CN114288389A - 一种抗酶解胶原蛋白复合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗酶解胶原蛋白复合物及其应用，所述抗酶解胶原蛋白复合物由携带一种或多种胶原酶抑制剂的高分子微球及胶原蛋白组成，所述高分子微球及胶原蛋白的质量比为1:20～20:1，抗酶解胶原蛋白复合物可依需求进行交联。本发明通过高分子微球携带并缓释胶原酶抑制剂，从而减低局部环境中胶原酶活性，进而降低胶原蛋白制品在组织中分解速率并延长其作用时间，可以减少胶原蛋白制品更换使用频次，降低胶原蛋白制品使用成本。

Description

一种抗酶解胶原蛋白复合物及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种抗酶解胶原蛋白复合物及其应用，此复合物是由携带一种或多种胶 原酶抑制剂的高分子微球及胶原蛋白所组成，胶原酶抑制剂可延长胶原蛋白在人体存在时间， 达成长效功能，具有高度医疗应用价值。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是人体中主要的蛋白质分子之一，约占人体蛋白质总量的1/3；胶 原蛋白也是细胞外基质的主要组成分，赋予不同组织的机械强度、结构与形状等结构特性。 在目前已发现的28型胶原蛋白中，以第Ⅰ型胶原蛋白含量最高，其次是第Ⅲ型和第Ⅱ型胶原 蛋白。以第Ⅰ型胶原蛋白为例，其基本单元为原胶原(tropocollagen)分子(见附图2)，每个 原胶原分子由三条α-链(αchains)构成，α-链为α螺旋构型的多肽分子，三条α-链以平行、右 旋形式相互缠绕形成原胶原分子的三股螺旋结构，原胶原蛋白分子间会以氨基端和羧基端的 端肽部位形成分子间键结交联(intermolecular crosslinking)，构成胶原蛋白纤维(collagen fibril)，胶原蛋白纤维是细胞间质中关键的结构性支撑基础(见附图1)。由于年纪增长、损 伤或特定疾病原因，会导致组织内胶原蛋白含量降低，继而产生皮肤皱纹、伤口不易愈合等 问题；因而，补充外源性胶原蛋白是临床上常用作为填补皱纹、促进伤口愈合或组织修复的 医疗策略之一。

与人类组织相似，胶原蛋白也是动物组织中含量最高的蛋白质组成，外源性胶原蛋白常 提取自牛、马、猪、禽类甚至是鱼类的皮肤、肌腱、骨骼或是鳞片。胶原蛋白是目前常见的 天然生医材料，其材料特性包括高度组织兼容性、可降解性、可修饰性、取得容易等优点， 因而，动物源胶原蛋白常运用于制备不同医疗制品，包括敷料产品、美容注射产品、软组织 缺损修复产品、药物载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品等。

动物源胶原蛋白生医材料的缺点是，为增加提取效率并降低不同物种来源胶原蛋白的免 疫原性(immunogenicity)，常会将免疫原性较高的氨基端和羧基端肽(N-and C-terminal telopeptides)去除，形成去端肽胶原蛋白(atelocollagen)(见附图3)；去端肽结果造成 胶原蛋白纤维分子间键结的瓦解，大幅破坏其纤维结构与机械强度，也会增加在体内的分解 速率。一般多以物理性、化学性或生物性交联工艺进行去端肽胶原蛋白改质，以期增强其机 械强度并降低体内分解速率。一般交联后的去端肽胶原蛋白在植入体内后维持时间最长介于 6～9个月，临床使用上只能靠增加使用频次来维持效果，因此，若能延长胶原蛋白在体内的 维持时间，将有助于减少使用频次，降低使用成本，使胶原蛋白生医材料有机会更广泛使用。

关于体内胶原蛋白的分解，目前已知与以下胶原酶有关，包含基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，以下简称MMP)1～23、弹力蛋白酶(elastase)、胰蛋白酶2(trypsin 2)、组织蛋白酶(cathepsins)K、B、L和S等，其中，MMP是负责裂解原胶原蛋白三股螺 旋构形的主要蛋白酶(protease)，经MMP裂解后的原胶原蛋白失去完整三股螺旋构形，可被 其他胶原酶进一步分解。蛋白酶对多肽底物(substrates)的特异性(specificity)主要取决于 酶切位点(cleavage site)二侧的氨基酸序列，酶切位点氨基端序列由近而远依序为P1、P2、 P3、P4....，酶切位点羧基端序列由近而远依序为P1'、P2'、P3'、P4'....；为确定人类与动物 源胶原蛋白Ⅰ型α1链、Ⅰ型α2链、Ⅱ型α1链或Ⅲ型α1链分子中MMP酶切位点是否具有相同 的专一性，本发明分析其潜在MMP酶切位点前后20个氨基酸序列，包含P10～P1及P1’～P10’ 部位，以CLUSTAL 2.1多序列排序软件分析，酶切位点以虚线表示，“*”表示序列间氨基 酸完全相同，“:”表示序列间氨基酸具有高度相似性，“.”表示序列间氨基酸具有低 度相似性，未标示者表示序列间氨基酸不具相似性，比对结果如下：

