CN102277371A

CN102277371A - 脑钠肽的制备方法

Info

Publication number: CN102277371A
Application number: CN2011102323386A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 柳鹏福; 吴黎诚; 刘萍
Original assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2011-08-15
Filing date: 2011-08-15
Publication date: 2011-12-14

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种基因工程方法构建脑钠肽重组工程菌，进而发酵、纯化制备脑钠肽的方法。本发明将编码脑钠肽的基因与硫氧还蛋白标签融合表达，并进一步构建完成能高表达BNP的基因工程菌；采用在发酵过程中添加IPTG和曲拉通X-100的化学渗透发酵技术，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外，有利于其继续合成、避免胞内蛋白酶的攻击，从而促进蛋白高产量胞外积累；同时，针对硫氧还融合蛋白的热稳定性，在发酵到达终点时，对发酵液进行热处理，这样离心后，可以直接从发酵上清液中回收得到初步纯化的目标蛋白。

Description

脑钠肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种基因工程方法构建脑钠肽重组工程菌，进而发酵、纯化制备脑钠肽的方法。

背景技术

脑钠肽 ( brain natriuretic peptide，BNP)又称B型利钠肽 ( B- type natriuretic peptide)，是继心钠肽(ANP)后利钠肽系统的又一成员，于1988年首先在猪脑中被发现，随后的研究发现脑钠肽主要在心室心肌中合成并分泌，可以促进排钠、排尿，舒张血管，具有较强的抗血管平滑肌细胞及内皮细胞的增殖作用，并能对抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统( RAAS)的缩血管作用，对人体水和电解质的平衡，心血管、内分泌系统的调节起着重要作用。

BNP是由 32个氨基酸组成的多肽片段，分子量约为3.4kDa，在心肌细胞内首先合成其激素原前体，经裂解去除一个26氨基酸的信号肽，以含108氨基酸的激素前体proBNP形式分泌至细胞内，并裂解成为无活性的N末端( NT- BNP)和有活性的BNP(含32个氨基酸的C端片段)。2001年 8月美国 SCIOS公司生产的基因重组人脑钠肽 ( recombinant human BNP，rhBNP)-Nesiritide上市，成为新一代静脉注射用治疗失代偿性心力衰竭的药物。

脑钠肽的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成脑钠肽成本高、价格昂贵，产业化困难。用基因重组技术生产的人脑钠肽是解决这个问题的有效途径, 通常将编码BNP的基因克隆到大肠杆菌中，通过大规模发酵基因工程大肠杆菌来大量表达目标蛋白，进而通过分离纯化，得到符合要求的BNP。常规大肠杆菌表达外源蛋白常会导致目标蛋白在胞内积累而限制其表达量，发酵结束后需要破碎细胞才能回收目标蛋白并进一步分离纯化，细胞破碎的过程中，胞内其它蛋白和细胞组分一起释放出来，体系中复杂的组分使得纯化的收率和成本大大增加。另外，多肽因其分子小，直接表达存在困难，一般需要采用融合表达技术。目前研究采用的融合表达分为自身串联融合表达和与其它载体蛋白融合表达两种，大都在胞内积累，易形成包涵体，而从包涵体复性具有生物活性的蛋白，需要经过一系列的变性复性过程，其代价是非常昂贵的。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题，提供一种脑钠肽的制备方法。

本发明的上述技术目的具体是通过以下技术方案得以实现的：

脑钠肽的制备方法，包括以下步骤：

①设计并合成BNP的基因序列，具体序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCATTAAGCTT ；

②将合成的基因序列用KpnI和HindIII酶切，装载于同样酶切的载体pET32a上，用DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌，得到大肠杆菌转化子，抽提该大肠杆菌转化子的质粒，然后构建完成表达载体pET32a-BNP；

③将上述表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3），得到基因工程菌；

④对该基因工程菌进行发酵，发酵过程中加入IPTG和曲拉通X-100；

⑤利用融合蛋白耐高温的特性，将发酵液加热处理，然后离心除去杂蛋白，初步纯化并浓缩目的蛋白；

⑥将浓缩后的目的蛋白加入缓冲液，过层析柱，使得含有6×His标签的融合蛋白得以进一步浓缩，除去杂蛋白，得到高纯度的融合蛋白；

⑦在合适的酶切条件下，利用肠激酶酶切高纯度的融合蛋白，使得融合标签和脑钠肽断裂。

作为上述技术方案的优选，它还包括以下步骤：

⑧经肠激酶酶切后的蛋白，配制成溶液后再过层析柱，使得融合标签与树脂结合，目标产物富集于穿透液中；

⑨收集上述穿透液，过凝胶层析柱，除去残留的肠激酶及其它残留杂蛋白，收集目标产物;

⑩将上述溶液冻干，得到纯的多肽产品。

作为上述技术方案的优选，步骤④中曲拉通X-100的加入量为0.1%（m/v）。

作为上述技术方案的优选，步骤⑥所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

作为上述技术方案的优选，步骤⑧所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

本发明具有以下有益效果：

本发明将编码脑钠肽的基因与硫氧还蛋白标签融合表达，并进一步构建完成能高表达BNP的基因工程菌；采用在发酵过程中添加IPTG和曲拉通X-100的化学渗透发酵技术，提高蛋白质在发酵过程释放至胞外，有利于其继续合成、避免胞内蛋白酶的攻击，从而促进蛋白高产量胞外积累；同时，针对硫氧还融合蛋白的热稳定性，在发酵到达终点时，对发酵液进行热处理，这样离心后，可以直接从发酵上清液中回收得到初步纯化的目标蛋白。

