CN114920826B

CN114920826B - Ⅲ型类人胶原蛋白及其编码基因、表达载体和重组酵母菌

Info

Publication number: CN114920826B
Application number: CN202210685024.XA
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 项志祥; 龚劲松; 许正宏; 苏畅; 蒋敏; 钱建瑛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN114920826A

Abstract

本发明公开了一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、表达载体和重组酵母菌，本发明在保持人源Ⅲ型胶原蛋白的Gly‑X‑Y基本骨架基础上对其进行改造，提供一种亲水性较好的Ⅲ型类人胶原蛋白(hlCOLⅢ)，该Ⅲ型类人胶原蛋白能够在毕赤酵母中可溶性分泌表达，并进一步通过启动子改造、高拷贝菌株筛选、发酵优化及高密度发酵等技术实现hlCOLⅢ的高产。

Description

Ⅲ型类人胶原蛋白及其编码基因、表达载体和重组酵母菌

技术领域

本发明涉及一种Ⅲ型类人胶原蛋白及其编码基因、表达载体和重组酵母菌，属于工业微生物技术领域。

背景技术

胶原蛋白是机体中含量最为丰富的功能性结构蛋白，广泛存在于人和动物的骨骼、皮肤、肌腱、血管等组织和器官中，占机体总蛋白含量的30％左右。胶原蛋白与细胞增生和分化、细胞之间信息的传递以及机体组织的形成与成熟等关系密切，在血液凝固、伤口愈合、细胞免疫、调节细胞衰老等方面也发挥着重要的生物学作用。

已报道的29种类型胶原蛋白中，Ⅲ型胶原蛋白是由3条相同的α多肽链组成的同源三聚体，其分子组成为[α1(Ⅲ)]₃，属于成纤维胶原。Ⅲ型胶原蛋白在肺泡间质中杂乱而广泛分布从而形成错综复杂的网状结构，这种组织分布对于维持肺部组织的柔韧性和弹性意义重大。Ⅲ型在血管中含量很高，以其良好的机械性能维系血管强度与张力并在一定程度上为细胞提供养分，促进新生血管的形成。相比于其他类型的胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白对于促进组织损伤修复的效果更佳，此外，Ⅲ型胶原蛋白对于激活凝血因子以及促进血小板向伤口部位聚集的凝血机制更是其它类型所不能及。

Ⅲ型胶原蛋白作为机体自然蛋白，由于其生物相容性好，抗原性弱，对皮肤亲和力高，生物降解性可控等，在生物医药、食品和日化等领域备受青睐。但市面中的胶原蛋白大多数从动物组织中提取所得，所得产品多为不溶性蛋白且成分复杂，应用于临床会有免疫排斥反应，且需要考虑动物源性病原体污染(如朊病毒，口蹄疫病毒，HIV，狂犬病毒等)和重金属超标的风险，产品质量控制较为困难。

随着基因工程与高密度发酵技术日趋成熟，通过生物合成手段生产胶原蛋白成为了研究者的不二选择。这种方法不仅可以避免病毒隐患、免疫排斥反应等缺点，而且可简化生产工艺，节约资源，具备大规模制备潜力，可获得更高的亲水性及安全性的优质产品。但天然胶原蛋白为不溶性纤维蛋白，其分子序列中含有独特的(Gly-X-Y)_n高度重复序列，合成过程中受到严格的翻译后修饰和复杂的自组装过程，因而一直面临表达困难、表达量低、分泌困难及纯化复杂的问题，导致目前Ⅲ型胶原蛋白种类少，价格昂贵，因而寻求Ⅲ型胶原蛋白的可溶性高效分泌表达一直是研究者努力的方向。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明首先在保持人源Ⅲ型胶原蛋白的Gly-X-Y基本骨架基础上对其进行改造，提供一种亲水性较好的Ⅲ型类人胶原蛋白，该Ⅲ型类人胶原蛋白能够在毕赤酵母中可溶性分泌表达，并进一步通过启动子改造、高拷贝菌株筛选、发酵优化及高密度发酵等技术实现hlCOLⅢ的高产。

本发明的第一个目的是提供一种Ⅲ型类人胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种所述的Ⅲ型类人胶原蛋白的编码基因。