人源与动物源第Ⅰ型胶原蛋白α1链MMP的酶切位点二侧序列比对如图4所示，由美国国 家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,以下简称NCBI) 蛋白质数据库中搜寻各物种第Ⅰ型胶原蛋白α1链序列，其检索号依序为：人P02452.5、牛 ELR60286.1、马XP_023508478.1、羊XP_027830506.1、猪BAX02568.1、鸡P02457.3、鲫鱼 BBD96224.1、虹鳟BAA33380.1，多序列排序结果显示，人源与动物源第Ⅰ型胶原蛋白α1链 MMP酶切位点氨基酸序列具有高度保守性。

人源与动物源第Ⅰ型胶原蛋白α2链MMP的酶切位点二侧序列比对如图5所示，NCBI蛋白 质数据库中各物种第Ⅰ型胶原蛋白α2链的检索号依序为：人P08123.7、牛NP_776945.1、 马NP_001310709.1、羊XP_004007775.1、猪NP_001230584.1、鸡NP_001073182.2、虹鳟 BAB79229.1，多序列排序结果显示，人源与动物源第Ⅰ型胶原蛋白α2链MMP酶切位点氨基酸 序列具有高度保守性。

人源与动物源第Ⅱ型胶原蛋白α1链MMP的酶切位点二侧序列比对如图6所示，NCBI蛋白 质数据库中各物种第Ⅱ型胶原蛋白α1链的检索号依序为：人P02458.3、牛NP_001001135.2、 马XP_014705536.1、羊XP_042102732.1、猪XP_020948270.1、鸡NP_989757.1、虹鳟 XP_035597124.1，多序列排序结果显示，人源与动物源第Ⅱ型胶原蛋白α1链MMP酶切位点氨 基酸序列具有高度保守性。

人源与动物源第Ⅲ型胶原蛋白α1链MMP的酶切位点二侧序列比对如图7所示，NCBI蛋白 质数据库中各物种第Ⅲ型胶原蛋白α1链的检索号依序为：人P02461.4、牛NP_001070299.1、 马XP_014708400.1、羊XP_004004563.1、猪NP_001230226.1、鸡NP_990711.2，多序列排 序结果显示，人源与动物源第Ⅲ型胶原蛋白α1链MMP酶切位点氨基酸序列具有高度保守性。

由图4-图7可知，人源与动物源Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型胶原蛋白α链分子的MMP酶切位点具 有高度保守性，因此MMP也会是决定不同物种外源性胶原蛋白在人体内分解速率的关键因素。 所以，通过抑制MMP等胶原酶的活性，有助于降低外源性(exogenous)和内生性(endogenous) 胶原蛋白在人体内的分解速率(见附图8，左侧表示一般胶原蛋白制品正常分解，右侧表 示本发明使用胶原酶抑制剂以减缓胶原蛋白分解)。

发明人在实际使用过程中发现，现有胶原蛋白医药制品至少存在以下问题：易被分解、 半衰期短、需要频繁更替或补充以维持产品应有效能等问题，因而造成胶原蛋白医药制品使 用成本偏高，不利于胶原蛋白医药制品的普及化使用。

发明内容

针对现有胶原蛋白医药制品中存在易被分解、半衰期短、使用频次高、使用成本高等问 题，本发明提出了一种抗酶解胶原蛋白复合物，其目的为：开发不易被酶解的胶原蛋白医药 制品，减少更换或使用频次，借以降低使用成本，以利于普及化使用。

