5mLのCHO細胞用CD培地ProCHO4(タカラバイオ社)を加えて5%炭酸ガス存在下で37℃、96時間培養した。続いて培養上清中のヒトI型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
生産量の検定はSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の12.5μLと等量のトリスSDSβ−MEサンプル処理液(第一化学)を混合し、95℃、5分間の熱処理を行なった。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル(PAGEL、ATTO社)に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液(アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒトI型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照としては、12.5〜100μg/mLの濃度のヒトI型コラーゲン(コスモバイオ社)を同様に処理して用いた。
G418耐性細胞株のうち、ヒトI型コラーゲン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた。ヒトI型コラーゲンの産生レベルは、培地当たり85μg/mL(4日間)であった。
遺伝子増幅により得られたヒトI型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液IS CHO−CD(アイエスジャパン社)を用いて25cm2培養フラスコ中で1×106個/mLになるように調製した。これを5%炭酸ガス存在下に37℃で96時間培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の12.5μLと等量のトリスSDSβ−MEサンプル処理液(第一化学社)を混合し、95℃、5分間の熱処理を行なった。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル(PAGEL、ATTO社)に重層し、電気泳動にて展開した。以下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液(アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒトI型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、100μg/mLの濃度のヒトI型コラーゲンを同様に処理して用いた。図5にヒトI型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒトI型コラーゲンα1鎖と考えられる150kDa、170kDaの位置のポリペプチドおよび組換えヒトI型コラーゲンα2鎖と考えられる130kDa、150kDaの位置のポリペプチドが検出された。
ヒトI型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のペプシン分解は99.7%酢酸を培養上清に最終濃度0.5Mになるように加え、これにペプシン(シグマ社)を最終濃度24ユニット/mLとなるように添加した後20℃、2時間で実施した。以下のペプシン分解は同様にして実施した。ペプシンによる分解によって得られたサンプルはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては185μg/mLの市販の組換えヒトI型コラーゲン(ベクトン・ディッキンソン社)を用いた。図6にペプシンによる分解産物のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒトI型コラーゲンは市販のヒトI型アテロコラーゲンと同様にα1鎖と考えられる130kDaの位置のポリペプチドおよびα2鎖と考えられる120kDaの位置のポリペプチドとして検出された。このことはヒトI型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒトI型コラーゲンが含まれていることを示していた。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒトI型コラーゲンをPVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後、2μg/mLの濃度の抗ヒトI型コラーゲンα1鎖抗体とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗ヤギIgG抗体を反応させた。反応した抗体はHRPの活性を検出する方法でTMBペルオキシダーゼ試薬(フナコシ社)を用いて行なった。比較対照としては、50μg/mLの組換えヒトI型コラーゲン(ベクトン・ディッキンソン社)を用いた。ヒトI型コラーゲンα2鎖の検出は抗ヒトI型コラーゲンα1鎖抗体のかわりに抗ヒトI型コラーゲンα2鎖抗体を用いて実施した。比較対照としては、10μg/mLのヒトI型コラーゲンを用いた。図7にウエスタンブロッティングによる分析結果を示す。培養上清中に抗ヒトI型コラーゲンα1鎖抗体が結合できる組換えヒトI型コラーゲンα1鎖と考えられる170kDaの位置のポリペプチドおよび抗ヒトI型コラーゲンα2鎖抗体が結合できる組換えヒトI型コラーゲンα2鎖と考えられる130kDa、150kDaの位置のポリペプチドが検出された。
ヒトI型コラーゲンを含む培養上清100mLを用いて以下の様に精製を行った。
遠心濃縮フィルター(VIVASPIN20(MWCO10,000:ザルトリウス社)にて4℃で3,000rpmの遠心分離により0.45μmのメンブランフィルター(ミリポア社)でろ過した100mLの培養上清を30mLに濃縮した。
4℃で30mLの90%硫酸アンモニウム溶液を上記濃縮培養上清中に攪拌しながら徐々に加えて塩析し、全ての硫酸アンモニウムを加えてから1時間攪拌した。その後、氷中にて1時間静置した後、高速冷却遠心器にて4℃で18,000rpm×30分間遠心分離を行った。塩析によって不溶化した溶液中のコラーゲンは溶液上に浮くのでそれを回収し、5mLのD−PBS(シグマ社)で完全に溶解させた。これを0.45μmのメンブランフィルター(ミリポア社)でろ過した後にD−PBSで平衡化したSuperose 6(アマシャムバイオサイエンス社)を用いたゲルろ過により精製し、最初に出現するピークを分取した。集めたピークのフラクションをVIVASPIN6(MWCO100,000)で約20倍に濃縮し、濃縮したコラーゲン溶液にD−PBSを適量加えてさらに濃縮し、低分子フラグメントを除去した。このD−PBSを加える操作を少なくとも3回以上行った。
