KR20070121809A

KR20070121809A - ３중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR20070121809A
Application number: KR1020077024903A
Authority: KR
Inventors: 데쯔오 가세; 아키오 기무라; 히로시 기사키; 히로유키 게시; 히로시 우에야마; 미즈키 니시하라
Original assignee: 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤; 오사까후
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2007-12-27
Also published as: EP2390326A1; CA2602611A1; DK1870460T3; US20120172577A1; EP1870460B1; EP2383338B1; EP1870460A1; WO2006106970A1; EP2390326B1; AU2006231795A1; HK1164917A1; AU2006231795B2; CN101171334B; KR101304735B1; ES2489715T3; EP2383338A1; US9018354B2; EP1870460A4; AU2006231795B9; PT1870460E

Abstract

본 발명은 콜라겐 유전자를 도입한 숙주세포에 있어서, 외래 유전자 고발현 벡터에 도입한 유전자에 유래하는 인간·콜라겐 단백질이 대량으로 합성되어 단리 정제가 용이하면서도, 또한 천연형 콜라겐 분자와 실질적으로 동등한 구조를 갖는 인간·콜라겐 분자의 제조방법의 제공을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 콜라겐 분자를 제공하는 것도 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 각종 포유동물 세포 중에서도 콜라겐 분자의 발현량이 적은 세포를 숙주로서 외래 유전자를 고발현 가능한 벡터에 콜라겐 유전자 컨스트럭트를 도입하는 것에 의해, 숙주세포 유래의 콜라겐의 혼재가 거의 보이지 않는 인간·콜라겐을 대량으로 제조할 수 있는 것을 발견하였다.

Description

３중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법{Process for production of protein having triple-helical structure}

본 발명은 3중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 인간·콜라겐 또는 인간·콜라겐의 부분 펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 과제는 생체에 있어서 안전하고, 정제 취득이 용이한 인간·콜라겐 및 인간·콜라겐의 부분 펩티드 및 그의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인간·콜라겐 cDNA를 삽입하여 얻어지는 포유동물 발현 벡터를 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 안정 형질도입하는 것에 의한 인간·콜라겐 및 인간·콜라겐의 부분 펩티드의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

콜라겐은 피부, 뼈, 연골을 비롯하여 거의 생체 중의 전 조직에 분포하는 단백질로서, 세포의 토대가 되어 조직, 기관의 구조를 유지하는 등, 중요한 기능을 담당하고 있는 것은 잘 알려져 있다. 한편 콜라겐은 섬유아세포로부터 분비되는 콜라게나아제 및 식세포 중에 존재하는 콜라게나아제에 의해 분해되는 생체 흡수성 재료이다. 이와 같이 콜라겐은 생체 적합성이 있고, 또한 생체 흡수성 재료이므로 생물소재로서 유용한 것으로 생각되고 있다. 지금까지 콜라겐은 생물소재로서 피부손상부위의 피복재로서 사용되어, 치유개선이 보고되어 있다(비특허문헌 1 및 2).

전 콜라겐 중 40%가 피부에 존재하며, 피부, 힘줄에서는 건조중량의 70% 이상이 콜라겐이다. 따라서 콜라겐은 인공피부의 개발에 있어서 중요하다. 또한, 세포나 기관의 배양기술에 있어서도 유용한 소재로서 이용되고 있다. 이런 점은 현재 진보가 현저한 재생의료 분야에서의 응용도 크게 기대할 수 있는 것이다. 또한, 경구 섭취하는 것에 의해 관절류머티즘이 억제된다고 하는 용도로의 가능성(Ⅱ형 콜라겐) 등도 지적되고 있다(비특허문헌 3 및 4). 이와 같은 콜라겐의 원재료로서는 지금까지는 주로 돼지나 소 등 인간 이외의 대형동물의 조직 유래의 것이 사용되어 왔다.

비특허문헌 1: Surg. Forum, 10, 303 (1960)

비특허문헌 2: J. Surg. Res., 10, 485-491 (1970)

비특허문헌 3: Lancet, 342, 799 (1993)

비특허문헌 4: Science, 261, 1727-1730 (1993)