进一步地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种包含所述的编码基因的重组表达载体。

进一步地，所述的重组表达载体以pPIC9k为载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的Ⅲ型类人胶原蛋白的重组酵母菌。

进一步地，所述的重组酵母菌是以毕赤酵母GS115为表达宿主。

进一步地，所述的重组酵母菌中，Ⅲ型类人胶原蛋白是以AOX1和DAS2双启动子启动表达。

本发明的第五个目的是提供一种生产Ⅲ型类人胶原蛋白的方法，包括如下步骤：

将所述的重组酵母菌接种至发酵培养基中发酵培养，并采用甲醇诱导Ⅲ型类人胶原蛋白表达，表达的Ⅲ型类人胶原蛋白采用亲和层析进行分离纯化。

进一步地，所述的发酵培养基为：甘油20～60g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 10～20g·L^-1，H₃PO₄ 20～30g·L^-1，K₂SO₄ 15～20g·L^-1，PTM1盐溶液0.1-1.0％(v/v)，氨水调节pH至5～8。

在本发明发酵过程中还包括采用甘油补料培养基和甲醇补料培养基进行补料。

所述的甘油补料培养基为：PTM1盐溶液0.1～2.0％(v/v)，甘油30％～80％(w/v)。

所述的甲醇补料培养基为：PTM1盐溶液0.1～2.0％(v/v)，甲醇50～100％(v/v)。

本发明的有益效果是：

本发明的重组菌株GS115/pPIC9k-P_DAS2-col成功实现hlCOLⅢ可溶性分泌表达且高效表达。该菌株在25～30℃条件下利用0.5～1.5％(v/v)甲醇诱导培养70～120h，摇瓶水平表达量为0.142g·L^-1，进一步在5L发酵罐中扩大培养，诱导60～72h，hlCOLⅢ最高产量为1.05g·L^-1。对目的产物进行亲和层析，其纯度可达96％。N/C端蛋白质测序结果与理论值完全一致且出现Gly-X-Y的重复序列特征，氨基酸分析中Gly占27.02％，Pro占23.92％，符合胶原蛋白的特性。紫外光谱、傅里叶变换红外光谱分析表明，目标产物符合胶原蛋白特征。此外，质谱分析探究了目的产物单链分子量为11313.4，与理论分子量一致。

附图说明

图1为GS115/pPIC9k-P_DAS2-col重组菌株的构建与筛选流程示意图；

图2为GS115/pPIC9k-P_DAS2-col重组菌株在摇瓶水平发酵的SDS-PAGE(A)及WB(B)分析；(A)中，1～3：GS115/pPIC9k阴性对照菌株发酵上清；M₁：三色预染蛋白Marker，4～6：GS115/pPIC9k-col阳性对照菌株发酵上清；7～9：GS115/pPIC9k-P_DAS2-col实验组重组菌发酵上清；M₂：非预染蛋白定量Maker；(B)中，M：三色预染蛋白Marker；1：GS115/pPIC9k阴性对照菌株发酵上清；2：GS115/pPIC9k-P_DAS2-col实验组重组菌发酵上清；

图3为重组hlCOLⅢ在5L发酵罐中96h内的发酵过程曲线(A)及发酵上清SDS-PAGE分析(B)；M₁：三色预染蛋白marker，1-9：分别发酵36，42，48，54，60，66，72，78，84h上清液，M₂：蛋白定量marker；

图4为hlCOLⅢ纯化后的SDS-PAGE电泳分析；M：三色预染蛋白marker；1：未纯化的重组hlCOLⅢ；2：纯化后的重组hlCOLⅢ；

图5为hlCOLⅢ的N末端(A)与C末端(B)氨基酸序列二级质谱图分析；

图6为hlCOLⅢ的MALDI-TOF-MS分析；

图7为hlCOLⅢ在200-400nm范围内的紫外全扫描分析；

图8为hlCOLⅢ的傅里叶红外振动光谱分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

hlCOLⅢ的含量测定方法

通过凝胶成像系统对SDS-PAGE图像进行捕捉，并利用ImagJ软件分析目的条带和蛋白浓度已知的定量预染Marker的灰度值，通过对比二者的比值以及上样体积计算目的产物hlCOLⅢ的含量。

