CN114404667A - 一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用，长效型重组人源胶原蛋白植入物是由未交联或交联耐酶解型重组人源胶原蛋白和生理盐溶液所组成，还可依需求加入止痛剂。将野生型重组人源胶原蛋白的基质金属蛋白酶辨识部位特定氨基酸经过适当突变后，会使其对基质金属蛋白酶产生抗性，从而提高植入体内后的维持时间，即为耐酶解重组人源胶原蛋白；耐酶解型重组人源胶原蛋白依需求经适当交联后，以生理盐溶液调整成所需浓度，依需求加入止痛剂即制得长效型重组人源胶原蛋白植入物。长效型重组人源胶原蛋白植入物可直接制成微针注射用产品、美容注射用产品等，或混合其他物质制成不同植入产品。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种长效型重组人源胶原蛋白植入剂及其应用。
背景技术
胶原蛋白家族(collagen family)是人体中主要的蛋白质分子之一，约占蛋白质总量的1/3，是细胞外基质(extracellular matrix)的主要组成分之一，赋予不同组织的机械强度、结构与形状等结构特性。胶原蛋白家族包含28型胶原蛋白分子，以罗马数字作为命名，包含第Ⅰ型到第ⅩⅩⅧ型；每型胶原蛋白分子的基本单元是由三条α链(αchain)所组成，同一型胶原蛋白的不同α链以阿拉伯数字作为命名，并冠以罗马数字作备注是哪一型胶原蛋白的α链，例如第Ⅰ型胶原蛋白的α链有α1(I)和α2(I)二种；胶原蛋白α链为α螺旋构型的多肽链(polypeptide chain)，每个α多肽链都含有一定比例G-X-Y重复序列的区域，其中G是甘氨酸、X和Y可以是任何氨基酸(X常为脯氨酸、Y常为羟脯氨酸)，G-X-Y重复序列构成胶原蛋白家族独特的三螺旋结构域 (triple-helical domain)基础。三螺旋结构域长度依胶原蛋白种类不同而有所差异，例如第Ⅰ型胶原蛋白中三螺旋结构域的比例占96％，而第Ⅻ型胶原蛋白中三螺旋结构域比例则低于10％。
胶原蛋白家族依超分子组装体形式可次分为纤维(fibrils)、珠状丝 (beadedfilaments),锚定纤维(anchoring fibrils)和网络状(networks) 四型，人体中以纤维型胶原蛋白含量最多，如第Ⅰ型、第Ⅱ型和第Ⅲ型胶原蛋白；第I型胶原蛋白存在同型三聚体[α1(I)]3或异型三聚体{[α1(I)]2,α2(I)1} 二种形式，主要分布于皮肤、骨骼和结缔组织中，第I型胶原蛋白含量很高，占人体胶原蛋白的90％左右；第Ⅱ型胶原蛋白以同型三聚体[α1(Ⅱ)]3存在，主要分布于是软骨、椎间盘髓核和玻璃体；第Ⅲ型胶原蛋白以同型三聚体[α1(Ⅲ)]3存在，主要分布于皮肤、子宮、大血管、腸道中。
由于年纪增长、损伤或特定疾病原因，造成组织内胶原蛋白含量下降，继而产生皮肤皱纹、组织修复困难等问题；因而，植入外源性胶原蛋白(exogenous collagen)是临床上作为填补皱纹、促进组织修复的常用医疗策略之一。常用外源性胶原蛋白植入物的来源提取自牛皮、猪皮、马皮、牛肌腱等哺乳动物组织，这些动物组织来源的胶原蛋白可能存在人-动物共通疾病传染隐患，同时也可能在植入人体后引起异种蛋白的排异反应，从而限制了胶原蛋白植入剂的广泛应用。为解决动物源胶原蛋白植入物的问题，开始有少数重组人源胶原蛋白 (recombinant human collagen)植入剂产品问市，以克服动物源胶原蛋白病原传播和排异反应的问题。然而，即使经过适当的交联(crosslinking)处理，不管是动物源或是重组人源胶原蛋白植入物，一旦植入体内后植入物维持的时间多只介于6～9个月，其临床应用价值受到一定限制。
完整三螺旋结构的胶原蛋白对许多蛋白酶(proteinases)具有一定的抗性(resistance)，只有在胶原蛋白失去完整三螺旋结构后，才会被其它蛋白酶分解成小分子胶原肽或胺基酸。目前已知基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，简称MMP)具有裂解完整三螺旋结构胶原蛋白的能力，MMPs 是一类锌离子依赖性的肽链内切酶(zinc-dependent endopeptidases)，可分解多种细胞外基质的蛋白质组成，在组织重塑(tissueremodeling)和许多生理病理过程中扮演重要角色。在已知的MMPs中，MMP-1、MMP-8、MMP-13和MMP-14 可以裂解第Ⅰ型、第Ⅱ型和第Ⅲ型胶原蛋白的完整三股螺旋结构，裂解后的胶原蛋白容易被其它MMPs或蛋白酶进一步分解，见图1左。
