CN101171334B - 具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法，生产所述蛋白的cho细胞和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明目的是提供一种易于分离和纯化的并且具有完全等同于天然胶原分子的人类胶原分子的生产方法，其中用胶原基因转化的宿主细胞合成大量的来源于引入了高外源基因表达载体的基因的人类胶原蛋白。本发明的另一目的是提供由该生产方法生产的胶原分子。本发明人发现通过从多种哺乳动物细胞中选择具有低胶原表达的宿主细胞并将胶原基因构造引入能够高外源基因表达的载体中，可生产大量的几乎不受宿主细胞来源的胶原污染的人类胶原。

Description

具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法,生产所述蛋白的CHO细胞和试剂盒

技术领域

本发明涉及具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法。更具体地，本发明涉及生产人类胶原或人类胶原部分肽的生产方法。本发明的目的是提供一种对活体安全的并且可以轻易地纯化并获得的人类胶原或人类胶原的部分肽，以及它们的生产方法。更具体地，本发明通过稳定地将插入了人类胶原cDNA的哺乳动物表达载体转导到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，提供了人类胶原和其部分肽的生产方法。 

背景技术

胶原是一种蛋白，该蛋白分布于包括皮肤，骨头和软骨在内的几乎所有的身体组织中，并且公知具有重要的功能，例如通过为细胞提供支架构造来维持组织和器官的结构。同时，胶原是生物可吸收的材料，其可通过成纤维细胞分泌的胶原酶和存在于噬菌细胞中的胶原酶所降解。胶原被认为是非常有用的生物材料，因为它是如上所述的生物相容和生物可吸收的材料。目前，胶原已作为生物材料用于涂覆受伤的皮肤并且据报道可促进复原(非专利文献1和2)。 

全部胶原的40%存在于皮肤之中，皮肤和腱干重的70%或更多为胶原；因此，胶原对于开发人造皮肤非常重要。它作为有用材料被应用于细胞和器官的培养技术中，在快速发展的再生医学领域中其应用具有广阔的前景。还需指出的是通过口服方式，胶原(II型胶原)可用于抑制关节风湿病(非专利文献3和4)。作为这种胶原的原材料，主要使用了那些来自大型非人类动物(如猪和牛)组织的胶原。 

[非专利文献1]Surg.Forum，10，303(1960) 

[非专利文献2]J.Surg.Res.，10，485-491(1970) 

[非专利文献3]Lancet，342，799(1993) 

[非专利文献4]Science，261，1727-1730(1993) 

[专利文献1]日本专利申请公开公报(JP-A)H10-179169(未审查，公开的日本专利申请) 

发明内容

如上所述，胶原作为生物材料或药物对于再生治疗和活器官移植非常有用，但是，到目前为止所用的胶原来自大型非人类动物如猪和牛的组织中。虽然胶原是生来具有低免疫原性的蛋白质，但是据报道当来自于异种动物的胶原作为生物材料被移植，被植入或给药时，诱导了较低频率的免疫反应(J.Immunol.，136，877-882(1986)，Biomaterials，11，176-180(1990))。另外，由于牛的朊病毒污染的问题，源自牛的胶原的应用已经不可能了。此外目前用于胶原提取的动物(例如猪)中无法保证类似于朊病毒污染的问题不会发生。从以上提及的几方面，优选将人类来源的胶原作为生物材料直接应用于人体。然而，从人类组织中提取和纯化胶原不仅具有伦理和技术的问题，而且还有得到的胶原为非特定的交联形式的质量上的问题并且难于纯化。 

为了获得无病原污染的并且易于分离和纯化的非免疫原的胶原，已经开发出了使用基因重组技术生产胶原(Biochem.Soc.，28，350-353(2000))。但是，用于将编码分子量超过100,000的胶原分子的 cDNA引入宿主细胞的表达载体的制备是非常复杂的。另外，常规方法的生产力低，并且还不能实际应用。此外，已知胶原分子具有三个肽缔合的三螺旋结构。该结构为对基因的初级转译产物进行若干修饰的结果而形成的(N.Engl.J.Med.，311，376-386(1984))；但是，只有特定的细胞被认为具有这种修饰能力。 

多种尝试通过使用小鼠的成纤维细胞，仓鼠的肺细胞等等作为宿主来生产重组人类胶原(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，84，764-768(1987)，J.Biol.Chem.，264，20683-20687(1989))。虽然在这些例子中生产的胶原具有通常的分子结构，但是它们是来自于人类和宿主细胞的胶原基因产物的混合胶原分子。在表达了人类II型胶原的例子中(Biochem.J.，298，31-37(1994))，产物的量少至每升培养基中0.5～1mg，并且发现通过引入的cDNA表达的II型胶原被大量的宿主来源的II型胶原污染。因此，必须从源自被引入基因的II型胶原中将内源的II型胶原分离。 

除了上述的实例外，还有使用酵母(日本专利公表公报(JP-A)H7-501939(相应于非日语国际公布的未审查、公开的日本国家阶段公开))，昆虫细胞(日本专利申请公开公报(JP-A)H8-23979(未审查，公开的日本专利申请))，短芽胞杆菌(Bacillus brevis)(JP-AH11-178574)以及大肠杆菌(Escherichia coli)(JP-A 2002-325584)表达人类胶原的实例，但是胶原肽的后表达修饰与那些在动物细胞中进行的修饰不同。如上所述，到目前为止没有报道过以基因重组方法生产在数量和质量方面令人满意的人类胶原。另外，没有任何研究针对于生产大量具有三螺旋结构的蛋白例如胶原的方法。 

考虑到以上情况完成了本发明。本发明的目的是提供具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法。更具体地，目的是通过在引入增加了高表达外源基因载体的胶原基因的宿主细胞中合成大量的人类胶原蛋白(其中大量的人类胶原蛋白来自引入的基因)，提供易于分离和纯化，并且具有与天然胶原分子完全相同的结构的人类胶原分子的生产方法。 