附图说明

图1为添加了不同浓度曲拉通的脑钠肽基因工程菌发酵生长曲线；

图 2为添加了不同浓度曲拉通的脑钠肽发酵液上清产量变化曲线。

具体实施方式

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

1）脑钠肽基因工程菌的构建：

①以脑钠肽氨基酸序列为基础，重新设计BNP的基因序列，具体序列如下，下划线的序列即为前后的酶切位点KpnI和HindIII位点，阴影部分的核酸序列对应的氨基酸残基即为肠激酶的识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的切割位点

GGTACCGACGACGACGACAAAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCATTAAGCTT ；

②将合成的基因序列用KpnI和HindIII从载体上切下，装载于同样酶切的载体pET32a上，用T4 DNA连接酶于16℃连接5小时，转化大肠杆菌。抽提上述大肠杆菌转化子的质粒，酶切验证后，进一步测序验证，构建完成表达载体pET32a-BNP；将上述两种正确的表达载体转入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），得到基因工程菌。

2）脑钠肽基因工程菌株的发酵

挑取脑钠肽基因工程菌单菌落接种至LB种子培养基中， 37℃摇床培养过夜，将一级种子以5%的接种量接入含有卡那霉素的二级种子培养基，37℃摇床振荡培养至OD₆₀₀3左右，以5%的接种量接至已灭好菌的发酵培养基中。发酵条件为：发酵温度37℃，发酵pH用25%（m/v）的氨水维持在6.8。在OD₆₀₀达到20左右时用0.2mM的IPTG诱导，加入0.05，0.1，0.5%曲拉通，并将发酵罐降温至25℃培养，确保蛋白的有效折叠。当本底甘油耗完时开始补料采用恒定的流速4.2g/L.H的速率加入补料液，发酵过程中定时取样测定OD_600，对样品进行离心去菌体并采用考马斯亮蓝法检测样品上清液中可溶总蛋白的含量。通过实验发现加入曲拉通后对菌体生长有一定影响，加入量过大将会使菌体破裂。如图1所示，加入曲拉通后上清液中释放出的可溶蛋白的含量明显增加，以0.1%的加入量效果最好，加入量过大会影响菌体生长而影响产量。如图1，2所示，从图中可以看出上清液中可溶蛋白的产量在24 h时达到最大，浓度为1160 mg/L,此时菌体浓度为OD₆₀₀=67.5。

3）脑钠肽的分离纯化

组合多种蛋白质纯化技术，从发酵上清液中分离纯化得到高纯度的目标多肽。具体流程为：

利用融合蛋白包含硫氧还蛋白，能耐高温的特性，将发酵液100℃煮15分钟，12 000rpm离心20分钟，大多数杂蛋白会变性沉淀，而目的蛋白仍在上清液中，达到初步纯化目的蛋白的目的；加0.8%的活性炭至热处理后的上清液，室温搅拌半小时，抽滤除去残留的两性剂曲拉通及色素成分；将蛋白加咪唑至终浓度20mM，流加至镍柱顶端，用5倍体积30mM的咪唑溶液洗涤，再用250mM的咪唑溶液洗脱，使得含有6×His标签的融合蛋白得以浓缩，除去绝大多数杂蛋白，得到高纯度的融合蛋白；将洗脱后的蛋白溶液过凝胶脱盐柱，除去高浓度咪唑，并替换为肠激酶缓冲液；采用的酶切条件为0.1units/50ul 蛋白，酶切时间4小时；酶切后的蛋白溶液再过镍亲和层析柱，使得含有6×His标签的硫氧还蛋白融合标签与亲和层析树脂结合，而目标产物脑钠肽富集于穿透液中；将上述穿透液用Sephacryl　S-200HR凝胶层析进一步纯化，除去残留融合标签、肠激酶等杂蛋白，进一步富集纯化目标，将上述溶液冻干，得纯的多肽产品。

Organization Applicant

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Street : 开发区红丰路1366号

City : 湖州市

State : 浙江省

Country : 中国

PostalCode : 313000

PhoneNumber :

FaxNumber :

EmailAddress :

<110> OrganizationName : 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心

Application Project

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<120> Title : 基因序列

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<141> CurrentFilingDate : ____-__-__

Sequence

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<213> OrganismName : 人工序列

<400> PreSequenceString :

ggtaccgacg acgacgacaa aagccccaag atggtgcaag ggtctggctg ctttgggagg 60

aagatggacc ggatcagctc ctccagtggc ctgggctgca aagtgctgag gcggcattaa 120

gctt 124

<212> Type : DNA

<211> Length : 124

SequenceName : GGTACCGACGACGACGACAAAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCATTAAGCTT

SequenceDescription :

Claims

1.脑钠肽的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的脑钠肽的制备方法，其特征在于，它还包括以下步骤：

⑩将上述溶液冻干，得到纯的多肽产品。

3.根据权利要求1所述的脑钠肽的制备方法，其特征在于：步骤④中曲拉通X-100的加入量为0.1%。

4.根据权利要求1所述的脑钠肽的制备方法，其特征在于：步骤⑥所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。

5.根据权利要求2所述的脑钠肽的制备方法，其特征在于：步骤⑧所述中层析柱为Ni²⁺亲和层析柱。