已知MMP对受质特异性(substrate specificity)主要取决于受质的酶切位点(cleavage site)二侧氨基酸序列(以下简称为MMP辨识部位)，酶切位点氨基端序列由近而远依序为P1、P2、P3、P4....，酶切位点羧基端序列由近而远依序为P1'、P2'、P3'、P4'....；表1为人类Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白的α链分子中MMP的酶切位点前后20个氨基酸序列，包含P10～P1及P1’～P10’部位，比对结果显示人类α1(Ⅰ)链、α2(Ⅰ)链、α1(Ⅱ)链或α1(Ⅲ)链分子的MMP酶切位点具有高度保守性，因此，破坏胶原蛋白α链分子上的MMP辨识部位，将可降低MMP对胶原蛋白分子的结合与裂解，进而减缓胶原蛋白在体内的代谢，见图1右。
表1：人类Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白的α链分子中MMP的酶切位点前后20个氨基酸序列
发明人在实际使用过程中发现，现有动物源或重组人源胶原蛋白植入剂至少存在以下共同问题：在人体内易被分解、半衰期短、需要频繁补充以维持植入效能等问题，因而造成胶原蛋白植入剂使用成本居高不下，不利这类产品的市场推广与广泛使用。发明内容
针对现有胶原蛋白植入剂制品中存在易被分解、半衰期短、使用频次高、使用成本高等问题，本发明提出了一种长效型重组人源胶原蛋白，其目的为：开发不易被酶解的重组人源胶原蛋白植入剂，减少更换或使用频次，藉以降低胶原蛋白植入剂制品使用成本，以利其市场推广与普及化使用。长效型重组人源胶原蛋白能够更好的抵抗体内的酶解作用，有较长的作用时间，能更好的发挥其应有的组织填补、修复功能。
为实现上述目的本发明所采用的方案是：提供一种长效型重组人源胶原蛋白植入物，该植入物由未交联或交联耐酶解型重组人源胶原蛋白和生理盐溶液所组成；耐酶解型重组人源胶原蛋白介于0.1％～10％(w/v)其余为生理盐溶液。
进一步的优选技术方案为：所述长效型重组人源胶原蛋白植入物还包括浓度介于0.3％～1％的止痛剂。
进一步的优选技术方案为：所述重组人源胶原蛋白是指包含I型胶原蛋白 {[α1(I)]2,[α2(I)]1}、Ⅰ型胶原蛋白[α1(I)]3、Ⅱ型胶原蛋白[α1(Ⅱ)]3、Ⅲ型胶原蛋白[α1(Ⅲ)]3的一种或多种，首选为I型胶原蛋白{[α1(I)]2, [α2(I)1}、Ⅲ型胶原蛋白[α1(Ⅲ)]3；
进一步的优选技术方案为：所述耐酶解型人源胶原蛋白是将重组人源胶原蛋白α链中的MMP酶辨识部位进行点突变(point mutation)，主要突变位点包含MMP酶辨识部位中P2、P1’、P2’、P7’、P8’、P10’的一个或多个，相对应氨基酸序列见表2，突变氨基酸位点以粗体标示；
表2：野生型(wt)与耐酶解型(dr)人类Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白的α链分子中 MMP的酶切位点前后20个氨基酸序列
点突变后可将野生型胶原蛋白改变为耐酶解型胶原蛋白，使其对MMP产生抗性；点突变可以透过使用野生型(wild-type)胶原蛋白互补脱氧核糖核酸 (complementary DNA,簡稱cDNA)模板、点突变引物(site-directed mutagenesis primer)及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) 方法来达成，再将耐酶解胶原蛋白互补脱氧核糖核酸克隆至适当表现载体 (expression vector)后，可于适当的宿主中表现出耐酶解重组人源胶原蛋白，经纯化可提取出耐酶解重组人源胶原蛋白；
进一步的优选技术方案为：所述交联耐酶解重组人源胶原蛋白使用包含但不限于物理交联法、化学交联法、酵素交联法，物理交联法，如紫外光照射 (ultravioletirradiation)、光氧化法(photo-oxidation)、微波法 (microwave)；化学交联法，如醛类(aldehydes)、亚胺类(imides)、环氧化物类(epoxides)、叠氮化物类(azides)、京尼平(genipin)交联剂；酵素交联法，如谷氨酰胺转胺酶(transglutaminase)、转肽酶A(sortaseA)等；首选为化学交联法，如醛类、亚胺类、环氧化物等化学交联剂；
进一步的优选技术方案为：所述生理盐溶液包含但不限于磷酸盐缓冲液、生理盐水、任氏溶液、乐氏溶液或台氏溶液，首选为磷酸盐缓冲液，酸碱度为 6.5～7.5；
进一步的优选技术方案为：所述止痛剂包含但不限于利多卡因及其衍生物、普鲁卡因及其衍生物、布比卡因及其衍生物、罗哌卡因及其衍生物等的一种或多种，首选为利多卡因及其衍生物；
进一步的优选技术方案为：上述一种长效型重组人源胶原蛋白植入物在制作医疗产品中的应用，包括但不限于微针注射用产品、美容注射用产品、软组织修复植入产品、药物释放载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品、3D打印用生物墨水或医药品；
