CN107446039B - 一种人胰岛素类似物前体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人胰岛素类似物前体及其制备方法。具体而言，本发明涉及一种含有新型连接肽的人胰岛素类似物前体及其制备方法，该新型人胰岛素类似物前体可以在酵母中高表达且下游的纯化方法简单易操作。

Description

一种人胰岛素类似物前体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种人胰岛素类似物前体及其制备方法，属于生化与分子生物学的领域，应用的技术包括分子构建信息、细胞筛选、发酵工艺等。
背景技术
糖尿病是胰岛素分泌缺陷或者胰岛素抵抗导致的以高血糖为特征的代谢紊乱疾病，该病目前已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的大三大危害性疾病。临床中将糖尿病分为四类，即Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、其他特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病、继发性糖尿病，胰岛素(insulin，Ins)是主要应用于所有Ⅰ型糖尿病及大多数Ⅱ型糖尿病的治疗药物。胰岛素是由胰腺β细胞分泌的多肽激素，它由两条多肽链A和B组成，这两条多肽链是通过两个链间二硫键相连的。该激素是以单链前体胰岛素原(前胰岛素原)的形式合成的，构型如下：前肽-B-ArgArg-C-LysArg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽，Arg-Arg和Lys-Arg是由A和B链切除连接肽的切割位点。胰岛素前体是指通过一个或多个随后的化学和/或酶促步骤可以转变成人胰岛素的单链多肽。胰岛素类似物前体是指A和/或B链相对于人胰岛素分子具有一个或多个突变、替代、删除、和/或添加的胰岛素前体分子。
已知的获取胰岛素的方法包括动物组织提取和基因工程表达，而采用基因工程表达人胰岛素及其类似物早已成为工业主流手段。基因工程中表达胰岛素的微生物主要分为2类，分别是大肠杆菌、及酵母菌。大肠杆菌表达为包涵体形式，需经过包涵体裂解和复性，工艺繁琐且产率低。最常用的酵母菌分酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母，二者均具有相同的遗传表达优点，但后者外源蛋白表达水平是前者10倍以上。
目前已公开了一系列在天然人胰岛素序列的不同位点上有氨基酸取代的胰岛素类似物。例如：EP0425482B1公开了一种在B25位上有His或Tyr取代的胰岛素类似物。EP0419504B1公开了一种在B3有取代，同时在A5或A15有Gln取代，或在A18或A21有Asn取代的胰岛素类似物。US5008241A公开了一种在A21有特定氨基酸取代，同时在A4、A17、B13或B21有特定氨基酸取代的胰岛素类似物。
CN100432104C公开了胰岛素B链B30缺失的胰岛素类似物前体的结构，但是通过该方法制得的胰岛素类似物中B链只有29个氨基酸，需通过体外酶促流程添加期望的B30氨基酸残基或者通过对B29为氨基酸残基进行其他基团修饰的方法才能得到与胰岛素活性相同的胰岛素类似物。CN101243190A公开了一种通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，所述的前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌争取加工的成熟、双链人胰岛素类似物，该申请中，连接肽的大小为3-35个氨基酸。但是，提供活性好的新的胰岛素类似物及通过提高发酵液中胰岛素类似物前体的产量、简化下游纯化工艺来降低生产成本仍是亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种新型的人胰岛素类似物前体，该类似物具有新的连接肽，在发酵时表达量较高，同时下游的处理方法比较简单，通过较为常规的纯化及酶切步骤就可以制备出对应的新型胰岛素类似物。
本发明所述的人胰岛素类似物前体分子含有连接胰岛素A链和B链的连接肽(C肽),可以通过简单的酶切方法将所述胰岛素类似物前体转变成胰岛素类似物。
本发明所述的人胰岛素类似物前体分子的连接肽C端和N端分别是K或R，或由K和R任意组合的一对碱性氨基酸残基，优选单个碱性氨基酸残基K或R，特别地，当连接肽C端和N端分别是K或R时，所述人胰岛素类似物前体可在宿主菌内被酶切为胰岛素类似物。
本发明所述连接肽包含有至少一个芳香族氨基酸残基F、W或Y，此外，还包含氨基酸残基个数选自0、1、2、3、4、5的一段非特异性氨基酸残基。
具体来说，本发明涉及具有如下通式的人胰岛素类似物前体：
B(1-27)-D-K-E-X1-X3-Y1-X2-A(1-21)
其中，A(1-21)(SEQ ID NO.1)是天然人胰岛素A链氨基酸序列，B(1-27)(SEQ IDNO.2)是缺失B28、B29、B30位氨基酸残基的天然人胰岛素B链，X1-X3-Y1-X2为连接胰岛素B链和A链的连接肽，X1、X2是1-2个氨基酸残基，并且各自独立选自K、R、RK、KR、RR、KK；X3选自芳香族氨基酸F、W或Y；Y1选自0、1、2、3、4、5个氨基酸残基，优选1-5个，最优选1-3个。
该领域普遍认知的，连接肽C端和N端的K或R可以由胰蛋白酶和羧肽酶B识别并进行切割，从而切除C肽。
本发明提供的的人胰岛素类似物前体分子X1-X3-Y1-X2位氨基酸可选自但不限于以下组：(1)KFK；(2)KWK；(3)RWR；(4)RFR；(5)RFKR；(6)KWRK；(7)KFRK；(8)RWER；(9)KRFEKR；(10)RFEKR；(11)RWGYPGVR；(12)KWAAK；(13)KFAAK；(14)KYAAK；(15)RWAKR；(16)RWLER；(17)KFMEK；(18)KWME AAK。
本发明还涉及编码上述人胰岛素类似物前体的核苷酸序列，含有这些核苷酸序列的重组载体。
本发明中所述的表达载体选自pPIC9K、pPICZK、pPIC3.5K、pET9a、pET28a，优选pPIC9K、pPICZK。
转化上述核苷酸序列或载体到宿主细胞也是本发明的一部分，本发明中所述的宿主细胞可选自酵母菌或大肠杆菌。当选用大肠杆菌为宿主细胞时，本领域常用的Escherichia coli DH5a、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)、JM109、HSM174(DE3)包含在内。选用酵母菌做宿主细胞时，优选毕赤酵母或酿酒酵母，最优选毕赤酵母，其中毕赤酵母的种类可以是毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33等，酿酒酵母的种类可以是酿酒酵母INVSc1、酿酒酵母MT663等。
本发明提供的人胰岛素类似物前体可以具有N端氨基酸残基延伸的形式表达，即在胰岛素类似物核苷酸序列的5’端添加几个氨基酸残基的密码子核苷酸序列，连接到载体并转化到宿主细胞中表达。所述N端延伸的氨基酸残基一般称为间隔肽，可以保护人胰岛素类似物前体的N端免于酵母蛋白酶的水解作用。间隔肽C端为碱性氨基酸，可以通过对碱性氨基酸特异水解的蛋白酶(如胰蛋白酶)切除。所述间隔肽氨基酸序列例如EEGEPK或EEAEAEAEPK等。
本发明提供的人胰岛素类似物前体相对于对照人胰岛素类似物前体在宿主细胞的表达产量有显著提高。其中所述对照人胰岛素类似物前体与本发明所述人胰岛素类似物前体B链和A链相同但连接肽不同，其氨基酸序列为B(1-27)-DKE-KAAK-A(1-21)(SEQ IDNO.4)。
此外，本发明还提供了获得所述人胰岛素类似物前体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)合成可编码上述人胰岛素类似物前体的DNA序列；
(2)将编码所述人胰岛素类似物前体的核苷酸连接到表达载体；
(3)将重组载体转化到宿主细胞，构建重组菌；
(4)在适宜培养条件下培养重组菌，并诱导人胰岛素类似物前体的的分泌表达。
本发明还提供了获得结构式为B(1-27)-D-K-E-A(1-21)(SEQ ID NO.3)的人胰岛素类似物的方法，该方法在上述制备人胰岛素类似物前体步骤的基础上还包括用合适的酶处理该胰岛素类似物前体除去连接肽X1-X3-Y1-X2的步骤。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
缩写和术语
“SDS-PAGE电泳”是指十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于分离蛋白质。
“HPLC”是指高效液相色谱法，是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
“TFA”是指三氟乙酸，“ACN”是指乙腈。
本发明所述“连接肽”或“C肽”是指连接胰岛素B链第30位氨基酸和A链第1位氨基酸的肽段。
本发明所述的“人胰岛素前体”、“人胰岛素类似物前体”和“重组人胰岛素前体”都是指通过一个或多个化学和/或酶促步骤可以转变成人胰岛素或人胰岛素类似物的单链多肽。
本发明所述“氨基酸”和“氨基酸残基”是一个意思，都是指完整的氨基酸或参与了肽键的形成而缺失了部分基团的氨基酸。
附图说明
图1：含有人胰岛素类似物前体基因的表达载体pPICZαA-INS的图谱。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明一种实施例中所用载体购自Invitrogen公司的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA，其特征在于该载体含有醇氧化酶AOX1启动子，可受甲醇诱导，该载体还含有Zeocin抗性基因，用于重组菌的筛选。
本发明一种实施例中所用的宿主菌是购自Invitrogen公司的毕赤酵母GS115菌株。
本发明一种实施例中所选的胰岛素类似物前体的间隔肽为EEGEPK。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，毕赤酵母表达实验手册(版本：10April 2009)，或按照商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。本发明下述实施例中提及的分子量的单位均为道尔顿(Dalton)。
本发明中人胰岛素类似物前体摇瓶产量、捕获样品测定采用HPLC方法如下：
色谱柱：Water Symmetry Shield TM RP18 3.5μm 4.6×100mm Column
柱温：60℃；流速：1ml/min；波长214nm；
流动相：A:0.1％TFA·H2O；B:0.1％TFA·ACN
时间(min) A B
0 75 25
10 70 30
11 30 70
本发明中人胰岛素类似物前体酶切、精纯样品检测采用HPLC方法如下：
色谱柱：water Symmetry Shield TM RP18 3.5μm 4.6×100mm Column
柱温：60℃；流速：1ml/min；波长214nm；
流动相：A:0.1％TFA·H2O；B:0.1％TFA·ACN
时间(min) A B
0 73 27
10 69 31
20 50 50
21 30 70
25 26 73
本发明实施例所用部分材料有：3KD超滤膜包购于默克密理博公司、Source30RPCTM购于通用电气(中国)医疗集团；胰蛋白酶、羧肽酶B购于上海雅心生物科技有限公司；Kromasil C8柱购自阿克苏诺贝尔管理有限公司。
实施例1：构建人胰岛素类似物前体的重组酵母表达系统
分如下2步进行
(1)、人胰岛素类似物前体重组表达载体的构建
带有间隔肽的不同C肽的重组人胰岛素类似物前体对应不同的编码基因序列。
氨基酸序列为
EEGEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKERWRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ IDNO.8)
对应的核苷酸序列如下，斜体部分分别是EcoRI和NotI酶切位点。
Figure BDA0001307176620000051
GAAGAAGGTGAACCAAAGTTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAGATGGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO.24)
氨基酸序列为EEGEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKFRKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.12)
对应的核苷酸序列如下，斜体部分分别是EcoRI和NotI酶切位点。
Figure BDA0001307176620000052
GAAGAAGGTGAACCAAAGTTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAGTTCAGAAAGGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO.25)
氨基酸序列为EEGEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKERWERGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.13)
对应的核苷酸序列如下，斜体部分分别是EcoRI和NotI酶切位点。
Figure BDA0001307176620000053
GAAGAAGGTGAACCAAAGTTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAGATGGGAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO.26)
氨基酸序列为EEGEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKERFEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.15)
对应的核苷酸序列如下，斜体部分分别是EcoRI和NotI酶切位点。
Figure BDA0001307176620000061
GAAGAAGGTGAACCAAAGTTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAGATTCGAAAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO.27)
对照胰岛素类似物前体氨基酸序列为
EEGEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ IDNO.5)
上述不同C肽的重组人胰岛素类似物前体对应的编码基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因序列在5’端加了一个EcoR I酶切位点，在3’端添加了一个Not I酶切位点，将合成的胰岛素前体基因片段用T载体试剂盒(Takara,Cat.D103A)连接到T载体。用内切酶EcoR I和Not I对上述带有胰岛素前体基因的T载体和pPICZαA载体进行双酶切消化，37℃酶切2h。采用快速胶回收试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System,Cat#A9281,Lot#0000066824,Progema)回收基因和载体片段，用T4连接酶进行连接，16℃连接过夜。
连接反应体系如下：
Figure BDA0001307176620000062
取10μl连接反应液与TOP10感受态细胞混匀，热激转化。涂布带有氨苄抗性的培养平板，挑取阳性克隆，抽提质粒并由南京金斯瑞公司测序验证，构建得到含有不同重组人胰岛素前体基因的表达载体pPICZαA-INS。
(2)、重组菌株构建及Zeocin梯度抗性平板筛选
采用Promega中抽质粒试剂盒对上述重组表达载体进行抽提，将5-10μg的重组表达载体pPICZɑA-INS用SacI单酶切1小时进行线性化。线性化质粒加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，2倍体积的无水乙醇，充分混合后，放置于-20℃2小时，13,000rpm离心5分钟，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀2次。将沉淀倒置晾干后，用10μL ddH2O溶解。将线性化的质粒与80μLGS115感受态细胞混合，转入电转化杯中，冰浴5分钟。电转化仪(Bio Rad Micropulser)设置参数至2kV、25Ω、200μF进行电转化。电转后迅速加入1mL冰浴的D-Sorbitol混合，取50-200μL涂布于含不同浓度Zeocin的YPD平板上(0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mg/mL)，30℃恒温培养，5天左右可见菌落，其中重组了对照胰岛素类似物前体基因的重组菌为对照菌株。
实施例2：重组菌株的高表达筛选及分子量测定
(1)Yeastern blot表达筛选
每一个重组菌从不同浓度Zeocin的平板上挑选单克隆各80个，共计约400个，进行Yeastern blot表达筛选。
Yeastern blot可以对大批量克隆菌进行胰岛素原表达量的快速检测。具体操作为从不同浓度的Zeocin平板上挑取单克隆划线于含对应Zeocin浓度的YPD平板，30℃恒温培养箱培养1-2天至菌落长饱满。用平板复制法将菌体转到一张灭过菌的硝酸纤维素(Nitrocellulose,NC)膜上，将印有菌落的NC膜贴放于BMMY平板上，盖上放有甲醇浸透的WHATMAN NO.1滤纸的平皿盖，于30℃恒温培养箱倒置诱导培养2天。Western blot方法检测每个单克隆的胰岛素原表达情况，其中一抗为Abcam公司的小鼠抗人胰岛素抗体(ab6995)，二抗为Boster公司的HRP偶联的羊抗鼠IgG(BA1050)，显色剂为Sigma-Aldrich公司的TMB。挑选表达量高的克隆菌做进一步的摇瓶表达筛选。
(2)摇瓶表达筛选
将Yeastern blot筛选的高表达菌落接种至5mL的YPD培养基中(50mL离心管)，30℃恒温摇床250rpm振荡培养至OD600＝10左右(16-18小时)。收集并重悬细胞于50mL BMGY培养基中，30℃恒温摇床250rpm振荡培养过夜，至OD600为30左右。1500rpm离心5分钟收集细胞，用25mL BMMY培养基重悬。在培养基中加入1/200体积的甲醇(终浓度为0.5％)，30℃恒温摇床250rpm振荡培养96小时，其中每24小时补加1/200体积的甲醇。表达结束后，10,000rpm离心取上清，通过HPLC检测上清液中胰岛素类似物前体的产量，换算为相对于对照菌株产量的百分比，其中对照菌表达与本发明所述胰岛素类似物前体B链和A链相同但连接肽不同的胰岛素前体，其氨基酸序列为B(1-27)-DKE-KAAK-A(1-21)(SEQ ID NO.1)。不同C肽对应的胰岛素类似物前体的表达量相对于对照菌株的表达量的百分比如表1所示。
表1、不同C肽对应的胰岛素类似物前体的表达量相对于对照菌株的表达量的百分比
Figure BDA0001307176620000071
Figure BDA0001307176620000081
将胰岛素类似物前体重组菌株的发酵上清通过LC-MS(液质联用)检测分子量，验证表达产物的正确性。其部分结果如表2所示。
表2、通过LC-MS(液质联用)检测分子量结果
Figure BDA0001307176620000082
实施例3：胰岛素类似物前体5L发酵
该实施例以5L发酵生产毕赤酵母为宿主菌的胰岛素类似物前体EEGEPK-B(1-27)-DKE-RWER-A(1-21)(SEQ ID NO.13)为例，本发明所述其他胰岛素类似物前体也可以按该方法进行发酵获得。
分如下4步进行。
(1)取0.2ml甘油菌接种至装有200ml YPG培养基(酵母粉10g/L，大豆蛋白胨20g/L，甘油20g/L)的1L摇瓶中，在30℃下250rpm振荡培养约22h，培养至菌种OD600为12左右。
(2)将培养好的种子液接种至5L发酵罐中进行发酵，使用2.5L BSM培养基(其组分为：85％磷酸26.7ml/L，CaSO4·2H2O 1.2g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4 7.3g/L，KOH 4.1g/L，甘油40.0g/L，PTM1 4.4ml/L，25％氨水调节pH至5.5。PTM1:CuSO4·5H2O，6.0g/L；KI，0.08g/L；MnSO4·H2O，3.0g/L；H3BO3，0.02g/L；MoNa2O4·2H2O，0.2g/L；CoCl2，0.5g/L；ZnCl2，20.0g/L；FeSO4·7H2O，65.0g/L；生物素，0.2g/L；H2SO4，5.0ml/L)，培养温度设定为30℃，通气量保持5L/min，调整搅拌转速使DO(溶解氧浓度)>20％，用25％氨水调节pH，维持pH在5.5。
(3)培养至甘油耗尽时，DO迅速升高，此时开始流加甘油补料培养基(50％甘油含1.2％PTM1)，调整搅拌转速使DO(溶解氧浓度)>20％，用25％氨水调节pH，维持pH在5.5。培养至菌种OD600达到110左右时，停止甘油补料。
(4)甘油补料结束后，一次性添加甲醇补料培养基(无水甲醇含1.2％PTM1)5mL，使发酵液中甲醇浓度达到0.2％。待添加的甲醇耗尽，DO迅速升高，再次添加5ml甲醇补料培养基，当甲醇再次耗尽时，甲醇适应阶段结束。菌种适应甲醇环境后，将培养温度设置为25℃，培养pH设置为5.0，开始甲醇诱导，补入甲醇补料培养基，根据溶氧反馈调整甲醇补料速率，维持DO(溶解氧浓度)>20％，诱导110h，发酵结束。
实施例4：胰岛素类似物的制备
该实施例以胰岛素类似物前体EEGEPK-B(1-27)-DKE-RWER-A(1-21)(SEQ IDNO.13)为例进行胰岛素类似物的纯化制备，本发明所述其他胰岛素类似物前体也可以按该方法进行纯化制备得到相应的胰岛素类似物。
分如下6步进行
(1)上清收集
将发酵液倒入离心杯中，磷酸调节pH至3.0，离心力10000g，离心20min后，收集上清，0.45um滤膜过滤得到上清滤液。
(2)胰岛素类似物前体捕获
将发酵上清液经大孔吸附树脂层析，用pH 3.0的醋酸缓冲液作为平衡液，冲洗3倍柱体积至pH恒定，上清液直接上样，平衡液冲洗纯化柱10倍柱体积，洗去未结合杂质和培养基组分，50％乙醇洗脱，收集洗脱峰，得到纯度90％的胰岛素前体。
(3)捕获样品超滤置换
选用密理博3KD膜包膜面积0.1㎡，蠕动泵流速500ml/min，跨膜压5psi，首先用0.1M NaOH清洗膜包30min，纯化水冲洗去除残留NaOH，选用pH 3.0的10mM醋酸盐缓冲液平衡膜包，步骤2洗脱样品用4M NaOH调pH至8.5，纯化水稀释1倍后进行浓缩，浓缩4倍体积后保持样品体积不变开始置换，缓冲液流加3倍样品体积后，检测样品电导低于5ms/cm，结束置换。
(4)胰岛素类似物前体酶切
步骤(3)样品经胰岛素前体25℃预热0.5h，配制4mg/ml胰蛋白酶溶液、8mg/ml羧肽酶B溶液，开启搅拌，缓慢加入胰岛素前体质量1/1000的胰蛋白酶和1/1500的羧肽酶B，25℃反应4h，4M HCl调节pH至3.0终止反应，经HPLC检测，胰岛素纯度达到80％。
(5)胰岛素类似物前体酶切后纯化
酶切终止液经低压反相层析，层析介质为Source 30RPCTM，平衡液为0.2M Na2SO4+0.1％磷酸+10％乙醇，上样量为5mg/ml，洗脱液为0.05M Na2SO4+0.1％磷酸+50％乙醇，酶切样品直接上样，20％洗脱液洗杂，20％-50％洗脱液20CV，线性梯度洗脱，收集洗脱峰。
(6)胰岛素类似物高压制备
取反相层析洗脱样品，进行高压反相制备，填料为Kromasil C8柱，流动相A为乙腈，B为0.1M乙酸铵水溶液，填料体积2L，上样量1.5g，梯度为25％A-30％A，得到精纯后胰岛素，纯度98％。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司
<120> 一种人胰岛素类似物前体及其制备方法
<130> 370209CG-360142
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 天然序列
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 天然序列
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
20 25
<210> 3
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Glu Gly Ile
20 25 30
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Tyr Cys Asn
50
<210> 4
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Glu Lys Ala
20 25 30
Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
35 40 45
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
<210> 5
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr
35 40 45
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 6
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Phe Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 7
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Trp Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 8
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Trp Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 9
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Phe Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 10
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Phe Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr
35 40 45
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 11
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Trp Arg Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr
35 40 45
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 12
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Phe Arg Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr
35 40 45
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 13
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Trp Glu Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr
35 40 45
Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 14
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Arg Phe Glu Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys
35 40 45
Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 15
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Phe Glu Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 16
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Trp Gly Tyr Pro Gly Val Arg Gly Ile Val Glu
35 40 45
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
50 55 60
Asn
65
<210> 17
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Trp Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 18
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Phe Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 19
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Tyr Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 20
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Trp Ala Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 21
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Arg Trp Leu Glu Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 22
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Glu Lys Phe Met Glu Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
35 40 45
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 23
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Glu Glu Gly Glu Pro Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1 5 10 15
Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Lys Trp Met Glu Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys
35 40 45
Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55 60
<210> 24
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gaattcgaag aaggtgaacc aaagttcgtc aaccagcact tgtgtggttc ccatttggtt 60
gaggctctgt acttggtctg tggagaaaga ggtttctttt acaccgataa ggaaagatgg 120
agaggtatcg ttgagcaatg ttgcacctct atttgttccc tgtatcagtt ggaaaactac 180
tgcaactaag cggccgc 197
<210> 25
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gaattcgaag aaggtgaacc aaagttcgtc aaccagcact tgtgtggttc ccatttggtt 60
gaggctctgt acttggtctg tggagaaaga ggtttctttt acaccgataa ggaaaagttc 120
agaaagggta tcgttgagca atgttgcacc tctatttgtt ccctgtatca gttggaaaac 180
tactgcaact aagcggccgc 200
<210> 26
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gaattcgaag aaggtgaacc aaagttcgtc aaccagcact tgtgtggttc ccatttggtt 60
gaggctctgt acttggtctg tggagaaaga ggtttctttt acaccgataa ggaaagatgg 120
gagagaggta tcgttgagca atgttgcacc tctatttgtt ccctgtatca gttggaaaac 180
tactgcaact aagcggccgc 200
<210> 27
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaattcgaag aaggtgaacc aaagttcgtc aaccagcact tgtgtggttc ccatttggtt 60
gaggctctgt acttggtctg tggagaaaga ggtttctttt acaccgataa ggaaagattc 120
gaaaagagag gtatcgttga gcaatgttgc acctctattt gttccctgta tcagttggaa 180
aactactgca actaagcggc cgc 203

Claims (16)

1.一种人胰岛素类似物前体，其包含通式：
B(1-27)-D-K-E-X1-X3-Y1-X2-A(1-21)
其中，A(1-21)是天然人胰岛素A链；
B(1-27)是缺失B28、B29、B30位氨基酸残基的天然人胰岛素B链,其特征在于：
X1-X3-Y1-X2的氨基酸序列为RWER。
2.一种编码权利要求1所述的人胰岛素类似物前体的DNA。
3.一种含有权利要求2所述的DNA的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体选自pPIC9K、pPICZK、pPIC3.5K、pET9a、pET28a。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体选自pPIC9K、pPICZK。
6.一种用权利要求3所述的表达载体转化的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母菌。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述酵母菌选自毕赤酵母或酿酒酵母。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于所述的毕赤酵母选自毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33。
10.一种制备权利要求1所述的人胰岛素类似物前体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建重组表达载体；(2)将重组载体转化到宿主细胞，构建重组菌；(3)在适宜培养条件下培养重组菌，并诱导人胰岛素类似物前体的分泌表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的表达载体选自
pPIC9K、pPICZK、pPIC3.5K、pET9a、pET28a。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的表达载体选自pPIC9K、pPICZK。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的宿主细胞选自大肠杆菌及酵母菌。
14.根据权利要求13所述的方法，所述酵母菌选自毕赤酵母或酿酒酵母。
15.根据权利要求14所述的方法，所述毕赤酵母选自毕赤酵母GS115及毕赤酵母X33。
16.一种制备人胰岛素类似物的方法，所述人胰岛素类似物的结构为B(1-27)-D-K-E-A(1-21)
其特征在于该方法包含权利要求10所述的所有步骤，还包括酶切除去连接肽X1-X3-Y1-X2的步骤，
其中，A(1-21)是天然人胰岛素A链；
B(1-27)是缺失B28、B29、B30位氨基酸残基的天然人胰岛素B链,其特征在于：
X1-X3-Y1-X2的氨基酸序列为RWER。
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