JP2011130725A - Ｌｎａオリゴヌクレオチドとそれを含有する化粧品 - Google Patents

Abstract

【課題】コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の一部をＬＮＡで修飾したＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、コラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡで修飾したＬＮＡオリゴヌクレオチド及び、ＬＮＡ修飾されたＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物、及びＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する化粧料を提供する。
【解決手段】コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡ（Locked-nucleic acid)で修飾することによってコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチド。また、これを含有する化粧料。
【選択図】なし

Description

ＬＮＡ(Locked Nucleic Acid)修飾されたＬＮＡオリゴヌクレオチドとそれを含有する化粧品に関する。より詳しくは、コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の一部をＬＮＡで修飾することによって、コラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡ修飾されたＬＮＡオリゴヌクレオチドと、それを含有する化粧品に関する。

皮膚は、表皮、真皮、皮下組織からなるが、中でも真皮は皮膚の構造維持に極めて重要であり、ヒアルロン酸、コラーゲン等から形成される真皮結合組織によって皮膚のハリが保たれている。 特に、真皮線維芽細胞により合成されるコラーゲンは、肌の弾力を保つのに重要な成分として知られている。老化にともなう皮膚変化のひとつであるシワやタルミは、炎症や老化によりコラーゲン量が低下して、前記ヒアルロン酸、コラーゲン等の真皮結合組織成分の減少及び変性により皮膚弾力性の低下によって起こる。それ故、シワやタルミを改善するためには、コラーゲンを外部から補給するか、内部のコラーゲン合成を促進することが考えられている。

従来、コラーゲンペプチドには線維芽細胞におけるコラーゲン合成の促進作用が明らかとなり、保湿性や皮膚に対する使用感の良さから、コラーゲンペプチドを配合した老化防止剤およびコラーゲン産生促進剤が提供されている（特許文献１、２参照）。しかし、これらは十分な効果を有するものではなかった。また、皮膚が紫外線を浴びるとコラゲナーゼ等のマトリックスメタロプロテアーゼが活性化されることが知られている。これらの酵素は、真皮の主要成分であるコラーゲンを減少させることによりシワやタルミを促進すると考えられている。

この皮膚のシワやタルミ等を防止するために化粧料の有効成分としてレチノイン酸、α−ヒドロキシ酸、レチノール等の添加が報告されている。しかしながら、これらの有効成分についても皮膚刺激性や安定性に問題がある。また、シワやタルミを防ぐ方法の一つに、コラゲナーゼ阻害剤やコラーゲン合成促進剤を配合することが知られているが、十分なものとは言えない。

一方、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けにくく、高い親和力で標的のメッセンジャーＲＮＡに結合し、その特異性に優れ、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス用の分子として、ロックヌクレオシド類似体（ＬＮＡ：Locked-nucleic Acid)が開発された（特許文献３、特許文献４）。ロックヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）の二環式類似体はオリゴヌクレオチドに組み込んだ場合に、親和性と特異性の向上を示すことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。

具体的には、ＬＮＡ(Locked Nucleic Acid)は、非常に高い生物安定性（低ターンオーバー）及び前例のない親和性（標的への非常に高い結合強度）と、正確な標的と不正確な標的を区別する能力（高い特異性）を兼ね備える。実際、ＬＮＡで記録された親和性増加は、先に報告された低値から中等値の範囲のすべてのアナログの親和性を追い越すものである。

ＬＮＡは、２’−酸素原子及び４’−炭素原子の間のメチレン架橋によりリボースが構造的に制限されたＲＮＡアナログである。この架橋は、リボフラノース環の柔軟性を限定し、固定した二環式形態へと構造をロックする。このいわゆるＮ型（すなわち３’−エンド）コンフォーメーションは、ＬＮＡを含む二重鎖のＴｍ値の増加、並びに結果的により高い結合親和性及びより高い特異性をもたらす。ＮＭＲスペクトル研究は、ＬＮＡ糖のロックされたＮ型コンフォーメーションを実際に実証しただけでなく、ＬＮＡモノマーがＮ型コンフォーメーションに向かってそれらの隣接する未修飾ヌクレオチドをねじることができることを明らかにした。重要なことには、ＬＮＡの好ましい特性は、核酸アナログでしばしば観察されるように、他の重要な特性を犠牲にして成り立つというものではない。