或混合其他物质制成长效型重组人源胶原蛋白衍生物加以应用，其他物质包含但不限于未交联透明质酸钠、多核苷酸、多脱氧核糖核苷酸、重组人类弹性蛋白、重组人类纤维粘连蛋白、聚乙二醇-聚乳酸共聚物、交联透明质酸钠、交联重组人类弹性蛋白、重组人源上皮生长因子、重组人源酸性成纤维细胞生长因子、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血管内皮细胞生长因子、重组人源类胰岛素生长因子、自体富血小板血浆、纤维蛋白凝胶、干细胞外泌体、聚乙二醇-聚乳酸共聚物微粒、羟基磷灰石微粒、聚左旋乳酸微粒、聚己内酯微粒、聚甲基丙烯酸甲酯微粒等；
或将长效型重组人源胶原蛋白植入物及其衍生物再加工成不同形式产品进行应用，再加工方法包含但不限于干燥成粉(powder)、干燥造粒(particle)、干燥制锭(table)、干燥成膜(film)、冷冻干燥成海绵(sponge)、纺制成丝线(thread)。
相比现有技术，本发明的技术方案具有如下优点/有益效果：
1.与使用动物源胶原蛋白植入剂比较，本专利使用的长效型重组人源胶原蛋白植入剂可以避免人-动物共通病原传播风险和动物源胶原蛋白排异反应。
2.与使用动物源胶原蛋白植入剂和一般重组人源胶原蛋白植入剂比较，本专利使用的长效型重组人源胶原蛋白植入剂可以抵抗植入部位周围环境中胶原酶的攻击，进而减低其分解速率并延长作用时间，可以减少使用频次，降低胶原蛋植入剂的使用成本，有助于市场推广与普及化使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中胶原蛋白分子的酶解。
图2是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中野生型重组人源第Ⅲ型胶原蛋白α链表现载体克隆策略。
图3是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解型重组人源第Ⅲ型胶原蛋白α链表现载体克隆策略。
图4是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试1结果示意图。
图5是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试2结果示意图。
图6是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试3结果示意图。
图7是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试4结果示意图。
图8是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试5结果示意图。
图9是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试6结果示意图。
图10是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试7结果示意图。
图11是本发明中耐酶解能力测试8结果示意图。
图12是本发明中耐酶解能力测试9结果示意图。
图13是本发明一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用中耐酶解能力测试10结果示意图。
具体实施方式
为使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1：野生型和耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白制备方法
1.提取mRNA
(1)将人类纤维母细胞培养于含10％胎牛血清DMEM培养基中；
(2)细胞长满后，去除培养基后直接加入Trizol，放置室温5分钟，使其充分裂解消化；
(3)将裂解液移到微量离心管，以12,000rpm转速离心5分钟；
(4)将上清液移到新的微量离心管，依每毫升Trizol加入200微升苯酚- 氯仿，振荡混匀后放置于室温15min；
(5)于4℃，以12,000rpm转速离心15分钟；
(6)将上层水相移到新的微量离心管；依每毫升Trizol加入0.5ml异丙醇，振荡混匀后放置于室温5-10min；
(7)于4℃以12,000rpm转速离心，弃上清液，RNA沉于管底；
(8)按每毫升Trizol加入1ml 75％乙醇，清洗RNA沉淀物；
(9)于4℃下以8,000g转速离心5分钟，尽量去除上清液，于室温晾干5-10 分；
(10)以用DEPC处理过的纯化水溶解RNA样品，置于55-60℃环境下5-10 分钟，以加速溶解，并以OD260吸光值定量；
2.制备互补脱氧核醣核酸(complementary DNA，以下简称cDNA)文库(cDNAlibrary)
(1)在无核糖核酸酶(RNase)的PCR反应管中加入下列试剂：oligo-dT引物、mRNA、水；
(2)将上述溶液混合均匀，置于70℃5分钟，随后置于4℃；
(3)在PCR管中加入下列试剂：M-MLV Reverse Transcriptase、dNTPs、 MgCl2、M-MLV RT缓冲液；