元の培養上清100mLにつき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約300μLになるように濃縮したものをSDS−PAGEにより電気泳動して精製度の確認を行った。
1μgのpNOW−hColIIa1を25cm2の培養フラスコ中の150万個のCHO細胞DG44株にリポフェクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後50万個の細胞を100mLの0.8mg/mLのG418を含む10%透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dalbecco’s Medium培地にて希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート10枚(960ウェル)中に播き、5%炭酸ガス存在下で37℃、約3週間培養し、126ウェル中の生存細胞を1mLの0.8mg/mLのG418を含む10%透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dalbecco’s Medium培地とともに24ウェルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後PBS(インビトロジェン社製)1mLを各ウェルに加え再び培養上清を廃棄した。これに0.5mLのCHO細胞用無血清培地細胞用CD培地ProCHO4(タカラバイオ社)を加えて5%炭酸ガス存在下で37℃、96時間培養した。続いて培養上清中のヒトII型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
生産量の検定はSDS−ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の7.5μLと等量のトリスSDSβ−MEサンプル処理液(第一化学社)を混合し、95℃、5分間の熱処理を行なった。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル(PAGEL、ATTO社)に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液(アマシャムバイオサイエンス社)で処理する事によりポリアクリルアミドゲル中のヒトII型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照としては、12.5〜100μg/mLの濃度のヒトII型コラーゲン(コスモバイオ社)を同様に処理して用いた。
G418耐性細胞株のうち、ヒトII型コラーゲン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた後に、MTXによる遺伝子増幅を行った。始めに5nMのMTXを含む培地で1週間、25nMのMTXを含む培地で1週間、50nMのMTXを含む培地で1週間、250nMのMTXを含む培地で3週間、1μMのMTXを含む培地でさらに3週間増幅させたところ、25nMのMTXの時点でヒトII型コラーゲンの産生レベルは培地当たり70μg/mL(4日間)に上昇した。遺伝子増幅に用いるMTX濃度は一般に10nM〜10μMの間の多段階とされ、最終濃度としては10μMがよく用いられるが、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の樹立には問題がある。このため低濃度MTXで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本実験では1μMまでとした。また通常セレクションを含めたMTX暴露期間は6〜12ヶ月とされるのに対して、本実験では約9週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず有効なヒトII型コラーゲンの産生量増加がみられた。以下のG418耐性細胞株の遺伝子増幅も同様にして実施した。
遺伝子増幅により得られたヒトII型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液IS CHO−CD(アイエスジャパン社)を用いて25cm2培養フラスコ中で1×106個/mLになるように調製した。これを5%炭酸ガス存在下に37℃で96時間培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の7.5μLと等量のトリスSDSβ−MEサンプル処理液(第一化学)を混合し、95℃、5分間の熱処理を行なった。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル(PAGEL、ATTO社)に重層し、電気泳動にて展開した。以下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液(アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒトII型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、100μg/mLの濃度のヒトII型コラーゲン(コスモバイオ社)を同様に処理して用いた。図8にヒトII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒトII型コラーゲンと考えられる170kDa、200kDaの位置のポリペプチドが検出された。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒトII型コラーゲンをPVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後1μg/mLの濃度の抗ヒトII型コラーゲン鎖抗体(コスモバイオ社)とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗ウサギIgG抗体を反応させた。反応した抗体はHRPの活性を検出する方法でTMBペルオキシダーゼ試薬(フナコシ社)を用いて行なった。比較対照としては、10μg/mLのヒトII型コラーゲン(コスモバイオ社)を用いた。培養上清中に抗ヒトII型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒトII型コラーゲンと考えられる170kDaのポリペプチドが検出された(図9)。