摇瓶优化后的初始培养基为：大豆蛋白胨20g·L^-1，水溶性黄豆饼浸粉10g·L^-1，YNB 13.4g·L^-1，KH₂PO₄ 11.8g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 4g·L^-1，葡萄糖10g·L^-1，调节pH至7；

摇瓶优化后的诱导培养基为：大豆蛋白胨20g·L^-1，水溶性黄豆饼浸粉10g·L^-1，YNB 13.4g·L^-1，KH₂PO₄ 11.8g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 4g·L^-1，0.75％甲醇(v/v)，调节pH至7。

罐上的发酵培养基为：甘油40g·L^-1，CaSO₄·2H₂O 0.9g·L^-1，MgSO₄·7H₂O14.9g·L^-1，KOH 4.1g·L^-1，H₃PO₄ 26.7g·L^-1，K₂SO₄ 18.2g·L^-1，PTM1盐溶液0.43％(v/v)，氨水调节pH至5。

甘油补料培养基：PTM1盐溶液1.2％(v/v)，甘油50％(w/v)。

甲醇补料培养基：PTM1盐溶液1.2％(v/v)，甲醇100％(v/v)。

实施例1：重组载体pPIC9k-P_DAS2-col的构建

(1)重组载体pPIC9k-col的构建：根据天然胶原蛋白为不溶性纤维蛋白且氨基酸序列高度重复的特点，在人源Ⅲ型胶原蛋白的螺旋区域中选取一段编码99个氨基酸残基的胶原肽段，在不改变Gly-X-Y基本骨架的基础上将序列中除Pro以外疏水性氨基酸的替换为亲水性残基以改善目的产物的亲水性。该基因col交由上海生工公司合成至pUC57载体中，以pUC57-col为模板，IF/IR-col[5’-CGGAATTCAGAGGTCCACCCGGTGAGC-3’(EcoRⅠ)；5’-TTGC GGCCGCATGGTGATGGTGATGATGACCACCGGCTGGACCTTG-3’(NotⅠ)]为上下游引物进行基因扩增，扩增产物经纯化、回收后，在EcoRⅠ/NotⅠ限制性内切酶作用下对回收产物以及表达载体pPIC9k双酶切。对酶切产物进行纯化、回收，并按照V:I＝7:1的比例在DNA连接酶的作用下进行连接并导入JM109感受态细胞中，用带有Amp抗性的LB平板进行阳性转化子筛选，挑选菌落PCR、双酶切、测序验证均正确的转化子进行培养并抽提重组质粒，得到pPIC9k-col。

(2)重组载体pPIC9k-P_DAS2-col的构建：上述重组载体pPIC9k-col经BamHⅠ进行线性化，引物设计时添加此缺口两端同源臂序列(20bp)，以IF/IR-P_AOX1-DAS2为引物，以P.pastoris基因组为扩增模板，在DNA聚合酶作用下进行DAS2启动子基因扩增。利用同源重组酶ClonExpressII将线性化载体与回收后的扩增产物按表1反应体系进行连接。

其中扩增所用的上游和下游引物为：

IF-P_AOX1-DAS2:5’-aactaattattcgaaggatccAATGATATTTGAGGGTGTTAGTTACTTCG-3’；

IR-P_AOX1-DAS2:5’-gaaatctcatcgtttggatccTTTTGATGTTTGATAGTTTGATAAGAGTG-3.

表1同源重组酶连接体系

连接产物转化进入JM109中克隆，经菌落PCR、测序等验证正确后进行培养并抽提重组质粒，得到pPIC9k-P_DAS2-col重组载体。

实施例2：重组菌株GS115/pPIC9k-P_DAS2-col的构建与筛选

(1)重组载体pPIC9k-P_DAS2-col的转化：重组质粒pPIC9k-P_DAS2-col经SacI线性化及纯化、回收处理后转移至电极杯，以2000mv、5ms电击一次，迅速加入1M D-山梨醇溶液重悬菌体，转移至离心管中。在30℃、220rpm复苏90min后涂布于MD平板上筛选阳性转化子。