ＬＮＡは、ＤＮＡアナログ集団を構成する他のすべての化学物質と自由に混合することができる。ＬＮＡ塩基は、短い全ＬＮＡの配列、又はより長いＬＮＡ／ＤＮＡキメラとして、オリゴヌクレオチドの中へと組み込むことができる。ＬＮＡは、内部、３’位又は５’位に配置することができる。しかしながら、それらの固定した二環式コンフォーメーションのために、ＬＮＡ残基は、時には核酸鎖のらせんのねじれを妨害する。したがって一般には、２つ又はそれ以上の近接するＬＮＡ残基を有するオリゴヌクレオチドのデザインは、あまり好ましくない。好ましくは、ＬＮＡ残基は、らせんのねじれを妨害しない、通常のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧ）のような少なくとも１つの（修飾された）ヌクレオチドにより隔てられる。

特開２０００−３０９５２１号公報 特開２００３−１３７８０７号公報 特許第３７５６３１３号公報 特許第４２５５２２７号公報

Nielsen,et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,p.3423,(1997) Koshkin et al.,Tetrahedron,54,p.3607-3630,(1998) Kumar et al.,Biiorg.Med.Chem.Lett.,8,p.2219-2222,(1998) Obika,et al.,Tetrahedron Lett.,39,5401-5404,(1998) Hoffman,et al.,J.Biol.Chem.,268(28),21113-21119(1993)

コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の一部をＬＮＡで修飾したＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、コラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡで修飾したＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。さらに、ＬＮＡ修飾されたＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物、及びＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する化粧料を提供するものである。

通常、日光傷害を受けた顔の皮膚では、真皮の繊維をつくる細胞が、加齢と共に小さくまた少なくなる。コラーゲン繊維が多量に失われ、皮膚に弛みが生じ、伸び易くなる；弾性繊維が異常になるため、皮膚は、一旦伸ばされると、直ぐには元に戻らない。繊維状成分が皮膚の容積の９０％以上を占めており、そのうちの９５％がコラーゲンであり、それらの繊維、特にコラーゲンの分解が、しわ、たるみ、および弾力性の消失の主因である。

加えて、小血管は、壁が薄くなり、拡張し、破裂することも多い。それにより脈管性供給が危なくなる。内因性加齢および外因性要因による傷害に関連する爪および毛髪の変化は、毛髪および爪板の薄化；光沢や艶の不足、および毛髪と爪のでこぼこな表面；毛髪および爪の脆さや裂け易さ；毛髪および爪の柔軟性、反発力、および弾力性の減少を含む。

加齢皮膚の徴候に対する従来の取扱いは、化粧品の使用、ならびにフェノール、トリクロロ酢酸、および他の化学剥離剤、および形成外科などのような医療処置であった。そうした医療処置は費用がかさみ、重大な副作用を伴う危険性があり、そしてその措置は、根底にある老化プロセスに何ら意味のある改変をせずに、皮膚の化粧的外観を変えるだけである。

本発明のコラーゲン遺伝子の発現を刺激するＬＮＡ修飾されたＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む組成物の皮膚、毛髪または爪への局所適用は、内因性および／または外因性加齢および外因性要因に関連するものを含む、また皮膚、毛髪および爪への前記の変化を特徴とするものも含む、さまざまな化粧容態および皮膚疾患に有益である。典型的適応症は、角質化の乱れ、皮膚成分の合成欠陥、および皮膚、爪および毛髪の加齢に関連する変化、および、皮膚、爪および毛髪の乾燥または放任、乾皮症、魚鱗癬、手掌および足蹠の過角化症、皮膚、爪および毛髪の平滑でない粗い表面、ふけ、ダリエ病、慢性単純性苔癬、表皮剥脱、にきび、仮性毛包炎、過敏、皮膚病、湿疹、乾癬、頭部および皮膚のかゆみ、かゆみ症、いぼ、ヘルペス、老人斑、ほくろ、メラニン沈着、汚れた皮膚、まだらの皮膚、過角化症、色素沈着過剰皮膚、コラーゲン、グリコサミノグリカン類、プロテオグリカン類およびエラスチンの合成異常または減少ならびに真皮におけるそれらの成分の含量減少、ひきつり、皮膚のすじ、小すじ、しわ、光老化の弾力繊維症による皮膚肥厚、皮膚、爪および毛髪の反発力、弾力性および復元性の消失または低減、皮膚、爪および毛髪の潤滑性および光沢の不足、たるんで年寄りじみた皮膚、爪毛髪、爪および毛髪の脆さや割れ、およびその他の局所的容態および適応症等を含む。

本発明の特徴は、コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾することによって得られるコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドである。

本発明の別の特徴は、コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾して得られたコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号２（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3')であるＬＮＡヌクレオチドである。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドの修飾位置は３’側より８塩基を修飾したが、修飾位置は（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3' 下線部分がＬＮＡ修飾部位)これに限定されるものではない。

