CN1972667A

CN1972667A - 工程蛋白及制备和使用方法

Info

Publication number: CN1972667A
Application number: CN 200580008933
Authority: CN
Inventors: D·A·蒂雷尔; D·M·施沃茨; P·J·诺沃茨基; R·H·格鲁布斯
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; University of California
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; University of California
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2007-05-30

Abstract

本发明提供工程蛋白和由工程蛋白制备的生物医学制品。生物医学产品包括用于眼科目的的晶状体。

Description

工程蛋白及制备和使用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2004年1月23日提交的美国临时申请第60/538,844号和2004年3月10日提交的美国临时申请第60/552,029号的优先权，这两个临时申请都全文在此引入作为参考。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明在美国政府资助号R01-HL59987资助下开发。因此，美国政府可拥有本发明的一定权益。

技术领域

本发明涉及工程蛋白，尤其是当用于制备生物医学模制品如眼用模制品时。

发明背景

角膜占人眼屈光力的2/3。此屈光力可通过改变角膜曲率或通过改变角膜折射率而改变。据美国国家健康统计中心(National Center forHealth Statistics)的数据，美国人群中约52％戴有某些形式的矫正透镜。尽管在过去的十年中在矫正近视、远视和散光的屈光手术方面已取得了显著进步，但仍存在一些问题。激光原位角膜磨镶术(LASIK)和光性屈光性角膜切削术(PRK)已被证实在矫正近视、散光和低-中度远视方面非常有效。这些方法的原理上局限在于其缺乏可逆性以及矫正远视和高度近视的效力有限。

最近，随着FDA批准有晶体眼人工晶状体(IOL)[Verisyse，Advanced Medical Optics Santa Ana，CA]，有一种潜在的改进方法治疗高度近视。尽管这些有晶体眼IOL为植入的近视者提供了极佳的视力品质，但其可能与严重眼内并发症如眼内炎和角膜失代偿有关。另外，这些IOL对于在有浅前房趋势的远视患者中植入没有同样的安全性，增加了植入体损伤角膜的风险。

当前屈光手术方法的这些问题已重新点燃了对治疗远视和高度近视的角膜内植入体(嵌体)的兴趣。在角膜中植入微透镜以矫正屈光不正并非新主意。在1949年，Barraquer描述了在兔模型中植入6mm无色玻璃(flint glass)角膜内晶状体。角膜出现基质坏死，晶状体被挤出。Barraquer使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)晶状体的随后实验得到相似的结果。他推断：经合成高嵌体交换的有限代谢与角膜存活力不相容。在1967年，Dohlman在兔和猫中测试了由甲基丙烯酸甘油酯制成的水凝胶嵌体。这些水可渗透性植入体能够进行代谢交换，且被兔角膜更好地耐受；但是，至3个月时，植入体经常被挤出。在猫中，有极佳的临床生物相容性，没有挤出现象。其它在使用胶体素、聚丙烯、sialastic和聚砜的合成嵌体方面的尝试没有被角膜良好耐受，导致透明度受损。

基于水凝胶嵌体有前景的初步结果，这些材料已在动物模型中得到最透彻的研究，新近，已进入临床实验。业已将微孔化水凝胶制剂(Nutrapore)掺入到角膜嵌体(PermaVision，Anamed Inc.，Anaheim，CA)中并植入，以矫正远视和高度近视。这些嵌体直径为5.0mm，中心厚度为25-60μm。其水含量为78％，屈光指数近似于角膜。Michieletto和同事报道了10例远视者，对这些远视者，使用微型角膜刀创建角膜瓣，并在无缝线的情况下固定植入体，由此植入PermaVision晶状体。尽管1个嵌体由于偏心而不得不被取出，但其它眼没有失去最佳的矫正视力敏锐度，晶状体在随后的6个月看起来被良好耐受。值得注意的是，未对术前散光超过0.5屈光度的眼进行手术。Guell等报道了6例植入PermaVision嵌体的远视眼。尽管所有的眼在没矫正的情况下在12个月时均为20/40或更佳，但仅有1只眼在没矫正时为20/20。作者推断：嵌体屈光力的可预测性“必须被提升”。Werblin和同事报道了应用不同的水凝胶嵌体Permalens(Alcon Labs，Fort Worth，TX)矫正高度近视。将-10.00至-15.00屈光度的嵌体植入5名近视患者中。对于所有病例进行至少18个月的随访，角膜澄清度都得以保持，但和远视嵌体中的情况一样，屈光力的可预测性是一个重大问题。实际上，平均术后屈光不正为-5.7+2.1屈光度。尽管这些使用水凝胶嵌体矫正远视和高度近视的探索性研究建立了一般的生物相容性(某些研究已出现晶状体周炎症或纤维化的病例)，但其确实揭示出需要可调性以使视觉效果最佳。因为不可能预知植入后患者的术后屈光不正，所以需要术后调节嵌体屈光力的方法。

当前水凝胶嵌体的一个显著局限是其不能解决术后可调性的重要需求。

美国专利第4,264,155号(授予Miyata)公开了由胶原凝胶制的软性接触透镜，在胶原凝胶中加入了水溶性有机多羟基聚合物，例如粘多糖、聚乙烯醇等，接着化学交联凝胶。多羟基聚合添加剂据说“环绕”着胶原分子链，以保护其对抗微生物降解。在美国专利第4,264,155号中没有讲述或提示可能酰化胶原，以产生烯键式不饱和或聚合取代的胶原，其然后可聚合，形成生物和组织可接受性高的有用生物医学制品。

例如，由WO95/13764已知提供由多孔聚合材料组成的角膜假体，用于矫正眼的光学特性或改变其外观。角膜嵌体一般采用手术方法植入到哺乳动物角膜中或角膜上，例如通过在角膜的基质组织中做一个切口，形成高嵌体置于其中的囊袋，然后通过缝合封口。

矫正屈光不正的替代方法是放置角膜高嵌体。其优势是可撤消、手术较简单和稳定。思路是将高嵌体放置在角膜基质之上的前界层(Bowman’s layer)上，这改变了角膜曲率，由此改变了角膜的屈光力。

一种方法包括通过刮擦去除角膜的角膜上皮细胞层，将合成微透镜直接放置于其上，和角膜组织密切接触，并将其在适当的位置保持一段时间，这段时间足以使上皮细胞恢复、于植入体上生长，因此以持久方式固定植入体。使用生物相容性粘着剂，例如市售可得的胶原或纤维蛋白型双组分粘着剂，实现高嵌体在角膜上的初始临时固定。但是，所述粘着剂尚未被证实令人满意，主要是因为严重的操作问题。

鉴于这些和其它缺点，有需要改进用于生物医学模制品的材料，特别是用于角膜高嵌体的材料。

发明简述

本发明提供工程蛋白及制备和使用该工程蛋白的方法。本发明的工程蛋白可为任何非天然蛋白、肽或多肽，其在交联时可形成具有有利眼特性的晶状体。在本发明的某些实施方案中，工程蛋白含至少一个纤连蛋白结构域和至少一个弹性蛋白结构域。蛋白可按照本领域技术人员已知的方法合成，可为重组蛋白或融合蛋白。在某些实施方案中，纤连蛋白结构域可含CS1、CS5或III型结构域，或RGD结构域。在其它特定实施方案中，弹性蛋白结构域包含氨基酸序列VPGVG、VPGKG、VPGIG或其功能等同物中的一个或组合。

在一个实施方案中，工程蛋白含SEQ ID NO：1(LD-YAVTGRGDSPASSKPIA((VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂)₄VP)₃。还设想蛋白可具有某些标志，例如His标志，以利于纯化。本领域技术人员会认识到，这样的标志可被切除或以其它方式去除，而不影响工程蛋白的材料特性。在本发明的一个实施方案中，工程蛋白小于30kd、小于15kd或小于10kd。

蛋白可按照本发明交联。设想交联可为化学或紫外交联。在某些实施方案中，交联以在交联产物中留下最少杂质的方式发生。本领域技术人员会认识到，工程蛋白的弹性特性可通过交联度改变，通过增加交联可产生更刚性的产物。本领域技术人员还会认识到，可通过改变蛋白设计实现交联增加。例如，在本发明的某些实施方案中，工程蛋白经结构域VPGKG中的赖氨酸残基交联。增加交联可用的赖氨酸数可改变蛋白的弹性特性。因此，可通过改变相对于VPGKG区段数的VPGIG重复区段数，改变SEQ ID NO：1中的蛋白。在某些实施方案中，交联产物中的杂质可通过清洗或化学提取去除。

在某些实施方案中，本发明提供含纤连蛋白样结构域和弹性蛋白样结构域的重复区段链的工程蛋白组合物。设想工程蛋白组合物还可包含丝心蛋白、弹性蛋白、角蛋白、胶原蛋白的重复区段或重复单元组合。

本发明的一个实施方案是含工程蛋白的晶状体，其中工程蛋白是交联的。在一个具体实施方案中，晶状体是接触透镜、角膜高嵌体、角膜嵌体或人工晶状体。在另一个具体实施方案中，产物形成角膜移植片或角膜片(corneal patch)。本发明的工程蛋白产物适于角膜置换，其中角膜组织的全部或部分被本文所述的工程蛋白置换。

在某些实施方案中，设想晶状体具生物相容性、光学透明、抗生物降解，刺激邻近细胞粘附，具有有利的弹性特性。在本发明的一个实施方案中，晶状体具有约0.01至约5.0Mpa的弹性模数。在另一个实施方案中，晶状体具有约0.05至约2.0Mpa的弹性模数。在另一个实施方案中，晶状体基本上没有内毒素或其它污染物。