(2)高拷贝重组菌株的筛选：将上述MD平板上长出的阳性转化子转移在浓度梯度分别为2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL^-1的G418抗性平板上，挑选在各个浓度平板上长势均良好的菌株进行培养，提取基因组后进行PCR验证及测序验证，得到GS115/pPIC9k-P_DAS2-col重组菌。图1显示了具体的构建及筛选流程。

实施例3：GS115/pPIC9k-P_DAS2-col的发酵培养及粗蛋白的制备

(1)GS115/pPIC9k-P_DAS2-col重组菌摇瓶水平发酵：将上述重组菌划线活化后，挑取单菌落接种至10mL/50mL YPD培养基中，30℃、220rpm培养18h，以2％的接种量接种至25mL/250mL初始培养基中培养24h，收集菌体并于4℃，5000rpm条件下离心10min，弃上清，用预冷的ddH₂O先后将菌体清洗两次后重悬于新鲜的25mL/250mL诱导培养基中，30℃、220rpm发酵培养，每隔12h向培养基中补充0.75％的甲醇，每隔24h取样测定胶原蛋白表达量。

通过对发酵液上清取样并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果表明在诱导96h后，GS115/pPIC9k-P_DAS2-col重组菌发酵上清中约27kDa处出现目的条带(图2A)利用WB实验进行产物验证，实验组同样在27kDa处出现目的条带显影(图2B)，即Ⅲ型类人胶原蛋白分泌表达成功，分析条带灰度值，得出摇瓶水平蛋白表达量最高为0.142g·L^-1。

(2)GS115/pPIC9k-P_DAS2-col重组菌罐上扩大培养：配制无机盐培养基BSM，实消后连接到发酵控制系统，调节初始pH为5，控制温度于30℃，通气量为1vvm，初始转速为600rpm，随着菌体逐渐生长和菌体密度不断增大，逐步增加通气量至2～3vvm，增大转速到950rpm，维持DO值在15％以上。接种之后，DO值将经历先下降再上升的过程，DO值回升至80％左右时以18mL·h^-1·L^-1的速率流加甘油补料培养基，直至菌体湿重达到200g·L^-1左右停止流加，待DO值回升到80％时饥饿处理1～2h，调节pH至6并开始甲醇诱导。初始适应阶段甲醇流加速度极低，适应后根据DO-star补料策略控制甲醇的流速脉冲补料，控制DO值在15％以上，每隔6个小时取样分析测定胶原蛋白产量。

通过对发酵上清产物测定，甲醇诱导之前目的蛋白不表达。进入诱导阶段，此时湿重达223g·L^-1，甲醇既是诱导剂又充当碳源。根据DO反馈情况，进行脉冲补料使甲醇成为限制因素，hlCOLⅢ开始表达，在发酵至66h后，细胞湿重为270g·L^-1，hlCOLⅢ产量达到最高值1.05g·L^-1。之后，生物量仍然增加，但目标产物的表达开始下降，说明目标蛋白被发酵液的蛋白酶降解(图3)，96h时结束发酵。

实施例4：hlCOLⅢ的分离纯化

利用AKTA蛋白纯化仪对表达产物进行Ni-NTA亲和层析。纯化仪与电脑控制系统联机并接层析柱(His Trap HP 5mL)，先后用ddH₂O和结合液对层析柱进行冲洗和柱平衡，5mL·min^-1流速冲洗约25个柱体积(CV)，直至UV 280和电导率两基线冲平。以5mL·min^-1流速上样，用低浓度咪唑结合液冲洗10CV以洗脱未结合到配基上的杂蛋白，最后通过高浓度咪唑的洗脱液线性洗脱已结合的目的蛋白，根据UV280出峰位置收集纯化产物。

洗脱前主要为杂蛋白的流穿峰，洗脱过程中出现了唯一吸收峰，收集出峰位置的产物并进行SDS-PAGE分析，在27kDa处有单一条带，大小与之前结果一致，灰度值分析产物纯度可达96％左右(图4)，减少了下游处理的工序和成本。