本発明の別の特徴は、コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾することによって得られたコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡ修飾されたＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進剤である。

本発明の別の特徴は、コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾することによって得られた、コラーゲン遺伝子の発現を促進する配列番号２（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3')のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する請求項３に記載のコラーゲン合成促進剤である。

本発明の別の特徴は、請求項１又は２に記載のコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する化粧料である。

本発明の別の特徴は、コラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが配列番号２（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3')である請求項５記載の化粧料である。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物中のＬＮＡヌクレオチドの配合量は、特に制限されないが、本発明の効果を得るため、組成物全体に対して通常０．００００１重量％〜１５重量％である。好ましくは０．００１重量％〜５重量％であり、より好ましくは、０．０１重量％〜１重量％である。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物には、各種の作用を増強または補足する目的で、あるいはＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に他の有用な作用を付加するため美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、ニキビ改善成分、コラーゲン等の生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等の各種成分を１種または２種以上組み合わせて配合することができる。好ましくは美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、老化防止成分または保湿成分の１種または２種以上の成分である。これらの各成分としては、医薬品、医薬部外品、または化粧品分野において従来より使用され、また将来使用されるものであれば特に制限されず、任意のものを適宜選択し使用することができる。

例えば、美白成分としては、プラセンタ；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸；フィチン酸；ルシノール；カモミラＥＴ；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＥ又はその誘導体、パントテン酸又はその誘導体等のビタミン類等が挙げられる。このうち、好ましいものとしては、パントテン酸又はその誘導体、エラグ酸、フィチン酸、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＥ又はその誘導体を挙げることができる。これらの美白成分は１種または２種以上を用いてもよい。

美白作用を有する植物成分を美白成分として用いてもよく、かかる植物成分としては、イリス（アイリス）、アーモンド、アロエ、イチョウ、ウーロン茶、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、オドリコソウ、海藻、カッコン、クチナシ、クジン、クロレラ、ゴバイシ、コムギ、コメ、コメハイガ、オリザノール、コメヌカ、サイシン、サンショウ、シソ、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、ダイズ、納豆、茶、トウキ、トウキンセンカ、ニンニク、ハマメリス、ベニバナ、ボタンピ、ヨクイニン、トウキ、アメジスト、アセンヤク、アセビワラビ、イヌマキ、エノキ、カキ(Diospyros kaki)、キササゲ、クロマメ、ゲンチアナ、ゲンジン、サルサ、サヤインゲン、ショクマ、ジュウロウ、セージ、ゼンコ、ダイコン、ツツジ、ツクシハギ、トシン、ニガキ、パセリ、ヒイラギ、ホップ、マルバハギ、チョウジ、カンゾウ等の植物に由来する成分が挙げられる。好ましくは、イリス（アイリス）、アロエ、イチョウ、ウーロン茶、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、オドリコソウ、海藻、カッコン、クチナシ、クジン、ゴバイシ、コムギ、コメ、コメヌカ、サイシン、サンショウ、シソ、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、茶、トウキ、トウキンセンカ、ハマメリス、ベニバナ、ボタンピ、ヨクイニン、アメジスト、アセンヤク、エノキ、カキ(Diospyros kaki)、キササゲ、クロマメ、ゲンチアナ、サルサ、サヤインゲン、ジュウロウ、セージ、ゼンコ、ダイコン、ツツジ、ツクシハギ、トシン、ニガキ、パセリ、ヒイラギ、ホップ、チョウジ、カンゾウ及びトウキの植物由来成分であり、より好ましくは、イリス（アイリス）、アロエ、イチョウ、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、クチナシ、クジン、コメ、コメヌカ、サイシン、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、茶、トウキ、トウキンセンカ、ハマメリス、ベニバナ、ボタンピ、アメジスト、アセンヤク、エノキ、カキ(Diospyros kaki)、セージ、ダイコン、ツツジ、パセリ、ホップ、カンゾウ及びヨクイニンの植物由来成分である。

これらの植物成分を本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に用いる場合、植物成分の形態は特に制限されないが、通常は植物エキス（植物抽出物）や精油などの態様で使用することができる。なお、上記植物成分中に記載の（ ）内は、その植物の種類、別名または生薬名である。

上記美白成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。

美白成分として美白作用のある植物成分を用いる場合は、目的に応じて１種もしくは２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。上記植物成分を美白成分として用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物への配合割合は、エキスや精油などの抽出物換算で、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。また、植物成分はアスコルビン酸類１００重量部に対して０．０００１〜１００重量部、好ましくは０．００１〜５０重量部の割合になるように配合することが望ましい。

