CN111793127B - 一种iii型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用，本发明提供一种新型的III型类人胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly‑X‑Y为基础设计了一段III型类人胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌可成功表达分子量为13.1kD的类人胶原蛋白。本发明的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的类人胶原蛋白，并且抗氧化活性较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
胶原蛋白是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白因具有良好的物理性能和生物学特性，在医药、组织工程、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。按照胶原蛋白发现的先后顺序，可将其分为I型、II型、III型等28种胶原蛋白。其中III型胶原蛋白血管中含量较高，主要存在于肺泡间质中且分布杂乱，因而形成复杂的网状结构，且使得肺组织具有良好的柔韧性与弹性，并且可以为细胞提供充足养分，使得皮肤饱满透亮。
目前工业上制备胶原蛋白方法主要为传统提取法。即动物组织如猪皮、牛皮等的酸、碱、盐、酶处理法，此法具有操作简单、生产时间短、回收率高等优点，但得到的胶原蛋白为水不溶性胶原蛋白，可加工性弱，提取过程中会造成部分生物活性的丧失，且提取的产品中含有动物疾病等病毒隐患，应用于人体会产生异体或异种的排斥反应，限制了其在医学组织材料领域的普遍应用
通过基因工程手段生产的类人胶原蛋白性能与天然胶原蛋白相近，但与天然胶原蛋白相比，类人胶原蛋白无病毒隐患、免疫排斥反应低，不仅保留了胶原蛋白原有功效，更赋予了其新的功能，如：可加工性、水溶性、质量可控性等。因此，利用分子生物学手段构建基因工程菌株对制备高质量的类人胶原蛋白具有重要意义。
但是由于胶原蛋白在体内的合成和修饰复杂，正确折叠成具有生物活性的胶原蛋白除了胶原链之外，还需要含有球状的头部和尾部，因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构，导致目前III型类人胶原蛋白种类较少，价格昂贵，且抗氧化活性有待进一步提高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种新型的III型类人胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly-X-Y为基础设计了一段III型类人胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌可成功表达分子量为13.1kD的类人胶原蛋白。本发明的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的类人胶原蛋白，并且抗氧化活性较高。
本发明的第一个目的是提供一种III型类人胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的第二个目的是提供所述的III型类人胶原蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供包含所述的编码基因的重组表达载体。
进一步地，所述的重组表达载体是以pET-28a为载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述的III型类人胶原蛋白的重组菌。
进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
本发明的第五个目的是提供所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将包含III型类人胶原蛋白编码基因的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，培养、筛选阳性转化子，得到所述的重组菌。
本发明的第六个目的是提供生产III型类人胶原蛋白的方法，包括如下步骤：将表达所述的III型类人胶原蛋白的重组菌以8～12％接种量接种至发酵培养基中发酵培养30～40h，离心去除菌体，得到含有类人胶原蛋白的上清液，纯化除盐得到所述的III型类人胶原蛋白。
进一步地，所述的发酵培养基为蛋白胨18～22g/L，酵母粉22～25g/L，KH2PO4 2.0～2.5g/L，K2HPO4·3H2O 16.0～16.5g/L，甘油0.3～0.5％v/v。