本发明的另一个实施方案是由本文描述的工程蛋白制成的薄膜或覆膜(coating)。

本发明的另一个实施方案是通过将含工程蛋白的角膜高嵌体植入角膜中或角膜上从而矫正眼光学特性的方法，其中该蛋白含至少一个纤连蛋白结构域和至少一个弹性蛋白结构域。

在某些实施方案中，设想可通过含对光化学交联敏感的反应性侧链，由工程蛋白制备可调节的生物医学植入体，例如角膜植入体。例如，可将丙烯酰基或异丁烯酰基连接至本发明蛋白的赖氨酸侧链。本领域技术人员会认识到，可调节单个工程蛋白中具有丙烯酰基或异丁烯酰基的氨基酸残基数。在本发明的某些实施方案中，每个工程蛋白都具有至少一个具有丙烯酰基或异丁烯酰基的修饰赖氨酸残基。在本发明的其它实施方案中，一些赖氨酸残基被修饰，而其它赖氨酸残基未被修饰。本领域技术人员会认识到，改变修饰的赖氨酸残基数会产生具有可变材料特性的光固化变体。本领域技术人员会认识到，可用增加交联度的反应性侧链类似地修饰其它氨基酸残基。本领域技术人员知晓其中可调节眼晶状体的技术。参见例如美国专利公开说明书第20030176521号和第20030174375号，这两个专利说明书都在此引入作为参考。

在本发明的某些实施方案中，工程蛋白是低分子量蛋白，其提供通过图案照射(patterned irradiation)和低分子量物质在渗透梯度作用下扩散从而改变植入体局部曲率的基础。在达到目的形状改变后，通过进一步照射整个植入体“锁定”结构。

在本发明的某些实施方案中，本发明的工程蛋白与可通过工程蛋白溶液扩散并有助于交联或聚合过程的小分子接触。

在本发明的某些实施方案中，本发明的工程蛋白可形成置换全部或部分角膜的移植片。

前文相当广泛地概述了本发明的特征和技术优势，以便可更好地理解随后的本发明详述。下文描述本发明的其它特征和优势。应当认识到，可容易地利用所公开的理念和具体实施方案作为修饰或设计用于实施本发明相同目的的其它结构的基础。还应当认识到，这样的等同构造并没有偏离如本文阐明的本发明。当将以下描述连同附图一起考虑时，由以下描述可更好地理解相信为本发明特征的、关于其组成和操作方法的新特征，以及进一步的目标和优势。但是，不言而喻，提供的每幅图都仅是为了例证和描述目的，无意界定本发明的限制。

附图简述

为更全面地理解本发明，现在参考以下的描述以及附图，其中：

图1显示了工程蛋白材料的蛋白设计。显示了完整的氨基酸序列。显示了纤连蛋白衍生结构域(促进与上皮细胞的相互作用)和弹性蛋白结构域(用于结构支持体柔性)。还有一个用于蛋白鉴别的标志、用于蛋白纯化的标志和切割位点；

图2显示了SDS凝胶和对应的显示单一条带的蛋白质印迹，该单一条带代表具有35.1kDa分子量的人工蛋白；

图3显示工程蛋白如何交联在高嵌体中。然后工程蛋白溶液在成型入角膜高嵌体后经历交联反应。显示了模制品。其由PMMA材料制成，产生6.0mm高嵌体；

图4显示了高嵌体图象；

图5显示了临床检查照片，其图示了在术后即时、术后48小时和术后1周植入角膜中的高嵌体。空心白箭头显示了囊袋中植入高嵌体的折入边(tucked-in edge)。黑箭头显示了环钻伤口。荧光素染料使整个暴露的高嵌体表面染色。在相同眼48小时后的照片中，上皮再形成过程业已开始，细胞由外周向内迁入，证据是在这些区域缺乏荧光素染料。黑箭头显示了用于对比的初始伤口边缘。在术后1周，高嵌体已被上皮掺入并完全覆盖。没有荧光素染色；

图6显示了对照眼的示意剖面；和

图7显示了植入高嵌体的示意剖面。PAS染色的低放大倍数视野显示了板层囊袋中的高嵌体。变形的角膜结构是保藏过程的人工制品。

图8显示了在第7天时间点的组织学检查。(A)在低放大倍数时，Mason三色染色显示了与天然角膜对比新高嵌体材料未染色。(B)经H & E染色的标本证实高嵌体表面上皮再形成。(C)较高放大倍数揭示了角膜基质、高嵌体和上覆的1-2个细胞层厚度的上皮，该上皮通常用于再生角膜上皮。

发明详述

I.本发明

本发明涉及工程蛋白产物，其可形成可用于医学用途的成型制品，包括用于眼科学、手术、矫形外科和心脏病学的植入体。这些由工程蛋白制成的材料还可用于替换部分或全部角膜，即在板层或穿透式角膜移植术后作为移植组织。本发明的工程蛋白材料和制品既可用作高嵌体，也可用作嵌体。工程蛋白材料和制品可用于白内障手术，以替换晶状体或用作有晶状体眼人工晶状体。

在本发明的某些实施方案中，由工程蛋白制成的晶状体具有至少一个(在某些实施方案中具有全部)下述有利眼特性：生物相容性；可预知的近视、远视和散光矫正；矫正高阶像差(特别是球面像差)以赋予好于20/20视力的能力；能够轻易插入的机械特性和耐久性；能够随时间保持稳定屈光矫正的能力；容易和低成本生产；以及可更换性。

在本发明的优选实施方案中，工程蛋白制品是角膜高嵌体。本发明设想的角膜高嵌体晶状体由重新设计的蛋白构成，其中所述重新设计的蛋白经基因工程而包含提供有利眼特性的结构域。

在本发明的某些实施方案中，工程蛋白由人纤连蛋白和哺乳动物弹性蛋白制备。可包含氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的纤连蛋白结构域设计用来促进细胞生长和粘附。弹性蛋白样结构域可构成蛋白的大部分，设计用来确保交联材料的弹性。先前还没有考虑过应用工程蛋白作为角膜高嵌体的基础。这些蛋白由于以下原因对应用于角膜高嵌体有优势：

1)已知RGD序列促进与许多细胞类型的粘附。

2)弹性蛋白样材料先前已表现出生物相容性。

3)弹性蛋白和弹性蛋白样蛋白一般来说抗酶降解，这延长了其在角膜中的预期寿命。

4)弹性蛋白样蛋白在水中具有高分子移动性，预期这促进营养物通过高嵌体薄膜良好扩散。

5)蛋白的模块设计指仅提供一些氨基酸结构域，而可用于角膜高嵌体的天然蛋白(如胶原蛋白)的生物学更为复杂。

6)可使用现有的化学方法使设计的蛋白交联，以产生透明薄膜，包括角膜晶状体型薄膜。

7)交联蛋白薄膜的模数约为0.2MPa，这对应用来说足够柔性，足以允许良好的手术操作。

本文描述的角膜高嵌体能够以手术和活体角膜联系在一起，优选附着于活体角膜，以便改变其光学特性(例如矫正眼睛的视力缺陷)或改变眼睛外观，例如瞳孔着色。可用一种或多种色素或染料对高嵌体或其部分着色，这在本领域众所周知。着色高嵌体，特别是在瞳孔区域周围着色，将导致植入时眼睛颜色改变。

本发明还设想了工程蛋白聚合组合物的众多其它用途。用途包括但不限于以下方面：生产工程组织和器官，包括例如工程蛋白材料的贴片、栓或组织的结构。这些和其它构建物可补加细胞，或不补加细胞使用。另外的用途包括以下方面：假体和其它植入体；诱导细胞在体外或体内分化的组织支架；伤口修复或包扎；稳态装置；用于组织修补和支持的装置或结构(例如缝线、粘合剂、手术和矫形螺钉以及手术和矫形板)；用于合成植入体的天然涂层或组分；美容用植入体和支持体；用于器官或组织的修复或结构支持体；物质传递；生物工程平台；测试物质对细胞作用的平台；细胞培养；以及众多其它用途。

II.定义

本文使用的单词“a”或“an”当和术语“包含”在句子和/或说明书中一起连用时，可指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”的含义相一致。本文使用的“另一个”可指至少第二个或更多个。再进一步，术语“具有”、“包括”、“包含”和“含有”可交互使用，本领域技术人员会认识到这些术语是开放式术语。

本文使用的术语“cDNA”可指单链或双链DNA分子。对于单链cDNA分子，DNA链与由基因转录的信使RNA(“mRNA”)互补。对于双链cDNA分子，一条DNA链与mRNA互补，另一条链与第一条DNA链互补。

术语“保守置换”就蛋白或肽而言用于反映基本不改变分子活性(特异性或结合亲和性)的氨基酸置换。典型的保守氨基酸置换涉及用一个氨基酸置换另一个具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的氨基酸。以下的6组各自包含通常彼此为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。本发明的内化肽可经修饰以包含保守置换，只要置换不影响肽的内化能力。

本文使用的“编码序列”或“编码”特定蛋白的“核苷酸序列”是在处于合适的调节序列控制下时在体内或体外被转录和翻译为多肽的核酸分子。编码序列的边界由5′-末端的起始密码子和3′-末端的终止密码子确定。编码序列可包括但不限于原核核酸分子、真核mRNA的cDNA、真核(例如哺乳动物)源的基因组DNA、病毒RNA或DNA乃至合成核苷酸分子。转录终止序列通常位于编码序列的3′。

本文使用的蛋白“结构域”指肽序列的功能单元。例如，VPGVG是弹性蛋白结构域。另外，纤连蛋白的CS1区域是结构域。对于本发明目的，蛋白结构域不必具有任何特定结构或折叠特性。

