CN110172470A

CN110172470A - 一种在毕赤酵母系统中表达重组人源脯氨酰-4-羟化酶的方法及应用

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Publication number: CN110172470A
Application number: CN201910241421.6A
Authority: CN
Inventors: 项琪; 黄亚东; 肖巧学; 肖雪
Original assignee: GUANGZHOU JIYUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd; Medical And Biological Technology Research And Development Center Jinan Univ G
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2019-08-27

Abstract

本发明公开了一种在毕赤酵母系统中表达重组人源脯氨酰‑4‑羟化酶(rhP4H)的方法，具体包括重组质粒pPICZαA‑P4Hα2和pHIL‑PDI的构建，P4Hα2和PDI共表达毕赤酵母工程菌GS115的转化和阳性表达菌的筛选，并对表达条件进行优化。所得到的rhP4H酶，无论是在酵母体系内还是分离提纯后均能特异性催化人源胶原蛋白结构单元‑Gly‑X‑Y‑中脯氨酸的羟基化。

Description

一种在毕赤酵母系统中表达重组人源脯氨酰-4-羟化酶的方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种在毕赤酵母系统中表达重组人源脯氨酰-4-羟化酶的方法及利用此酶催化人源胶原蛋白结构单元-Gly-X-Y-中脯氨酸的羟基化形成羟脯氨酸的应用。

背景技术

脯氨酰羟化酶(Prolyl 4-hydroxylase，P4H)是一种高度丰富的多功能酶，在蛋白翻译后修饰中起关键作用，翻译后修饰可改变蛋白构象及蛋白质-蛋白质相互作用，并能够进一步进行修饰。最有名的是在胶原合成中参与了前原胶原中脯氨酰残基的羟基化，对新合成的前胶原链形成正确折叠，保持三螺旋结构具有重要意义。在人类和其他脊椎动物中，脯氨酰羟化酶是一个α2β2异源四聚体，由两个α亚基(P4Hα1和P4Hα2)和两个β亚基(PDI)组成，在胶原生物合成中，通过将新合成的前胶原结构中(-Gly-X-Y-)的脯氨酸羟化成羟脯氨酸，来保证新合成的胶原蛋白形成正确的三维折叠，从而使胶原蛋白发挥正常的生理功能。α亚基(P4Hα)具有几种不同的类型，提供酶活性催化位点的主要部分。β亚基(PDI)是含有两个硫氧还蛋白结构域的二硫键异构酶，其催化二硫键的形成、还原和异构化，进而辅助蛋白的折叠和复性，从而能更好的促进P4Hα活性的挥发。文献报导rhP4H中α和β在1:1时或者大于1:1时才具有催化Pro转化为HYP的活性(Vuorela A,Myllyharju J,Nissi R,et al.EmboJournal,2014,16(22):6702-6712.；Buechter D D,Paolella D N,Leslie B S,etal.Journal of Biological Chemistry,2003,278(1):645-650.)。在植物和病毒中也存在脯氨酰羟化酶，然而植物的脯氨酰羟化酶主要以多聚的L-脯氨酸或者类似的序列为底物，而非类似人胶原中的Gly-X-Y重复单元，特异性不好。

Stein Hanan等在烟草中表达了重组人脯氨酰-4-羟化酶(Biomacromolecules,2009,10:2640-5.)，占鹏飞等以家蚕为生物工厂共表达了Ⅰ型类人胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶α-蛋白的品系构建(蚕业科学,2016(5):832-839.)，对于哺乳动物表达系统，PinkasDaniel M在大肠杆菌中实现了rhP4H翻译后再修饰(ACS Chem.Biol.,2011,6:320-4)。中国发明专利申请(申请号97195401.5)涉及了人脯氨酰-4-羟化酶α亚单位同工型，编码这些新蛋白质的多核苷酸序列，和制备这些蛋白质的方法。更多的中国发明专利申请是针对植物中的脯氨酸羟化酶的发明，不是人源脯氨酰羟化酶。