本发明的第七个目的是提供所述的III型类人胶原蛋白在生物医药材料或化妆品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供一种新型的III型类人胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly-X-Y为基础设计了一段III型类人胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌可成功表达分子量为13.1kD的类人胶原蛋白。本发明的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的类人胶原蛋白，并且抗氧化活性较高。
附图说明
图1是大肠杆菌BL21(DE3)-pET-28a-kit在自制的发酵培养基中发酵生产III型类人胶原蛋白的结果；
图2是纯化的III型类人胶原蛋白SDS-PAGE电泳结果。M为标准蛋白分子量，泳道1为初始发酵液细胞破碎液上清，泳道2为BL21(DE3)-pET-28a-kit制备并经纯化的III型类人胶原蛋白；
图3是纯化的III型类人胶原蛋白质谱分析结果；
图4是纯化的III型类人胶原蛋白圆二色谱分析结果；
图5是纯化的III型类人胶原蛋白还原能力测定结果；
图6是纯化的III型类人胶原蛋白清除DPPH·自由基能力测定结果；
图7是纯化的III型类人胶原蛋白清除·OH自由基能力测定结果；
图8是类人胶原蛋白冻干品与市售胶原蛋白水溶性验证图(浓度均为20mg/mL)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
类人胶原蛋白含量测定：采用Bradford法测定菌体总蛋白含量，使用QuantityOne软件扫描并分析SDS-PAGE电泳图，分析类人胶原蛋白占总蛋白的比例，根据菌体总蛋白量与类人胶原蛋白的百分含量计算出类人胶原蛋白含量。
实施例1：重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-28a-kit的构建
(1)III型类人胶原蛋白基因扩增：以含有亲本III型类人胶原蛋白基因质粒pUC-57-kit为模板进行PCR扩增，PCR体系为：25μL
(Premix)，1μL pUC-57-kit，上下游引物各1μL，22μL ddH2O。扩增条件：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，8min；35个循环；72℃，15min。本文设计的III型类人胶原蛋白以人Ⅲ型胶原蛋白α1链mRNA序列(GenBank：X14420.1)为模板，以三螺旋区域的特征序列(Gly-X-Y)为基础，将脯氨酸之外的部分疏水氨基酸进行亲水性氨基酸的相似性替换，设计了一段编码分子量为13.1kD的类人胶原蛋白基因kit且此序列两端含有同尾酶序列，可以在此基础上随意获得任何分子量的类人胶原蛋白。
其中重组质粒构建所用的上游引物和下游引物：
上游引物：CGGGATCCAGAGGTCCACCCGGTGAGC
下游引物：CGGAATTCTTAACCACCGGCTGGACCTTGG
(2)用DpnⅠ酶消化模板质粒，DpnⅠ酶切消化体系：8.5μL上述PCR产物，1μL 10×Tbuffer，0.5μL DpnⅠ。将DpnⅠ酶切消化体系置于37℃下，2h。
(3)重组质粒转化：将上步消化产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中。涂布于LB(含100μg/mL硫酸卡那霉素)平板。挑选阳性克隆进行PCR验证及基因测序，即获得重组大肠杆菌表达菌株。
实施例2：III型类人胶原蛋白基因工程菌的发酵及粗蛋白液的制备
(1)制备种子培养液，挑取固体LB培养基(酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L)上表达III型类人胶原蛋白的重组大肠杆菌BL21(DE3)，接种在装有30mL LB培养基的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以220r/min的转速培养12h至对数生长期，即制得一级种子培养液；吸取300μL一级种子培养液，接种在装有30mL种子培养基(蛋白胨20.0g/L，酵母粉24.0g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4·3H2O 16.4g/L，甘油0.4％(v/v))的250mL锥形瓶中，在37℃条件下，置于摇床上以220r/min的转速培养12h至对数生长期，即制得二级种子培养液。