抗炎症成分としては、アラントイン、カラミン、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、酸化亜鉛、グアイアズレン、酢酸トコフェロール、塩酸ピリドキシン、メントール、カンフル、テレピン油、インドメタシン、サリチル酸又はその誘導体等が挙げられる。好ましくはアラントイン、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、グアイアズレン、メントールである。

上記抗炎症成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。また、抗炎症成分はＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物中に含まれるアスコルビン酸類１００重量部に対して０．００１ 〜１０００重量部、好ましくは０．００５〜５００重量部、より好ましくは０．０１〜１００重量部の割合になるように配合することが望ましい。

抗菌成分としては、クロルヘキシジン、サリチル酸、塩化ベンザルコニウム、アクリノール、エタノール、塩化ベンゼトニウム、クレゾール、グルコン酸及びその誘導体、ポピドンヨード、ヨウ化カリウム、ヨウ素、イソプロピルメチルフェノール、トリクロカルバン、トリクロサン、感光素１０１号、感光素２０１号、パラベン、フェノキシエタノール、１，２-ペンタンジオール、塩酸アルキルジアミノグリシン等が挙げられる。好ましくは、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸及びその誘導体、イソプロピルメチルフェノール、トリクロカルバン、トリクロサン、感光素１０１号、感光素２０１号、パラベン、フェノキシエタノール、１，２-ペンタンジオール、塩酸アルキルジアミノグリシン等が挙げられる。さらに好ましくは、塩化ベンザルコニウム、グルコン酸及びその誘導体、塩化ベンゼトニウム、イソプロピルメチルフェノールである。

上記抗菌成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。

細胞賦活化成分としては、γ-アミノ酪酸、ε-アミノカプロン酸などのアミノ酸類：レチノール、チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、パントテン酸類などのビタミン類：グリコール酸、乳酸などのα-ヒドロキシ酸類：タンニン、フラボノイド、サポニン、アラントイン、感光素301号などが挙げられる。好ましくは、γ-アミノ酪酸、ε-アミノカプロン酸などのアミノ酸類：レチノール、チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、パントテン酸類などのビタミン類である。

上記細胞賦活化成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。

収斂成分としては、ミョウバン、クロロヒドロキシアルミニウム、塩化アルミニウム、アラントインアルミニウム塩、硫酸亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の金属塩；タンニン酸、クエン酸、乳酸、コハク酸などの有機酸を挙げることができる。好ましくは、ミョウバン、クロロヒドロキシアルミニウム、塩化アルミニウム、アラントインアルミニウム塩、硫酸アルミニウムカリウム、タンニン酸である。

収斂成分を用いる場合、そのＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。

抗酸化成分としては、トコフェロール及びその誘導体、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、亜硫酸水素ナトリウム、エリソルビン酸及びその塩、フラボノイド、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、カタラーゼ、スーパーオキサイドジスムターゼ、チオレドキシン、タウリン、チオタウリン、ヒポタウリンなどが挙げられる。好ましくは、トコフェロール及びその誘導体、チオタウリン、ヒポタウリン、チオレドキシン、フラボノイドである。

抗酸化成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。

老化防止成分としては、レチノイド（レチノール、レチノイン酸、レチナール等）、パンガミン酸、カイネチン、ウルソール酸、ウコンエキス、スフィンゴシン誘導体、ケイ素、ケイ酸、Ｎ−メチル−Ｌ−セリン、メバロノラクトン等が挙げられる。好ましくは、レチノイド（レチノール、レチノイン酸、レチナール等）、カイネチンである。

上記老化防止成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合は、好ましくは０．０００３〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％の割合になるように配合することが望ましい。

保湿成分としては、アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、グルコサミン、テアニンなどのアミノ酸及びその誘導体；コラーゲン、コラーゲンペプチド、ゼラチン等のペプチド；グリセリン、1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール；ソルビトールなどの糖アルコール；レシチン、水素添加レシチン等のリン脂質；ヒアルロン酸プロピレングリコール、ヘパリン、コンドロイチン等のムコ多糖；乳酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、尿素などのＮＭＦ由来成分などがあげられる。好ましいものは、アラニン、セリン、グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、グルコサミン、テアニン、コラーゲン、コラーゲンペプチド、グリセリン、1,3-ブチレングリコール、水素添加レシチン、ヒアルロン酸プロピレングリコール、ヘパリン、コンドロイチン、乳酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウである。