为了解决上述问题本发明人进行了各种研究。结果，发明人发现通过从多种哺乳动物细胞中选择具有低胶原表达的宿主细胞并且将胶原基因构造引入能够高外源基因表达的载体中，可以生产大量的几乎没有被宿主细胞来源的胶原所污染的人类胶原，由此完成本发明。在宿主细胞中通过大量表达引入的胶原基因择优生产人类胶原的胶原生产方法还没有被报道过。 

具体地，本发明人成功地开发了不需要复杂纯化方法的大量人类胶原的生产方法，该方法通过将人类胶原基因嵌入能够高量表达外来基因的载体中，然后将得到的结构引入具有低表达胶原(三螺旋结构蛋白质)的宿主哺乳动物细胞中，由此完成本发明。 

具体地，本发明提供了： 

具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法，其中该方法包括： 

(a)将编码具有三螺旋结构的蛋白质的DNA引入载体中； 

(b)通过基因载体的转入来转化哺乳动物细胞；和 

(c)培养或培育转化体，并且从细胞或其培养上清液中收集具有三螺旋结构的蛋白质； 

根据[1]的方法，其中具有三螺旋结构的蛋白质为人类胶原或其部分肽； 

根据[2]的方法，其中人类胶原含有至少一种或多种类型的α链； 

根据[2]的方法，其中人类胶原为人类I型胶原； 

根据[4]的方法，其中人类I型胶原为α1链和α2链的复合体； 

根据[2]的方法，其中人类胶原是人类II型胶原； 

根据[2]的方法，其中人类胶原是人类III型胶原； 

根据[1]的方法，其中编码具有三螺旋结构的蛋白质的DNA为至少一种选自以下的DNA： 

(a)含有SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一的DNA；和 

(b)在严格条件下与含有SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一的DNA杂交的DNA； 

根据[1]～[8]中任一的方法，其中哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞； 

根据[1]～[8]中任一的方法，其中哺乳动物细胞为人胚肾(HEK293)细胞； 

根据[1]～[10]中任一的方法，其中将编码具有三螺旋结构的蛋白质的DNA引入的载体为pNOW/CMV-AA； 

根据[1]～[11]中任一的方法生产的人类胶原； 

引入了至少一种选自以下的DNA的载体： 

(a)含有SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一的DNA；和 

(b)在严格条件下与含有SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一的DNA杂交的DNA； 

携带[13]的载体的哺乳动物细胞；和 

用于生产具有三螺旋结构的蛋白质的试剂盒，其中试剂盒含有[13]的载体或[14]的哺乳动物细胞。 

附图说明

图1显示了人类I型胶原的α1链的表达构造。 

hColIa1：人类I型胶原α1链的cDNA，PCMV：巨细胞病毒启动子，BGHPA：牛生长素基因的聚腺苷酸添加信号，PSVd：缺乏增强子的猿猴病毒40的启动子，DHFR：小鼠二氢叶酸还原酶的cDNA，SVpA：猿猴病毒40的聚腺苷酸添加信号，ColE1ori：大肠杆菌的复制起点，Neor：哺乳动物(G418抗性)和大肠杆菌(卡那霉素抗性)的选择标记。 

图2显示了人类I型胶原的α2链的表达构造。 

hColIa2：人类I型胶原α2链的cDNA，PCMV：巨细胞病毒启动子，BGHPA：牛生长素基因的聚腺苷酸添加信号，PSVd：缺乏增强子的猿猴病毒40的启动子，DHFR：小鼠二氢叶酸还原酶的cDNA，SVpA：猿猴病毒40的聚腺苷酸添加信号，ColE1ori：大肠杆菌的复制起点，Neor：哺乳动物(G418抗性)和大肠杆菌(卡那霉素抗性)的选择标记。 

图3显示了人类II型胶原的α1链的表达构造。 

hColIIa1：人类II型胶原α1链的cDNA，PCMV：  巨细胞病毒启动子，BGHPA：牛生长素基因的聚腺苷酸添加信号，PSVd：缺乏增强子的猿猴病毒40的启动子，DHFR：小鼠二氢叶酸还原酶的cDNA，SVpA：猿猴病毒40的聚腺苷酸添加信号，ColE1ori：大肠杆菌的复制起点，Neor：哺乳动物(G418抗性)和大肠杆菌(卡那霉素抗性)的选择标记。 

图4显示了人类III型胶原的α1链的表达构造。 

hColIIIa1：人类III型胶原α1链的cDNA，PCMV：巨细胞病毒启动子，BGHPA：牛生长素基因的聚腺苷酸添加信号，PSVd：缺乏增强子的猿猴病毒40的启动子，DHFR：小鼠二氢叶酸还原酶的cDNA，SVpA：猿猴病毒40的聚腺苷酸添加信号，ColE1ori：大肠杆菌的复制起点，Neor：哺乳动物(G418抗性)和大肠杆菌(卡 那霉素抗性)的选择标记。 

图5是显示了培养上清液中重组人类I型胶原的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的照片。泳道1：人类I型胶原(100μg/mL)，泳道2：重组I型胶原。 

图6是显示了在培养上清液中重组人类I型胶原的胃蛋白酶消化产物SDS-PAGE分析的照片。泳道1：重组人类I型胶原(185μg/mL)，泳道2：重组人类I型胶原(20倍浓缩的)。 

图7是显示了纯化的重组人类I型胶原和其胃蛋白酶消化产物的Western杂交检测的一系列照片。 

A.通过抗体检测人类I型胶原的α1链，泳道1：人类I型胶原(50μg/mL)，泳道2：重组I型胶原，泳道3：重组I型胶原的胃蛋白酶消化产物。 

B.通过抗体检测人类I型胶原的α2链，泳道1：人类I型胶原(10μg/mL)，泳道2：重组I型胶原，泳道3：重组I型胶原的胃蛋白酶消化产物。 

图8是显示了培养上清液中重组人类II型胶原的SDS-PAGE分析的照片。泳道1：人类II型胶原(100μg/mL)，泳道2：重组人类II型胶原。 

图9是显示了培养上清液中重组人类II型胶原的Western杂交分析的照片。泳道1：人类II型胶原(10μg/mL)，泳道2：重组人类II型胶原(10倍稀释的)。 

图10是显示了培养上清液中重组人类II型胶原的胃蛋白酶消化产物的SDS-PAGE分析的照片。泳道1：人类II型胶原(100μg/mL)，泳道2：重组人类II型胶原(5倍浓缩的)。 