(2)发酵罐扩大培养，以10％接种量将二级种子液接种在装有3L发酵培养基(蛋白胨20.0g/L，酵母粉24.0g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4·3H2O 16.4g/L，甘油0.4％(v/v))的5L发酵罐中，在37℃条件下，以600r/min的转速培养4h，添加终浓度为0.7mmol/L的诱导剂IPTG，18℃诱导发酵至24h时，类人胶原蛋白表达量达到最高值3.02g/L，此时pH为6.8，菌体生物量OD600为17.34，随着发酵时间的延长，pH保持6.8不变，菌体生物量缓慢增加后趋于平稳，类人胶原蛋白表达量慢慢降低，当发酵至36h时，pH为6.8，菌体生物量OD600为20.62，类人胶原蛋白表达量为2.43g/L，结束发酵。大多数培养基所用碳源为葡萄糖；而本发明构建的重组菌培养基碳源为甘油，含量为0.4％。
(3)高压匀浆发酵液，将类人胶原蛋白发酵液12000rpm离心10min，使用0.2mmol/L，pH＝7.2的磷酸盐缓冲液溶解菌体，置于高压匀浆机中4℃，1000Pa破碎5min，回收菌体，4℃，12000rpm离心10min，取上清液待纯化。
实施例3：III型类人胶原蛋白的纯化
选用硫酸铵沉淀分级盐析初步纯化。经过对硫酸铵饱和度的摸索，硫酸铵盐析的最佳饱和度为0-20％。采用亲和层析法，使用His-Trap FF 1mL镍柱对目标蛋白进行梯度洗脱，洗脱液梯度为0-10％时可洗脱出目标蛋白。使用3000Da的超滤管浓缩除盐，将浓缩液通过葡聚糖凝胶G-100纯化目的蛋白。先用50mmol/L磷酸钠缓冲液平衡柱子，上样流速为1.0mL/min，平衡3个柱体积，以0.6mol/L NaCl(pH＝7.5)洗脱，洗脱速度为0.4mL/min。收集紫外280nm处的出峰，并进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验。与普通透析法除盐不同，本研究除了采用超滤浓缩除盐外，还使用葡聚糖凝胶G-100进行除盐，保证可以完全除盐。
蛋白分子量的测定：用SDS-PAGE技术确定III型类人胶原蛋白的表观分子量约为26kD，质谱分析结果表明III型类人胶原蛋白的相对分子量为13.1kD。
实施例4：III型类人胶原蛋白的表征及抗氧化活性评定
将上述制备的III型类人胶原蛋白进行冻干，对冻干品进行结构表征，主要包括氨基酸分析、质谱分析和圆二色谱分析。对冻干品进行抗氧化活性评定，主要包括：还原能力的测定、清除DPPH·自由基能力的测定、清除·OH自由基能力的测定。
(1)结构表征：
氨基酸分析：对类人胶原蛋白水溶液进行酸水解前处理，称量100.0mg左右类人胶原蛋白纯品放入水解管中，先加入4mL 6mol/L的HCl摇匀润湿，再加入4mL 6mol/L的HCl，充氮气，调整流速，使溶液呈现微沸状态，约3min后拧紧水解管盖，放入120℃烘箱中，水解22h。将水解样品转移至具塞试管中，加入4.8mL10mol/L的NaOH中和，使用蒸馏水定容至25mL，双层滤纸过滤后，取1mL澄清滤液置于1.5mL ep管中，10000rpm离心10min，将离心上清液使用0.22μm水膜进行过滤，取400μL过滤液置于液相样品瓶中，通过邻苯二甲醛(o-Phthalic dicarboxaldehyde)和氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)联用的衍生化后，使用高效液相色谱经C18柱分离后分析氨基酸含量。结果如表1。
表1类人胶原蛋白的氨基酸分析
注：“-”表示未检出。
质谱分析：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted LaserDesorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)对类人胶原蛋白水溶液进行相对分子量测定。基质为α-CHCA饱和溶解在0.1％TFA-30％乙腈-10％丙酮溶液中，将1μL蛋白样品与1μL基质充分混匀后取出1μL置于靶上做质谱分析。MALDI-TOF-MS分析采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压为20KV，每一个肽图谱由200次轰击累加形成。使用Bruker公司肽混合标准品作外校正，胰蛋白酶自降解峰作内校正。使用MassLynx软件进行分析。结果如图3，从图中可以看出，类人胶原蛋白的相对分子量为13135.0Da，与理论分子量一致，但SDS-PAGE及Western blotting结果显示类人胶原蛋白的表观分子量约为27kDa，明显大于理论分子量，推测原因为类人胶原蛋白含有较多亲水性氨基酸，导致蛋白与SDS结合能力变弱，蛋白电泳过程中负电荷减少使得电泳迁移距离变短，因而表观分子量变大。
圆二色谱分析：采用圆二色谱仪表征类人胶原蛋白，条件如下：带宽：1nm，响应值：1s，测量范围：250-190nm，扫描速度：100nm/min，溶剂：去离子水。天然胶原蛋白的圆二色谱特征一般是在197nm处有一个负吸收峰，在225nm处有一个微弱的正吸收峰，吸收峰位置会随着氨基酸的长度和序列的变化而偏移。类人胶原蛋白的圆二色谱如图4所示，从图中可以看出，其特征基本符合天然胶原蛋白特征。南京理工大学的刘斌制备的类人胶原蛋白缺乏220nm的正峰。