发明内容

针对上述问题，本发明对人源的P4H酶进行体外重组表达，采用巴斯德毕赤酵母真核表达系统，具有有无致热源、可进行翻译后加工修饰、且外源基因遗传稳定性高等优势。

因此，本发明提供以下各项：

1.一种在毕赤酵母中表达重组人源脯氨酰-4-羟化酶(rhP4H)的方法，包括以下步骤：

(1)构建分别表达所述脯氨酰-4-羟化酶的α亚基(P4Hα2)和β亚基(PDI)的重组表达质粒，并将其共同导入毕赤酵母菌株中；和

(2)通过抗生素抗性筛选和诱导培养，从毕赤酵母细胞中和/或培养物上清中获得所述重组人源脯氨酰-4-羟化酶。

2.根据以上1所述的方法，其中用于表达P4Hα2和PDI的质粒各自独立地选自pPICZαA、pHIL、pPIC9k、和/或pPICZαB，优选pPICZαA或pHIL，更优选用于表达P4Hα2的质粒为pPICZαA，和用于表达PDI的质粒为pHIL，最优选所构建的重组质粒为pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI。更优选的，P4Hα2基因序列的GenBank Accession No.为NM_001017973.1，并且PDI基因的GenBank Accession No.为XM_024450777.1。

3.根据以上1所述的方法，其中所述毕赤酵母菌株选自：GS115、X33和KM71，优选GS115。

4.根据以上1所述的方法，其中用于诱导培养的培养基选自：MM(基本培养基，minimal medium)、BMM(最小缓冲甲醇培养基，Buffered Minimal Methanol Medium)、BMMY(含甲醇缓冲性复杂培养基，Buffered Methanol-complex Medium)、BMGY(含甘油缓冲性复杂培养基，Buffered Glycerol-complex Medium)、YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)和YPM(酵母浸出粉胨甲醇培养基)，优选YPM。

5.根据以上1-4中任一项所述的方法，其中P4Hα2的表达量等于和/或高于PDI的表达量。

6.根据以上1-4中任一项所述的方法，其中所述抗生素抗性筛选为博来霉素(zeocin)抗性筛选，优选筛选浓度为0.05至10mg/ml，更优选为0.1、0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.0、4.5、或5.0mg/ml，最优选为1.5mg/ml。

7.根据以上1-4中任一项所述的方法，其中所述诱导培养为甲醇诱导培养，优选以培养物的总重量计甲醇诱导浓度为0.1重量％至5.0重量％，更优选0.5重量％、1.0重量％、1.5重量％、2.0重量％，最优选1.0重量％。

8.根据以上1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括离心收集上清的步骤，和/或将收集的上清采用硫酸铵沉淀和/或脱盐的方法进行纯化以获得纯度大于80％(例如85％，90％和95％)的rhP4H的步骤。

9.通过根据以上1-8中任一项所述的方法获得的rhP4H。

10.根据以上9所述的rhP4H在特异性催化底物如人源胶原蛋白中脯氨酸的羟基化以形成羟脯氨酸中的应用，所述底物可以为Gly-Pro-Pro-Gly,(Gly-Pro-Pro)₃或(Gly-Pro-Pro)₅。

本发明区别于已有文献报导的优势至少在于，现有报导是将P4Hα2和PDI同时构建在一个表达载体上，而本发明是将P4Hα2和PDI分别构建在两个不同的表达载体上，再分别将两个重组质粒转化毕赤酵母菌株中进行共表达P4Hα2和PDI，降低了蛋白表达的难度，并通过表达条件的优化获得了高表达量的菌株。

发明详述

本发明的目的在于利用毕赤酵母工程菌表达一种重组人源脯氨酰-4-羟化酶。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌中重组人源脯氨酰-4-羟化酶的表达方法，具体技术方案如下：

一种在毕赤酵母系统中表达重组人源脯氨酰-4-羟化酶的方法，其特征在于:将构建的重组质粒pPICZαA-P4Hα2、pHIL-P4Hα2、pPIC9k-P4Hα2、pPICZαB-P4HA2，pPICZαA-PDI、pHIL-PDI、pPIC9k-PDI和/或pPICZαB-PDI导入工程菌株中，用甲醇诱导的方法分别在MM、BMM、BMMY、YPM培养基中进行诱导培养。

进一步的，所述重组质粒的工程菌株采用如下方案构建：将P4Hα2和PDI基因片段分别构建到表达载体pPICZαA、pHIL、pPIC9k、pPICZαB中，获得重组质粒pPICZαA-P4Hα2、pHIL-P4Hα2、pPIC9k-P4Hα2、pPICZαB-P4Hα2，pPICZαA-PDI、pHIL-PDI、pPIC9k-PDI、pPICZαB-PDI，并将重组质粒转化到毕赤酵母表达菌GS115、X33和KM71中，获得重组毕赤酵母工程菌。