保湿成分を用いる場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物に配合する割合としては、通常０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、より好ましくは０．５〜５重量％を挙げることができる。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物は、上記各成分に加えて組成物の用途あるいは剤形に応じて、食品、医薬部外品、医薬品に通常使用される成分を適宜配合しても良い。配合できる成分としては、特に制限されないが、例えば、アミノ酸類、アルコール類、多価アルコール類、糖類、ガム質、多糖類などの高分子化合物、界面活性剤、可溶化成分、油脂類、経皮吸収促進成分、防腐・抗菌・殺菌剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、抗酸化剤、酵素成分、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、清涼化剤の他、ミネラル類、細胞賦活剤、滋養強壮剤、賦形剤、増粘剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、分散剤、吸着剤、崩壊補助剤、湿潤剤または湿潤調節剤、防湿剤、着色料、着香剤または香料、芳香剤、還元剤、可溶化剤、溶解補助剤、発泡剤、粘稠剤または粘稠化剤、溶剤、基剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤、光沢化剤などをあげることができる。特に界面活性剤、可溶化成分または油脂類を配合することによって、水性溶媒中におけるアスコルビン酸類の安定性、有効性、使用感をより向上させることができる。また、本発明の組成物が外用組成物である場合には、界面活性剤、可溶化成分、油脂類または経皮吸収促進成分を配合するのが好ましい。

ここで用いられる界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（以下、ＰＯＥという）−オクチルドデシルアルコールやＰＯＥ−２−デシルテトラデシルアルコール等のＰＯＥ−分岐アルキルエーテル；ＰＯＥ −オレイルアルコールエーテルやＰＯＥ−セチルアルコールエーテル等のＰＯＥ−アルキルエーテル；ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート及びソルビタンモノラウレート等のソルビタンエステル；ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンモノイソステアレート、及びＰＯＥ−ソルビタンモノラウレート等のＰＯＥ−ソルビタンエステル；グリセリンモノオレエート、グリセリンモノステアレート、及びグリセリンモノミリステート等のグリセリン脂肪酸エステル；ＰＯＥ−グリセリンモノオレエート、ＰＯＥ−グリセリンモノステアレート、及びＰＯＥ−グリセリンモノミリステート等のＰＯＥ−グリセリン脂肪酸エステル；ＰＯＥ−ジヒドロコレステロールエステル、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油、及びＰＯＥ−硬化ヒマシ油イソステアレート等のＰＯＥ−硬化ヒマシ油脂肪酸エステル；ＰＯＥ−オクチルフェニルエーテル等のＰＯＥ−アルキルアリールエーテル；モノイソステアリルグリセリルエーテルやモノミリスチルグリセリルエーテル等のグリセリンアルキルエーテル；ＰＯＥ−モノステアリルグリセリルエーテル、ＰＯＥ−モノミリスチルグリセリルエーテル等のＰＯＥ−グリセリンアルキルエーテル；ジグリセリルモノステアレート、デカグリセリルデカステアレート、デカグリセリルデカイソステアレート、及びジグリセリルジイソステアレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル、等の各種非イオン界面活性剤：：あるいはレシチン、水素添加レシチン、サポニン、サーファクチンナトリウム、コレステロール、胆汁酸などの天然由来の界面活性剤等を例示することができる。これらの界面活性剤は、１種単独で使用してもまた２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。

界面活性剤を使用する場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物への配合割合としては、副作用がなく皮膚や粘膜に影響を与えず且つ本発明の効果を妨げないことを限度として特に制限されず、コラーゲン合成促進用組成物中に０．０１〜３０重量％の割合で含まれるような範囲で適宜選択して使用することができる。ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物中の有効成分の安定性や皮膚使用感等の観点からは、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは０．５〜１０重量％の範囲を挙げることができる。

可溶化成分としては、医薬品、医薬部外品または化粧品分野において用いられるものであれば特に限定されない。例えば、エタノール等の低級アルコール、グリセリン，エチレングリコール等の多価アルコール、水素添加大豆リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、水素添加大豆リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、より好ましくは、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、水素添加大豆リン脂質である。これらの可溶化成分は、１種単独で使用しても、または２種以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

これらの可溶化成分を使用する場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物への配合割合としては、副作用がなく皮膚や粘膜に影響を与えず且つ本発明の効果を妨げないことを限度として特に制限されず、コラーゲン合成促進用組成物中に０．０１〜７０重量％の割合で含まれるような範囲で適宜選択して使用することができるが、コラーゲン合成促進用組成物中の有効成分の安定性や皮膚使用感等の観点からは、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％の範囲を挙げることができる。