本文使用的术语“工程蛋白”指非天然多肽。该术语包括例如相对于天然多肽含一个或多个改变(包括添加、缺失或置换)的多肽，其中这样的改变通过重组DNA技术引入。该术语还包括含人工产生的氨基酸序列的多肽、人工蛋白、融合蛋白和嵌合多肽。本领域技术人员可容易地生产按照本发明的此方面有用的工程蛋白。当几种所需蛋白片段或肽编码在掺入到载体中的核苷酸序列中时，本领域技术人员会认识到，可通过由一个或多个氨基酸组成的间隔分子(例如肽)分隔蛋白片段或肽。一般而言，除了将所需蛋白片段或肽连接在一起或保持它们之间的某些最小距离或其它空间关系以外，间隔区不具有特定的生物活性。但是，可选择间隔区的组成氨基酸，以影响分子的某些特性，例如折叠、净电荷或疏水性。可将用来产生可用于纯化所表达重组蛋白的残基的编码核苷酸序列构建入载体中。这样的序列是本领域已知的。例如，可将编码多组氨酸序列的核苷酸序列加入到载体中，以利于在镍柱上纯化表达的重组蛋白。一旦表达，就可按照本领域普通技术人员已知的标准方法，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等，来纯化重组肽、多肽和蛋白。优选约50-99％均一性的大致纯的组合物用作治疗剂，最优选80-95％或更高均一性的组合物用作治疗剂。工程蛋白可通过任何方法(包括例如肽、多肽或蛋白合成)生产。

本文使用的术语“基因”指直接或间接编码具有限定生物活性的核酸或蛋白产物的DNA分子。本领域经常遇到的一类基因是所谓的“报告基因”。报告基因是其表达用于检测与其有效连接的控制序列活性的任何基因。常用的报告基因的实例包括但不限于β-半乳糖苷酶基因、氯霉素氨基转移酶(CAT)基因、荧光素酶(luc)基因和荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)等)编码基因。理想的是，报告基因不干扰作为研究靶标的基础生物过程。但是，在某些情况下，可能需要通过将控制序列连接至其产物不改变其中发生基因表达的系统的基础生物学的基因来检测控制序列活性。这样的基因尽管也是报告基因，但通常称为“生物活性”基因。

本文使用的术语“基因组DNA”指由其转录RNA分子的DNA分子。RNA分子最常见的是信使RNA(mRNA)分子，其最终被转录为具有限定生物活性的蛋白，但作为选择，可为转移RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)分子，它们是蛋白合成过程的介导物。

如本文所用，两个核酸分子在共有两个或多个可定量的生物功能时是“功能等同物”。例如，一级序列不同的核酸分子可编码相同的多肽；这样的分子尽管不同，却是功能等同物。在该实例中，这些分子也可共有高度的序列同源性。同样，一级序列不同的核酸分子可共有作为RNA转录启动子的活性，其中所述RNA转录发生在特定细胞亚群中，并响应于一组独特的调节物质；这样的核酸分子也是功能等同物。

本文使用的DNA构建物的“异源”区是另一个DNA分子中或连接至另一个DNA分子的可鉴别DNA区段，未发现其与另一个分子天然相连。异源编码序列的实例是其中编码序列自身天然不存在的构建物(例如密码子不同于天然基因的合成序列)。等位基因变体或天然突变事件不产生如本文所使用的DNA异源区。

如本文所用，据使用标准序列分析软件如Vector NTI、GCG或BLAST的测定，当两个核酸分子在分子的限定长度内，包含的至少约60％-75％、优选至少约80％或最优选至少约90％的核苷酸相同时，两个核酸分子是“同源”的。同源的DNA序列可通过在所限定特定系统的严格条件下杂交来鉴别。限定合适杂交条件属于本领域技术范围。参见例如1989年第一次印刷但每年更新的Current Protocols inMolecular Biology，卷I.Ausubel等编辑，John Wiley：New York N.Y.，2.10.1-2.10.16页，其中可通过使用在含0.1-2xSSC(15-30mM NaCl、1.5-3mM柠檬酸钠，pH7.0)和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中于65-68℃或更高温度反复漂洗，达到固定在硝酸纤维素滤膜上的DNA样品的最大杂交特异性。对于固定在尼龙滤膜上的DNA样品，严格杂交漂洗溶液可由40mM NaPO₄，pH7.2、1-2％SDS和1mMEDTA组成。再者，推荐至少65-68℃的漂洗温度，但真正严格漂洗需要的最佳温度将取决于核酸探针的长度、其GC含量、单价阳离子的浓度和甲酰胺的浓度，如果有甲酰胺的话，其包含于杂交溶液中(Current Protocols in Molecular Biology，卷I.Ausubel等编辑，JohnWiley：New York N.Y.，2.10.1-2.10.16页，1989和每年更新)。

本文使用的术语“核酸分子”现包括DNA，也包括RNA，除非另有说明，否则既包括双链核酸，也包括单链核酸。还包括同时含DNA和RNA的分子，或者为DNA/RNA异源双链体(也称为DNA/RNA杂合体)或者为在同一条链同时含DNA和RNA的嵌合分子。本发明的核酸分子可包含修饰碱基。本发明提供“有义”方向(即与基因编码链方向相同)和“反义”方向(即与基因编码链互补的方向)的核酸分子。

本文使用的术语“有效连接的”指核酸分子的排列，其中配置所述组分，以实现其常用功能。

术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文用于指一列线性的氨基酸残基，其通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键一个接一个连接。氨基酸残基优选为天然“L”异构形。但是，可用“D”异构形残基取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留了所需功能特性。另外，除20个“标准”氨基酸以外，氨基酸还包括修饰的和不常见的氨基酸。而且，应当注意的是，在氨基酸残基序列开始或结束处的破折号表示与具有一个或多个氨基酸残基的其它序列连接的肽键或与羧基或羟基末端基团连接的共价键。

如本文所用，可通过称为“转导”、“转染”或“转化”的过程将外源DNA导入到细胞中。转导指经病毒来源的载体穿过真核细胞膜导入为RNA或DNA的遗传物质。转染指利用化学方法(如通过磷酸钙介导的沉淀)、机械方法(例如电穿孔)或物理方法(例如生物弹道传递)穿过真核细胞膜导入遗传物质。转化指利用化学、机械、物理或生物方法将遗传物质导入到非真核细胞(例如细菌细胞或酵母细胞)中。传递到细胞中的遗传物质可整合(共价连接)或不整合到染色体DNA中。

III.角膜上皮

角膜具有几种重要的视觉功能，例如将＞80％的入射光折射在视网膜上、滤出有害的UV射线和保持光学“窗口”。角膜由5个结构层组成：上皮、前界层、基质、Descemet膜和内皮。最外层角膜上皮是多层结构，具有胞间连接、化学信号传导和神经末梢的复杂排列。和整个机体内的其它上皮层类似，角膜上皮阻止病原体进入、提供抗体液流失的屏障和保护免受擦伤伤害。上皮仅通过一层液体泪液和外部环境分开。

角膜上皮由三种类型的细胞组成—基细胞(1层)、翼状细胞(1-3层)和扁平细胞(3-4层)，它们通过紧密细胞连接彼此粘附。基细胞还与支持性胞外基质形成强粘附复合物，并最终与前界层形成强粘附复合物。前界层是角膜基质的最外层，是由胶原纤维和相连的蛋白多糖组成的无细胞区，它们以随机方式密集编织成毡样基质。在上皮的细胞中，仅基细胞具有有丝分裂能力。和机体内所有复层上皮一样，角膜上皮是自我更新的；每5-7天就发生一次彻底的细胞更新。一般来说，在基细胞经历有丝分裂后，子细胞开始向外迁移，向终末分化，并最终脱皮。参见C.Hanna等，“Cell production and migrationin the epithelial layer of the cornea，”Arch.Ophthalmol.，64卷，536页(1960)。

在本发明的某些实施方案中，设想本发明的眼工程蛋白制品，包括角膜高嵌体、人工晶状体或接触透镜，将在制品表面上呈现出上皮细胞的汇合生长。另外，在本发明的某些实施方案中，工程蛋白制品将表现出对降解和排斥的抗性。在某些实施方案中，工程蛋白包含促进神经穿过植入体生长的组分，如神经生长因子的功能片段。在某些实施方案中，合适时，可使用手术技术使本发明的高嵌体通过物理粘附附着于角膜基质。在其它实施方案中，角膜高嵌体可借助生物粘附胶粘剂如血纤蛋白组织胶粘剂粘附于角膜。在某些实施方案中，可通过手术(或在具体实施方案中借助激光)在角膜上皮和前界层之间创建手术囊袋或膜瓣。然后可将本发明的晶状体植入到膜瓣下或囊袋中，而无需使用生物胶粘剂。本领域技术人员知晓，可能需要些许设计修改，以修改工程蛋白设计或工程蛋白产物形状、提升某些优势，例如增强角膜中高嵌体和前界层之间的粘附。

IV.工程蛋白

本发明的工程蛋白可为任何蛋白，其在交联或形成成型制品时，具有有利眼特性，例如弹性、透明度、生物相容性等。在本发明的某些实施方案中，工程蛋白是融合蛋白或嵌合蛋白。在本发明的某些实施方案中，工程蛋白由各种蛋白来源的人蛋白结构域组合制成。在本发明的一个实施方案中，工程蛋白包含至少一个来自人胞外基质蛋白的结构域。在本发明的另一个实施方案中，人蛋白结构域是已经过修饰从而增加了工程蛋白有利眼特性的野生型蛋白变体。