进一步的，所述诱导培养条件如下:温度为25-30℃，转速为180-250rpm，培养时间为48～120h。

进一步的，还包括离心收集上清的步骤。

进一步的，收集的上清采用硫酸铵沉淀的方法进行纯化后获得纯度大于大于85％的酶。硫酸铵分及沉淀采用的硫酸铵浓度范围为20％-70重量％。

本发明的另一方面提供了一种利用脯氨酰-4-羟化酶将类似人胶原肽中的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法类似人胶原肽有：Gly-Pro-Pro-Gly,(Gly-Pro-Pro)₃，(Gly-Pro-Pro)₅。其采用如下技术方案：

将含有rhP4H的提取液加入到含有四肽的反应液中，反应液包括50mM/L Tris-HCL(pH＝7.8)，1mg/ml BSA，100um/L H₂O₂酶，0.1mM/L DTT，0.1mM/L Fe²⁺,0.5mM/Lα-酮戊二酸，2mM/L抗坏血酸。

进一步的，先将反应液与含有rhP4H的提取液混匀，静置2-3min，再加入Gly-Pro-Pro-Gly,(Gly-Pro-Pro)₃，和/或(Gly-Pro-Pro)₅底物，30℃培养箱孵育过夜，然后沸水浴煮1min,进行MS检测。

本发明与现有技术相比，特别具有以下优势及有益成果：

本发明在毕赤酵母中生产出rhP4H，不仅在毕赤酵母提取物中有活性，而且在酵母细胞内也有活性。

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此而限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤、条件等所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

附图说明

图1.重组质粒pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI的结构示意图(a:pPICZaA-P4Hα2质粒图谱；b:pHIL-PDI质粒图谱)；

图2.重组质粒pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI转化GS115后菌落PCR鉴定图(M:DNALadder 10000；泳道1:重组质粒pHIL-PDI阴性对照；泳道2:PCR鉴定重组质粒pHIL-PDI；泳道3:重组质粒pPICZaA-P4Hα2阴性对照；泳道4:PCR鉴定重组质粒pPICZaA-P4Hα2)；

图3.P4Hα2和PDI在工程菌GS115中共表达鉴定(Western Blot)；

图4.P4Hα2和PDI共表达抗生素浓度的筛选图(Western Blot)(泳道1至5:分别为0.1、0.5、1.5、2.5、3.5mg/ml zeocin抗性筛选)；

图5.P4Hα2和PDI共表达甲醇浓度的筛选图(SDS-PAGE和Western Blot)。a(泳道1至4：分别为0.5、1.0、1.5、2.0wt％甲醇筛选),b(M:蛋白质标记；泳道1至4：分别为0.5、1.0、1.5、2.0wt％甲醇筛选；a图红色方框内为共表达蛋白条带)；

图6.MS检测rhP4H的羟化活性(Dαnsyl-Gly-Phe-Pro-Gly-OEt肽段酵母菌内外测活a:底物标准品质谱图.b:产物标准品质谱图.c:P4H酵母表达菌体外活性鉴定质谱图(底物).d:P4H酵母表达菌体外活性鉴定质谱图(产物).e:P4H酵母表达菌体内活性鉴定质谱图(底物).f:P4H酵母表达菌体内活性鉴定质谱图(产物).g:载空白质粒酵母菌对照质谱图(底物).h:载空白质粒酵母菌对照质谱图(产物)。

M[Dαnsyl-Gly-Phe-Pro-Gly-OEt+H⁺]＝638.24；

M[Dαnsyl-Gly-Phe-Pro-OH-Gly-OEt+H⁺]＝654.26)。

具体实施方式

以下结合具体事例详细说明本发明技术方案的实施方式和效果，并非对本发明的限制。

实施例1 P4Hα2和PDI重组表达质粒的获得

从人胎盘提取P4Hα2的RNA经反转录反应(PrimeScript^TMRT Master Mix(PerfectReal Time)(RR036A Takara))获得P4Hα2的cDNA,根据P4Hα2基因序列(GenBank AccessionNo.:8974,NM_001017973.1)设计引物(P4Hα2-F:ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTT；P4Hα2-R:

TTAGTCAACTTCTGTTGATCCACAAGG)，以P4Hα2的cDNA为模板扩增P4Hα2基因，用限制性内切酶(EcoRI和XbaI)双酶切酵母表达载体pPICZαA(Invitrogen)、pHIL(Invitrogen)、pPIC9k(优宝生物)、pPICZαB(购买自生物风资源技术服务公司)，用双酶切(EcoRI和XbaI)载体的限制性内切酶酶切RT-PCR扩增出来的P4Hα2片段，并通过切胶回收，获得载体片段和目的基因P4Hα2片段。然后将回收的载体片段与基因片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜；将连接产物转化大肠杆菌TOP10(广州瑞真生物技术有限公司)感受态细胞，在含有zeocin和Ampicillin的LB抗性平板筛选阳性克隆，成功获得重组表达质粒，命名为pPICZαA-P4Hα2、pHIL-P4Hα2、pPIC9k-P4Hα2、pPICZαB-P4Hα2。

PDI基因(GenBank Accession No.:5034；XM_024450777.1)；(扩增引物：PDI-F:ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGT；PDI-R:TTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG)的获得及重组表达质粒的构建步骤与P4Hα2基因相同。最后获得重组表达质粒命名为：pPICZαA-PDI、pHIL-PDI、pPIC9k-PDI、pPICZαB-PDI。

pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI的构建示意图如图1所示。

实施例2 rhP4H重组毕赤酵母工程菌的获得

重组质粒pPICZαA-P4Hα2、pHIL-P4Hα2、pPIC9k-P4Hα2、pPICZαB-P4Hα2，pPICZαA-PDI、pHIL-PDI、pPIC9k-PDI、pPICZαB-PDI线性化后，分别电转到毕赤酵母GS115、X33、KM71(可商购自上海泽叶生物科技有限公司或北京华越洋生物科技有限公司，本研究实验室即暨南大学医药生物技术研究开发中心保藏))感受态细胞，按照常规方法进行培养和阳性表达菌鉴定。

实施例3 rhP4H在工程菌GS115中表达及P4Hα2和PDI的鉴定

将含有重组质粒的工程菌GS115，X33,KM71分别进行培养,进行P4Hα2和PDI的诱导表达，具体实施方案如下：

挑取活化后的含有重组质粒的工程菌GS115,X33,KM71接种于10mL的YPD培养基中，230rpm、30℃，培养18-20h。按1％接种量吸取培养液于25mL的YPG培养基中，230rpm、30℃，培养18-20h至OD₆₀₀＝1.0，而后将培养液3000rpm离心5min收集菌体，用25ml的YPM重悬菌体并置于250mL的三角瓶中，230rpm、30℃，培养72h，培养期间每隔24h添加终浓度为0.5％的甲醇进行诱导表达。将获得的发酵液，10000rpm离心5min，取上清即得rhP4H粗酶液。通过SDS-PAGE和Western Blot分别进行了鉴定。

图2是重组质粒pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI转化GS115后菌落PCR鉴定图；鉴定所用引物如下：

P4Hα2-F:ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTT

P4Hα2-R:TTAGTCAACTTCTGTTGATCCACAAGG

PDI-F:ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGT

PDI-R:TTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG

图3是P4Hα2和PDI在工程菌GS115中共表达鉴定(Western Blot)(抗-P4Hα2和抗-PDI的多克隆抗体购买自广州杰特伟生物科技有限公司)。

实施例4筛选博来霉素(Zeocin)浓度优化rhP4H表达水平

将实施例3的含有重组质粒pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI的工程菌GS115分别划线于含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/ml zecion抗生素的YPD平板上，30℃培养，挑取活化后的单克隆于10mL的YPD培养基中，230rpm、30℃，培养18-20h。按1％接种量吸取培养液于25mL的YPG培养基中，230rpm、30℃，培养18-20h至OD₆₀₀≈1.0，而后将培养液3000rpm离心5min收集菌体，用25ml YPM重悬菌体并置于250mL的三角瓶中，230rpm、30℃，培养72h，培养期间每隔24h添加终浓度为0.5wt％的甲醇进行诱导表达。将获得的发酵液，10000rpm离心5min，即得rhP4H粗酶液。结果如图4所示，可以看出，当博来霉素(zeocin)筛选浓度为1.5mg/ml时，rhP4H表达水平最高。