(4)将上述反应溶液混匀，以下列反应条件进行反转录作用：25℃保温10 分钟；42℃保温60分钟；70℃保温15分钟；随后置于4℃；
(5)以分光光度计检测cDNA浓度。
3.野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白表现载体pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)的制备于美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)查询人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的核苷酸序列，其ID： CCDS2297.1，使用聚合酶链反应(Polymerase chainreaction，简称PCR) 以上述cDNA文库为模板，扩增出野生型人源Ⅲ型α1胶原蛋白(Wild-type human collagen,简称wt)cDNA；由于hCOL-Ⅲα1cDNA全长达4402碱基对 (base pair,简称bp)，故使用二段式扩增再连结的克隆策略，见图2，先分別扩增出hCOL-Ⅲα1(wt)N、hCOL-Ⅲα1(wt)C二段cDNA，再分別以EcoRI 和SphI及SphI和XhoI进行酶切，再将二者连接至pPICZB表现载体的EcoRI –XbaI部位内，制得hCOL-Ⅲα1表现载体pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)，见图2；由于CR引物上不含有终止码(stop codon)，因而此载体表现的野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白C端具有myc抗原决定基(epitope)和6xHis标志物 (tag)，以利于重组蛋白的纯化与分析，其氨基酸序列如下，灰底标示处为 MMP辨识部位(P10～P10’)，C端双底线标示处为myc抗原决定基，单底线标示处为6xHis标志物序列。
野生型重组人源第Ⅲ型胶原蛋白a链胺基酸序列：
(1)hCOL-Ⅲα1(wt)N扩增所用引物序列为：
正向引物NF 5’-GAATTC ATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGGAG-3’(底标为EcoR Ⅰ位点)
反向引物NR 5’-TCCAGGTGCACCGGCATCACC-3’(底标为ApaLI位点)
(2)hCOL-Ⅲα1(wt)N PCR扩增反应条件：
扩增循环：
扩增循环数：33次
(3)hCOL-Ⅲα1(wt)C PCR扩增所用引物序列为：
正向引物CF 5’-ATGCCGGTGCACCTGGAGCTC-3’(底标为ApaLI位点)
反向引物CR 5’-tctagaAAAAAGCAAACAGGGCCAACGTCCAC-3’(底標为XbaI 位点)
(4)hCOL-Ⅲα1(wt)C PCR扩增反应条件：
扩增循环：
扩增循环数：33次
(5)先以琼脂糖电泳确认hCOL-Ⅲα1N和hCOL-Ⅲα1C扩增片段大小的正确性，再将hCOL-Ⅲα1(I949P)N、hCOL-Ⅲα1(I949P)C和pPICZB分别以 EcoRI+ApaI、ApaI+XbaI和EcoRI+XbaI进行酶切，纯化后进行三段式DNA 连接反应，可得表现载体pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)；
(6)pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)表现载体可用5′AOX1引物做hCOL-Ⅲα1(wt) cDNA的定序，5′AOX1引物序列为：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，定序结果如下：
其中粗体标示部分为NF和NR引物位置，底线标示为CF和CR引物位置；
4.耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白表现载体pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)制备
以pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)为PCR模板，设计I949P点突变引物时加入一ApaI 内切酶位点(GGGCCC)，以便与野生型作区别，使用扩增再置换连结的克隆策略，先PCR扩增出hCOL-Ⅲα1(I949P)I cDNA，hCOL-Ⅲα1(I949P)I cDNA 和pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)载体再分別以SphI进行酶切，將pPICZB-hCOL- Ⅲα1(wt)中SphI片段置换为hCOL-Ⅲα1(I949P)I，制得耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白表现载体pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)，见图3；由于hCOL-Ⅲα1(I949P)不含有终止码(stop codon)，因而此载体表现的耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白C端具有myc抗原决定基和6xHis标志物，以利于重组蛋白的纯化与分析，其氨基酸序列如下：