ペプシンによる分解によって得られたサンプルはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては、100μg/mLのヒトII型コラーゲン(コスモバイオ社)を用いた。図10にペプシンによる分解産物のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒトII型コラーゲンは市販のヒトII型アテロコラーゲンと同様に130kDaのポリペプチドとして検出された。このことはヒトII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には実質的に天然型と同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒトII型コラーゲンが含まれていることを示していた。ウエスタンブロッティングによる分析においても同様の結果が得られた(図11)。
1μgのpNOW−hColIIIa1を用いて25cm2の培養フラスコ中の150万個のCHO細胞DG44株にリポフェクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後30万個の細胞を100mLの0.8mg/mLのG418を含む10%透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dalbecco’s Medium培地にて希釈後、96ウェルマイクロタイタープレート10枚(960ウェル)中に播き、5%炭酸ガス存在下で37℃、約3週間培養したところ、117ウェルにのみ細胞の生存が見られた(G418耐性株)。生存細胞を1mLの0.8mg/mLのG418を含む10%透析ウシ胎児血清添加Iscove’s Modified Dalbecco’s Medium培地とともに24ウェルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後PBS(インビトロジェン社)1mLを各ウェルに加え再び培養上清を廃棄した。これに0.5mLのCHO細胞用無血清培地CHO−S−SFM II(インビトロジェン社)を加えて5%炭酸ガス存在下で37℃、72時間培養した。続いて培養上清中のヒトIII型コラーゲンの生産量の検討を行なった。
生産量の検定はドットブロット法にて実施した。ナイロンメンブレン上に72時間培養上清1μLと市販のヒトIII型コラーゲン(ベクトン・ディッキンソン社)のCHO細胞用無血清培地CHO−S−SFM IIによる2倍希釈系列(0.125〜8μg/mL)とCHO−S−SFM IIそれぞれ1μLをドットし、1時間の風乾、ブロックエースによるブロッキングの後1μg/mLの濃度の抗ヒトIII型コラーゲン抗体(コスモバイオ社)とそれに引き続いてHRP標識抗ウサギIgG抗体を反応させた。反応した抗体はスーパーシグナルウエストピコ試薬にてHRPの活性を検出する方法でルミノキャプチャーを用いて行なった。
G418耐性細胞株のうち、ヒトIII型コラーゲン産生が最も高かったクローンを継代培養し安定化させた後に、MTXによる遺伝子増幅を行った。始めに15nMのMTXを含む培地で2週間、60nMのMTXを含む培地で2週間、250nMのMTXを含む培地で2週間、1μMのMTXを含む培地でさらに4週間増幅させたところ、ヒトIII型コラーゲンの産生レベルは培地当たり225μg/mL(3日間)に上昇した。
遺伝子増幅により得られたヒトIII型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液IS CHO−CD(アイエスジャパン社)を用いて25cm2培養フラスコ中で1×106個/mLになるように調製した。これを5%炭酸ガス存在下に37℃で96時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の6μLと等量のトリスSDSβ−MEサンプル処理液(第一化学社)を混合し、95℃、5分間の熱処理を行なった。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル(PAGEL、ATTO社)に重層し、電気泳動にて展開した。以下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液(アマシャムバイオサイエンス社)で処理する事によりポリアクリルアミドゲル中のヒトIII型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、100μg/mLの濃度のヒトIII型コラーゲン(ベクトン・ディッキンソン社)を同様に処理して用いた。図12にヒトIII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒトIII型コラーゲンと考えられる140kDa、170kDaの位置のポリペプチドが検出された。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒトIII型コラーゲンをPVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後1μg/mLの濃度の抗ヒトIII型コラーゲン鎖抗体(コスモバイオ社)とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗ウサギIgG抗体を反応させた。反応した抗体はHRPの活性を検出する方法でTMBペルオキシダーゼ試薬(フナコシ社)を用いて行なった。比較対照としては、100μg/mLのヒトIII型コラーゲン(ベクトン・ディッキンソン社)を用いた。培養上清中に抗ヒトIII型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒトIII型コラーゲンと考えられる140kDa、170kDaの位置のポリペプチドが検出された(図13)。
ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒトIII型コラーゲンは市販のヒトIII型アテロコラーゲン(ベクトン・ディッキンソン社)と同様に130kDaの位置のポリペプチドとして検出された。このことはヒトIII型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒトIII型コラーゲンが含まれていることを示していた。
ヒトI型またはIII型コラーゲンを含む培養上清100mLを用いて実施例12と同様に操作して精製を行った。元の培養上清100mLにつき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約300μLになるように濃縮したものをSDS−PAGEにより電気泳動して精製度の確認を行った(図14)。