适用于工程蛋白的结构域或蛋白片段的一个实例是弹性蛋白结构域。弹性蛋白(SEQ ID NO：29)是提供巨大强度和弹性的结构分子。其抗分解。其序列主要由疏水氨基酸的简单重复序列组成。弹性蛋白的重要特征是发生在赖氨酸残基上的其多肽链之间的广泛交联，这是弹性蛋白独特结构和不溶性的原因。弹性蛋白的一个典型重复序列是VPGVG。纤连蛋白(SEQ ID NO：28)是由称为I、II和III型的三种原型结构域的同源重复序列组成的模块式蛋白质(modularprotein)。纤连蛋白III型(FN3)重复序列是最大且最常见的纤连蛋白亚结构域。FN3表现出功能以及结构模块性。业已将与其它分子相互作用的位点作图至短氨基酸序列段上，例如存在于各种FN3结构域中的Arg-Gly-Asp(RGD)序列。RGD序列参与和整合素的相互作用。含RGD序列的小肽可调节各种与血栓形成、炎症和肿瘤转移相关的细胞粘附事件。在角膜中，已知纤连蛋白在伤口愈合中起重要作用：其触发上皮细胞生长、迁移和粘附至下面的胞外基质。已知含FN3结构域的一些其它蛋白是：接触蛋白2或axonin-1蛋白、胶原蛋白α1链、神经细胞粘附蛋白L1、白细胞共同抗原和接触蛋白。

一般而言，区段包括组成蛋白中存在的肽序列的重复氨基酸组。定性地看，基因工程蛋白与天然存在的连续多肽的区别在于：其区段重复序列的长度可以更大(达数百个氨基酸，相比之下连续多肽少于10个)，其区段重复序列的序列几乎可无限复杂。表1描述了基因工程区段的实例。表1和基因工程区段的进一步描述可见于Franco A.Ferrari和Joseph Cappello，Biosynthesis of Protein Polymers，载于：Protein-Based Materials，(Kevin McGrath和David Kaplan编辑)，第2章，37-60页，Birkhauser，Boston(1997)。本发明的工程蛋白可包含任何顺序、任意重复序列数、与任何其它合适结构域(例如纤连蛋白结构域和弹性蛋白结构域)组合的任何以下序列，从而提供在形成晶状体或人工组织时提供有利眼特性的蛋白。本发明的工程蛋白还包括本文所述任意序列的功能变体。在本发明的某些实施方案中，功能变体与其参比序列具有至少80％的序列同源性。

表1蛋白聚合物序列

聚合物名称	单体氨基酸序列
聚合物名称	单体氨基酸序列	SLP 3(SEQ ID NO：5)	[(GAGAGS)₉GAAGY)]
SLP 4(SEQ ID NO：6)	(GAGAGS)_n	SLP 3(SEQ ID NO：5)	[(GAGAGS)₉GAAGY)]
SLP 4(SEQ ID NO：6)	(GAGAGS)_n	SLP F(SEQ ID NO：7)	[(GAGAGS)₉GAAVTGRGDSPASAAGY]_n
SLP L3.0(SEQ ID NO：8)	[(GAGAGS)₉GAAPGASIKVAVSAGPSAGY]_n	SLP F(SEQ ID NO：7)	[(GAGAGS)₉GAAVTGRGDSPASAAGY]_n
SLP L3.0(SEQ ID NO：8)	[(GAGAGS)₉GAAPGASIKVAVSAGPSAGY]_n	SLP L3.1(SEQ ID NO：9)	[(GAGAGS)₉GAAPGASIKVAVSGPSAGY]_n
SLP F9(SEQ ID NO：10)	[(GAGAGS)₉RYVVLPRPVCFEKAAGY]_n	SLP L3.1(SEQ ID NO：9)	[(GAGAGS)₉GAAPGASIKVAVSGPSAGY]_n
SLP F9(SEQ ID NO：10)	[(GAGAGS)₉RYVVLPRPVCFEKAAGY]_n	ELP I(SEQ IDNO：11)	[(VPGVG)₄]_n
SELP 0(SEQ IDNO：12)	[(GVGVP)₈(GAGAGS)₂]_n	ELP I(SEQ IDNO：11)	[(VPGVG)₄]_n
SELP 0(SEQ IDNO：12)	[(GVGVP)₈(GAGAGS)₂]_n	SELP 1(SEQ ID NO：13)	[GAA(VPGVG)₄VAAGY(GAGAGS)₉]_n
SELP 2(SEQ ID NO：14)	[(GAGAGS)₆GAAGY(GAGAGS)₈(GVGVP)₈]_n	SELP 1(SEQ ID NO：13)	[GAA(VPGVG)₄VAAGY(GAGAGS)₉]_n

SELP 3(SEQ ID NO：15)	[(GVGVP)₈(GAGAGS₈]_n
SELP 3(SEQ ID NO：15)	[(GVGVP)₈(GAGAGS₈]_n	SELP 4(SEQ ID NO：16)	[(GVGVP)₁₂(GAGAGS)₈]_n
SELP 5(SEQ ID NO：17)	[(GVGVP)₁₆(GAGAGS)₈]_n	SELP 4(SEQ ID NO：16)	[(GVGVP)₁₂(GAGAGS)₈]_n
SELP 5(SEQ ID NO：17)	[(GVGVP)₁₆(GAGAGS)₈]_n	SELP 6(SEQ ID NO：18)	[(GVGVP)₃₂(GAGAGS)₈]_n
SELP 7(SEQ ID NO：19)	[(GVGVP)₈(GAGAGS)₆]_n	SELP 6(SEQ ID NO：18)	[(GVGVP)₃₂(GAGAGS)₈]_n
SELP 7(SEQ ID NO：19)	[(GVGVP)₈(GAGAGS)₆]_n	SELP 8(SEQ ID NO：20)	[(GVGVP)₈(GAGAGS)₄]_n
KLP 1.2(SEQ ID NO：21)	[(AKLKLAEAKLELAE)₄]_n	SELP 8(SEQ ID NO：20)	[(GVGVP)₈(GAGAGS)₄]_n
KLP 1.2(SEQ ID NO：21)	[(AKLKLAEAKLELAE)₄]_n	CLP 1(SEQ ID NO：22)	[GAP(GPP)₄]_n
CLP 2(SEQ IDNO：23)	{[GAP(GPP)₄]₂ GPAGPVGSP}_n	CLP 1(SEQ ID NO：22)	[GAP(GPP)₄]_n
CLP 2(SEQ IDNO：23)	{[GAP(GPP)₄]₂ GPAGPVGSP}_n	CLP-CB(SEQ ID NO：24)	{[GAP(GPP)₄]₂(GLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGPA)GPAGPVGS-P}_n
CLP 3(SEQ ID NO：25)	(GAPGAPGSQGAPGLQ)_n	CLP-CB(SEQ ID NO：24)	{[GAP(GPP)₄]₂(GLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGPA)GPAGPVGS-P}_n

选定蛋白聚合物的重复氨基酸序列。SLP＝丝样蛋白；SLPF＝含纤连蛋白RGD序列的SLP；SLPL 3/0和SLPL 3/1＝含层粘连蛋白的两个不同序列的SLP；ELP＝弹性蛋白样蛋白；SELP＝丝状弹性蛋白样蛋白；CLP＝胶原蛋白样蛋白；CLP-CB＝含人胶原蛋白细胞结合结构域的CLP；KLP＝角蛋白样蛋白。

工程蛋白的实施方案包括交联蛋白产物。可通过使蛋白与合适的生物相容性交联剂反应而交联蛋白。交联剂包括但不限于戊二醛、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯、对叠氮苯甲酰肼(p-AzidobenzolylHydazine)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酸亚胺、4-[对叠氮基水杨基酰氨基]丁胺、任何其它合适的交联剂及其任意组合。各种交联剂的描述和罗列以及用这样的交联剂实施交联步骤的方法的公开内容可见于Pierce Endogen 2001-2002目录，其在此引入作为参考。工程蛋白可利用本领域一般已知的方法交联。例如，可通过使工程蛋白装置暴露于气态交联剂、液态交联剂、光或其组合或与其接触和/或温育，使工程蛋白部分或全部地交联。

可调节的生物医学植入体，例如角膜植入体，可通过使工程蛋白含对光化学交联敏感的反应性侧链而由工程蛋白制备。使丙烯酰或异丁烯酰基团连接至蛋白的赖氨酸侧链产生可通过激光辐射交联的光固化变体。包含类似地官能化的低分子量蛋白提供了通过图案照射和低分子量物质在渗透梯度作用下扩散从而改变植入体局部曲率的基础。在达到目的形状变化后，通过进一步照射整个植入体“锁定”结构。

本发明的工程蛋白还可包括治疗性肽片段，以在蛋白用作例如晶状体时提供给患者治疗利益。

V.肽合成

本发明的工程蛋白可按照本领域技术人员众所周知的肽合成技术合成(Bodanszky等，1976；)Peptide Synthesis，1985；Solid PhasePeptide Synthelia，1984)；The Proteins，1976。适用于此合成的保护基可见于以上文献以及载于：Protective Groups in Organic Chemistry，1973。这些合成方法包括序贯加入一个或多个氨基酸或合适的受保护氨基酸残基，以增长肽链。通常，第一个氨基酸残基的氨基或羧基的任一个受到合适的、可选择性去除的保护基保护。不同的可选择性去除的保护基用于含反应性侧基的氨基酸，例如赖氨酸。

使用固相合成作为实例，通过其未被保护的羧基或氨基将受保护或衍化的氨基酸连接至惰性固体支持体。然后选择性去除氨基或羧基的保护基，与序列中具有适当受保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸混合，并与已连接至固体支持体的残基反应。然后去除此新加入的氨基酸残基中的氨基或羧基的保护基，接着加入下一个氨基酸(适当受保护)，以此类推。在所有需要的氨基酸都以正确的顺序连接后，序贯或同时去除任何剩余的端基和侧基保护基(和固体支持体)，以提供最终的肽。本发明的肽优选没有苄化或甲苄化的氨基酸。这样的保护基部分可用于合成过程，但其在使用肽之前去除。如其它文献所述，可能需要另外的反应，以形成抑制构象的分子内键合。