图11是显示了培养上清液中重组人类II型胶原的胃蛋白酶消化产物的Western杂交分析的照片。泳道1：人类II型胶原 (10μg/mL)，泳道2：重组人类II型胶原。 

图12是显示了培养上清液中重组人类III型胶原的SDS-PAGE分析的照片。泳道1：人类III型胶原(100μg/mL)，泳道2：重组人类III型胶原。 

图13是显示了培养上清液中重组人类III型胶原和其胃蛋白酶消化产物的Western杂交分析的照片。泳道1：人类III型胶原(10μg/mL)，泳道2：重组人类III型胶原(10倍稀释的)，泳道3：重组人类III型胶原的胃蛋白酶消化产物。 

图14是显示了培养上清液中纯化的人类III型胶原的SDS-PAGE分析的照片。 

A.I型胶原，泳道1：人类I型胶原，泳道2：重组I型胶原。 

B.III型胶原，泳道1：人类III型胶原，泳道2：重组III型胶原。 

具体实施方式

在此以下显示了实施本发明的最佳的方式并对本发明做了更加详尽的说明。 

本发明涉及具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法，包括以下步骤： 

(a)将编码具有三螺旋结构的蛋白质的DNA引入载体中； 

(b)通过基因载体的转入来转化哺乳动物细胞； 

(c)培养或培育该转化体，并从细胞或其培养上清液中收集具有三螺旋结构的蛋白质。 

本发明中“具有三螺旋结构的蛋白质”并不特别地限定，只要其具有三螺旋结构，但是优选胶原或胶原凝集素，并且更优选胶原。具有三螺旋结构的蛋白质可以是在培养或生产步骤中构造三螺旋 结构，或者在培养或生产步骤之后通过处理(如纯化)构造三螺旋结构的蛋白质。生产大量的可以在单一链结构状态即可形成三螺旋结构的蛋白质是同样可能的。 

已知多于20种不同类型的胶原和约25种类型的构成的α链。编码它们的基因已经被克隆并且它们的核苷酸序列已经被阐明(″Connective Tissue and Its Heritable Disorders″，145-165页，由Weily-Liss Inc.出版(1992))。这些基因可通过本领域技术人员公知的基因重组技术引入可以高度表达外来基因的本发明使用的载体中(例如，″Molecular Cloning″第二版，由Cold Spring Harbor Laboratory Press出版(1989))。本发明中使用的人类胶原的cDNA可以为任何这些克隆的胶原的cDNA，并且包括部分胶原肽的cDNA。 

本发明的胶原不具有特别地限定的来源，但是优选哺乳动物来源的胶原，更优选人类来源的胶原。 

此外，本发明的胶原还包括那些其氨基酸序列由于取代，缺失等而部分改变的胶原，或者具有加入了非胶原来源的氨基酸序列的胶原。另外，通过将载体引入宿主哺乳动物细胞而获得转导细胞表达蛋白质分子的方法是已知的。同样的方法也可应用于本发明中。 

下述方法可用来检测胶原是否是由引入了上述高外源基因表达载体的细胞作为重组蛋白来合成的。具体地，胶原肽可以通过免疫化学的方法来鉴别，例如通过使用商业可用的特定结合到人类胶原上的抗体的Western杂交。通常在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，根据其分子量胶原是不迁移的(Nature，227，680-685(1970))。因此，根据Matsudaira等的方法(J.Biol.Chem.，261，10035-10038(1987))，同时以胶原作为标记将样本进行电泳之后，将其转移到尼龙薄膜或硝化纤维膜上，检测样本与抗胶原抗体的反应。此外，由表达载体产生的重组胶原产物中是否存在三螺旋结构的分子可进行以下的检验。 

典型的纤维性胶原为三个亚基(α链)形成的三链分子，并且具有分子内的三螺旋结构。此外，具有三螺旋结构的胶原已知可耐受胃蛋白酶消化。因此，在蛋白质样本中三链分子的存在可在酸性环境下由用胃蛋白酶消化引入了上述高外源基因表达载体细胞的培养上清液来确认，并且检测样本是否具有胃蛋白酶抗性结构。 

具体地，在本发明中，在还原条件下将用胃蛋白酶处理的蛋白样本进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果，得到的重组凝胶显示出具有与天然胶原相似的胃蛋白酶抗性，因此期望具有胃蛋白酶抗性的胶原肽包含于引入了高外源基因表达载体的细胞培养上清液中。上述结论显示出本发明的表达载体具有在宿主细胞中合成具有耐受胃蛋白酶(其等价于在活体中发现的胶原的特性)的胶原的能力。 

生产和纯化本发明的三螺旋结构蛋白质的方法给出如下，但不作为限定。 

本发明中作为宿主细胞使用的哺乳动物细胞不做特别地限定，但是优选CHO细胞或HEK293细胞。 

通过悬浮培养以大量培养本发明使用的CHO细胞或HEK293细胞。例如，在振荡培养瓶或旋动培养瓶中用100ml～1L的培养基培养1×10⁸～1×10⁹的引入了含有弱化的新霉素磷酸转移酶基因，小鼠的二氢叶酸还原酶基因，和编码人类胶原或人类胶原部分肽的cDNA的人类胶原表达载体的重组CHO细胞。将这些细胞培养合适的时间后，从收集的培养上清液中提取大量的蛋白质。 