为实现上述目的本发明所采用的方案是：一种抗酶解胶原蛋白复合物，其包含携带胶原 酶抑制剂的高分子微球及胶原蛋白

一种抗酶解胶原蛋白复合物的制备方法如下：

S1.提供一种胶原酶抑制剂与高分子混合溶液；胶原酶抑制剂用量介于0.01％～50％(w/v)， 高分子高分子用量介于0.10％～50％(w/v)；

S2.依高分子特性制作携带胶原酶抑制剂的高分子微球，微球制作方法包含但不限于乳化 法、喷雾干燥法、研磨法、溶剂挥发法等；

S3.依高分子特性需求对携带胶原酶抑制剂的高分子微球进行交联定型，如胶原蛋白或多 糖及其衍生物需要交联定型，高分子聚合物或生物陶瓷则不需要；

S4.提供一种胶原蛋白溶液；胶原蛋白用量介于0.1％～10％(w/v)；

S5.加入所述高分子微球，混合均匀得胶原蛋白复合物，所述胶原蛋白与所述高分子微球 的质量之比为1:20～20:1；

S6.依需求对胶原蛋白复合物进行交联并清洗；

S7.依需求调节最终胶原蛋白浓度、酸碱度、渗透压；胶原蛋白浓度介于0.10％～10％(w/v)、 酸碱度介于pH 6.0～pH 7.5、渗透压介于200～400mOsm；

进一步的优选技术方案为：抗酶解胶原蛋白复合物中使用微球与胶原蛋白的混合比例为 1:20～20:1(w/w)，首选为1:10～10:1(w/w)；

进一步的优选技术方案为：所述胶原酶，包含但不限于基质金属蛋白酶1～23、弹力蛋白 酶、胰蛋白酶2、组织蛋白酶K、B、L和S等；

进一步的优选技术方案为：所述胶原酶抑制剂，包含但不限于金属锌螯合剂、基质金属 蛋白酶小分子抑制剂、基质金属蛋白酶胜肽抑制剂、基质金属蛋白酶组织抑制因子、基质金 属蛋白酶中和抗体的一种或多种；

金属螯合剂，如乙二胺四乙酸及其二钠盐、双硫仑(disulfiram)、,10-菲罗啉 (1,10-Phenanthroline)等；

基质金属蛋白酶小分子抑制剂，如等；马立马司他(Marimastat)、多西环素(Doxycycline) 等；

基质金属蛋白酶胜肽抑制剂，如CTT1(氨基酸序列为CTTHWGFTLC)、CTT2(氨基酸序列为GRENYHGCTTHWGFTLC)等；

基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)， 如TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4或其衍生物N-TIMP；

基质金属蛋白酶中和抗体(anti-MMP neutralizing antibody)，如抗MMP-1中和抗体、 抗MMP-8中和抗体等；

进一步的优选技术方案为：所述高分子，包括：哺乳动物类明胶，如A型明胶、B型明胶；重组人源胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型；人类胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型；哺乳动物类去 端肽胶原蛋白，如牛源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、马源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型 或Ⅲ型、羊源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、猪源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型； 禽鸟类去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅱ型；鱼类去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅱ型；多糖及其衍生物，如 透明质酸钠及其衍生物、β-葡聚糖及其衍生物、皮肤素及其衍生物、软骨素及其衍生物、角 质素及其衍生物、肝素及其衍生物、纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、海藻酸及其衍 生物、葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物、普鲁兰多糖及其衍生物、裂褶菌多糖及其衍生 物；合成高分子聚合物，如聚乙二醇-聚乳酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚左旋乳酸、 聚苯乙烯、聚己内酯、聚甲基丙烯酸甲酯；生物陶瓷，如羟基磷灰石、双相磷酸钙；更优选 为A型明胶、猪源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、重组人源胶原蛋白Ⅰ型或Ⅲ型；

进一步的优选技术方案为：所述微球，形状无定形、平均粒径大小介于500nm～100μm； 更优选为1μm～50μm；小粒径或天然高分子微球释放速率快而时间短，适用于短效型产品，如 敷料类产品、微针注射用产品；大粒径或合成高分子微球释放速率慢而时间持久，适用于中 长效型产品，如美容注射用产品、药物载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品；

进一步的优选技术方案为：所述胶原蛋白，包括重组人源胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、 人类胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、牛源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、马源去端肽胶原 蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、羊源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、猪源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、禽类去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅱ型、鱼类去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅱ型、富含胶原蛋白的脱细胞人类皮肤组织、脱细胞猪皮组织或牛皮组织的一种或多种；未交联复合物分解 快而维持时间较短，适用于短效型产品，如敷料类产品、水光类美容注射用产品；交联复合 物的分解慢而维持时间较长，适用于中长效型产品，如皮下植入剂美容注射用产品、软组织 缺损修复用产品、药物载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品；

其进一步的优选技术方案为：胶原蛋白交联方法包括物理交联法、化学交联法、生物交 联法的一种或多种；物理交联法，如紫外光照射法、光氧化法、微波法等；化学交联法，如 醛类、亚胺类、环氧化物类、叠氮化物类、京尼平等交联剂；生物交联法，如谷氨酰胺转胺酶、转肽酶A等酵素；更优选为化学交联法，如醛类、亚胺类、环氧化物等交联剂的一种或 多种；

抗酶解胶原蛋白复合物在制作医疗产品中的应用，包括敷料类产品、水光和植入类美容 注射用产品、软组织缺损修复用产品、药物载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品；

或混合其他物质制作成衍生复合物加以应用，其他物质包含但不限于未交联透明质酸钠、 多核苷酸、多脱氧核糖核苷酸、重组人类弹性蛋白、重组人类纤维粘连蛋白、交联透明质酸 钠、交联重组人类弹性蛋白、重组人源角细胞生长因子、重组人源上皮生长因子、重组人源 酸性成纤维细胞生长因子、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血管内皮细胞生长 因子、重组人源类胰岛素生长因子、重组人源肝细胞生因子、富血小板血浆、干细胞外泌体、 同种异体细胞或组织移植物、自体细胞或组织移植物等；

或将抗酶解胶原蛋白复合物或其衍生复合物加工成不同形式产品进行应用，包含但不限 于水凝胶、冻干粉、锭剂、膜片、海绵。

相比现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：

1.携带MMP抑制剂的高分子微球可以缓释胶原酶抑制剂，从而减低局部环境中胶原酶活性， 进而降低胶原蛋白制品在组织中分解速率并延长其作用时间，可以减少胶原蛋白制品更换 使用频次，降低胶原蛋白制品使用成本；

2.MMP抑制剂的释放会调节局部环境中MMP活性，降低内源性胶原蛋白的分解速率，有助于 促进慢性伤口愈合或组织修复；

3.除了缓释MMP抑制剂外，高分子微球也能透过引发组织的异物反应，进而刺激内源性胶原 蛋白的生合成；

4.补充抗酶解外源性胶原蛋白、降低外源性及内源性胶原蛋白的酶解加上刺激内源性胶原蛋 白的生合成，本发明的技术方案可达成三合一效用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图 作简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范 围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些 附图获得其他相关的附图。

图1是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中胶原蛋白纤维构造造示意图。

图2是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中原胶原构造造示意图。

图3是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中去端肽胶原蛋白构造示意图。

图4是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中人源与动物源第Ⅰ型胶原蛋白α1 链MMP的酶切位点二侧序列比对。(由上到下依序为人、牛、马、羊、猪、鸡、鲫鱼、虹鳟的序列)

图5是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中人源与动物源第Ⅰ型胶原蛋白α2 链MMP的酶切位点二侧序列比对。(由上到下依序为人、牛、马、羊、猪、鸡、虹鳟的序列)

图6是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中人源与动物源第Ⅱ型胶原蛋白α1 链MMP的酶切位点二侧序列比对。(由上到下依序为人、牛、马、羊、猪、鸡、虹鳟的序列)

图7是本发明背景技术中一种抗酶解胶原蛋白复合物中人源与动物源第Ⅲ型胶原蛋白α1 链MMP的酶切位点二侧序列比对。(由上到下依序为人、牛、马、羊、猪的序列)

图8是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的示意图。

图9是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试1的测试结果。

图10是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试2的测试结果。

图11是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试3的测试结果。

图12是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试4的测试结果。

图13是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试5的测试结果。

图14是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试6的测试结果。

图15是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试7的测试结果。

图16是本发明一种抗酶解胶原蛋白复合物的抗酶解能力测试8的测试结果。

具体实施方式

为使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实 施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下提供的本发明的实施方式的 详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附 图中被定义，则在随后的附图中可以不对其进行进一步定义和解释。

实施例1：抗酶解能力测试1

(1)将A型明胶溶解于温水，配制10％(w/v)明胶溶液，加入5％(w/v)乙二胺四乙酸二钠盐(以下简称EDTA)搅拌至溶解；

(2)将5ml EDTA-明胶溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000rpm搅拌15～20分 钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除大部分上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗EDTA-明胶微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入EDTA-明胶微球，置于50℃交联6小时；

(6)以纯化水清洗交联明胶微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将1g猪源去端肽胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH 7，以 NaCl调节渗透压至250～300mOsm，分别加入0、0.1g、0.2g的EDTA-交联明胶微球， 混合均匀得胶原蛋白复合凝胶；

(8)加入胶原酶到胶原蛋白复合凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发 性溶解的空白对照组；

(9)取各组反应上清液，以羟脯氨酸呈色检测法测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶 溶液内羟脯氨酸含量扣除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(10)以不含交联明胶微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较添加EDTA-交联明 胶微球对胶原蛋白分解速率的影响；

(11)由图9可见加入EDTA-交联明胶微球的加入可以使胶原蛋白复合凝胶对胶原酶产生 明显的抗性，胶原蛋白凝胶加入不同比例的EDTA-交联明胶微球后，制成不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上清液的羟脯氨酸含量来检视胶原蛋白 复合物的酶解速率。以未添加EDTA-交联明胶微球的对照组为100％分解，结果显示 加入EDTA-交联明胶微球可以使未交联胶原蛋白复合物对胶原酶产生抗性。横坐标 由左到右的微球添加比例分别为0％、10％、20％。

实施例2：抗酶解能力测试2

(1)将明胶溶解于温水，配制10％(w/v)明胶溶液，加入10％(w/v)乙二胺四乙酸二钠 盐(以下简称EDTA)搅拌至溶解；

(2)将10ml EDTA-明胶溶液加到100ml 55℃预热含有1％(w/v)单油酸山梨醇酐酯的矿 物油，以2,400rpm搅拌；

(3)待溶液冷却至室温后，将溶液移至冰浴并持续搅拌，静置去除上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗EDTA-明胶微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛溶液加入EDTA-明胶微球，于40℃交联12小时；

(6)以纯化水清洗交联明胶微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将1g牛源去端肽胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH 7，以 NaCl调节渗透压至250～300mOsm，分别加入0、0.1g、0.2g的EDTA-交联明胶微球， 混合均匀得胶原蛋白复合凝胶；

(8)加入胶原酶到胶原蛋白复合凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发 性溶解的空白对照组；

(9)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(10)以不含交联明胶微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％酶解，比较添加EDTA-交联明 胶微球对胶原蛋白分解速率的影响；

(11)由图10可见加入EDTA-交联明胶微球的加入可以使交联胶原蛋白复合凝胶对胶原酶 产生明显的抗性，胶原蛋白凝胶加入不同比例的EDTA-交联明胶微球后，制成不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上清液的羟脯氨酸含量来检视胶原 蛋白复合物的酶解速率。以未添加EDTA-交联明胶微球的对照组为100％分解，结果 显示加入EDTA-交联明胶微球可以使未交联胶原蛋白复合物对胶原酶产生抗性。横 坐标由左到右的微球添加比例分别为0％、10％、20％。

实施例3：抗酶解能力测试3

(1)将重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于温水0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH7， 配制2％(w/v)明胶溶液，加入2.5％(w/v)盐酸多西环素(以下简称DOX)搅拌至溶解；

(2)将5ml DOX-明胶溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000rpm搅拌15～20分 钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗DOX-明胶微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入DOX-明胶微球，于50℃交联6小时；

(6)以纯化水清洗交联明胶微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将1g人源Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH 7，以NaCl 调节渗透压至250～300mOsm，分别加入0、0.1g、0.2g的DOX-交联明胶微球，混合 均匀得胶原蛋白复合凝胶；

(8)加入胶原酶到胶原蛋白复合凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发 性溶解的空白对照组。

(9)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(10)以不含交联明胶微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％分解，比较添加DOX-交联明 胶微球对胶原蛋白分解速率的影响；

(11)由图11可见加入DOX-交联明胶微球的加入可以使交联胶原蛋白复合凝胶对胶原酶 产生明显的抗性，胶原蛋白凝胶加入不同比例的DOX-交联明胶微球后，制成不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上清液的羟脯氨酸含量来检视胶原蛋 白复合物的酶解速率。以未添加DOX-交联明胶微球的对照组为100％分解，结果显示 加入DOX-交联明胶微球可以使未交联胶原蛋白复合物对胶原酶产生抗性。横坐标由 左到右的微球添加比例分别为0％、10％、20％。

实施例4：抗酶解能力测试4

(1)将B型明胶溶解于温水，配制10％(w/v)明胶溶液，加入5％(w/v)乙二胺四乙酸二钠盐(以下简称EDTA)搅拌至溶解；

(2)将5ml EDTA-明胶溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000rpm搅拌15～20分 钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除大部分上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗EDTA-明胶微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入EDTA-明胶微球，置于40℃交联12小时；

(6)以纯化水清洗交联明胶微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将1g猪源去端肽Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH7， 以NaCl调节渗透压至250～300mOsm，加入0.2g的EDTA-交联明胶微球，混合均匀 得胶原蛋白复合凝胶，调整至胶原蛋白终浓度35mg/ml；

(8)分别取胶原蛋白复合凝胶及市售胶原蛋白植入剂(Sunmax Collagen ImplantI，猪 源去端肽胶原蛋白植入剂)各0.5ml；

(9)分别加入胶原酶到二组凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发性溶 解的空白对照组；

(10)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(11)以市售胶原蛋白植入剂酶解产生的羟脯氨酸含量为100％分解，与胶原蛋白复合凝胶 分解速率的差异进行比较；

(12)由图12可见加入EDTA-明胶微球的加入可以使胶原蛋白复合凝胶对胶原酶产生抗 性，抗酶解效果优于市售胶原蛋白植入剂，胶原蛋白凝胶加入20％的EDTA-交联明胶微球后，制成胶原蛋白凝胶复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上清液的羟脯氨 酸含量来检视胶原蛋白复合物的酶解速率。以市售胶原蛋白凝胶为100％分解，结果 显示加入EDTA-明胶微球的加入可以使未交联胶原蛋白复合凝胶对胶原酶产生抗 性，抗酶解效果优于市售胶原蛋白植入剂。

实施例5：抗酶解能力测试5

(1)将A型明胶溶解于温水，配制10％(w/v)明胶溶液，加入EDTA和DOX到终浓度各为 2.5％(w/v)，溶解均匀；

(2)将5ml DOX-明胶溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000rpm搅拌15～20分 钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗EDTA-DOX-明胶微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入EDTA-DOX-明胶微球，于50℃交联1小时；

(6)以纯化水清洗交联明胶微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将1g禽源去端肽Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH7， 以NaCl调节渗透压至250～300mOsm，分别加入0、0.1g、0.2g的EDTA-DOX-交联明 胶微球，混合均匀得胶原蛋白复合凝胶；

(8)加入胶原酶到胶原蛋白复合凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发 性溶解的空白对照组；

(9)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(10)以不含交联明胶微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％分解，比较添加EDTA-DOX-交 联明胶微球对胶原蛋白凝胶分解速率的影响；

(11)由图13可见加入EDTA-DOX-交联明胶微球的加入可以使胶原蛋白复合凝胶对胶原酶 产生明显的抗性，胶原蛋白凝胶加入不同比例的EDTA-DOX-交联明胶微球后，制成不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上清液的羟脯氨酸含量来检视 胶原蛋白复合物的酶解速率。以未添加EDTA-DOX-交联明胶微球的对照组为100％分 解，结果显示加入EDTA-DOX-交联明胶微球可以使未交联胶原蛋白复合物对胶原酶 产生抗性。横坐标由左到右的微球添加比例分别为0％、10％、20％。

实施例6：抗酶解能力测试6

(1)将重组类人源胶原蛋白多肽溶解于温水，配制10％(w/v)溶液，加入DOX到终浓度 2.5％(w/v)，溶解均匀；

(2)将5ml DOX-重组类人源胶原蛋白多肽溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000 rpm搅拌15～20分钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗DOX-重组类人源胶原蛋白多肽微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入DOX-重组类人源胶原蛋白多肽微球，于50℃交联1小时；

(6)以纯化水清洗交联重组类人源胶原蛋白多肽微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm 微球备用

(7)将0.5g猪源去端肽Ⅰ型胶原蛋白和0.5g重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸， 以1N NaOH调节酸碱度至pH 7，以NaCl调节渗透压至250～300mOsm，分别加入0、0.1g、0.2g的DOX-交联重组类人源胶原蛋白多肽微球，混合均匀得胶原蛋白复合凝 胶；

(8)加入胶原酶到胶原蛋白复合凝胶中，于30℃培养24小时，以不含胶原酶溶液当自发 性溶解的空白对照组；

(9)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(10)以不含交联重组类人源胶原蛋白多肽微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％分解，比 较添加DOX-交联重组类人源胶原蛋白多肽微球对胶原蛋白凝胶分解速率的影响；

(11)由图14可见加入DOX-交联重组类人源胶原蛋白多肽微球的加入可以使胶原蛋白复 合凝胶对胶原酶产生明显的抗性，胶原蛋白凝胶加入不同比例的DOX-交联重组类人 源胶原蛋白多肽微球后，制成不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到 上清液的羟脯氨酸含量来检视胶原蛋白复合物的酶解速率。以未添加DOX-交联重组 类人源胶原蛋白多肽微球的对照组为100％分解，结果显示加入DOX-交联重组类人源 胶原蛋白多肽微球可以使未交联胶原蛋白复合物对胶原酶产生抗性。横坐标由左到 右的微球添加比例分别为0％、10％、20％。

实施例7：抗酶解能力测试7

(1)将B型明胶溶解于温水，配制10％(w/v)明胶溶液，加入DOX到终浓度5％(w/v)，溶 解均匀；

(2)将5ml DOX-明胶溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000rpm搅拌15～20分 钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗DOX-明胶微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入DOX-明胶微球，于50℃交联1小时；

(6)以纯化水清洗交联明胶微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将1g猪源去端肽Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸，以1N NaOH调节酸碱度至pH7， 分别加入0、0.1g、0.2g的DOX-交联明胶微球，混合均匀得胶原蛋白复合凝胶；

(8)将胶原蛋白复合凝胶浸泡于0.5％(w/v)戊二醛溶液内，于50℃交联1小时；

(9)以清水反复清洗交联胶原蛋白复合凝胶数次后，以生理缓冲盐水调节渗透压至 250～300mOsm，将交联胶原蛋白复合凝胶浸泡于酶解缓冲液中，于30℃培养24小 时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；

(10)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(11)以不含交联明胶微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％分解，比较添加DOX-交联明 胶微球对胶原蛋白凝胶分解速率的影响；

(12)由图15可见加入DOX-交联明胶微球的加入可以使交联胶原蛋白复合凝胶对胶原酶 产生明显的抗性胶原蛋白凝胶加入不同比例的DOX-交联明胶微球后，进行交联制成 不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上清液的羟脯氨酸含量来检视 胶原蛋白复合物的酶解速率。以未添加DOX-交联明胶微球的对照组为100％分解，结 果显示加入DOX-交联明胶微球可以使交联胶原蛋白复合物对胶原酶产生抗性。横坐 标由左到右的微球添加比例分别为0％、10％、20％。

实施例8：抗酶解能力测试8

(1)将透明质酸钠溶解于热水，配制1.5％(w/v)溶液，降温后加入EDTA和DOX到终浓度 各为2.5％(w/v)，溶解均匀；

(2)将5ml EDTA-DOX-透明质酸钠溶液加到100ml 45℃预热的大豆油，以13,000rpm搅 拌15～20分钟；

(3)加入冰水持续搅拌10～15分钟，静置后去除上清液；

(4)以4℃预冷丙酮清洗EDTA-DOX-透明质酸钠微球数次后风干；

(5)将0.5％(w/v)戊二醛加入EDTA-DOX-透明质酸钠微球，于50℃交联1小时；

(6)以纯化水清洗EDTA-DOX-透明质酸钠微球数次，干燥后过筛挑选10–50μm微球备用；

(7)将0.5g猪源去端肽Ⅰ型胶原蛋白和0.5g重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶解于0.1N氢氯酸， 以1N NaOH调节酸碱度至pH 7，分别加入0、0.1g、0.2g的EDTA-DOX-透明质酸钠 微球，混合均匀得胶原蛋白复合凝胶；

(8)将胶原蛋白复合凝胶浸泡于0.5％(w/v)戊二醛溶液内，于50℃交联1小时；

(9)以清水反复清洗交联胶原蛋白复合凝胶数次后，以生理缓冲盐水调节渗透压至 250～300mOsm，将交联胶原蛋白复合凝胶浸泡于酶解缓冲液中，于30℃培养24小 时，以不含胶原酶溶液当自发性溶解的空白对照组；

(10)取各组反应上清液，测定上清液内羟脯氨酸含量。含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量扣 除不含胶原酶溶液内羟脯氨酸含量后，即为酶分解产生的羟脯氨酸含量；

(11)以不含交联EDTA-DOX-透明质酸钠微球降解产生的羟脯氨酸含量为100％分解，比较 添加EDTA-DOX-交联透明质酸钠微球对胶原蛋白凝胶分解速率的影响；

(12)由图16可见加入EDTA-DOX-交联透明质酸钠微球的加入可以使交联胶原蛋白复合凝 胶对胶原酶产生明显的抗性，胶原蛋白凝胶加入不同比例的EDTA-DOX-交联透明质酸钠微球后，进行交联制成不同胶原蛋白复合物，加入胶原酶反应后，由释出到上 清液的羟脯氨酸含量来检视胶原蛋白复合物的酶解速率。以未添加EDTA-DOX-交联 透明质酸钠的对照组为100％分解，结果显示加入EDTA-DOX-交联透明质酸钠微球可 以使交联胶原蛋白复合物对胶原酶产生抗性。横坐标由左到右的微球添加比例分别 为0％、10％、20％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明 的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗酶解胶原蛋白复合物，其特征在于，所述抗酶解胶原蛋白复合物由携带胶原酶抑制剂的高分子微球及胶原蛋白组成。

2.根据权利要求1所述的一种抗酶解胶原蛋白复合物，其特征在于，所述高分子微球及胶原蛋白的质量比为1:20～20:1。

3.根据权利要求1所述的一种抗酶解胶原蛋白复合物，其特征在于，所述胶原蛋白包括重组人源胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、人类胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、牛源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、马源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、羊源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、猪源去端肽胶原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型、禽鸟类去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅱ型、鱼类去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅱ型、富含胶原蛋白的脱细胞人类皮肤组织、脱细胞猪皮组织或牛皮组织中的一种或多种；更优选为重组人源胶原蛋白Ⅰ型或Ⅲ型、猪源去端肽胶原蛋白Ⅰ型或Ⅲ型。

4.一种抗酶解胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于，制备方法如下：

S1.携带一种或多种胶原酶抑制剂的高分子微球的制备

将胶原酶抑制剂与高分子溶液均匀混合，并依所述高分子溶液特性制作携带胶原酶抑制剂的高分子微球，所述高分子微球的制作方法包括乳化法、喷雾干燥法、研磨法、溶剂挥发法；

对所述携带胶原酶抑制剂的高分子微球进行交联定型；

S2.抗酶解胶原蛋白复合物的制备

将胶原蛋白溶解制得胶原蛋白溶液，向所述胶原蛋白溶液中加入所述携带胶原酶抑制剂的高分子微球，混合均匀得胶原蛋白复合物，所述胶原蛋白复合物中胶原蛋白与所述高分子微球的质量之比为1:20～20:1；

S3.对胶原蛋白复合物进行交联并清洗；调节胶原蛋白浓度介于0.10％～10％w/v、酸碱度介于pH 6.0～7.5、渗透压介于200～400mOsm。

5.根据权利要求所述的一种抗酶解胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述胶原酶抑制剂，包括金属螯合剂、基质金属蛋白酶小分子抑制剂、基质金属蛋白酶胜肽抑制剂、基质金属蛋白酶组织抑制因子、基质金属蛋白酶中和抗体中的一种或多种；更优选为金属螯合剂、基质金属蛋白酶小分子抑制剂、基质金属蛋白酶胜肽抑制剂。

6.根据权利要求所述的一种抗酶解胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述高分子溶液包括哺乳动物类明胶溶液、重组人源胶原蛋白溶液、人类胶原蛋白溶液、哺乳动物类去端肽胶原蛋白溶液、禽鸟类去端肽胶原蛋白溶液、鱼类去端肽胶原蛋白溶液、多糖及其衍生物溶液、合成高分子聚合物溶液和生物陶瓷溶液中的一种或多种。

7.根据权利要求所述的一种抗酶解胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述高分子微球形状无定形、平均粒径大小介于500nm～500μm，更优选为1μm～50μm。

8.根据权利要求所述的一种抗酶解胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白复合物的交联方法包括物理交联法、化学交联法、生物交联法中的一种或多种，更优选为化学交联法，所述化学交联法中所采用的化学交联剂包括醛类、亚胺类、环氧化物。

9.一种抗酶解胶原蛋白复合物在制作医疗产品中的应用，包括敷料产品、水光和植入类美容注射产品、软组织缺损修复产品、药物载体、细胞治疗载体和组织工程基质产品；

混合其他物质制作成衍生复合物加以应用，其他物质包括未交联透明质酸钠、多核苷酸、多脱氧核糖核苷酸、重组人类弹性蛋白、重组人类纤维粘连蛋白、交联透明质酸钠、交联重组人类弹性蛋白、重组人源角细胞生长因子、重组人源上皮生长因子、重组人源酸性成纤维细胞生长因子、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血管内皮细胞生长因子、重组人源类胰岛素生长因子、重组人源肝细胞生因子、富血小板血浆、干细胞外泌体、同种异体细胞或组织移植物、自体细胞或组织移植物；

或将抗酶解胶原蛋白复合物或其衍生复合物加工成不同形式产品进行应用，包括水凝胶、冻干粉、锭剂、膜片、海绵。

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