VI.融合蛋白

本发明涉及工程蛋白，其可为重组蛋白。在本发明的某些实施方案中，融合蛋白可能是有用的。融合蛋白一般可使用标准技术制备，包括化学缀合。优选融合蛋白表达为重组蛋白，使得可在表达系统中相对于非融合蛋白以增加水平生产。简言之，编码多肽组分的DNA序列可单独装配，并连接入合适的表达载体中。用或不用肽接头，将编码一种多肽组分的DNA序列的3′末端连接至编码第二种多肽组分的DNA序列的5′末端，以使序列读框一致。这允许翻译为单个融合蛋白，其保有两种组成多肽的生物活性。

可使用肽接头序列以足以确保每个多肽折叠成其二级或三级结构的距离分隔第一种和第二种多肽组分。使用本领域众所周知的标准技术将这样的肽接头序列掺入到融合蛋白中。可根据以下因素选择合适的肽接头序列：(1)其采用柔性延长构象的能力；(2)其不能采用可与第一种和第二种多肽上的功能表位相互作用的二级结构；和(3)没有可与多肽功能表位反应的疏水或带电残基。优选的肽接头序列包含Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，如Thr和Ala，也可用于接头序列。可有效地用作接头的氨基酸序列包括公开于Maratea等，Gene 40：39-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad Sci.USA83：8258-8262，1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号的那些序列。接头序列长度一般可为1至约50个氨基酸。当第一种和第二种多肽具有可用于分隔功能结构域和防止空间干扰的非必需N-端氨基酸区时，不需要接头序列。

已连接的DNA序列有效连接至合适的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件只位于第一种多肽编码DNA序列的5′。同样，终止翻译所需的终止密码子和转录终止信号只存在于第二种多肽编码DNA序列的3′。

VII.蛋白表达系统

本发明的工程蛋白可重组生产。可使用原核和/或真核型系统，按照本发明的使用方式，生产核酸序列或其关联多肽、蛋白或肽。许多这样的系统在商业上是可广泛获取的。

昆虫细胞/杆状病毒系统可产生异源核酸区段的高水平蛋白表达，例如述于美国专利第5,871,986、4,879,236号，这两个专利都在此引入作为参考，此系统例如可按照名称Invitrogen的MaxBac2.0和Clontech的BacPack^TM Baculovirus Expression System购买。

表达系统的其它实例包括含有合成蜕皮素诱导型受体的Stratagene的Complete Control^TM诱导型哺乳动物表达系统，或其pET表达系统、大肠杆菌表达系统。诱导型表达系统的另一个实例可得自Invitrogen，其出售T-Rex^TM(四环素调节表达)系统，该系统是使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。Invitrogen还提供叫做甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达系统的酵母表达系统，其设计用于在甲基营养酵母甲醇毕赤酵母中高水平生产重组蛋白。本领域技术人员应知晓如何表达载体(例如表达构建物)、生产核酸序列或其关连多肽、蛋白或肽。

设想可使通过本发明方法生产的蛋白、多肽或肽“过表达”，即相对于其在细胞中的天然表达以增加水平表达。这样的过表达可通过各种各样的方法评价，包括放射性标记和/或蛋白纯化。但是，优选简单直接的方法，例如包括SDS/PAGE和蛋白染色或蛋白质印迹分析接着进行定量分析(例如光密度扫描所获得的凝胶或印迹)的那些方法。相比于在天然细胞中的水平，重组蛋白、多肽或肽的水平特异性增加是过表达的标志，特定蛋白、多肽或肽相对于宿主细胞生产的其它蛋白的相对丰余并例如在凝胶上可见也是过表达的标志。

在某些实施方案中，表达的蛋白质序列在宿主细胞中形成内含体，宿主细胞例如通过在细胞匀浆器中破碎而裂解，清洗和/或离心，以将密集的内含体和细胞膜与可溶性细胞组分分离。此离心可在以下条件下进行：通过将糖(例如蔗糖)加入到缓冲液中并以选定速度离心，选择性富集密集的内含体。在还原剂(例如β-巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇))存在下，内含体可溶解在含高浓度尿素(例如8M)或离液剂(例如盐酸胍)的溶液中，并重折叠成更理想的构象，这是本领域一般技术人员所知晓的。

VIII.蛋白质组合物

在某些实施方案中，本发明的工程蛋白可为蛋白质分子。本文使用的“蛋白质分子”、“蛋白质组合物”、“蛋白质化合物”、“蛋白质链”或“蛋白质材料”一般是指但不限于至少两个氨基酸的蛋白或多肽。上述所有的“蛋白质”术语在本文都可交互使用。另外，术语蛋白、肽和多肽在本文可交互使用。

在某些实施方案中，至少一种蛋白质分子或工程蛋白的大小可包含但不限于具有约2个至约2500个或更多氨基分子残基的分子，以及由此可推论的任何范围。本发明包括本文论述的任意序列的连续氨基酸的那些长度。

本文使用的“氨基分子”指本领域一般技术人员应知晓的任意氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质分子的残基是连续的，没有任何非氨基分子中断氨基分子残基的序列。在其它实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基分子部分。在具体的实施方案中，蛋白质分子残基的序列可被一个或多个非氨基分子部分中断。

因此，术语“蛋白质组合物”包括含天然合成蛋白中20种常见氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰或不常见氨基酸的氨基分子序列。

在某些实施方案中，蛋白质组合物包含至少一种蛋白、多肽或肽。在进一步的实施方案中，蛋白质组合物包含生物相容性蛋白、多肽或肽。本文使用的术语“生物相容性”指当按照本文描述的方法和量应用于或给予给定生物时不产生显著的不适当作用的物质。此不适当或不需要的作用是例如显著毒性或不利免疫反应的那些作用。在优选实施方案中，组合物包含的生物相容性蛋白、多肽或肽一般为哺乳动物蛋白或肽或合成蛋白或肽，其中每种都基本无毒素、病原体或有害免疫原。

蛋白质组合物可利用本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白、多肽或肽；由天然来源分离蛋白质组合物或化学合成蛋白质材料。各种基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽序列先前已公开，并可在本领域一般技术人员知晓的计算机化数据库中查找。一个此类数据库是美国国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库。这些已知基因的编码区可使用本文公开的技术或本领域一般技术人员已知的技术扩增和/或表达。另一方面，本领域技术人员知晓蛋白、多肽和肽的各种商业化制品。

在某些实施方案中，可对蛋白质化合物进行纯化。一般来说，“纯化的”指特定的或蛋白、多肽或肽组合物，其已经过分级分离，去除了各种其它蛋白、多肽或肽，该组合物基本上保留了其活性，可通过例如蛋白质测定评价，所述测定对于特定的或所需的蛋白、多肽或肽的组合物而言应是本领域一般技术人员所知晓的。

设想实际上任何含蛋白、多肽或肽的组分都可用于本文公开的组合物和方法。但是，优选蛋白质材料是生物相容性的。在某些实施方案中，设想形成更粘稠的组合物是有利的，因为这将使组合物更精确或容易地应用于组织，并在整个过程中保持与组织接触。在此情况下，设想使用肽组合物，或更优选设想使用多肽或蛋白组合物。粘度范围包括但不限于约40至约100泊。在某些方面，优选约80至约100泊的粘度。

IX.蛋白质组合物的变体

本发明蛋白、多肽和肽的氨基酸序列变体可为置换、插入或缺失变体。缺失变体缺少天然蛋白中一个或多个功能和免疫原性非必需的残基。另一种常见类型的缺失变体是缺少引导蛋白结合细胞特定部分的分泌信号序列或信号序列的变体。插入突变通常包括在多肽的非末端点加入材料。这可包括插入免疫反应性表位或仅插入单个残基。末端加入叫做融合蛋白，这在下文论述。

置换变体通常包含在蛋白中的一个或多个位点上一个氨基酸交换为另一个氨基酸，可用来调节多肽的一种或多种特性，例如抗蛋白水解切割的稳定性，而没有损失其它功能或特性。这类置换优选是保守置换，即一个氨基酸被另一个具相似形状或电荷的氨基酸所取代。保守置换在本领域众所周知，包括例如丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。

术语“生物学功能等同物”在本领域众所周知，在下文进一步详细定义。因此，保持这样序列：其约70％至约80％、更优选约81％至约90％、乃至更优选约91％至约99％的氨基酸与肽模拟物氨基酸相同或功能等同，且提供肽模拟物生物学活性。(参见表1，以下是功能等同密码子的列表)。

表2

密码子表

氨基酸	ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY	密码子
氨基酸		密码子	丙氨酸 Ala半胱氨酸 Cys天冬氨酸 Asp谷氨酸 Glu苯丙氨酸 Phe甘氨酸 Gly组氨酸 His异亮氨酸 Ile赖氨酸 Lys亮氨酸 Leu甲硫氨酸 Met天冬酰胺 Asn脯氨酸 Pro谷氨酰胺 Gln精氨酸 Arg丝氨酸 Ser苏氨酸 Thr缬氨酸 Val色氨酸 Trp酪氨酸 Tyr	GCA GCC GCG GCUUGC UGUGAC GAUGAA GAGUUC UUUGGA GGC GGG GGUCAC CAUAUA AUC AUUAAA AAGUUA UUG CUA CUC CUG CUUAUGAAC AAUCCA CCC CCG CCUCAA CAGAGA AGG CGA CGC CGG CGUAGC AGU UCA UCC UCG UCUACA ACC ACG ACUGUA GUC GUG GUUUGGUAC UAU