灰底标示处为MMP辨识部位(P10～P10’)，其中粗体P为突变位点，C端双底线标示处为myc抗原决定基，单底线标示处为6xHis标志物序列。
(1)hCOL-Ⅲα1(I949P)I扩增所用引物序列为：
正向引物I949PIF 5’-GCATGCCCGGAAGTCCAGGAGGACC-3’(底标为SphI位点) 反向引物I949PIR
(底標为 SphI和ApaI位点)
(2)hCOL-Ⅲα1(I949P)I PCR扩增反应条件：
扩增循环：
扩增循环数：30次
(3)先以琼脂糖电泳分析确认hCOL-Ⅲα1(I949P)I扩增片段大小是否正确，再将hCOL-Ⅲα1(I949P)I和pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)分别以SphI进行酶切，电泳分离并纯化后进行二段式DNA连接反应，可得耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白表现载体pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)
(6)pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)表现载体可用5′AOX1引物做hCOL-Ⅲα1(I949P)cDNA的定序，定序结果见如下：
其中粗体部分为I949PIF和I949PIR引物位置，双底标线为ApaI位点，单底标线为SphI位点；
5.脯氨酰4-羟化酶表现载体pPICZB-vP4H制备
小球藻病毒1(Paramecium bursaria Chlorella virus 1)具有一种脯氨酰 4-羟化酶(viral Prolyl 4-hydroxylase，简称vP4H)，已知可以对胶原蛋白上的脯氨酸进行羟化作用，将vP4H与重组人源Ⅲ型胶原蛋白共同表现时将有助于重组人源Ⅲ型胶原蛋白的脯氨酸羟化作用及结构稳定性。先以PCR 自受感染的小球藻DNA样品中扩增出vP4H cDNA，再以EcoRI和XbaI进行酶切，再连接至pPICZB表现载体的EcoRI–XbaI部位内，即可制得表现载体脯氨酰4-羟化酶表现载体pPICZB-vP4H，由于vP4HR引物包含有终止码 (stop codon)，因而此载体只会表现脯氨酰4-羟化酶，没有myc抗原决定基和6xHis标志物，不会干扰重组人源胶原蛋白的纯化与分析，其氨基酸序列如下：
(1)vP4H扩增所用引物序列为：
正向引物vP4HF 5’-GAATTCATGACAAATAAATTTATTTCGTACAATAAAATGG-3’(底标为EcoRⅠ酶切位点)
反向引物vP4HR 5’-TCTAGATCATTTAACAGCACGGATCCATTG-3’(底标为XbaI 酶切位点)
(2)vP4H PCR扩增反应条件：
扩增循环数：30次
(3)先以琼脂糖电泳分析确认vP4H扩增片段大小是否正确，再将vP4H和 pPICZB分别以EcoRI++XbaI进行酶切，纯化后进行DNA连接反应，可得脯氨酰4-羟化酶表现载体pPICZ-vP4H
(4)pPICZ-vP4H表现载体可用5′AOX1引物做vP4H cDNA的定序，定序结果如下：
6.重组人源Ⅲ型胶原蛋白的制备
(1)利用Polyethylene glycol(PEG)1000转化法分别将pPICZB-hCOL-Ⅲ
α1(wt)或pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)与pPICZ-vP4H共转化入毕氏酵母细胞(Pichiapastoris)，详细方法可参考赛默飞世尔科技公司所出版的Pichia ExpressionKit手冊，所需试剂如下：
缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH 8.35,3％(v/v)ethylene glycol
缓冲液B：40％(w/v)PEG-1000，0.2M Bicine，pH 8.35
缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH 8.35
-70℃保存的新鲜、试剂级DMSO