油脂類としては、医薬品、医薬部外品または化粧品分野において外用剤の成分として用いられるものであれば特に限定されない。例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の合成油脂；大豆油、米油、菜種油、綿実油、ゴマ油、サフラワー油、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、椿油、ヒマワリ油、パーム油、アマ油、シソ油、シア油、サル油、ヤシ油、木ロウ、ホホバ油、グレープシード油、及びアボガド油等の植物油脂；ミンク油、卵黄油、牛脂、乳脂、及び豚脂等の動物油脂；ミツロウ、鯨ロウ、ラノリン、カルナウバロウ、キャンデリラロウ等のロウ類；流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、パラフィンワックス、ワセリン等の炭化水素類；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ベヘニン酸等の天然及び合成脂肪酸；セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルデカノール、ラウリルアルコール等の天然及び合成高級アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、コレステロールオレート等のエステルやエーテル類；シリコーン油等が挙げられる。これらの油脂類は、１種単独で使用しても、または２種以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

これらの油脂類を使用する場合、ＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物への配合割合としては、副作用がなく皮膚や粘膜に影響を与えず且つ本発明の効果を妨げないことを限度として特に制限されず、コラーゲン合成促進用組成物中に０．０１〜７０重量％の割合で含まれるような範囲で適宜選択して使用することができるが、コラーゲン合成促進用組成物中の有効成分の安定性や皮膚使用感等の観点から、好ましくは０．１〜６０重量％、より好ましくは０．１〜５０重量％の範囲を挙げることができる。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物は、組成物の用途に応じて、食品、医薬部外品、化粧品に通常使用される剤形をとることができ、通常、固形剤、半固形剤または液剤である。具体的には、錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、軟膏剤、ゼリー剤などの公知の形態をとることができる。また、必要に応じてその他の溶媒や通常使用される基剤等を配合することによって、ペースト状、ムース状、ジェル状、液状、乳液状、クリーム状、シート状（基材担持）、エアゾール状、スプレー状などの各種所望の形態に調製することができる。

これらの剤形は当業界の通常の方法にて製造することができる。例えば、半固形剤であれば、必要に応じて上記各任意成分を配合混合し、さらに必要に応じてその他の溶媒や通常使用される外用剤の基剤等を配合することによって、ペースト状、ムース状、ジェル状、液状、乳液状、クリーム状、シート状（基材担持）、エアゾール状、スプレー状などの各種所望の形態に調製することができる。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物は、通常ｐＨ１〜８の液性を備えていればよいが、半固形剤又は液剤にする場合、アスコルビン酸類の安定性、皮膚や粘膜に対する低刺激性、及び皮膚使用感のよさという観点から、好ましくはｐＨ２〜７、より好ましくはｐＨ２〜６の酸性領域であることが望ましい。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物は、本発明の効果を奏すれば特に限定されないが、例えば医薬品、医薬部外品、食品［菓子、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなど）を含む）、栄養機能食品、特定保健用食品を含む］、化粧品ではファンデーション、口紅、マスカラ、アイシャドウ、アイライナー、眉墨及び美爪料等のメーキャップ化粧料；乳液、クリーム、ローション、オイル及びパックなどの基礎化粧料；洗顔料やクレンジング、ボディ洗浄料などの洗浄料、入浴剤などとすることができる。

本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進用組成物は内服用組成物として用いても外用組成物として用いてもよいが、本発明は外用組成物として使用されることが好ましい。本発明の組成物はコラーゲン合成量が顕著に増大しているのでコラーゲン減少に伴う各種障害（角膜潰瘍などの角膜障害、リューマチ，関節炎，変形性関節炎，骨関節炎などの関節障害、炎症性障害等）の治療又は予防用組成物、美容上の問題を予防又は治療するための組成物（抗シワ用組成物、抗タルミ用組成物等）として用いることができる。

本発明の、コラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡヌクレオチド、及び、該ＬＮＡヌクレオチドを有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤は、皮膚の線維芽細胞においてコラーゲン合成促進効果を有する。本発明のコラーゲン合成促進剤を含む組成物、又は化粧料は皮膚における線維芽細胞のコラーゲン合成を促して、結果として、シワの改善効果を示し、抗老化作用等の効果を期待することができる。

ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、アンチセンス遺伝子治療で使用される非常に興味深い特性を備えたDNA、RNAアナログである。ＬＮＡは、二環式及び三環式のヌクレオシドアナログ及びヌクレオチドアナログ、並びにそのようなアナログを含んでいるオリゴヌクレオチドである。ＬＮＡ及び関連したアナログの基本的な構造特性及び機能特性は、特許文献３、特許文献４に開示されている。

具体的には、ＬＮＡは、非常に高い生物安定性（低ターンオーバー）及び前例のない親和性（標的への非常に高い結合強度）と、正確な標的と不正確な標的を区別する能力（高い特異性）を兼ね備える。実際、ＬＮＡで記録された親和性増加は、先に報告された低値から中等値の範囲のすべてのアナログの親和性を追い越すものである。