以下是基于改变蛋白的氨基酸而产生等同乃至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可置换蛋白结构中的其它氨基酸，而与结构(例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点)的互作结合能力没有明显损失。因为正是蛋白的互作能力和特性限定了蛋白的生物学功能活性，所以可在蛋白序列、以及在作为其基础的DNA编码序列中实施某些氨基酸置换，仍然可产生具有类似特性的蛋白。因此，如下文所述，本发明的发明人设想可在基因的DNA序列中实施各种改变，而其生物实用性或活性没有明显损失。

在进行这些改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。一般来说，本领域理解赋予蛋白互作生物功能的亲水氨基酸指数的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。一般公认，氨基酸的相对亲水特征影响所获蛋白的二级结构，二级结构又限定了蛋白与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

在本领域还会理解的是，可在亲水性基础上有效进行类似氨基酸的置换。美国专利4,554,101指出，蛋白的最大局部平均亲水性由其邻近氨基酸的亲水性掌控，与蛋白的生物学特性有关联，该专利在此引入作为参考。如美国专利4,554,101的详述，已赋予氨基酸残基以下的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸^*-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

当然，某氨基酸可置换另一个具有相似亲水性值的氨基酸，仍产生生物学等同和免疫学等同的蛋白。在此变化中，优选其亲水性值在±2之内的氨基酸置换，特别优选亲水性值在±1之内的氨基酸置换，甚至更特别优选亲水性值在±0.5之内的氨基酸置换。

如上所概述，氨基酸置换一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的代表性置换对本领域技术人员是周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

实施例

包含以下的实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到，以下实施例中所公开的技术代表了本发明人发现的、在实施本发明时运行良好的技术，因此可被认为是构成了本发明实施的优选模式。但是，本领域技术人员应当意识到，按照本文公开内容，可对公开的具体实施方案进行多种变化，仍可获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1

aECM蛋白“aE-RGD”的克隆和表达

蛋白aE-RGD具有氨基酸序列：M-MASMTGGQQMG-HHHHHHH-DDDDK-(LD-YAVTGRGDSPASSKPIA((VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂)₄VP)₃-LE(SEQID NO：1)，其包含用于蛋白质印迹鉴别的T7标志，可用于纯化的6-His标志、允许酶去除T7和6-His标志的肠激酶切割位点以及三个细胞结合弹性蛋白样结构域的可变重复序列。17个氨基酸的细胞结合结构域包含RGD，其得自纤连蛋白III型结构域的1/10；其用作α_vβ₃和α₅β₁整联蛋白的配体。其它细胞结合结构域包括纤连蛋白的CS1和CS5结构域，也已被基因工程改造为相同的设计，以代替RGD结构域。可由这些或其它潜在的生物活性结构域选择细胞结合结构域，以激发最有利的细胞应答。弹性蛋白样结构域是得自哺乳动物弹性蛋白的(VPGVG)_x基序的修饰形式。赖氨酸残基掺入到弹性蛋白样结构域中，以允许通过其亲核侧链进行特异性交联。还可使用其它交联化学方法，包括光交联。

进行标准的克隆、细菌培养、蛋白表达、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹方法，以生产aE-RGD。aE-RGD的基因处于pET28表达载体中的T7噬菌体启动子控制之下，并转化入蛋白表达宿主BL21(DE3)pLysS中。

使用“Terrific Broth”培养基pH7.4，在10L发酵罐(NewBrunswick Scientific BioFlo 3000)中培养宿主细胞。在光密度约为6时，用异丙基-1-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导蛋白表达；在诱导后1.5小时通过于4℃离心收获细胞。

实施例2

aE-RGD蛋白的纯化

将含表达的aE-RGD蛋白的细胞重悬浮在0.5g/mL浓度的TEN缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，100mM NaCl)中，并于-20℃冷冻。将悬浮液解冻，裂解细胞，与10μg/mL脱氧核糖核酸酶I、10μg/mL核糖核酸酶A、5mM氯化镁和1mM用于抑制蛋白水解的苯甲基磺酰氟于37℃振摇3小时或于4℃振摇过夜aE-RGD的低临界溶解温度(LCST)性状(其中随着温度增加，蛋白与水性溶液分离)使得蛋白可通过循环变温(aE-RGD在水中的LCST是35℃)纯化。将细胞裂解液的pH调节至9.0，以确保蛋白溶解性，并在LCST以下离心(约1小时，39,750g，4℃)。向上清液(含所述蛋白)中加入1M NaCl，在LCST以上再次离心(约1小时，39,750g，37℃)。将沉淀以50-100mg/mL的浓度再分散在水中。重复循环变温两次，每次蛋白的纯度(SDS-PAGE)都增加。

含aE-RGD蛋白的溶液于4℃透析3天，以去除杂质，并冻干。蛋白的纯度和分子量通过SDS-PAGE凝胶、蛋白质印迹、氨基酸分析和基质辅助激光解吸电离-质谱(MALDI-MS)验证。内毒素水平可通过相似的纯化过程降低至公认的标准。使用这些步骤的典型10L发酵获得1-2g aE-RGD。

实施例3

交联aE-RGD以形成角膜高嵌体

用辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯(BS3)在水中于4℃交联aE-RGD，产生具有0.2Mpa弹性模数的薄膜，其在生理温度时保持透明。使用6mm光学直径和7.5mm半径的两片式PMMA模制品，用此化学方法制作角膜高嵌体晶状体。所有的操作都在4℃进行，完全处于aE-RGD的LCST之下，以确保透明性。对于每个批次，将20mgaE-RGD溶解在55μL水中，然后混合刚刚溶解在20μL水中的2.3mgBS3(BS3中的N-羟基琥珀酰亚胺酯基团与蛋白中的伯胺是化学计量的)。样品在台式离心机上快速旋转(10秒)，以去除混合时引入的气泡，将12μL混合物以移液管移入5个模制品的每一个中，这些模制品在重力(300g)下装配，于4℃过夜交联。测试了几个晶状体的弹性模数，一致观测到约0.2Mpa的值。通过将晶状体与过量水和乙醇接触去除污染物和反应副产物，将经淋洗的晶状体储存于加湿容器中待用。

实施例4

手术

使用吸入3％异氟烷和局部丙氧苯卡因麻醉用于研究的兔(n＝12)。在整个手术过程中，细心监测动物的生命指征，包括角膜反射、心率、呼吸和氧饱和度。使角膜高嵌体粘附的最初尝试并未成功。用聚维酮碘溶液灌洗每只动物的右眼，将金属护睑板(wire lidspeculum)放置入眼中。通过刮擦去除中央角膜上皮的约7mm直径区域。将角膜高嵌体置于刮擦区域中央。兔眼睑眨眼使高嵌体移位。将Tisseel(血纤蛋白原组织封闭剂)应用于刮擦角膜，将高嵌体置于Tisseel上。Tisseel固化，形成可见的血纤蛋白凝块。

为了将高嵌体安全地粘附于刮擦角膜，如下所述在角膜中创建囊袋。用聚烯吡酮碘(Betadine)溶液灌洗每只动物的右眼，将金属护睑板(wire lid speculum)放置入眼中。使用3.0mm环钻在中央角膜创建一个深约100-200μm的部分皮层角膜切除。使用0.12钳和69刀片去除角膜切除基底的环钻区域中的基质薄层。这留下了3.0mm直径的环状角膜切除。使用锋利的囊袋刀片在角膜切除基底做一个2mm宽的环状皮层内囊袋，其沿圆周向外向角膜缘延伸。

制备了3组角膜。在组1(n＝1)中，创建伤口，但没有放入植入体。在组2(n＝8)中，构建相同的伤口，然后小心将5.0mm直径角膜高嵌体植入体放置在角膜表面上。使用钝头睫状体分离铲将植入体卷360°，放入具沟囊袋中。该组未布置缝线。在组3(n＝3)中，构造相同的伤口，在囊袋中放入植入体，然后在植入体上布置9-0尼龙缝线，以固定植入体。在植入后，用BSS溶液灌洗眼。在手术后给予兔卡布洛芬(Carprofen)止痛药(5mg/kg，肌内)注射。

实施例5

临床评价

在植入后1周内进行每日评价。密切跟踪动物不舒服或伤口感染的任何迹象。在有任何不舒服迹象时，给予动物1滴局部0.03％氟比洛芬，以及每24小时肌内注射5mg/kg卡洛芬。监测动物的体重。在初始步骤后每2-4天进行裂隙灯活组织镜检。使用蓝光荧光染色，以评价上皮再形成过程。记录上皮再形成的速度和程度以及任何炎症迹象。

实施例6

组织学

使用大动物标准指引使兔安乐死，该指引由肌内氯胺酮35-50mg/kg和甲苯噻嗪5-10mg/kg组成。每只动物还于不同的时间点接受心内注射戊巴比妥钠和经受双侧开胸。

将眼固定在戊二醛溶液中，并于不同的时间点进行组织学检查。用苏木精-曙红(H&E)、高碘酸-Schiff(PAS)、用于胶原蛋白的Mason三色染色和用于粘多糖的染色方法对载玻片进行染色。将染色切片封固，利用光学显微镜观察。组织学评价角膜植入体上的上皮生长模式。评价角膜基质内和植入体内二者的炎症程度。

光学显微镜术显示，在术后1周的组织学检查时间，上皮细胞覆盖了整个角膜植入体。覆盖在植入体上的角膜上皮显然是正常的，由几层细胞组成。角膜基质和植入体之间的界面并不明显。在一些情况下，可观察到角膜基质和角膜植入体有适量的炎性细胞，包括淋巴细胞和嗜中性粒细胞。在其它情况下，在植入体后方的角膜基质和角膜上皮看起来正常，没有炎症。