实施例5：hlCOLⅢ的结构表征

为进一步确定表达产物的特性，将上述纯化产物透析处理后进行表征，包括蛋白测序、氨基酸分析、质谱分析、紫外全扫描以及红外光谱分析。

(1)hlCOLⅢ的N/C-末端蛋白测序：上述hlCOLⅢ样品经二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化处理用胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶消化以获得小肽片段。溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈)溶解肽段并离心后取上清，通过电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪(orbitrapElite^TM,Thermofisher)与毛细管高效液相色谱(Ultimate 3000，Thermofisher)相结合进行LC-MS/MS测定。使用PEAKS Studio软件进行数据分析。

经测定，N-末端(图5A)显示具有从第6个氨基酸开始出现具备胶原蛋白(Gly-X-Y)_n的特征三肽重复序列，该特征序列也同样出现在C-末端前段(图5B)，且经过序列比对，N端和C端序列与理论序列均完全一致(表2)。

表2Ⅲ型类人胶原蛋白的N/C末端氨基酸序列分析

(2)hlCOLⅢ的氨基酸分析：将HCl加入上述hlCOLⅢ冻干样品并充N₂约3min后在120℃条件下水解22h，用NaOH中和并定容至25mL，双层滤纸过滤并以15000rpm离心30min，取上清装样。样品经邻苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)共衍生处理后，用自动氨基酸分析仪对每种氨基酸组分进行分析，根据相应的峰面积计算每种氨基酸的含量

根据胶原蛋白螺旋区呈现出Gly-X-Y重复短肽序列的特征，Gly和Pro的水平在整个蛋白分子中含量应该比较高，这也是胶原蛋白相对于其他蛋白质的一个显著特征。表3显示了hlCOLⅢ经酸水解后各组分的含量、摩尔含量等，其中Gly、Pro的摩尔含量分别占27.02％和23.92％，符合胶原蛋白的特征，且其它组分残基与理论含量基本相符。

表3Ⅲ型类人胶原蛋白的氨基酸分析

注：Ⅰ、II中Asn和Gln在酸水解过程中会分别生成Asp和Glu，因此表中的值

为Asn+Asp和Gln+Glu之和。

(3)hlCOLⅢ的质谱分析：将hlCOLⅢ水溶液与基质溶液(饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸、50％乙腈、0.1％三氟乙酸、10％丙酮)1:1混合并点在MALDI靶板上干燥处理，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)以反射正离子模式RP700-4500测量相对分子量。加速电压20kV，质量电荷比(m/z)设定在5000-50000范围内，每个样品叠加200次轰击收集峰并利用FlexAnalysis软件分析图谱。

重组hlCOLⅢ的MALDI-TOF-MS结果如图6所示，在质荷比(m/z)为11313.4处有一个最为明显的单峰，即α1链的准确分子量为11.3kDa，这与α1链的理论值(11.3kDa)一致。通过质谱测定的α1链实际分子量与SDS-PAGE及WB实验中显示的27kDa的表观分子量不一致，根据已有文献报导，这种现象普遍存在，研究者普遍认为是重组胶原蛋白由于部分疏水性氨基酸被替换，亲水增强的同时使得表面带有负电荷的SDS与蛋白的结合能力减弱，目的蛋白在电泳过程中由于自身携带的电荷数减少，在电场中的作用力降低，因而导致迁移距离变短，从而使得表观分子量变大。

(4)hlCOLⅢ的紫外全扫面分析：将上述hlCOLⅢ水溶液(1mg·mL^-1)加入96孔石英酶标板中，在室温下利用多功能酶标仪在200～400nm波长范围内进行紫外全扫描分析，使用SoftMax Pro 6.3软件进行数据采集和分析。

图7显示了hlCOLⅢ在近紫外区域的紫外光谱，分别在223和278nm处有两个吸收峰，这与天然胶原的光谱类似，表明hlCOLⅢ具备胶原蛋白类似结构。图6中280nm处附近吸收峰由Tyr的酚羟基以及Phe的吲哚环上的π→π*的跃迁所贡献，由于hlCOLⅢ中Tyr和Phe含量低(表3)，苯环中的π*相对较弱，因而278nm处的吸收值较低。而210～230nm处的吸收峰主要归因于hlCOLⅢ的α链中的如-C＝O，-COOH，-CONH-等官能团的n→π*跃迁，因此具有较强的光吸收。

(5)hlCOLⅢ的傅里叶红外振动光谱分析：将hlCOLⅢ冻干样与KBr以1:100的比例充分研磨后，将样品放入样品槽中压片并进行傅里叶红外振动光谱仪检测，室温下采样32次，记录4000～400cm^-1波数范围内的光谱。