(2)将约40μg pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)或pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)与10 μgpPICZ-vP4H溶解于20μL TE buffer中，直接加于冻结的毕氏酵母细胞中；加入载体DNA(40μg超声波碎段的变性鲑鱼精DNA)以获得最大转化率；将混合物置于37℃水浴孵育5分钟，期间再混合1～2次；加入1.5mL 缓冲液B，彻底混匀，置于30℃水浴孵育1小时；室温下2000g离心10 分钟，去除上清液，菌体沉淀以1.5mL缓冲液C混勻；离心样品，去除上清液，再将菌体溶于0.2mL缓冲液C中；将所有转化液平铺于含Zeocin 的选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定并挑选出具有表现载体的转化子；
(3)先将具有pPICZB-hCOL-Ⅲα1(wt)或pPICZB-hCOL-Ⅲα1(I949P)的转化子培养于BMGY(Buffered Glycerol-Complex Medium,pH 6.0)中；之后再将培养基更换为BMM培养基(Buffered Minimal Methanol Medium,pH 6.0) 以诱导重组人源胶原蛋白的表达，每24小时加入适量的甲醇，使甲醇最终浓度为0.5％(v/v)，氨基酸依需求添加至50mg/L，每12小时加入L-抗坏血酸钠盐至80mg/mL；
(4)将上述转化子裂解于含有10mM imidazole的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)，将裂解液以10,000g转速离心30分钟，然后将上清液与
混合24小时，以含20mM imidazole缓冲液清洗数次后，以含45mM imidazole缓冲液进行冲提可得到纯化重组人源胶原蛋白，最后以蛋白质电泳分析鉴定人源胶原重组蛋白分子量并以100mM醋酸溶液进行透析、冷冻干燥后低温保存备用；
实施例2：耐酶解能力测试1
(1)将野生型重组人源Ⅰ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅰ型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得胶原蛋白凝胶；
(2)以生理缓冲盐溶液将胶原蛋白凝胶浓度调至3.5％(w/v)；
(3)加入含胶原酶(重组人源MMP-1，R&D Systems)的反应溶液到胶原蛋白凝胶中，于37℃培养12小时，以不胶原酶的反应溶液当自发性溶解的空白对照组；
(4)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(5)以野生型重组人源Ⅰ型胶原蛋白凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较长效型型重组人源Ⅰ型胶原蛋白凝胶对胶原酶的抗性；
(6)由图4可见与野生型重组人源Ⅰ型胶原蛋白凝胶(图4-1)进行比较时，长效型重组人源Ⅰ型胶原蛋白凝胶(图4-2)对胶原酶产生明显的抗性。
实施例3：耐酶解能力测试2
(1)将野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得胶原蛋白凝胶；
(2)以含利多卡因0.3％(w/v)的生理缓冲盐溶液将胶原蛋白凝胶浓度调至 3.5％(w/v)；
(3)加入含重组人源胶原酶的反应溶液到胶原蛋白凝胶中，于30℃培养12 小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；
(4)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(5)以野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较长效型型重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶对胶原酶的抗性；
(6)由图5可见与野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶(图5-1)进行比较时，长效型重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶(图5-2)对胶原酶产生明显的抗性。
实施例4：耐酶解能力测试3
(1)将市售重组人源Ⅲ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得胶原蛋白凝胶；
(2)以生理缓冲盐溶液将胶原蛋白凝胶浓度调至3.5％(w/v)；
(3)加入含胶原酶的反应溶液到胶原蛋白凝胶中，于30℃培养12小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；