ＬＮＡは、２’−酸素原子及び４’−炭素原子の間のメチレン架橋によりリボースが構造的に制限されたＲＮＡアナログである。この架橋は、リボフラノース環の柔軟性を限定し、固定した二環式形態へと構造をロックする。このいわゆるＮ型（すなわち３’−エンド）コンフォーメーションは、ＬＮＡを含む二重鎖のＴｍ値の増加、並びに結果的により高い結合親和性及びより高い特異性をもたらす。ＮＭＲスペクトル研究は、ＬＮＡ糖のロックされたＮ型コンフォーメーションを実際に実証しただけでなく、ＬＮＡモノマーがＮ型コンフォーメーションに向かってそれらの隣接する未修飾ヌクレオチドをねじることができることを明らかにした。重要なことには、ＬＮＡの好ましい特性は、核酸アナログでしばしば観察されるように、他の重要な特性を犠牲にして成り立つというものではない。

ＬＮＡは、DNA、RNAアナログ集団を構成する他のすべての化学物質と自由に混合することができる。ＬＮＡ塩基は、短い全ＬＮＡの配列、又はより長いＬＮＡ／ＤＮＡキメラとして、オリゴヌクレオチドの中へと組み込むことができる。ＬＮＡは、内部、３’位又は５’位に配置することができる。しかしながら、それらの固定した二環式コンフォーメーションのために、ＬＮＡ残基は、時には核酸鎖のらせんのねじれを妨害する。したがって一般には、２つ又はそれ以上の近接するＬＮＡ残基を有するオリゴヌクレオチドのデザインは、あまり好ましくない。好ましくは、ＬＮＡ残基は、らせんのねじれを妨害しない、通常のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧ）のような少なくとも１つの（修飾された）ヌクレオチドにより隔てられる。

もともと開発された好ましいＬＮＡモノマー（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマー）は、新しいＬＮＡモノマーへと修飾された。新規α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡは、３’エキソヌクレアーゼ活性に対する優れた安定性を示し、さらに性能の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインにおいては、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡよりも有力であり、用途が広い。特許文献３、特許文献４において開示されるように、キシロ−ＬＮＡ及びＬ−リボＬＮＡもまた使用することができる。本発明において、上記のタイプの任意のＬＮＡは、β−Ｄ−ＬＮＡアナログに対する選択性により、本発明の目標を達成するのに効果的である。

オリゴヌクレオチド合成
ヒトコラーゲンタイプVII型 COL701遺伝子プロモーター配列中（非特許文献５）の４１９６番目から４２０３番目のエンハンサー配列のアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを、標準のホスホルアミダイト（phosphoramidite）誘導体の化学的性質を用いて、構築者のプロトコールに従って、自動合成器（Perseptive Biosystems Expedite モデル８９０９）により合成した。ヌクレオシドのβ−シアノエチルジイソプロピル−ホスホルアミダイト誘導体を使用した。ヨウ素溶液を用いて、亜リン酸酸化工程を行った。カラム（Controlled Pore Glass,Perseptive Biosystems）から開裂させ、３３％の水性アンモニア溶液で５５℃にて１８時間処理することによって配列を完全に脱保護化した後、オリゴヌクレオチドを、酢酸ナトリウムの存在下でエタノールから析出させることにより精製した。次いで、塩化ナトリウムの勾配を用いた溶出によるイオン交換クロマトグラフィーにより、およびトリエチル酢酸アンモニウムの存在下でアセトニトリルの勾配を用いた溶出によるＣ１８逆相クロマトグラフィーにより、高圧液体クロマトグラフィー対照実験を行った。

ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、株式会社ニッポンイージーティ（Nippon EGT Co.,Ltd.）において合成された。以下の実施例は配列番号２のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む化粧料を調製して、その効果を確認した。配列番号２を含むＬＮＡオリゴヌクレオチドは期待通りの特性を有すると考えられる。ＬＮＡの修飾位置は３’側の８塩基が修飾された（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3' 下線部分がＬＮＡ修飾部位)。ＬＮＡで修飾するオリゴヌクレオチドの位置、数は前記３’側の８塩基に限定されるものではない。

コラーゲン合成促進作用試験
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ブレットキット−ＫＧM）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２〜４×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の濃度にブレットキット−ＫＧMで希釈した後、６ウェルディッシュ（１ウェル当たり９．６ｃｍ^２）に入れ、１ウェル当たり（培地：５ｍｌ）TE緩衝液に溶解した１００pmolの配列番号２のＬＮＡヌクレオチドを０．０５μｌ添加し３日間培養した。対照群にはTE緩衝液を同量添加した。