在引入了含有弱化的新霉素磷酸转移酶基因，小鼠的二氢叶酸还原酶基因，和编码人类胶原或人类胶原部分肽的cDNA的人类胶原表达载体的重组CHO细胞培养上清液中，不仅存在具有三螺旋结构的三链胶原分子，而且存在还未形成正常三链分子的胶原。如 上所述，不具有三螺旋结构的胶原分子由胃蛋白酶消化。因此，缺乏三螺旋结构的胶原分子可通过胃蛋白酶消化而被除去。该处理还可同时降解或除去在培养上清液中的非胶原蛋白。通过使用上述特性，通过直接用胃蛋白酶处理存在于引入了含有弱化的新霉素磷酸转移酶基因，小鼠的二氢叶酸还原酶基因，和编码人类胶原或人类胶原部分肽的cDNA的人类胶原表达载体的重组CHO细胞培养上清液中的总蛋白，就可消化或除去非胶原蛋白以及缺乏三螺旋结构的胶原。 

在本发明中，人类胶原涉及所有的目前已知的人类胶原，包括I～XXI型胶原，并且还包括其部分肽。本发明的胶原的类型未作特别地限定，包括的典型实例为I型，II型，III型，IV型，V型，VII型，IX型，XI型，XII型，XVII，和XVIII，并且优选I型，II型，III型。I型，IV型，V型，IX型和XI型由两种或三种类型的α链组成，而II型，III型，VII型，XII型，XVII型和XVIII型由一种类型的α链组成。它们每一个都具有下述分子组成：I型：[α1(I)]₂α2(I)，II型：[α1(II)]₃，III型：[α1(III)]₃，IV型：[α1(IV)]₂α2(IV)，V型：[α1(V)]₂α2(V)和α1(V)α2(V)α3(V)，VII型：[α1(VII)]₃，IX型：α1(IX)α2(IX)α3(IX)，XI型：α1(XI)α2(XI)α3(XI)，XII型：[α1(XII)]₃，XVII型：[α1(XVII)]₃，或XVIII型：[α1(XVIII)]₃；然而本发明胶原的分子组成不特别地限定。此外，本发明胶原的分子组成不限定为天然胶原的分子组成并且可以人工地由三种不同类型的α链组成。 

编码本发明的I型胶原的α1链的DNA的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：1，编码I型胶原的α2链的DNA的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：4，编码II型胶原的α1链的DNA的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：7并且编码III型胶原的α1链的DNA的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：10。 

编码本发明胶原的DNA包括具有核苷酸序列SEQ ID NO：1，4，7和10中任一的寡核苷酸，优选包括选择性杂交到具有核苷酸序列SEQ ID NO：1，4，7和10中任一的寡核苷酸上的寡核苷酸。“选择性杂交”指的是在合适的严格度杂交条件下与存在于DNA或RNA样本中具有特定序列(即第二寡核苷酸)的分子杂交、与该分子形成双链或与该分子完全结合的核酸分子。严格条件例如通常为42℃，2×SSC，和0.1％SDS，优选条件为50℃，2×SSC，和0.1％SDS，并更优选65℃，0.1×SSC，和0.1％SDS，但是不限定为这些条件。影响杂交严格度的条件可包括多种因素例如温度和盐的浓度，并且本领域的技术人员可以选择这些合适的因素以获得最好的严格度。 

本发明生产的胶原可为前肽连接到N-端和C-端的前胶原分子或者可以是除去了前肽的形式。 

在本发明中，“胶原的部分肽”指的是由20％或更多(例如20，30，40，50，60，70，80或90％)的胶原编码cDNA的多核苷酸编码的多肽。所述肽还包括那些胶原氨基酸序列被部分改变的肽或那些具有另外的非胶原氨基酸序列的肽。 

在本发明中，“具有低胶原表达的哺乳动物细胞”指的是当在密度为1×10⁶细胞/mL培养时产生50ng/mL的或更少的胶原的细胞；并且优选实例为CHO细胞和HEK293细胞。在本发明中，“高表达”指的是表达10μg/mL或更多的胶原，优选表达50μg/mL或更多的胶原。 

在本发明中，“高外源基因表达载体”指的是例如在哺乳动物细胞中含有弱药物选择标记基因的载体，如此以致于由载体携带的外源基因被选择性地嵌入哺乳动物细胞中染色体的活性转录区域。该载体优选包括pNOW/CMV-AA载体。pNOW/CMV-AA载体在JP-AH10-179169中可知。在本发明中，培养方法可为悬浮液或附着培养。 

本发明中列举的所有现有技术文献以参考方式并入于此。 

下文中，本发明将使用实施例作更加详细的描述，但是不能理解为对本发明的限制。 

实施例1 

pNOW/CMV-AA载体的制备 

通过已知方法(JP-A H10-179169)制备使用的pNOW/CMV-AA载体。 

实施例2 

胶原表达载体的制备(1)：人类I型α1链cDNA的分离 

人类I型α1链胶原基因已经被克隆出来了，并且其核苷酸序列已经被报道过(EMBL Gene Database Accession NO：NM000088)。序列示于SEQ ID NO：1。人类I型α1 cDNA通过聚合酶链式反应(PCR)方法(″PCR Technology″，由Stockton Press出版(1989)从人类睾丸来源的cDNA中扩增出来。具体地，使用人的睾丸来源的cDNA(Becton，Dickinson and Company)作为模板和SEQ ID NO：2(GCGGCCGCCACCATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG)以及SEQ ID NO：3(TTCTAGATTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA)的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增出SEQ ID NO：1的全长序列。更具体地，使用商业可用的PCR扩增试剂盒(具有GC缓冲液的TaKaRa LA Taq：TakaraBio Inc.)进行反应。反应混合物加热到94℃持续5分钟然后进行以下三个步骤的35次循环：变性(94℃，20秒)，引物退火(60℃，30秒)，扩增(72℃，3分30秒)。然后在72℃进行额外的处理持续7分钟以结束反应。在下文中所有在实施例中的PCR反应都以相同的反应循环进行。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并且使用连接试剂盒(DNA连接试剂盒ver.2：Takara Bio Inc.)将其连接到用于PCR产物的克隆载体(pT7Blue试剂盒：Novagen Inc.)上。将 连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基(Difco Inc.)上的氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA。将编码人类I型α1链胶原的DNA片断切离质粒DNA，并使用DNA连接试剂盒ver.2与实施例1中制备的pNOW/CMV-AA载体的Not I和Xba I-消化产物连接。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基上的一个氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA(pNOW-hColIa1，图1)。 

实施例3 

胶原表达载体制备(2)：人类I型α2链cDNA的分离 

人类I型α2链胶原基因已经被克隆出来了，并且其核苷酸序列已经被报道过(EMBL Gene Database Accession NO：NM000089)。该序列显示于SEQ ID NO：4中。通过PCR从来自人类肝脏来源的cDNA扩增出人类I型α2cDNA。具体地，使用人类肝脏来源的cDNA(WakoPure Chemical Industries，Ltd)作为模板并且以  SEQ ID NO：5(GCGGCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGA)和SEQ ID NO：6(ACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAAT)的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增出SEQ ID NO：4的全长序列。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并且通过使用连接试剂盒(DNA连接试剂盒ver.2：Takara Bio Inc.)将其连接到用于PCR产物的克隆载体(pT7Blue试剂盒：Novagen Inc.)上。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-IBlue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基(Difco Inc.)上的四株氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA。将编码人类I型α2链胶原的DNA片断切离质粒DNA，并使用DNA连接试剂盒ver.2与用Not I和Xba I切开的pNOW/CMV-AA载体连接。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基上的一个氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA(pNOW-hColIa2，图2)。 

实施例4 

胶原表达载体的制备(3)：人类II型α1链cDNA的分离 

人类II型α1链胶原基因已经被克隆出来了，并且其核苷酸序列也已经被报道过(EMBL Gene Database Accession NO：NM001844.1)。所述序列显示于SEQ ID NO：7中。通过PCR从人类睾丸来源的cDNA中将人类II型α1 cDNA扩增出来。具体的，使用人类睾丸来源的cDNA(Becton，Dickinson and Company)作为模板并以SEQ IDNO：8(GGCCCCGCGGTGAGCCATGATTCGCCTCG)和SEQ ID NO：9(TCTAGATTACAAGAAGCAGACCGGCCCTAT)的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增出SEQ ID NO：7的全长序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用连接试剂盒(DNA连接试剂盒ver.2：Takara BioInc.)将其连接到用于PCR产物的克隆载体(pT7Blue试剂盒：NovagenInc.)上。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基(Difco Inc.)上的四株氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA。将编码人类II型α1链胶原的DNA片断切离质粒DNA，并使用DNA连接试剂盒ver.2与用Not I和Xba I切开的pNOW/CMV-AA载体连接。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基上的一个氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA(pNOW-hColIIa1，图3)。 

实施例5 

胶原表达载体的制备(4)：人类III型α1链cDNA的分离 

人类III型α1链胶原基因已经被克隆出来，并且其核苷酸序列已经被报道过(EMBL Gene Database Accession NO：X14420)。该序列显示于SEQ ID NO：10中。通过PCR从来自于人类肝脏来源cDNA将人类III型α1 cDNA扩增出来。具体地，使用人类肝脏来源cDNA(Wako Pure Chemical Industries，Ltd)作为模板并且SEQ ID NO： 11(GCGGCCGCCACCATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGGA)和SEQ IDNO：12(TCTAGATTATAAAAAGCAAACAGGGCCAAC)的寡核苷酸作为引物通过PCR扩增出SEQ ID NO：10的全长序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并且使用连接试剂盒(DNA连接试剂盒ver.2：Takara Bio Inc.)将其连接到用于PCR产物的克隆载体(pT7Blue试剂盒：Novagen Inc.)上。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基上的四株氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA。将编码人类III型α1链胶原的DNA片断切离质粒DNA，并使用DNA连接试剂盒ver.2与用Not I和Xba I切开的pNOW/CMV-AA载体连接。将连接过的DNA引入大肠杆菌菌株XL-I Blue之后，通过培养出现在LB琼脂培养基上的一个氨苄青霉素抗性菌落获得质粒DNA(pNOW-hColIIIa1，图4)。

实施例6 

人类I型凝胶的制备：使用pNOW-hColIa1和pNOW-hColIa2表达载体的人类I型胶原基因的转入和初始G418抗性克隆的建立 

在25cm²的培养瓶中通过脂转染方法(Effectene转染试剂，QIAGEN Inc.)将实施例2和3中获得的分别1微克的pNOW-hColIa1和pNOW-hColIa2转入1.5×10⁶的DHFR缺乏的CHO细胞中(CHO DG44细胞；由Dr.Gail Urlaub提供)。转化方法根据操作指南进行。48小时后，该细胞通过胰蛋白酶处理除去并进行细胞计数。然后用100mL含有0.8mg/mL的G418和10％的透析的胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium稀释5×10⁵的细胞，然后接种到10个96孔的微量滴定板(960个孔)上，接下来在5％的二氧化碳气体的存在下于37℃培养三周。用1mL含有0.8mg/mL的G418和10％的透析的胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium将197个孔中的存活细胞转入到24孔板上，并且培养直到铺满为止。弃掉培养上清液，向每个孔中加入1mL的PBS(Invitrogen Inc.)，再次弃掉培养上清液。将0.5mL的ProCHO4(Takara Bio Inc.)(CHO细胞的CD培养基)加入每个孔中并于37℃在5％的二氧化碳气体存在下培养96小时。随后，检测在培养上清液中产生的人类I型胶原的量。 

实施例7 

pNOW-hColIa1和pNOW-hColIa2转导细胞克隆产生的人类I型胶原的定量检测 

通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对产生的量进行检测。将12.5μL的培养上清液与等体积的Tris-SDSβ-ME样本处理溶液(Daiichi PureChemicals Co.，Ltd.)混合，并在95℃加热处理5分钟。将该混合物装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGEL，ATTO Inc.)通过电泳将其分开。电泳后，通过Coomassie Brilliant Blue染色溶液(Amersham Biosciences)处理凝胶，检测到并且定量了聚丙烯酰胺凝胶中的人类I型胶原。作为对比对照，使用以相同的方式处理的12.5μg/mL～100μg/mL的人类I型胶原(Cosmo Bio Co.，Ltd.)。 

实施例8 

人类I型胶原的生产 

在G418抗性细胞系中，生产最大量的人类I型胶原的一个细胞克隆通过传代和培养稳定下来。人类I型胶原生产的水平为85μg/mL培养基(四天)。 

实施例9 

培养上清液中重组人类I型胶原的SDS-PAGE分析 

用细胞培养溶液IS CHO-CD(IS Japan Co.，Ltd.)，在25cm²的培养瓶中将由基因扩增获得的大量生产人类I型胶原的细胞克隆调整为1×10⁶细胞/mL。在5％的二氧化碳气体存在的条件下于37℃培 养96小时，收集培养液体。通过离心的方法除去细胞获得培养上清液。12.5μL的培养上清液与等体积的Tris-SDSβ-ME样本处理溶液(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)混合，并在95℃加热处理5分钟。混合物装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGEL，ATTO Inc.)并通过电泳分离。以相同的方式进行下述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳完成后，通过用Coomassie Brilliant Blue染色液(Amersham Biosciences)处理凝胶，检测到聚丙烯酰胺凝胶中的人类I型胶原。使用以相同方式处理的100μg/mL人类I型胶原作为对比对照。图5显示了由人类I型胶原生产用细胞克隆获得的培养上清液的SDS-PAGE分析结果。在培养上清液中检测到可能为重组人类I型胶原α1链的150kDa和170kDa的多肽，以及可能为重组人类I型胶原α2链的130kDa和150kDa的多肽。 

实施例10 

培养上清液中重组人类I型胶原的胃蛋白酶消化和SDS-PAGE分析 

通过向上清液中添加99.7％的乙酸达到最终浓度0.5M然后添加胃蛋白酶(Sigma Inc.)达到最终浓度为24单位/mL，接下来在20℃培养2小时，进行由人类I型胶原生产用细胞克隆获得的培养上清液的胃蛋白酶消化。下述的胃蛋白酶的消化都以相同的方式进行。从胃蛋白酶消化获得的样本通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。使用185μg/mL的商业可用的重组人类I型胶原(Beckton，Dickinson and Company)作为对比对照。图6显示了通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对胃蛋白酶消化产物的分析结果。如所观测到的商业可用的人类I型不完全胶原(atelocollagen)，当用胃蛋白酶处理时，在培养上清液中的重组人类I型胶原发现可能分别为α1链和α2链的130KDa和120KDa的多肽。这些事实显示出在由人类I型胶原 生产用细胞克隆获得的培养上清液中含有具有完全等同于天然类型胶原的胃蛋白酶抗性的重组人类I型胶原。 

实施例11 

上清培养液中重组人类I型胶原的Western杂交分析 

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，将聚丙烯酰胺凝胶浸入到转移缓冲液中，然后通过传统的方法将聚丙烯酰胺凝胶中的人类I型胶原转移到PVDF膜上。用Block Ace进行封闭后，该膜与2μg/mL的人类I型胶原α1链抗体反应，然后与用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗羊IgG抗体反应。通过使用TMB过氧化物酶试剂(FunakoshiCo.)检测HRP活性的方法检测反应了的抗体。使用50μg/mL的重组人类I型胶原(Beckton，Dickinson and Company)作为对比对照。使用人类I型胶原α2链抗体代替抗人类I型胶原α1链抗体检测人类I型胶原α2链。用10μg/mL的人类I型胶原作为对比对照。图7显示了Western杂交分析的结果。在培养上清液中检测到可能是重组人类I型胶原α1链(可被抗人类I型胶原α1链抗体结合)的170KDa的多肽和可能是重组人类I型胶原α2链(可被抗人类I型胶原α2链抗体结合)的130KDa和150KDa的多肽。 

实施例12 

培养上清液中人类I型胶原的纯化 

100mL的含有人类I型胶原的培养上清液进行如下纯化： 

于4℃用离心浓缩过滤器(VIVASPIN20(MWCO 10,000)：Sartorius)以3,000rpm将用0.45μm薄膜过滤器(Millipore Co.)过滤的100mL培养上清液浓缩到30mL。 

于4℃边搅拌边向上述浓缩的培养上清液缓慢添加30mL的90％的硫酸铵溶液进行盐析。所有的硫酸铵溶液加入后，混合物进一步搅拌一个小时。然后，接下来混合物放置在冰上1个小时，然 后于4℃在高速冷冻离心机中以18,000rpm离心30分钟。溶液中的胶原由于盐析不溶解并且漂浮于溶液的表面，然后将其收集并完全溶解于5mL的D-PBS(Sigma Co.)中。该溶液用0.45μm薄膜过滤器(Millipore Co.)过滤，然后使用D-PBS平衡的Superose 6(AmershamBiosciences)由凝胶过滤进行纯化，并且第一个峰被分离。收集到的峰片断用VIVASPIN6(MWCO 100,000)浓缩约20倍。向浓缩的胶原溶液中添加合适量的D-PBS进一步浓缩，除去低分子量的片断。添加该D-PBS至少三次或更多次。 

将原100mL培养上清液得到的纯化的胶原溶液浓缩至接近300μL并通过SDS-PAGE电泳确定其纯度。 

实施例13 

人类II型胶原生产的检测：用pNOW-hColIIa1表达载体的人类II型胶原基因的转化和初始G418抗性克隆的建立 

在25cm²的培养瓶中通过脂转染方法将1微克的pNOW-hColIIa1转入1.5×10⁶的CHO-DG44细胞中。转入方法根据操作指南进行。48小时后，该细胞通过胰蛋白酶处理除去并进行细胞计数。然后用100mL含有0.8mg/mL的G418和10％的透析的胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium稀释5×10⁵个细胞，然后接种到10个96孔的微量滴定板(960个孔)上，接下来在5％的二氧化碳气体的存在下于37℃培养三周。用1mL含有0.8mg/mL的G418和10％的透析的胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium将126个孔中的存活细胞转入到24孔板上，并且培养直到铺满为止。弃掉培养上清液，向每个孔中加入1mL的PBS(Invitrogen Inc.)，再次弃掉培养上清液。将0.5mL的ProCHO4(Takara Bio Inc.)(用于CHO细胞的无血清CD培养基)加入到每个孔中并于37℃在5％的二氧化碳气体存在下培养96小时。接着，检测在培养上清液中产生的人 类II型胶原的量。 

实施例14 

由pNOW-hColIIa1转导的细胞克隆生产的人类II型胶原的定量分析 

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对产生的量进行检测。7.5μL的培养上清液与等体积的Tris-SDSβ-ME样本处理溶液(Daiichi PureChemicals Co.，Ltd.)混合，并在95℃加热处理5分钟。将该混合物装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGEL，ATTO Inc.)通过电泳将其分开。电泳完成后，通过Coomassie Brilliant Blue染色溶液(Amersham Biosciences)处理凝胶，检测到并且定量了聚丙烯酰胺凝胶中的人类II型胶原。作为对比对照，使用以相同的方式处理的12.5μg/mL～100μg/mL的人类II型胶原(Cosmo Bio Co.，Ltd.)。 

实施例15 

G418抗性细胞系的基因扩增 

在G418抗性细胞系中，产生最大量人类II型胶原的一个细胞克隆通过传代和培养稳定下来，然后使用MTX进行基因扩增。首先在含有5nM MTX的培养基中扩增一周，在含有25nM MTX的培养基中扩增一周，在含有50nM MTX的培养基中扩增一周，在含有250nM MTX的培养基中扩增三周，在含有1μM MTX的培养基中扩增三周。结果，当MTX达到25nM时，人类II型胶原的生产水平增加到70μg/mL培养基(四天)。通常，在10nM～10μM间的多种MTX的浓度用于基因扩增，10μM通常用作最终浓度。但是，建立起稳定的重组细胞系时由于细胞毒性，曝露于高浓度是有问题的。因此，在低的MTX浓度下得到高的生产力也是非常重要的标准，因而在本发明中使用最高1μM的浓度。另外，虽然包括选择在内的MTX曝露时间通常为6～12个月，但是本试验在大约9周 内完成。不管这些试验条件，发现有效地增加了产生的人类II型胶原的量。下述的G418抗性细胞系中的基因扩增都以相同的方式进行。 

实施例16 

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对培养上清液中的重组人类II型胶原的分析 

用细胞培养基IS CHO-CD(IS Japan Co.，Ltd.)，在25cm²的培养瓶中将由基因扩增得到的大量产生人类II型胶原的细胞克隆调整为1×10⁶细胞/mL。在5％的二氧化碳气体存在的条件下于37℃培养96小时，收集培养液体并通过离心除去细胞获得培养上清液。7.5μL的培养上清液与等体积的Tris-SDSβ-ME样本处理溶液(Daiichi PureChemicals Co.，Ltd.)混合，并在95℃加热处理5分钟。混合物装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGEL，ATTO Inc.)并通过电泳分离。以相同的方式进行下述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳完成后，通过用Coomassie Brilliant Blue染色液(Amersham Biosciences)处理凝胶检测到聚丙烯酰胺凝胶中的人类II型胶原。使用以相同方式处理的100μg/mL人类II型胶原(Cosmo Bio Co.，Ltd.)作为对比对照。图8显示了由人类II型胶原生产用细胞克隆获得的培养上清液的SDS-PAGE分析结果。在培养上清液中发现了可能为重组人类II型胶原的170kDa和200kDa的多肽。 

实施例17 

培养上清液中重组人类II型胶原的Western杂交分析 

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，将聚丙烯酰胺凝胶浸入到转移缓冲液中，然后通过传统的方法将聚丙烯酰胺凝胶中的人类II型胶原转移到PVDF膜上。用Block Ace进行封闭后，该膜与1μg/mL的人类II型胶原链抗体(Cosmo Bio Co.，Ltd.)反应，然后与用 辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗羊IgG抗体反应。通过使用TMB过氧化物酶试剂(Funakoshi Co.)检测HRP活性的方法检测反应了的抗体。使用10μg/mL的人类II型胶原(Cosmo Bio Co.，Ltd.)作为对比对照。在培养上清液中检测到可能是重组人类II型胶原(可被人类II型胶原抗体结合)的170KDa的多肽(图9)。 

实施例18 

培养上清液中重组人类II型胶原的胃蛋白酶消化，SDS-PAGE分析和Western杂交分析 

从胃蛋白酶消化得到的样本通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。使用100μg/mL的人类II型胶原(Cosmo Bio Co.，Ltd.)作为对比对照。图10显示了通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胃蛋白酶消化产物的结果。如所观测到的商业可用的人类II型不完全胶原，当用胃蛋白酶处理时，培养上清液中的重组人类II型胶原作为130KDa的多肽被检测到。这些事实显示出在由人类II型胶原生产用细胞克隆获得的培养上清液中含有具有完全等同于天然类型胶原的胃蛋白酶抗性的重组人类II型胶原。通过Western杂交分析获得了同样的结果(图11)。 

实施例19 

人类III型胶原生产的检测：使用pNOW-hColIIIa1表达载体的人类III型胶原基因的转化和初始G418抗性克隆的建立 

在25cm²的培养瓶中通过脂转染方法将1微克的pNOW-hColIIIa1转入1.5×10⁶的CHO-DG44细胞中。转化方法根据操作指南进行。48小时后，该细胞通过胰蛋白酶处理除去并进行细胞计数。然后用100mL含有0.8mg/mL的G418和10％的透析的胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium稀释3×10³个细胞，并接种在10个96孔的微量滴定板(960个孔)上，之后于37℃在5％ 的二氧化碳气体存在下培养三周。结果，仅在117个孔中发现了存活细胞(G418抗性)。用1mL含有0.8mg/mL的G418和10％的透析的胎牛血清的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium将存活细胞转移到24孔的板上，并且培养直到铺满为止。弃掉培养上清液，向每个孔中加入1mL的PBS(Invitrogen Inc.)，再次弃掉培养上清液。0.5mL的CHO-S-SFM II(Invitrogen Inc.)(用于CHO细胞的无血清培养基)加入每个孔中并于37℃在5％的二氧化碳气体存在下培养72小时。接着，检测在培养上清液中产生的人类III型胶原的量。 