(4)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(5)以市售重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较长效型型重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶对胶原酶的抗性；
(6)由图6可见与市售重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶(图6-1)进行比较时，耐酶解重组人源Ⅲ型胶原蛋白凝胶(图6-2)对胶原酶产生明显的抗性。
实施例5：耐酶解能力测试4
(1)将野生型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅰ与Ⅲ型型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得混合胶原蛋白凝胶；
(2)以生理缓冲盐溶液将胶原蛋白凝胶浓度调至3.5％(w/v)；
(3)加入含胶原酶的反应溶液到胶原蛋白凝胶中，于30℃培养12小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；
(4)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(5)以野生型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较长效型型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白凝胶对胶原酶的抗性；
(6)由图7可见与野生型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白混合凝胶(图7-1)进行比较时，耐酶解重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白混合凝胶(图7-2)对胶原酶产生明显的抗性。
实施例6：耐酶解能力测试5
(1)将野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得胶原蛋白凝胶；
(2)将胶原蛋白复合凝胶浸泡于0.5％(w/v)戊二醛溶液内，于50℃交联1 小时；
(3)以清水反复清洗交联胶原蛋白复合凝胶数次后，以生理缓冲盐溶液将交联胶原蛋白凝胶浓度调至3.5％(w/v)；
(4)加入含重组人源胶原酶的反应溶液到交联胶原蛋白凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；
(5)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(6)以野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为 100％酶解，比较耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶对胶原酶的抗性；
(7)由图8可见与野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶(图8-1)进行比较时，耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶(图8-2)对胶原酶产生明显的抗性。
实施例7：耐酶解能力测试6
(1)将野生型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得胶原蛋白凝胶；
(2)将胶原蛋白复合凝胶浸泡于0.5％(w/v)戊二醛溶液内，于50℃交联1 小时；
(3)以清水反复清洗交联胶原蛋白复合凝胶数次后，以生理缓冲盐溶液将交联胶原蛋白凝胶浓度调至3.5％(w/v)；
(4)加入含胶原酶的反应溶液到交联胶原蛋白凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；
(5)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(6)以野生型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较耐酶解型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶对胶原酶的抗性；
(7)由图9可见与野生型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶(图9-1)进行比较时，耐酶解型重组人源Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶(图9-2)对胶原酶产生明显的抗性。
实施例8：耐酶解能力测试7