さらに、本発明のコラーゲンの製造方法において、種類の異なるα鎖を同時に発現させることで、天然では本来製造されることのない(これまでに発見されていない)新規な分子構成の3重螺旋構造を持つコラーゲンを大量に製造できる可能性がある。これらの新規な分子構成の3重螺旋構造を持つコラーゲンは、既知のコラーゲンとは異なった性質を持っていることが考えられ、新規の材料としての応用が期待される。
Claims (15)
- 以下の(a)から(c)の工程を含む、3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法。
(a)3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAをベクターに導入する工程
(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程
(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から3重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程 - 3重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト・コラーゲンまたはその部分ペプチドである請求項1に記載の方法。
- ヒト・コラーゲンが少なくとも1種類以上のα鎖からなるヒト・コラーゲンである、請求項2に記載の方法。
- ヒト・コラーゲンが、ヒト・I型コラーゲンである請求項2に記載の方法。
- ヒト・I型コラーゲンがα1鎖とα2鎖の複合体である請求項4に記載の方法。
- ヒト・コラーゲンが、ヒト・II型コラーゲンである請求項2に記載の方法。
- ヒト・コラーゲンが、ヒト・III型コラーゲンである請求項2に記載の方法。
- 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAが、以下の(a)または(b)に記載のDNAから選択される少なくとも1つのDNAである、請求項1に記載の方法。
(a)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA - 哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞(HEK293)である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードするDNAが導入されるベクターが、pNOW/CMV−AAである、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト・コラーゲン。
- 以下の(a)または(b)に記載のDNAから選択される少なくとも1つのDNAが導入されたベクター。
(a)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1、4、7、または10のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA - 請求項13に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。
- 請求項13に記載のベクター、または請求項14に記載の哺乳動物細胞を含む、3重螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007511203A JP4892474B2 (ja) | 2005-03-31 | 2006-03-31 | 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005102999 | 2005-03-31 | ||
JP2005102999 | 2005-03-31 | ||
JP2007511203A JP4892474B2 (ja) | 2005-03-31 | 2006-03-31 | 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 |
PCT/JP2006/306941 WO2006106970A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-03-31 | 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006106970A1 true JPWO2006106970A1 (ja) | 2008-09-25 |
JP4892474B2 JP4892474B2 (ja) | 2012-03-07 |
Family
ID=37073520
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007511203A Expired - Fee Related JP4892474B2 (ja) | 2005-03-31 | 2006-03-31 | 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9018354B2 (ja) |
EP (3) | EP1870460B9 (ja) |
JP (1) | JP4892474B2 (ja) |
KR (1) | KR101304735B1 (ja) |
CN (1) | CN101171334B (ja) |
AU (1) | AU2006231795B9 (ja) |
CA (1) | CA2602611C (ja) |
DK (2) | DK2390326T3 (ja) |
ES (2) | ES2387467T3 (ja) |
HK (1) | HK1164917A1 (ja) |
PT (2) | PT1870460E (ja) |
WO (1) | WO2006106970A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8470555B2 (en) * | 2008-12-22 | 2013-06-25 | National University Corporation Hokkaido University | Protein substance having triple helix structure and manufacturing method therefor |
CA2748011C (en) * | 2008-12-22 | 2019-02-26 | National University Corporation Hokkaido University | Expression vector for producing protein derived from foreign gene in large quantity using animal cells, and use thereof |