实施例20 

由pNOW-hColIIIa 1转导的细胞克隆产生的人类III型胶原的定量分析 

通过班点杂交的方法检测产生的量。用1μL的72小时的培养上清液，1μL的用于CHO细胞的在无血清培养基中2倍稀释(0.125～8μg/mL)的商业可用的人类III型胶原(Beckton，Dickinson andCompany)，1μL的CHO-S-SFM II，和单独1μL的CHO-S-SFM II在尼龙膜上打点；然后风干一小时。用Block Ace封闭后，将膜与1μg/mL的抗人类III型胶原抗体(Cosmo Bio Co.，Ltd.)反应，然后与HRP标记的抗兔IgG抗体反应。用Lumino Capture通过SuperSignal WestPico试剂检测HRP活性的方法检测反应过的抗体。 

实施例21 

G418抗性细胞系的基因扩增 

在G418抗性细胞系中，产生最大量人类III型胶原的一个细胞克隆通过传代和培养得到稳定，然后用MTX进行基因扩增。首先在含有15nM MTX的培养基中扩增两周，在含有60nM MTX的培养基中扩增两周，在含有250nM MTX的培养基中扩增两周以及在含有1μM MTX的培养基中扩增四周。结果，人类III型胶原的 生产水平增加到了225μg/mL培养基(三天)。 

实施例22 

培养上清液中的重组人类III型胶原的SDS-PAGE分析 

用细胞培养溶液IS CHO-CD(IS Japan Co.，Ltd.)，在25cm²的培养瓶中将由基因扩增获得的大量生产人类III型胶原的细胞克隆调整为1×10⁶细胞/mL。在5％的二氧化碳气体存在的条件下于37℃培养96小时，收集培养液体，并通过离心的方法除去细胞获得培养上清液。6.0μL的培养上清液与等体积的Tris-SDSβ-ME样本处理溶液(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)混合，并在95℃加热处理5分钟。混合物装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGEL，ATTO Inc.)并通过电泳分离。以相同的方式进行下述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳完成后，通过用Coomassie Brilliant Blue染色液(Amersham Biosciences)处理凝胶检测到聚丙烯酰胺凝胶中的人类III型胶原。使用以相同方式处理的100μg/mL人类III型胶原(Beckton，Dickinson and Company)作为对比对照。图12显示了由人类III型胶原生产用细胞克隆获得的培养上清液的SDS-PAGE分析结果。在培养上清液中检测到可能为重组人类III型胶原的140kDa和170kDa的多肽。 

实施例23 

培养上清液中重组人类III型胶原的Western杂交分析 

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，将聚丙烯酰胺凝胶浸入到转移缓冲液中，然后通过传统的方法将聚丙烯酰胺凝胶中的人类III型胶原转移到PVDF膜上。用Block Ace进行封闭后，该膜与1μg/mL的人类III型胶原链抗体(Cosmo Bio Co.，Ltd.)反应，然后与用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG抗体反应。通过使用TMB过氧化物酶试剂(Funakoshi Co.)检测HRP活性的方法检测反应了的抗体。使用100μg/mL的人类III型胶原(Beckton，Dickinson and Company) 作为对比对照。在培养上清液中检测到可能是重组人类III型胶原(可被人类III型胶原链抗体结合)的140KDa和170KDa的多肽(图13)。 

如所观测到的商业可用的人类III型不完全胶原(Beckton，Dickinson and Company)，当用胃蛋白酶处理时，上清液中重组人类III型前胶原作为130KDa的多肽被检测到。这些事实显示出在由人类III型胶原生产用细胞克隆获得的培养上清液中含有具有完全等同于天然类型胶原的胃蛋白酶抗性的重组人类III型胶原。 

实施例24 

培养上清液中人类I型和III型胶原的纯化 

用含有人类I型和III型胶原的100mL培养上清液以与实施例12相同的方式进行纯化。将来自于原100mL培养上清液的被纯化的胶原溶液浓缩至约300μL并用SDS-PAGE电泳确认其纯度(图14)。 

工业应用 

本发明可以提供表达载体和人类胶原生产用细胞，该细胞能够生产高质量的并且接近于天然类型的重组人类胶原。本发明还提供了生产三螺旋结构的人类胶原的细胞。 

本发明的生产方法不仅可以应用于胶原而且可以应用于具有三螺旋结构的蛋白质如胶原凝集素。 

此外，本发明的胶原生产方法通过同时表达不同类型的α链，可用于生产具有新颖分子组成的大量三螺旋结构的胶原(在自然界不存在或没有被发现)。具有新颖分子组成的三螺旋结构的胶原具有不同于已知的那些胶原的特性，并且因此预期作为新的材料应用。 

Claims (3)

1.具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法，其中该方法包括：

(a)将编码具有三螺旋结构的蛋白质的DNA引入pNOW/CMV-AA载体中，其中所述DNA选自由SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一序列组成的DNA；

(b)通过基因载体的转入来转化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；和

(c)培养或培育转化体，并且从细胞或其培养上清液中收集具有三螺旋结构的蛋白质。

2.携带pNOW/CMV-AA载体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述载体引入了至少一种选自由SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一序列组成的DNA。

3.用于生产具有三螺旋结构的蛋白质的试剂盒，其中该试剂盒含有pNOW/CMV-AA载体和权利要求2的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中所述载体引入了至少一种选自由SEQ ID NO：1、4、7和10核苷酸序列中任一序列组成的DNA。

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