(1)将野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白或耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于10mM氢氯酸，以1M NaOH调节酸碱度至pH 7.0，混合均匀得胶原蛋白凝胶；
(2)将胶原蛋白复合凝胶浸泡于0.5％(w/v)戊二醛溶液内，于50℃交联1 小时；
(3)以清水反复清洗交联胶原蛋白交联凝胶数次后，以生理缓冲盐溶液将交联胶原蛋白凝胶浓度调至3.5％(w/v)并含0.3％(w/v)利多卡因；
(4)加入胶原酶的反应溶液到交联胶原蛋白凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；
(5)取各组反应上清液，以呈色法羟脯氨酸检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量-不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量＝酶解产生的羟脯氨酸含量；
(6)以野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶降解产生的羟脯氨酸含量为 100％酶解，比较耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶对胶原酶的抗性；
(7)由图10可见与含利多卡因的野生型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶(图 10-1)进行比较时，含利多卡因的耐酶解型重组人源Ⅲ型胶原蛋白交联凝胶 (图10-2)对胶原酶产生明显的抗性。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种长效型重组人源胶原蛋白植入物，其特征在于：所述长效型重组人源胶原蛋白植入物包括耐酶解重组人源胶原蛋白和生理盐溶液，所述耐酶解型重组人源胶原蛋白浓度介于0.1％～10％。
2.根据权利要求1所述的长效型重组人源胶原蛋白植入物，其特征在于：所述长效型重组人源胶原蛋白植入物还包括浓度介于0.3％～1％的止痛剂。
3.根据权利要求2所述的长效型重组人源胶原蛋白植入物，其特征在于：所述止痛剂包括利多卡因及其衍生物、普鲁卡因及其衍生物、布比卡因及其衍生物、罗哌卡因及其衍生物等的一种或多种，首选为利多卡因及其衍生物。
4.根据权利要求1或2所述的长效型重组人源胶原蛋白植入物，其特征在于：所述耐酶解型人源胶原蛋白是将重组人源胶原蛋白的α链中的基质金属蛋白酶辨识部位中P2、P1’、P2’、P7’、P8’、P10’的一个或多个位置进行点突变，使其能对基质金属蛋白酶产生抗性，首选为P1’点突变。
5.根据权利要求4所述的长效型重组人源胶原蛋白植入物，其特征在于：所述重组人源胶原蛋白选自交联或未交联人源胶原蛋白，所述交联或未交联人源胶原蛋白包括以下的一种或多种：I型胶原蛋白{[α1(I)]2,α2(I)1}、Ⅰ型胶原蛋白[α1(I)]3、Ⅱ型胶原蛋白[α1(Ⅱ)]3、Ⅲ型胶原蛋白[α1(Ⅲ)]3，首选为I型胶原蛋白{[α1(I)]2,α2(I)1}、Ⅲ型胶原蛋白[α1(Ⅲ)]3。
6.根据权利要求5所述的长效型重组人源胶原蛋白植入物，其特征在于：所述交联人源胶原蛋白的交联方法包括物理交联法、化学交联法、生物交联法，首选为化学交联法，如醛类、亚胺类、环氧化物等化学交联剂。
7.根据权利要求3所述的长效型重组人源胶原蛋白，其特征在于：所述生理盐溶液包括磷酸盐缓冲液、生理盐水、任氏溶液、乐氏溶液或台氏溶液，首选为磷酸盐缓冲液，酸碱度为6.5～7.5。
8.一种长效型重组人源胶原蛋白植入物在医疗产品中的应用，包含但不限于微针注射用产品、美容注射用产品、软组织修复植入产品、药物释放载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品、3D打印用生物墨水或医药品；
或混合其他物质制成长效型重组人源胶原蛋白衍生物加以应用，其他物质包含但不限于未交联透明质酸钠、多核苷酸、多脱氧核糖核苷酸、胶原胜肽、重组人类弹性蛋白、重组人类纤维粘连蛋白、交联透明质酸钠、交联重组人类弹性蛋白、交联重组人类纤维粘连蛋白、重组人源上皮生长因子、重组人源酸性成纤维细胞生长因子、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血管内皮细胞生长因子、重组人源类胰岛素生长因子、自体富血小板血浆、纤维蛋白凝胶、干细胞外泌体、聚乙二醇-聚乳酸共聚物、羟基磷灰石微粒、聚左旋乳酸微粒、聚己内酯微粒、聚甲基丙烯酸甲酯微粒等；
或将长效型重组人源胶原蛋白植入物及其衍生物再加工成不同形式产品进行应用，再加工方法包含但不限于干燥成粉、干燥造粒、干燥制锭、干燥成膜、冷冻干燥成海绵、纺制成丝线。
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