JP2011130725A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-07 | Contig I:Kk | Lnaオリゴヌクレオチドとそれを含有する化粧品 |
FR2997083B1 (fr) | 2012-10-19 | 2014-12-12 | Nvh Medicinal | Proteines recombinantes derivees du collagene a activite de liaison au facteur willebrand |
US10373702B2 (en) * | 2014-03-27 | 2019-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Water-soluble trans-membrane proteins and methods for the preparation and use thereof |
CN111087478B (zh) * | 2020-01-10 | 2022-04-05 | 杭州嘉颜生物医药科技有限公司 | 一种重组胶原蛋白及其制备方法 |
CN114920826B (zh) * | 2022-06-15 | 2023-04-25 | 江南大学 | Ⅲ型类人胶原蛋白及其编码基因、表达载体和重组酵母菌 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01107857A (ja) | 1987-10-21 | 1989-04-25 | Mitsubishi Electric Corp | 超電導物質の分離方法 |
US20020142391A1 (en) * | 1991-06-12 | 2002-10-03 | Kivirikko Kari I. | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems |
US5593859A (en) | 1991-10-23 | 1997-01-14 | Thomas Jefferson University | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant DNA systems |
EP0625048B2 (en) | 1991-10-23 | 2005-10-26 | Thomas Jefferson University | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant dna systems |
US20020098578A1 (en) * | 1992-10-22 | 2002-07-25 | Darwin J. Prockop | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant dna systems |
JPH0823979A (ja) | 1994-07-15 | 1996-01-30 | Terumo Corp | ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法 |
AU3056697A (en) | 1996-04-12 | 1997-11-07 | Academy Of Finland | Synthesis of human procollagens and collagens in recombinant dna systems |
JP3582965B2 (ja) * | 1996-08-23 | 2004-10-27 | 株式会社イムノ・ジャパン | 哺乳動物細胞用発現ベクター |
JPH11178574A (ja) | 1997-12-22 | 1999-07-06 | Toyota Central Res & Dev Lab Inc | 新規コラーゲン様タンパク質 |
JP2002325584A (ja) | 2000-11-30 | 2002-11-12 | Japan Science & Technology Corp | 組換えヒトiv型コラーゲンペプチドとその製造方法 |
JP2004016144A (ja) | 2002-06-18 | 2004-01-22 | Japan Science & Technology Corp | ヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコ |
-
2006
- 2006-03-31 JP JP2007511203A patent/JP4892474B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-31 PT PT06730889T patent/PT1870460E/pt unknown
- 2006-03-31 US US11/909,873 patent/US9018354B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-31 EP EP06730889A patent/EP1870460B9/en not_active Not-in-force
- 2006-03-31 PT PT110020484T patent/PT2390326E/pt unknown
- 2006-03-31 CN CN2006800149518A patent/CN101171334B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-31 AU AU2006231795A patent/AU2006231795B9/en not_active Ceased
- 2006-03-31 EP EP11002048.4A patent/EP2390326B1/en not_active Not-in-force
- 2006-03-31 EP EP11002042.7A patent/EP2383338B1/en not_active Not-in-force
- 2006-03-31 DK DK11002048.4T patent/DK2390326T3/da active
- 2006-03-31 ES ES06730889T patent/ES2387467T3/es active Active
- 2006-03-31 CA CA2602611A patent/CA2602611C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-03-31 ES ES11002048.4T patent/ES2489715T3/es active Active
- 2006-03-31 DK DK06730889.0T patent/DK1870460T3/da active