实施例7

电子显微镜术

通过电子显微镜术检查几只眼。对动物实施安乐死，如对光学显微镜术的描述固定眼。使用几只动物进行电子显微镜检查，以评价植入体和上皮界面。

实施例8

临床观察

植入体还良好耐受所述操作，因为其在手术过程中相对易于操作和耐用，只要其良好水合。所有的植入体都保持完整，并在环状基质囊袋中良好定位。在保持植入体的正确位置方面没有差异，无论是布置还是不布置缝线。在布置缝线的眼中，植入体显示出某些表面起皱现象，原因是布置在植入体上的缝线的张力。和对照相比，在所有具有植入体的眼中都观察到初始轻微至中度的炎症，如球结膜轻微充血和轻度角膜基质水肿所示。在任一只动物中都没有记录到显著的粘液或脓流出。

在所有情况下，上皮形成都是在角膜高嵌体暴露表面的周围开始，并向内向中心发展。完全上皮形成所需的时间在动物个体之间略有变化。所有的植入动物(组2和3)在96小时的时间点都部分地上皮再形成，所有动物到1周时间点时都完全上皮再形成。对比的对照眼在96小时时完全上皮再形成。动物良好耐受所述操作，没有手术并发症。

实施例9

上皮性状

通常，上皮细胞通过粘附复合物(包括半桥粒和固着性原纤维)固着于下面的基底膜。使用电子显微镜术观察高嵌体-上皮界面，以寻找在我们的长期研究中形成的这些结构。下一步是解决粘附于底部的前界层的问题。向蛋白中加入血纤蛋白原结构域可在凝血酶存在下促进粘附。

参考文献

在说明书中提及的所有专利和出版物都代表了本发明所属领域技术人员的水平。所有专利和出版物都在此引入作为参考，其程度如同各个单独的出版物被明确和个别指出在此引入作为参考。

美国专利第4,264,155号

美国专利公开第2002/0028243号

WO95/13764

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尽管已详细描述了本发明及其优势，但应当理解的是，可对此进行各种改变、替换和变化，而不偏离所附权利要求书限定的本发明。而且，本发明的范围无意限于说明书中描述的过程、机器、生产、物质组合物、手段、方法和步骤的具体实施方案。由于人们由公开内容能容易地意识到，可利用目前存在或以后开发的可实施和本文所述对应实施方案基本相同的功能或获得基本相同的结果的过程、机械、生产、物质组合物、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求书意欲将这样的过程、机械、生产、物质组合物、手段、方法或步骤包含在其范围内。

序列表

<110>Tirrell，David

Nowatzki，Paul

Schwartz，Daniel

Grubbs，Robert

<120>新型生物医学模制品

<130>P03092WOO

<140>未指定

<141>2005-01-21

<150>US60/552,029

<151>2004-03-10

<150>US 60/538,844

<151>2004-01-23

<160>29

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>389

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>1

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1 5 10 15

His His His Asp Asp Asp Asp Lys Leu Asp Tyr Ala Val Thr Gly Arg

20 25 30

Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ala Val Pro Gly Ile Gly

35 40 45

Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val

50 55 60

Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro

65 70 75 80

Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly

85 90 95

Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile

100 105 110

Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly

115 120 125

Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val

130 135 140

Pro Leu Asp Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser

145 150 155 160

Lys Pro Ile Ala Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro

165 170 175

Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly

180 185 190

Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile

195 200 205

Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly

210 215 220

Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val

225 230 235 240

Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro

245 250 255

Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Leu Asp Tyr Ala Val Thr

260 265 270

Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ala Val Pro Gly

275 280 285

Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile

290 295 300

Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly

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Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val

325 330 335

Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro

340 345 350

Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly

355 360 365

lle Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile

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<210>2

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<220>

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<212>PRT

<213>人工序列

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<223>合成蛋白质

<400>3

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1 5

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<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>4

Val Pro Gly Ile Gly

1 5

<210>5

<211>59

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>5

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Gly Tyr

50 55

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<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>6

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>7

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser

50 55 60

Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>8

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Pro Gly Ala Ser Ile Lys Val

50 55 60

Ala Val Ser Ala Gly Pro Ser Ala Gly Tyr

65 70

<210>9

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>9

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Pro Gly Ala Ser Ile Lys Val

50 55 60

Ala Val Ser Gly Pro Ser Ala Gly Tyr

65 70

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<212>PRT

<213>人工序列

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<223>合成蛋白质

<400>10

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Pro Val Cys

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Phe Glu Lys Ala Ala Gly Tyr

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<213>人工序列

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<223>合成蛋白质

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1 5 10 15

Pro Gly Val Gly

20

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>12

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Gly Ser

50

<210>13

<211>82

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>13

Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Ala Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala

20 25 30

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

50 55 60

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

65 70 75 80

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<213>人工序列

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<223>合成蛋白质

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1 5 10 15

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly

35 40 45

Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly

100 105 110

Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val

115 120 125

Pro

<210>15

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

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Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

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Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

65 70 75 80

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

85

<210>16

<211>108

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>16

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala

50 55 60

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Sar

85 90 95

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

100 105

<210>17

<211>128

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>17

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val

50 55 60

Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro

65 70 75 80

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

85 90 95

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

100 105 110

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

115 120 125

<210>18

<211>208

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>18

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val

50 55 60

Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro

65 70 75 80

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

85 90 95

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

100 105 110

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly

115 120 125

Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val

130 135 140

Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro

145 150 155 160

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala

165 170 175

Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

180 185 190

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

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<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>19

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

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Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

50 55 60

Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

65 70 75

<210>20

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>20

Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

1 5 10 15

Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val

20 25 30

Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser

50 55 60

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<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>21

Ala Lys Leu Lys Leu Ala Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu Ala Lys

1 5 10 15

Leu Lys Leu Ala Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu Ala Lys Leu Lys

20 25 30

Leu Ala Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu Ala Lys Leu Lys Leu Ala

35 40 45

Glu Ala Lys Leu Glu Leu Ala Glu

50 55

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<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>22

Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro

1 5 10 15

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<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>23

Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1 5 10 15

Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro

20 25 30

Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro

35

<210>24

<211>63

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>24

Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1 5 10 15

Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu

20 25 30

Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp

35 40 45

Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Ser Pro

50 55 60

<210>25

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>25

Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln

1 5 10 15

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<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>26

Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile

1 5 10 15

Ala

<210>27

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<213>人工序列

<220>

<223>合成蛋白质

<400>27

Leu Glu Gly Glu Glu Ile Gln Ile Gly His Ile Pro Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Asp Tyr His Leu Tyr Pro

20

<210>28

<211>2355

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<213>人纤连蛋白

<400>28

Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys

1 5 10 15

Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys Arg Gln

20 25 30

Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val Ala Val Ser Gln Ser

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Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr

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Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met Ile Trp Asp Cys Thr Cys Ile Gly Ala

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Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala Asn Arg Cys His Glu Gly

130 135 140

Gly Gln Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Thr Trp Arg Arg Pro His Glu Thr

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Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu

165 170 175

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180 185 190

Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Trp

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Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg lle Thr

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Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu

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Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly

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Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly

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Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu

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Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe

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Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn

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Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr

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530 535 540

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660 665 670

Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly

675 680 685

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Pro Val Thr Ser Asn Thr Val Thr Gly Glu Thr Thr Pro Phe Ser Pro

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Leu Val Ala Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Ile Thr Ala Ser Ser Phe

725 730 735

Val Val Ser Trp Val Ser Ala Ser Asp Thr Val Ser Gly Phe Arg Val

740 745 750

Glu Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Gly Asp Glu Pro Gln Tyr Leu Asp Leu

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Pro Ser Thr Ala Thr Ser Val Asn Ile Pro Asp Leu Leu Pro Gly Arg

770 775 780

Lys Tyr Ile Val Asn Val Tyr Gln Ile Ser Glu Asp Gly Glu Gln Ser

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Leu Ile Leu Ser Thr Ser Gln Thr Thr Ala Pro Asp Ala Pro Pro Asp

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Pro Thr Val Asp Gln Val Asp Asp Thr Ser Ile Val Val Arg Trp Ser

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835 840 845

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Tyr Ala Val Glu Glu Asn Gln Glu Ser Thr Pro Val Val Ile Gln Gln

885 890 895

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915 920 925

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1160 1165 1170

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1175 1180 1185

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1250 1255 1260

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Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu

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Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val

1310 1315 1320

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1325 1330 1335

Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg

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Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp

1355 1360 1365

Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala

1370 1375 1380

Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser

1385 1390 1395

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Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile

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Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln

1430 1435 1440

Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala

1445 1450 1455

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Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn

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Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val

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Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met

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Gln Val Thr Asp Val Gln Asp Asn Ser Ile Ser Val Lys Trp Leu

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Pro Ser Ser Ser Pro Val Thr Gly Tyr Arg Val Thr Thr Thr Pro

1565 1570 1575

Lys Asn Gly Pro Gly Pro Thr Lys Thr Lys Thr Ala Gly Pro Asp

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Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu Gly Leu Gln Pro Thr Val Glu Tyr

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Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu

1625 1630 1635

Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu

1640 1645 1650

Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser

1655 1660 1665

Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu

1670 1675 1680

Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr

1685 1690 1695

Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro

1700 1705 1710

Leu Ile Gly Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu

1715 1720 1725

Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr

1730 1735 1740

Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro

1745 1750 1755

Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp

1760 1765 1770

Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr

1775 1780 1785

Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro

1790 1795 1800

Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg

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Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser

1820 1825 1830

Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala

1835 1840 1845

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1850 1855 1860

Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp

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Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser

1880 1885 1890

Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn

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Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp

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Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu

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Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro

1940 1945 1950

Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu

1955 1960 1965

Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu

1970 1975 1980

Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val

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Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val

2000 2005 2010

Pro Ser Thr Val Gln Lys Thr Pro Phe Val Thr His Pro Gly Tyr

2015 2020 2025

Asp Thr Gly Asn Gly Ile Gln Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gln Gln

2030 2035 2040

Pro Ser Val Gly Gln Gln Met Ile Phe Glu Glu His Gly Phe Arg

2045 2050 2055

Arg Thr Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Pro Ile Arg His Arg Pro

2060 2065 2070

Arg Pro Tyr Pro Pro Asn Val Gly Gln Glu Ala Leu Ser Gln Thr

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Thr Ile Ser Trp Ala Pro Phe Gln Asp Thr Ser Glu Tyr Ile Ile

2090 2095 2100

Ser Cys His Pro Val Gly Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gln Phe Arg

2105 2110 2115

Val Pro Gly Thr Ser Thr Ser Ala Thr Leu Thr Gly Leu Thr Arg

2120 2125 2130

Gly Ala Thr Tyr Asn Ile Ile Val Glu Ala Leu Lys Asp Gln Gln

2135 2140 2145

Arg His Lys Val Arg Glu Glu Val Val Thr Val Gly Asn Ser Val

2150 2155 2160

Asn Glu Gly Leu Asn Gln Pro Thr Asp Asp Ser Cys Phe Asp Pro

2165 2170 2175

Tyr Thr Val Ser His Tyr Ala Val Gly Asp Glu Trp Glu Arg Met

2180 2185 2190

Ser Glu Ser Gly Phe Lys Leu Leu Cys Gln Cys Leu Gly Phe Gly

2195 2200 2205

Ser Gly His Phe Arg Cys Asp Ser Ser Arg Trp Cys His Asp Asn

2210 2215 2220

Gly Val Asn Tyr Lys Ile Gly Glu Lys Trp Asp Arg Gln Gly Glu

2225 2230 2235

Asn Gly Gln Met Met Ser Cys Thr Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly

2240 2245 2250

Glu Phe Lys Cys Asp Pro His Glu Ala Thr Cys Tyr Asp Asp Gly

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Lys Thr Tyr His Val Gly Glu Gln Trp Gln Lys Glu Tyr Leu Gly

2270 2275 2280

Ala Ile Cys Ser Cys Thr Cys Phe Gly Gly Gln Arg Gly Trp Arg

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Cys Asp Asn Cys Arg Arg Pro Gly Gly Glu Pro Ser Pro Glu Gly

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Thr Thr Gly Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Ser Gln Arg Tyr His Gln

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<210>29

<211>757

<212>PRT

<213>人弹性蛋白

<400>29

Met Ala Gly Leu Thr Ala Ala Ala Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Ile Leu His Pro Ser Arg Pro Gly Gly Val Pro Gly Ala

20 25 30

Ile Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly Val Phe Tyr Pro Gly Ala Gly Leu

35 40 45

Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Lys

50 55 60

Pro Val Pro Gly Gly Leu Ala Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Gly

65 70 75 80

Ala Phe Pro Ala Val Thr Phe Pro Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val

85 90 95

Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala Gly Ala Gly Leu

100 105 110

Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Val Ser Ala Gly Ala Val

115 120 125

Val Pro Gln Pro Gly Ala Gly Val Lys Pro Gly Lys Val Pro Gly Val

130 135 140

Gly Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Gly Val Leu Pro Gly Ala Arg Phe

145 150 155 160

Pro Gly Val Gly Val Leu Pro Gly Val Pro Thr Gly Ala Gly Val Lys

165 170 175

Pro Lys Ala Pro Gly Val Gly Gly Ala Phe Ala Gly Ile Pro Gly Val

180 185 190

Gly Pro Phe Gly Gly Pro Gln Pro Gly Val Pro Leu Gly Tyr Pro Ile

195 200 205

Lys Ala Pro Lys Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Pro Tyr Thr Thr Gly

210 215 220

Lys Leu Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly

225 230 235 240

Lys Ala Gly Tyr Pro Thr Gly Thr Gly Val Gly Pro Gln Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ala Gly

260 265 270

Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Pro Gly Ala

275 280 285

Ile Pro Gly Ile Gly Gly Ile Ala Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Ala

305 310 315 320

Gly Leu Val Pro Gly Gly Pro Gly Phe Gly Pro Gly Val Val Gly Val

325 330 335

Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro

340 345 350

Val Val Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Val

355 360 365

Ser Pro Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly

370 375 380

Ala Arg Pro Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Thr Tyr Gly Val Gly

385 390 395 400

Ala Gly Gly Phe Pro Gly Phe Gly Val Gly Val Gly Gly Ile Pro Gly

405 410 415

Val Ala Gly Val Pro Ser Val Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Val

420 425 430

Pro Gly Val Gly Ile Ser Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Lys

435 440 445

Ala Ala Lys Tyr Gly Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala

450 455 460

Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Pro Gly Val Gly Val Ala

465 470 475 480

Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly

485 490 495

Leu Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly Val Gly Val Ala Pro Gly

500 505 510

Val Gly Val Ala Pro Gly Ile Gly Pro Gly Gly Val Ala Ala Ala Ala

515 520 525

Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala

530 535 540

Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro Gly Leu Gly Val Gly Val Gly Val Pro

545 550 555 560

Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly

565 570 575

Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Asp Glu Gly Val Arg Arg Ser Leu

580 585 590

Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Asp Pro Ser Ser Ser Gln His Leu Pro

595 600 605

Ser Thr Pro Ser Ser Pro Arg Val Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Lys

610 615 620

Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Val Pro Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly

625 630 635 640

Ala Leu Gly Gly Val Gly Ile Pro Gly Gly Val Val Gly Ala Gly Pro

645 650 655

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe

660 665 670

Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu Gly Val Gly Gly Leu

675 680 685

Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Leu Gly Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala

690 695 700

Ala Lys Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Val Leu Gly

705 710 715 720

Gly Ala Gly Gln Phe Pro Leu Gly Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Phe

725 730 735

Gly Leu Ser Pro Ile Phe Pro Gly Gly Ala Cys Leu Gly Lys Ala Cys

740 745 750

Gly Arg Lys Arg Lys

755

Claims

1.含工程蛋白的晶状体，其中所述晶状体通过使工程蛋白交联而形成。

2.权利要求1的晶状体，其中所述工程蛋白含至少一个纤连蛋白样结构域和至少一个弹性蛋白样结构域。

3.权利要求2的晶状体，其中所述纤连蛋白样结构域含SEQ IDNO：26。

4.权利要求2的晶状体，其中所述纤连蛋白样结构域含SEQ IDNO：27。

5.权利要求2的晶状体，其中所述工程蛋白含SEQ ID NO：1。

6.权利要求1的晶状体，其中所述交联包括照射。

7.权利要求6的晶状体，其中所述照射包括激光照射。

8.权利要求1的晶状体，其中交联度是不均一的。

9.权利要求1的晶状体，其中所述交联以预定图案进行。

10.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体进一步经受第二次交联。

11.权利要求1的晶状体，其中所述工程蛋白通过将至少一个丙烯酰基或异丁烯酰基连接至该蛋白进行修饰。

12.权利要求1的晶状体，其中所述工程蛋白是低于约15千道尔顿的低分子量蛋白。

13.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体选自：接触透镜、角膜高嵌体、角膜嵌体和人工晶状体。

14.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体为角膜高嵌体。

15.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体为生物相容性的。

16.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体是光学透明的。

17.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体抗生物降解。

18.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体刺激邻近细胞粘附。

19.权利要求1的晶状体，其中所述晶状体具有0.05MPa至2.0MPa的弹性模数。

20.含工程蛋白的角膜移植片，其中所述移植片通过使工程蛋白交联而形成。

21.工程蛋白，其中所述蛋白含至少一个纤连蛋白样结构域和至少一个弹性蛋白样结构域。

22.权利要求21的工程蛋白，其中所述纤连蛋白样结构域包含CS1、CS5、RGD结构域或III型结构域。

23.权利要求21的工程蛋白，其中所述弹性蛋白样结构域包含VPGVG(SEQ ID NO：2)、VPGKG(SEQ ID NO：3)、VPGIG(SEQ IDNO：4)或其功能等同物。

24.权利要求21的工程蛋白，其中所述蛋白是交联的。

25.权利要求21的工程蛋白，其中所述纤连蛋白样结构域包含SEQ ID NO：26。

26.权利要求21的工程蛋白，其中所述纤连蛋白样结构域包含SEQ ID NO：27。

27.权利要求21的工程蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO：1。

28.权利要求21的工程蛋白，其中所述工程蛋白通过将一个或多个改变工程蛋白交联能力的实体连接至所述工程蛋白进行修饰。

29.权利要求21的工程蛋白，其中所述工程蛋白通过将至少一个丙烯酰基或异丁烯酰基连接至所述蛋白进行修饰。

30.权利要求21的工程蛋白，其中所述工程蛋白的分子量低于约15千道尔顿。

31.权利要求21的工程蛋白，其进一步包含丝心蛋白、弹性蛋白、角蛋白、胶原蛋白的重复区段或重复区段的组合。

32.包含工程蛋白的生物医学覆膜，其中所述蛋白含至少一个纤连蛋白样结构域和至少一个弹性蛋白样结构域。

33.通过在角膜中或角膜上植入含工程蛋白的角膜高嵌体矫正眼光学特性的方法，其中所述蛋白含至少一个纤连蛋白样结构域和至少一个弹性蛋白样结构域。

34.权利要求33的方法，其中所述高嵌体的表面刺激邻近细胞粘附于所植入的高嵌体。