实施例5 P4Hα2和PDI共表达甲醇浓度的筛选图

将实施例3的含有重组质粒pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI的工程菌GS115分别划线于含1.5mg/ml zecion抗生素的YPD平板上，30℃培养，挑取活化后的单克隆于10mL的YPD培养基中，230rpm、30℃，培养18-20h。按1％接种量吸取培养液于25mL的YPG培养基中，230rpm、30℃，培养18-20h至OD₆₀₀≈1.0，而后将培养液3000rpm离心5min收集菌体，用25ml YPM重悬菌体并置于250mL的三角瓶中，230rpm、30℃，培养72h，培养期间每隔24h添加终浓度为0.5、1.0、1.5、2.0wt％的甲醇进行诱导表达。将获得的发酵液，10000rpm离心5min，即得rhP4H粗酶液。结果如图5所示，可以看出，当添加终浓度为1.0wt％的甲醇进行诱导表达时，rhP4H表达水平最高。

实施例6 rhP4H酶活性测定

脯氨酸羟基化酶在Fe²⁺、α-酮戊二酸和还原剂如抗坏血酸盐等存在的条件下,可以把以肽链形式结合存在的L-脯氨酸转化为4-L-羟基脯氨酸。具体方法如下:

rhP4H的酵母细胞体外活性测定

将从实施例4获得的rhP4H粗酶提取液经过硫酸铵等级沉淀，得到纯度>80％的rhP4H。以Dαnsyl-Gly-Phe-Pro-Gly-OEt(由吉尔生化(上海)有限公司合成))或者L-脯氨酸为底物，以50mM/L Tris HCL(pH＝7.8),1mg/ml BSA,100u/ml H₂O₂酶，0.1mM/L DTT，0.1mM/L Fe²⁺,0.5mM/Lα-酮戊二酸，2mM/L抗坏血酸为反应液，总反应体系是1.01ml，先将反应液与rhP4H，静置2-3min，再加入底物；30℃培养箱孵育过夜，然后沸水浴煮1min,进行HPLC-MS检测。

rhP4H的酵母细胞体内活性测定

将从实施例4获得的含有P4Hα2和PDI的重组质粒的表达菌GS115在YPM培养基中诱导表达，同时用含有空质粒的表达菌GS115做空白对照，YPM培养基中同时含有Dαnsyl-Gly-Phe-Pro-Gly-OEt四肽底物或L-脯氨酸，其次含有抗坏血酸，α-酮戊二酸，硫酸亚铁溶液。诱导72h后收集上清，进行MS检测。

以上细胞体外和细胞体内测定的结果如图6所示。

以上实验结果证明：无论是在酵母体系内还是分离提纯后，rhP4H均能对催化Dαnsyl-Gly-Phe-Pro-Gly-OEt肽段中的脯氨酸反应得到羟基化脯氨酸，但对游离的L-脯氨酸无论是在酵母体系内还是分离提纯后均不具有催化作用，表明本发明得到的rhP4H与天然的人源脯氨酰羟化酶活性保持一致，能特异性催化人源胶原蛋白结构单元-Gly-X-Y-中脯氨酸的羟基化形成羟脯氨酸。

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。

Claims

2.根据权利要求1所述的方法，其中用于表达P4Hα2和PDI的质粒各自独立地选自pPICZαA、pHIL、pPIC9k、和/或pPICZαB，优选pPICZαA或pHIL，更优选用于表达P4Hα2的质粒为pPICZαA，和用于表达PDI的质粒为pHIL，最优选所构建的重组质粒为pPICZαA-P4Hα2和pHIL-PDI。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述毕赤酵母菌株选自：GS115、X33和KM71，优选GS115。

4.根据权利要求1所述的方法，其中用于诱导培养的培养基选自：MM、BMM、BMGY、BMMY、YPD和YPM，优选YPM。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中P4Hα2的表达量等于和/或高于PDI的表达量。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗生素抗性筛选为博来霉素(zeocin)抗性筛选，优选筛选浓度为0.05至10mg/ml，更优选为0.1、0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.0、4.5、或5.0mg/ml，最优选为1.5mg/ml。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述诱导培养为甲醇诱导培养，优选以培养物的总重量计甲醇诱导浓度为0.1重量％至5.0重量％，更优选0.5重量％、1.0重量％、1.5重量％、2.0重量％，最优选1.0重量％。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括离心收集上清的步骤，和/或将收集的上清采用硫酸铵沉淀和/或脱盐的方法进行纯化以获得纯度大于80％(例如85％，90％和95％)的rhP4H的步骤。

9.通过根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得的rhP4H。

10.根据权利要求9所述的rhP4H在特异性催化人源胶原蛋白中脯氨酸的羟基化以形成羟脯氨酸中的应用。