表皮角化細胞の遺伝子発現量は、培養終了後、遠心分離によりウェルから細胞を回収して、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社製）でRNAを抽出した。抽出後、リアルタイムPCR法により、ｃDNA(ｍRNA)を定量して、ＬＮＡヌクレオチドを含まない対照群とコラーゲン遺伝子の発現量を比較した。

その結果、本願発明のＬＮＡヌクレオチドは対照と比較して５倍以上のCOL7A1遺伝子の発現量を促進していた。

（皮膚化粧料のモニター試験）
モニター試験には配列番号２のＬＮＡヌクレオチドを使用して、下記に示す成分をそれぞれの割合で混合して美容液を得た。

ＬＮＡ溶液（100pmol） 1μl/100ml

ヒアルロン酸 0.5%

リン酸化アスコルビン酸 3%

クエン酸 0.6%

トレハロース 2%


結果：上記の割合で配合された美容液を３０〜７０代の健常な成人女性２０名を被験者とし、実施例３の美容液を通常の方法で連日３日使用してもらった。３日経過した後、皮膚の状態として乾燥による肌荒れに対する改善効果と、はり、たるみに対する改善効果を以下の基準で評価した。このモニター試験で皮膚に異常が生じた被験者は１名もいなかった。また、３日にわたって調製した美容液はその状態に変化が生じることなく安定していた。

肌の張り感 ８／２０
皺の伸び感 ７／２０
肌荒れの改善 ２／２０
肌の潤いの持続 １０／２０

以下、本発明のＬＮＡヌクレオチドを含有する皮膚外用剤の処方例を示す。なお、含有量は重量％である。
＜処方例１：クリーム＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
グリセリルモノステアレート ３．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ３．０
セタノール ２．０
スクワラン ３．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル １０．０
グリセリン ７．０
エチルパラベン ０．１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例２：クリーム＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ステアリン酸 １０．０
セタノール ２．０
ラノリン １．０
ミリスチン酸イソプロピル ３．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．５
トリエタノールアミン ０．８
ソルビトール（７０％） ４．０
メチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例３：リキッドファンデーション＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ヒアルロン酸 ０．０１
グリセリルモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム ０．５
ステアリン酸 ５．０
ベヘニルアルコール １．０
ラノリン ２．０
スクワラン ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル ４．０
顔料 １０．０
プロピレングリコール ７．０
トリエタノールアミン １．０
エチルパラベン ０．１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例４：リキッドファンデーション＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ラノリン ２．０
流動パラフィン ５．０
ステアリン酸 ２．０
セタノール １．０
グリセリン ２．０
スクワラン ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル ４．０
顔料 １０．０
プロピレングリコール ７．０
トリエタノールアミン １．０
エチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例５：乳液＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ヒアルロン酸 ０．０１
ステアリン酸 ２．０
エタノール ０．５
流動パラフィン １０．０
ラノリン脂肪酸イソプロピル ３．０
ラノリン ４．０
スクワラン ５．０
セスキイソステアリン酸ソルビタン １．０
プロピレングリコール ５．０
トリエタノールアミン ０．６
エチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例６：乳液＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ステアリン酸 ３．５
エタノール ０．５
流動パラフィン ３．０
ラノリン ０．５
スクワラン ２．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．８
エチルパラベン ０．１
カルボキシビニルポリマー１％液（アルカリ中和） ８．０
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例７：化粧水＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン １．０
１，３−ブチレングリコール ３．０
ソルビトール（７０％） ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 ３．０
エタノール １５．０
アスコルビン酸 ０．１
メチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００．０
＜処方例８：化粧水＞
ＬＮＡヌクレオチド ０．００１
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ソルビトール（７０％） ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 ３．０
エタノール １５．０
アスコルビン酸 ０．１
メチルパラベン ０．１
色素 ０．０１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００．０

Claims (6)

1. コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾することによって得られるコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチド。
2. コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾して得られたコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号２（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3')であるＬＮＡヌクレオチド。
3. コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾することによって得られたコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡ修飾されたLNAオリゴヌクレオチドを含有するコラーゲン合成促進剤。
4. コラーゲン遺伝子のプロモーター配列の５〜２０のヌクレオ配列をＬＮＡで修飾することによって得られた、コラーゲン遺伝子の発現を促進する配列番号２（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3')のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する請求項３に記載のコラーゲン合成促進剤。
5. 請求項１又は２に記載のコラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する化粧料。
6. コラーゲン遺伝子の発現を促進するＬＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが配列番号２（5'-GGGGCCGGCGTGGATTG-3')である請求項５記載の化粧料。