天然胶原蛋白通过链间和链内氢键作用将三条α链组装成三螺旋结构，其酰胺A、酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ表现出显著的光谱特征，hlCOLⅢ的红外光谱如图8所示。胶原蛋白酰胺A带一般出现在3330～3325cm^-1范围内，这是N-H键拉伸振动的结果，当N-H键参与氢键形成时，出峰位置移向较低的波数。hlCOLⅢ在3283.8cm^-1附近有一条酰胺A，故与天然胶原蛋白相比，hlCOLⅢ有更多的N-H键参与氢键形成。胶原蛋白酰胺Ⅰ(1600～1700cm^-1)是最明显的肽键振动，对蛋白质的二级结构十分敏感。hlCOLⅢ的酰胺Ⅰ峰在1629.1cm^-1附近，主要由C＝O键拉伸振动、C-N耦合拉伸和C-H弯曲振动所致。酰胺II(1600～1500cm^-1)主要受酰胺键中N-H弯曲振动和C-N拉伸振动的影响，对蛋白质构象变化不太敏感，hlCOLⅢ的酰胺II出现在1537.1cm^-1处。胶原蛋白酰胺Ⅲ范围为1300～1175cm^-1，其特征峰分布在1280、1240和1202cm^-1左右的三个主峰中，其中1240cm^-1的峰值最为强烈。hlCOLⅢ在1279、1239和1205cm^-1处有三个特征峰，1239cm^-1附近的吸收峰最强，这是由N-H拉伸振动引起的。hlCOLⅢ氢键区的酰胺A和酰胺B、双键区的酰胺Ⅰ和酰胺II以及指纹区的酰胺Ⅲ的光谱特征和波数与天然胶原蛋白相近，表明hlCOLⅢ具有与天然胶原蛋白相似的结构特征。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> III型类人胶原蛋白及其编码基因、表达载体和重组酵母菌

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Tyr Val Glu Phe Arg Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser

1 5 10 15

Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Gln Asn Gly Glu Ser

20 25 30

Gly Pro Ser Gly Lys Pro Gly Asp Gln Gly Asn Glu Gly Pro Pro Gly

35 40 45

Pro Asn Gly Gln Glu Gly Lys Pro Gly Gln Ser Gly Pro Asn Gly Pro

50 55 60

Pro Gly Glu Pro Gly Pro Ser Gly Gln Thr Gly Pro Lys Gly Gln Ser

65 70 75 80

Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Glu Gly

85 90 95

Thr Ser Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Gly His His His

100 105 110

His His His Ala Ala Ala Asn

115

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

tacgtagaat tcagaggtcc acccggtgag ccaggaaatc ccggttcccc tggaaatcaa 60

ggtcagccag gtaacaaagg tcagaacgga gaatctggcc cttctggtaa gccaggagat 120

cagggaaatg aaggacctcc cggcccaaat ggacaagaag gtaaacccgg tcaatctgga 180

ccaaatggtc caccaggaga accaggccca agtggtcaaa ctggtccaaa gggacaatcc 240

ggtgaaccag gaccccaagg accacctgga cctcaaggtc cagagggtac ctcaggtaaa 300

cctggaaacc aaggtccagc cggtggtcat catcaccatc accatgcggc cgcgaattaa 360

Claims

1.一种Ⅲ型类人胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的Ⅲ型类人胶原蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.一种包含权利要求2或3所述的编码基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体以pPIC9k为载体。

6.一种表达权利要求1所述的Ⅲ型类人胶原蛋白的重组酵母菌。

7.根据权利要求6所述的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌是以毕赤酵母GS115为表达宿主。

8.根据权利要求7所述的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌中，Ⅲ型类人胶原蛋白是以AOX1和DAS2双启动子启动表达。

9.一种采用权利要求6～8任一项所述的重组酵母菌生产Ⅲ型类人胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：甘油20～60g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 10～20g·L^-1，H₃PO₄ 20～30g·L^-1，K₂SO₄ 15～20g·L^-1，PTM1盐溶液0.1-1.0％(v/v)，氨水调节pH至5～8。