- 2006-03-31 KR KR1020077024903A patent/KR101304735B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2006-03-31 WO PCT/JP2006/306941 patent/WO2006106970A1/ja active Application Filing
-
2012
- 2012-05-29 HK HK12105235.0A patent/HK1164917A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT2390326E (pt) | 2014-08-05 |
KR101304735B1 (ko) | 2013-09-05 |
CA2602611A1 (en) | 2006-10-12 |
KR20070121809A (ko) | 2007-12-27 |
EP1870460A4 (en) | 2008-12-24 |
EP1870460B1 (en) | 2012-05-30 |
EP2383338A1 (en) | 2011-11-02 |
CN101171334B (zh) | 2013-03-27 |
EP1870460A1 (en) | 2007-12-26 |
AU2006231795B9 (en) | 2012-04-12 |
WO2006106970A1 (ja) | 2006-10-12 |
DK2390326T3 (da) | 2014-10-13 |
EP2390326B1 (en) | 2014-07-09 |
PT1870460E (pt) | 2012-06-21 |
AU2006231795B2 (en) | 2012-02-16 |
EP1870460B9 (en) | 2012-12-05 |
CN101171334A (zh) | 2008-04-30 |
US9018354B2 (en) | 2015-04-28 |
US20120172577A1 (en) | 2012-07-05 |
HK1164917A1 (en) | 2012-09-28 |
ES2489715T3 (es) | 2014-09-02 |
ES2387467T3 (es) | 2012-09-24 |
CA2602611C (en) | 2015-09-29 |
EP2383338B1 (en) | 2016-10-19 |
EP2390326A1 (en) | 2011-11-30 |
AU2006231795A1 (en) | 2006-10-12 |
DK1870460T3 (da) | 2012-09-03 |
JP4892474B2 (ja) | 2012-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4892474B2 (ja) | 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法 | |
ES2437068T3 (es) | Líneas celulares para expresar enzima útil en la preparación de productos amidados | |
EP0859838B1 (en) | Novel procollagens | |
JP7402604B2 (ja) | 組換えコラーゲンの水酸化を調節する酵母株及び方法 | |
CN108165593A (zh) | 胶原蛋白7及相关方法 | |
US8470555B2 (en) | Protein substance having triple helix structure and manufacturing method therefor | |
WO2010071938A1 (en) | Novel collagen constructs | |
JP6000130B2 (ja) | 新規なシグナルペプチドおよび組換えタンパク質の生成のためのその使用 | |
JP4701336B2 (ja) | ヒト・コラーゲンを産生する形質転換カイコ | |
JP2008125367A (ja) | 組換えプロリン水酸化ヒトコラーゲンを生産する組換え細胞およびトランスジェニック生物 | |
AU2012200573B2 (en) | "Process for production of protein having triple-helical structure" | |
JP5346145B2 (ja) | 神経再生用組成物 | |
WO2010010848A1 (ja) | 分子シャペロンを用いた、哺乳動物培養細胞における抗体の産生方法 | |
US20030077811A1 (en) | ADAMTS nucleic acids and proteins | |
KR20070035483A (ko) | 태반 및 뇌하수체 아형 유래의 키메라 인간 성장 호르몬 및상기 키메라의 제조 방법 | |
JP2009537151A (ja) | ヒトoct−2変異体ペプチド鎖、核酸、および方法 | |
WO2003104390A2 (en) | Adamts nucleic acids and proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081028 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081028 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110601 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110801 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110822 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111116 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20111124 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111212 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111219 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141222 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |