CN112121233A - 酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂及其制备方法以及酪蛋白钙磷微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂及其制备方法以及酪蛋白钙磷微球的制备方法,本发明采用新型材料酪蛋白钙磷微球,提升了传统胶原填充剂的有效性和维持时间,生物安全性高,且能够刺激自身胶原蛋白的表达,具有极高的应用前景和价值。本发明使用去端肽动物胶原蛋白或基因重组人胶原蛋白,材料免疫原性低,材料采购/制备成本低,适合大规模工业化生产。本发明在填充剂中加入辅助成分,如甘油或小分子透明质酸,能够改善填充剂的流变特性,使其填充性能更强且更容易注射。本发明提供的工艺具有应用前景广阔,成本低,不产生有害废物,能够工业化生产,实用性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域,尤其涉及一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂及其制备方法以及酪蛋白钙磷微球的制备方法。
背景技术
酪蛋白是一种两亲性含磷蛋白,包括大量的谷氨酸和天冬氨酸残基及少量的磷酸化的丝氨酸残基,采用酪蛋白胶束与无机钙磷成分制备的多孔微球,能够结合形状优势与材料优势,在组织工程以及医疗领域具有广泛应用前景。
胶原蛋白是一种常用的医用填充剂成分,其中去端肽动物胶原蛋白或基因重组人胶原蛋白由于其免疫原性更低,更加适合应用于医用填充剂领域。但目前胶原蛋白填充剂普遍维持时间短,且不能有效刺激自体胶原蛋白的修复,因此有巨大的改进空间。
发明内容
本发明的目的在于提出一种应用范围广,免疫原性低、可以刺激自体胶原蛋白的修复的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂及其制备方法以及酪蛋白钙磷微球的制备方法。
为达到上述目的,本发明提出一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,包括胶原蛋白、酪蛋白钙磷微球和辅助成分。
进一步的,所述胶原蛋白溶液、酪蛋白钙磷微球和辅助成分之间的质量比为7:12:1或5:4:1。
进一步的,所述胶原蛋白为动物源去端肽I型胶原蛋白、动物源去端肽Ⅲ型胶原蛋白、基因重组人I型胶原蛋白和基因重组人Ⅲ型胶原蛋白中的一种或多种的混合物。
进一步的,在多种胶原蛋白的混合物中,I型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白的重量比大于9:2。
进一步的,所述辅助成分为藻酸钠、透明质酸、甘油、聚谷氨酸等聚氨基酸、PEG、黄原胶、葡聚糖和壳聚糖中的任意一种或多种的组合。
本发明还提出一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:选取胶原蛋白;
步骤2:对所述胶原蛋白进行去端肽处理;
步骤3:提取去端肽的胶原蛋白;
步骤4:将所述去端肽的胶原蛋白溶于溶剂中,得到胶原蛋白溶液;
步骤5:将所述胶原蛋白溶液、酪蛋白钙磷微球和辅助成分进行混合。
进一步的,在步骤1中,当所述胶原蛋白选取未去端肽的动物源I型胶原蛋白和未去端肽的动物源Ⅲ型胶原蛋白,进行步骤2和步骤3;
当所述胶原蛋白选取去端肽的动物源I型胶原蛋白、去端肽的动物源Ⅲ型胶原蛋白、基因重组人I型胶原蛋白和基因重组人Ⅲ型胶原蛋白,跳过步骤2和步骤3,直接进行步骤4。
进一步的,在步骤2中,使用纯化水漂洗未去端肽的胶原蛋白,以每1-10g 胶原蛋白加入100ml 0.1-1.0mol/L的乙酸溶液,之后加入特异性胃蛋白酶1-10mL 进行搅拌水解,去除端肽;搅拌速度为50-1000RPM,温度10-30℃,水解时间 2-36h。
进一步的,在步骤3中,水解后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂,取残留白色沉淀为去端肽胶原蛋白。
进一步的,在步骤4中,所述溶剂为蒸馏水,所述胶原蛋白溶液的浓度为 1-5g/100mL。
本发明还提出一种酪蛋白钙磷微球的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:称取酪蛋白加入至预先配置好的钙盐水溶液中溶解混匀并调节pH 至8.0-11.5,得到第一溶液,其中,所述钙盐水溶液的浓度为0.3-3.0moL/L,所述酪蛋白在所述第一溶液中的浓度为1.0-20.0mg/mL;
步骤2:将所述第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合,搅拌,调节 pH至8.0-11.5,在10-90℃条件下反应12-48h,提取沉淀,得到第一沉淀物,搅拌速率为50-800rpm;
步骤3:将所述第一沉淀物进行洗涤,得到第二沉淀物;
步骤4:将所述第二沉淀物使用缓冲液进行重悬,得到第二溶液,其中,所述缓冲液为浓度大于10mg/mL的酪蛋白水溶液;
步骤5:将所述第二溶液进行流化床干燥造粒、喷雾干燥或使用杆式研磨机等破碎造粒,即得所述酪蛋白钙磷微球。
进一步的,所述磷酸盐水溶液中的磷酸盐与所述钙盐水溶液中的钙的摩尔量比为:4-6:2-4;
钙盐为氯化钙、硝酸钙、碳酸钙、硫酸钙或磷酸钙中的任意一种;所述磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾或磷酸二氢铵中的任意一种。
与现有技术相比,本发明的优势之处在于:本发明的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂应用范围广,可以应用于生物相容性医用材料、形外科填充剂材料、皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料等多种医用领域。
本发明的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂采用新型材料酪蛋白钙磷微球,提升了传统胶原填充剂的有效性和维持时间,在不影响生物相容性的同时提升了产品的有效性,应用于皮肤各部位能够达到刺激自体胶原再生的作用。
本发明使用去端肽动物胶原蛋白或基因重组人胶原蛋白,材料免疫原性低,材料采购/制备成本低,适合大规模工业化生产。
本发明在填充剂中加入辅助成分,如甘油或小分子透明质酸,能够改善填充剂的流变特性,使其填充性能更强且更容易注射。
附图说明
图1为本发明实施例中植入实验60天后组织切片染色。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案作进一步地说明。
本发明提出一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,包括胶原蛋白、酪蛋白钙磷微球和辅助成分。
在本实施例中,胶原蛋白溶液、酪蛋白钙磷微球和辅助成分之间的质量比为7:12:1或5:4:1。
在本实施例中,胶原蛋白为动物源去端肽I型胶原蛋白、动物源去端肽Ⅲ型胶原蛋白、基因重组人I型胶原蛋白和基因重组人Ⅲ型胶原蛋白中的一种或多种的混合物。
在本实施例中,在多种胶原蛋白的混合物中,I型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白的重量比大于9:2。
在本实施例中,辅助成分为藻酸钠、透明质酸、甘油、聚谷氨酸等聚氨基酸、PEG、黄原胶、葡聚糖和壳聚糖中的任意一种或多种的组合。
本发明还提出一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:选取胶原蛋白当胶原蛋白选取未去端肽的动物源I型胶原蛋白和未去端肽的动物源Ⅲ型胶原蛋白,进行步骤2和步骤3;
当胶原蛋白选取去端肽的动物源I型胶原蛋白、去端肽的动物源Ⅲ型胶原蛋白、基因重组人I型胶原蛋白和基因重组人Ⅲ型胶原蛋白,跳过步骤2和步骤3,直接进行步骤4。
步骤2:使用纯化水漂洗未去端肽的胶原蛋白,以每1-10g胶原蛋白加入 100ml0.1-1.0mol/L的乙酸溶液,之后加入特异性胃蛋白酶1-10mL进行搅拌水解,去除端肽;搅拌速度为50-1000RPM,温度10-30℃,水解时间2-36h。
步骤3:水解后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂,取残留白色沉淀为去端肽胶原蛋白。
步骤4:将去端肽的胶原蛋白溶于溶剂中,得到胶原蛋白溶液;溶剂为蒸馏水,胶原蛋白溶液的浓度为1-5g/100mL。
步骤5:将胶原蛋白溶液、酪蛋白钙磷微球和辅助成分进行混合。
本发明还提出一种酪蛋白钙磷微球的制备方法,步骤如下:
步骤1:称取酪蛋白加入至预先配置好的钙盐水溶液中溶解混匀并调节pH 至8.0-11.5,得到第一溶液,其中,钙盐水溶液的浓度为0.3-3.0moL/L,酪蛋白在第一溶液中的浓度为1.0-20.0mg/mL;pH所用试剂可为任意本领域常规pH调节用试剂,如氨水、氢氧化钠溶液、稀盐酸、氢氧化钾溶液等。
步骤2:将第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合,搅拌,调节pH至 8.0-11.5,在10-90℃条件下反应12-48h,提取沉淀,得到第一沉淀物,搅拌速率为50-800rpm;
步骤3:将第一沉淀物进行洗涤,得到第二沉淀物;所提取沉淀的方法可以选择过滤方式或离心方式,采用过滤方式时,优选的,采用微滤膜,孔径为 0.1-0.26μm,采用离心方式时,优选的,离心转速为100-2000rpm。
步骤4:将第二沉淀物使用缓冲液进行重悬,得到第二溶液,其中,缓冲液为浓度大于10mg/mL的酪蛋白水溶液;可根据工艺要求变化进行调整,以达到在不同室温下控制悬浮稳定性和影响干燥造粒后的微球粒径的作用。
步骤5:将第二溶液进行流化床干燥造粒、喷雾干燥或使用杆式研磨机等破碎造粒,即得酪蛋白钙磷微球,优选为流化床干燥造粒。流化床干燥的喷头直径2-20mm,干燥温度为100-300℃,风机频率为1-15m3/min,溶液的流速为 5-80mL/min,需要说明的是,所使用的参数应根据不同机型的实际条件进行修正。所述喷雾干燥的压力为0.01-1MPa,温度为80-800℃,进风量为0.5-8m3/min,所述第二溶液的流速为1-100mL/min,需要说明的是,所使用的参数应根据不同机型的实际条件进行修正。
进一步的,磷酸盐水溶液中的磷酸盐与钙盐水溶液中的钙的摩尔量比为: 4-6:2-4;
钙盐为氯化钙、硝酸钙、碳酸钙、硫酸钙或磷酸钙中的任意一种;磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾或磷酸二氢铵中的任意一种。
下面将结合具体的实施例数据,对本发明做出进一步的解释说明:
实施例1:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)配置0.3mol/L的硝酸钙溶液2L,加入2g酪蛋白溶解混匀,加入氨水调节至pH=8.0,得到第一溶液;
2)配置0.252mol/L的磷酸氢二铵溶液2L,调节至pH=8.0,加入所述第一溶液进行混合,搅拌,调节pH=8.0,在10℃条件下反应48h,反应完成后使用 0.1μm膜进行抽滤来提取沉淀获得滤饼,得到第一沉淀物,其中,所述搅拌的转速是50rpm;
3)使用4L纯化水对所述第一沉淀物形成的滤饼进行洗涤,再使用2L无水乙醇进行洗涤,洗涤完成后离心得到第二沉淀物;
4)配置1L浓度为10mg/mL酪蛋白水溶液作为缓冲液,将所述第二沉淀物使用所述缓冲液进行重悬,得到第二溶液;
5)将所述第二溶液进行流化床干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球,其中,所述喷头直径2mm,干燥温度为100℃,风机频率为10m3/min,溶液的流速为 5mL/min。
6)使用纯化水漂洗未处理的动物源胶原蛋白,然后每0.1g胶原蛋白加入 100mL0.1moL/L的乙酸溶液,每份加入特异性胃蛋白酶1mL(2mg/mL)进行搅拌,搅拌速度50RPM,温度30℃,水解时间24h,去除端肽。
7)水解过后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂等,取残留白色沉淀即为去端肽胶原蛋白。
8)取去端肽胶原蛋白0.1g溶于100mL注射用水中
9)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:甘油=7:12:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
在本实施例中,制得的酪蛋白钙磷微球的粒径为20-70微米,是一种多孔球形颗粒,结构稳定,易注射,生物相容性好。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例2:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)配置3moL/L的硝酸钙溶液5L,加入100g酪蛋白溶解混匀,加入氨水调节至pH=10.5,得到第一溶液;
2)配置5.04moL/L的磷酸二氢铵溶液5L,调节至pH=10.5,加入所述第一溶液进行混合,搅拌,调节pH=10.5,在90℃条件下反应12h,反应完成后使用碟片式离心机提取沉淀,得到第一沉淀物,其中,所述搅拌的转速是800rpm,所述碟片式离心机的转速300rpm;
3)使用12L纯化水对所述第一沉淀物形成的滤饼进行洗涤,再使用8L无水乙醇进行洗涤,洗涤完成后离心得到第二沉淀物;
4)配置2.5L浓度为200mg/mL酪蛋白水溶液作为缓冲液,将所述第二沉淀物使用所述缓冲液进行重悬,得到第二溶液;
5)将所述第二溶液进行流化床干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球,其中,所述喷头直径8mm,干燥温度为300℃,风机频率为70m3/min,溶液的流速为 2mL/min。
6)使用纯化水漂洗未处理的动物源胶原蛋白,然后每5g胶原蛋白加入100mL1moL/L的乙酸溶液,每份加入特异性胃蛋白酶10mL(5mg/mL)进行搅拌,搅拌速度1000RPM,温度30℃,水解时间12h,去除端肽。
7)水解过后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂等,取残留白色沉淀即为去端肽胶原蛋白。
8)取去端肽胶原蛋白15g溶于100mL注射用水中
9)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:透明质酸=7:12:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
在本实施例中,制得的酪蛋白钙磷微球的粒径为100-180微米,是一种多孔球形颗粒,结构稳定,易注射,生物相容性好。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例3:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)配置1moL/L的硝酸钙溶液4L,加入40g酪蛋白溶解混匀,加入氨水调节至pH=9.5,得到第一溶液;
2)配置0.84moL/L的磷酸氢二钠溶液4L,调节至pH=9.5,加入所述第一溶液进行混合,搅拌,调节pH=9.5,在40℃条件下反应24h,反应完成后使用 0.24μm滤膜抽滤来提取沉淀获得滤饼,得到第一沉淀物,其中,所述搅拌的转速是300rpm;
3)使用7L纯化水对所述第一沉淀物形成的滤饼进行洗涤,再使用5L无水乙醇进行洗涤,洗涤完成后离心得到第二沉淀物;
4)配置2L浓度为50mg/mL酪蛋白水溶液作为缓冲液,将所述第二沉淀物使用所述缓冲液进行重悬,得到第二溶液;
5)将所述第二溶液进行喷雾干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球,所述酪蛋白钙磷微球是大粒径多孔酪蛋白钙磷微球,其中,所述喷雾干燥的压力0.05Mpa,风机进风量为3m3/min,喷雾温度为250℃,所述第二溶液的流速为20mL/min。
6)本实施例采用采购的基因重组类人胶原蛋白。
7)取基因重组类人胶原蛋白5g溶于100mL注射用水中
8)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:PEG=15:4:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
在本实施例中,制得的酪蛋白钙磷微球的粒径为10-50微米,是一种多孔球形颗粒,结构稳定,易注射,生物相容性好。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例4:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)称取酪蛋白加入至预先配置好的钙盐水溶液中溶解混匀并调节pH至8.0,得到第一溶液,其中,所述钙盐水溶液的浓度为0.5moL/L,所述酪蛋白在所述第一溶液中的浓度为1.0mg/mL;
2)将所述第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合,搅拌,调节pH至 8.5,在10℃条件下反应18h,提取沉淀,得到第一沉淀物;
3)将所述第一沉淀物进行洗涤,得到第二沉淀物;其中,所述洗涤的方式具体为用纯化水和无水乙醇清洗,每5L反应液(即所述第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合得到的反应液)所得的第一沉淀物使用4L纯化水洗涤3次,再使用2L无水乙醇清洗1次,其中纯化水可用级别更高的去离子水、注射用水等代替,这里并不作限定,可以根据需要进行选择;
4)将所述第二沉淀物使用缓冲液进行重悬,得到第二溶液,其中,所述缓冲液为浓度大于10mg/mL的酪蛋白水溶液;
5)将所述第二溶液进行流化床干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球。
6)本实施例采用采购的去端肽I型以及III型胶原蛋白。
7)分别称取I型以及III型胶原蛋白4g,0.2g溶于100mL注射用水中得胶原蛋白溶液。
8)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:聚谷氨酸=10:10:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
本实施例中,在步骤2)中,所述反应在速率为200rpm的搅拌条件下进行。在步骤4)中,所述重悬的具体参数为每100g第二沉淀物使用300mL酪蛋白水溶液进行重悬,重悬可以使用搅拌、震荡等手段。在步骤5)中,所述流化床干燥喷头直径12mm,干燥温度为200℃,风机频率为40m3/min,溶液的流速为8mL/min。需要说明的是,所使用的参数应根据不同机型的实际条件进行修正。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例5:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)称取酪蛋白加入至预先配置好的钙盐水溶液中溶解混匀并调节pH至10.0,得到第一溶液,其中,所述钙盐水溶液的浓度为1.0moL/L,所述酪蛋白在所述第一溶液中的浓度为20.0mg/mL;
2)将所述第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合,搅拌,调节pH至 10.5,在80℃条件下反应36h,提取沉淀,得到第一沉淀物;
3)将所述第一沉淀物进行洗涤,得到第二沉淀物;其中,所述洗涤的方式具体为用纯化水和无水乙醇清洗,每5L反应液(即所述第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合得到的反应液)所得的第一沉淀物使用6L纯化水洗涤3次,再使用4L无水乙醇清洗1次,其中纯化水可用级别更高的去离子水、注射用水等代替,这里并不作限定,可以根据需要进行选择;
4)将所述第二沉淀物使用缓冲液进行重悬,得到第二溶液,其中,所述缓冲液为浓度大于10mg/mL的酪蛋白水溶液;
5)将所述第二溶液进行喷雾干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球。
6)使用纯化水漂洗未处理的动物源胶原蛋白,然后每5g胶原蛋白加入 100mL1moL/L的乙酸溶液,每份加入特异性胃蛋白酶10mL(10mg/mL)进行搅拌水解36h,去除端肽。
7)水解过后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂等,取残留白色沉淀即为去端肽胶原蛋白。
8)取去端肽胶原蛋白1g溶于100mL注射用水中
9)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:聚谷氨酸=10:10:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
本实施例中,在步骤2)中,所述反应在速率为200rpm的搅拌条件下进行。在步骤4)中,所述重悬的具体参数为每100g第二沉淀物使用300mL酪蛋白水溶液进行重悬,重悬可以使用搅拌、震荡等手段。在步骤5)中,所述喷雾干燥的压力为0.01MPa,温度为100℃,进风量为1m3/min,所述第二溶液的流速为 1mL/min,需要说明的是,所使用的参数应根据不同机型的实际条件进行修正。
需要说明的是,所述调节pH所用试剂可为任意本领域常规pH调节用试剂,如氨水、氢氧化钠溶液、稀盐酸、氢氧化钾溶液等,这里并不作限定。所述提取沉淀的方法可以选择过滤方式或离心方式。
采用上述的填充剂的制备方法制备得到的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,部分或全部包含上述的材料。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例6:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)配置0.5moL/L的硝酸钙溶液2L,加入4g酪蛋白溶解混匀,加入氨水调节至pH=10.0,得到第一溶液;
2)配置0.42moL/L的磷酸氢二铵溶液2L,调节至pH=8.5,加入所述第一溶液进行混合,搅拌,调节pH=10.0,在90℃条件下反应24h,反应完成后使用 0.1μm膜进行抽滤来提取沉淀获得滤饼,得到第一沉淀物,其中,所述搅拌的转速是400rpm;
3)使用4L纯化水对所述第一沉淀物形成的滤饼进行洗涤,再使用2L无水乙醇进行洗涤,洗涤完成后离心得到第二沉淀物;
4)配置1L浓度为40mg/mL酪蛋白水溶液作为缓冲液,将所述第二沉淀物使用所述缓冲液进行重悬,得到第二溶液;
5)将所述第二溶液进行流化床干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球,所述酪蛋白钙磷微球是大粒径多孔酪蛋白钙磷微球,其中,所述流化床干燥喷头直径2mm,干燥温度为300℃,风机频率为15m3/min,溶液的流速为5mL/min。
6)使用纯化水漂洗未处理的动物源胶原蛋白,然后每1g胶原蛋白加入 100mL0.5moL/L的乙酸溶液,每份加入特异性胃蛋白酶5mL(5mg/mL)进行搅拌,搅拌速度400RPM,温度25℃,水解时间18h,去除端肽。
7)水解过后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂等,取残留白色沉淀即为去端肽胶原蛋白。
8)取去端肽胶原蛋白1g溶于100mL注射用水中
9)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:聚谷氨酸=7:12:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
在本实施例中,制得的酪蛋白钙磷微球的粒径为800纳米-40微米,是一种多孔球形颗粒,结构稳定,易注射,生物相容性好。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例7:一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,具体制备方法如下:
1)配置0.5moL/L的硝酸钙溶液2L,加入4g酪蛋白溶解混匀,加入氨水调节至pH=10.0,得到第一溶液;
2)配置0.42moL/L的磷酸氢二铵溶液2L,调节至pH=8.5,加入所述第一溶液进行混合,搅拌,调节pH=10.0,在90℃条件下反应24h,反应完成后使用 0.1μm膜进行抽滤来提取沉淀获得滤饼,得到第一沉淀物,其中,所述搅拌的转速是400rpm;
3)使用4L纯化水对所述第一沉淀物形成的滤饼进行洗涤,再使用2L无水乙醇进行洗涤,洗涤完成后离心得到第二沉淀物;
4)配置1L浓度为40mg/mL酪蛋白水溶液作为缓冲液,将所述第二沉淀物使用所述缓冲液进行重悬,得到第二溶液;
5)将所述第二溶液进行喷雾干燥,即得所述酪蛋白钙磷微球,所述酪蛋白钙磷微球是大粒径多孔酪蛋白钙磷微球,其中,所述喷雾干燥的压力0.1Mpa,风机进风量为0.5m3/min,喷雾温度为200℃,所述第二溶液的流速为0.2mL/min。
6)使用纯化水漂洗未处理的动物源胶原蛋白,然后每1g胶原蛋白加入100mL0.5moL/L的乙酸溶液,每份加入特异性胃蛋白酶5mL(5mg/mL)进行搅拌,搅拌速度400RPM,温度25℃,水解时间18h,去除端肽。
7)水解过后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂等,取残留白色沉淀即为去端肽胶原蛋白。
8)取去端肽胶原蛋白1g溶于100mL注射用水中
9)按照质量比胶原蛋白溶液:酪蛋白钙磷微球:聚谷氨酸=7:12:1进行真空搅拌混合,得酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂。
在本实施例中,制得的酪蛋白钙磷微球的粒径为400纳米-10微米,是一种多孔球形颗粒,结构稳定,易注射,生物相容性好。
本实施例中,所述酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法在制备整形外科填充剂材料以及皮肤科修复材料、骨修复材料、口腔颌面填充剂材料、神经外科修复材料中均有应用价值。
本实施例中,所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂在整形外科、皮肤科、骨科、牙科以及神经外科中均有应用价值。
实施例8:
对制备的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂进行小鼠植入实验,部分过程和检验结果如图1所示。图1为植入实验60天后组织切片染色,其中球形物体为产品,包裹球形的染色部分为诱导皮肤新生的胶原蛋白。由图1可以看出本产品在植入小鼠体内60天后,植入部位的组织切片图显示填充剂胶原载体和辅助成分均已被代谢吸收,而酪蛋白钙磷微球则被新生的胶原蛋白包裹固定,且未出现不良的炎性反应,由此可证明本产品刺激皮肤胶原新生的有益效果。本实施例证明了本产品的有效性好,生物安全性高,且维持时间较市面上其他类似产品大大加长,且能够刺激自身胶原蛋白的表达,具有极高的应用前景和价值。
本发明有益效果如下,本发明采用新型材料酪蛋白钙磷微球,提升了传统胶原填充剂的有效性和维持时间,生物安全性高,且能够刺激自身胶原蛋白的表达,具有极高的应用前景和价值。本发明使用去端肽动物胶原蛋白或基因重组人胶原蛋白,材料免疫原性低,材料采购/制备成本低,适合大规模工业化生产。本发明在填充剂中加入辅助成分,如甘油或小分子透明质酸,能够改善填充剂的流变特性,使其填充性能更强且更容易注射。本发明提供的工艺具有应用前景广阔,成本低,不产生有害废物,能够工业化生产,实用性高等优点。
上述仅为本发明的优选实施例而已,并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明的技术方案的范围内,对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动,均属未脱离本发明的技术方案的内容,仍属于本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,其特征在于,包括胶原蛋白、酪蛋白钙磷微球和辅助成分。
2.根据权利要求1所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,其特征在于,所述胶原蛋白溶液、酪蛋白钙磷微球和辅助成分之间的质量比为7:12:1至15:4:1。
3.根据权利要求1所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,其特征在于,所述胶原蛋白为动物源去端肽I型胶原蛋白、动物源去端肽Ⅲ型胶原蛋白、基因重组人I型胶原蛋白和基因重组人Ⅲ型胶原蛋白中的一种或多种的混合物。
4.根据权利要求3所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,其特征在于,在多种胶原蛋白的混合物中,I型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白的重量比大于9:2。
5.根据权利要求1所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,其特征在于,所述辅助成分为藻酸钠、透明质酸、甘油、聚谷氨酸等聚氨基酸、PEG、黄原胶、葡聚糖和壳聚糖中的任意一种或多种的组合。
6.一种酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,制备如权利要求1-5中任意一项所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:选取胶原蛋白;
步骤2:对所述胶原蛋白进行去端肽处理;
步骤3:提取去端肽的胶原蛋白;
步骤4:将所述去端肽的胶原蛋白溶于溶剂中,得到胶原蛋白溶液;
步骤5:将所述胶原蛋白溶液、酪蛋白钙磷微球和辅助成分进行混合。
7.根据权利要求6所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,其特征在于,在步骤1中,当所述胶原蛋白选取未去端肽的动物源I型胶原蛋白和未去端肽的动物源Ⅲ型胶原蛋白,进行步骤2和步骤3;
当所述胶原蛋白选取去端肽的动物源I型胶原蛋白、去端肽的动物源Ⅲ型胶原蛋白、基因重组人I型胶原蛋白和基因重组人Ⅲ型胶原蛋白,跳过步骤2和步骤3,直接进行步骤4。
8.根据权利要求6所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,其特征在于,在步骤2中,使用纯化水漂洗未去端肽的胶原蛋白,以每1-10g胶原蛋白加入100ml 0.1-1.0mol/L的乙酸溶液,之后加入特异性胃蛋白酶1-10mL进行搅拌水解,去除端肽;搅拌速度为50-1000RPM,温度10-30℃,水解时间2-36h。
9.根据权利要求8所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,其特征在于,在步骤3中,水解后将溶液离心取澄清液,加入氢氧化钠溶液进行pH调节,待析出杂蛋白等沉淀,取上清液,加入氯化钠溶液进行反复盐析,去除残余化学试剂,取残留白色沉淀为去端肽胶原蛋白。
10.根据权利要求6所述的酪蛋白钙磷微球胶原蛋白填充剂的制备方法,其特征在于,在步骤4中,所述溶剂为蒸馏水,所述胶原蛋白溶液的浓度为1-5g/100mL。
11.一种酪蛋白钙磷微球的制备方法,以制备如权利要求1-10中任意一项所述的酪蛋白钙磷微球,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:称取酪蛋白加入至预先配置好的钙盐水溶液中溶解混匀并调节pH至8.0-11.5,得到第一溶液,其中,所述钙盐水溶液的浓度为0.3-3.0moL/L,所述酪蛋白在所述第一溶液中的浓度为1.0-20.0mg/mL;
步骤2:将所述第一溶液与预先配置好的磷酸盐水溶液混合,搅拌,调节pH至8.0-11.5,在10-90℃条件下反应12-48h,提取沉淀,得到第一沉淀物,搅拌速率为50-800rpm;
步骤3:将所述第一沉淀物进行洗涤,得到第二沉淀物;
步骤4:将所述第二沉淀物使用缓冲液进行重悬,得到第二溶液,其中,所述缓冲液为浓度大于10mg/mL的酪蛋白水溶液;
步骤5:将所述第二溶液进行流化床干燥造粒、喷雾干燥或使用杆式研磨机等破碎造粒,即得所述酪蛋白钙磷微球。
12.根据权利要求11所述的酪蛋白钙磷微球的制备方法,其特征在于,所述磷酸盐水溶液中的磷酸盐与所述钙盐水溶液中的钙的摩尔量比为:4-6:2-4;
钙盐为氯化钙、硝酸钙、碳酸钙、硫酸钙或磷酸钙中的任意一种;所述磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾或磷酸二氢铵中的任意一种。
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