(2)抗氧化活性测定：
还原能力的测定：将制备好的类人胶原蛋白纯品溶解于乙醇溶液中，分别配制浓度为1、2、3、4、5mg/mL的类人胶原蛋白溶液，于10mL ep管中按顺序依次加入1mL类人胶原蛋白溶液、2mL PBS缓冲液和2mL铁氰化钾溶液，充分混匀后于50℃水浴20min后加入2.5mL10％的三氯乙酸溶液，3000rpm离心10min，取上清2.5mL于新10mL ep管中，依次加入2.5mLddH2O和0.5mL 10％FeCl3溶液，混匀后吸取200μL于96孔板中，使用酶标仪测定700nm处的吸光值，结果如图5显示，在一定范围内还原能力与吸光值呈正相关。
清除DPPH·自由基能力的测定：在10mL ep管中分别加入2mL上述的类人胶原蛋白溶液和2mL DPPH·溶液，混合均匀后使用酶标仪测定517nm处吸收值，记为A1；将上述溶液于4℃避光反应30min，测定517nm处吸收值记为A2；将类人胶原蛋白溶液替换为无水乙醇溶液即为对照溶液，吸收值记为A0。DPPH·自由基清除率％＝[1-(A1-A2)/A0]×100％。结果如图6所示，在一定浓度范围内，类人胶原蛋白浓度越高，清除DPPH·自由基的能力越强。当类人胶原蛋白浓度达到5mg/mL时，DPPH·自由基清除率高达53.70％。
清除·OH自由基能力的测定：取5mL ep管，加入1mL 9mmol/L FeSO4溶液和1mL9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，依次加入1mL上述浓度的类人胶原蛋白溶液和1mL 8.8mmol/LH2O2溶液于37℃反应10min，使用酶标仪测定510nm处吸收值Aa。用ddH2O替换类人胶原蛋白溶液即为对照溶液，吸光度值记为Ab，将ddH2O替换H2O2即为空白对照，测得的吸光度值记为Ac。·OH自由基清除率％＝[Ab-(Aa-Ac)]/Ab×100％。结果如图7。图中可以看出，在一定范围内，类人胶原蛋白的浓度与·OH自由基清除率成正比，类人胶原蛋白浓度为1mg/mL时，·OH自由基清除率为8.43％；类人胶原蛋白浓度为5mg/mL时，·OH自由基清除率高达为48.46％。
实施例5：
取2只10mL ep管，分别加入5mL去离子水并加入1.0g类人胶原蛋白和1.0g市售胶原蛋白，浓度均为20mg/mL，验证类人胶原蛋白的亲水性。实验结果如图8，图8可以明显看出，左边的类人胶原蛋白溶液澄清，证明类人胶原蛋白已完全溶于水中，而右边的市售胶原蛋白溶液具有沉淀，经文献调研，天然类人胶原蛋白微溶于水，实验结论亦证明胶原蛋白此特性。故本发明所制备的类人胶原蛋白具有良好的亲水性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种III型类人胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的III型类人胶原蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是以pET-28a为载体。
5.一种表达权利要求1所述的III型类人胶原蛋白的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
7.一种权利要求5或6所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将包含III型类人胶原蛋白编码基因的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，培养、筛选阳性转化子，得到所述的重组菌。
8.一种生产权利要求1所述的III型类人胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：将表达所述的III型类人胶原蛋白的重组菌以8～12％接种量接种至发酵培养基中发酵培养30～40h，离心去除菌体，得到含有III型类人胶原蛋白的上清液，纯化除盐得到所述的III型类人胶原蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为蛋白胨18～22g/L，酵母粉22～25g/L，KH2PO4 2.0～2.5g/L，K2HPO4·3H2O 16.0～16.5g/L，甘油0.3～0.5％v/v。
10.权利要求1所述的III型类人胶原蛋白在生物医药材料或化妆品中的应用。
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| CN111793127A (zh) | 2020-10-20 |
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