특허문헌 1: 일본국 특허공개 평10-179169

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

이와 같이 콜라겐은 재생의료나 생체이식용 생물소재 또는 의약품으로서 유용한 물질이나, 종래부터 사용되어 온 콜라겐은 돼지나 소 등 인간 이외의 대형동물의 조직 유래의 것이다. 콜라겐은 원래 면역성이 낮은 단백질이긴 하나, 이종동물의 콜라겐을 생물소재로서 인간 생체 내에 이식, 매입 또는 투여한 경우에는 면역반응이 저빈도이지만 야기되는 것이 보고되어 있다(J. Immunol., 136, 877-882 (1986), Biomaterials, 11, 176-180 (1990)). 또한, 소에 있어서의 프리온 오염 문제가 발생함에 이르러, 소 유래의 콜라겐 사용이 불가능하게 되어 있다. 더욱이 돼지 등 현재 콜라겐의 추출에 사용되고 있는 동물에 있어서 프리온오염과 같은 문제가 생기지 않는다고 하는 보증은 없다. 이상의 점에 있어서 인체에 직접 적용하는 생물소재로서는 인간 유래 콜라겐의 사용이 바람직하다. 그러나, 인간 조직으로부터 콜라겐을 추출, 정제하는 것은 윤리적인 문제나 기술적인 문제가 있을 뿐 아니라, 얻어진 콜라겐이 불특정의 가교를 형성하므로 정제가 곤란해진다고 하는 질적인 문제점도 있다.

항원성이 없고, 병원체 혼입의 위험성을 배제하며, 추가로 단리 정제가 용이한 콜라겐을 얻기 위해, 유전자 재조합 기술을 응용한 콜라겐의 제조가 검토되어 왔다(Biochem. Soc., 28, 350-353 (2000)). 그러나, 분자량 10만 이상의 콜라겐 분자를 코드하는 cDNA를 숙주세포에 도입하기 위한 발현 벡터의 제작은 매우 번잡한 것이 된다. 또한 종래의 방법으로는 생산량도 낮고 실용화에는 아직 먼 것이었다. 더욱이 콜라겐은 세가닥의 폴리펩티드 사슬이 회합하여 3중 나선구조를 취하는 분자인 것이 알려져 있고, 이와 같은 구조는 유전자로부터 번역된 1차 산물이 추가로 복수의 수식을 받는 것에 의해 형성되나(N. Engl. J. Med., 311, 376-386 (1984)), 특정 세포만이 이와 같은 수식능력을 보유하고 있는 것으로 생각되고 있다.

지금까지 마우스 섬유아세포, 햄스터 폐세포 등을 숙주로 한 재조합 인간·콜라겐의 생산이 시도되고 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 764-768 (1987), J. Biol. Chem., 264, 20683-20687 (1989)). 그러나 이들의 예에 있어서 얻어지는 콜라겐은 분자구조로서는 정상이나, 인간과 숙주세포 각각의 콜라겐 유전자 산물로 되는 혼성 콜라겐 분자였다. 또한, 인간 Ⅱ형 콜라겐을 발현시킨 예(Biochem. J., 298, 31-37 (1994))에서는, 그 생산량이 배양액 1 L당 0.5~1 ㎎으로 낮은 것에 지나지 않고, 추가로 cDNA 도입에 의해 발현시킨 Ⅱ형 콜라겐에 상당량의 숙주 유래 Ⅳ형 콜라겐의 혼입이 인정되었다. 이로 인해, 도입 유전자 유래의 Ⅱ형 콜라겐과 내재성의 Ⅱ형 콜라겐을 분리할 필요가 있었다.

또한, 상기한 것 이외에 효모(일본국 특허공표 평7-501939호 공보), 곤충세포(일본국 특허공개 평8-23979호 공보), 바실루스 브레비스(일본국 특허공개 평11-178574호 공보), 대장균(일본국 특허공개 제2002-325584호 공보)을 사용하여 인간·콜라겐을 발현시킨 예도 보여지나, 콜라겐 펩티드 발현 후의 수식에 동물세포에 있어서의 그것과 차이가 있을 위험성을 생각하게 되었다. 이상과 같이 지금까지 제시되어 온 어떤 방법도 인간·콜라겐을 유전자 재조합으로 제조하는 수단으로서는, 양적, 질적 모두 만족시킬 수 있는 것은 아니었다. 또한, 지금까지 콜라겐과 같이 3중 나선구조를 갖는 단백질을 대량으로 제조하는 방법은 검토되고 있지 않았다.

본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 3중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 콜라겐 유전자를 도입한 숙주세포에 있어서, 외래 유전자 고발현 벡터에 도입한 유전자에 유래하는 인간·콜라겐 단백질이 대량으로 합성되어 단리 정제가 용이하면서도, 또한 천연형 콜라겐 분자와 실질적으로 동등한 구조를 갖는 인간·콜라겐 분자의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 각종 검토를 행한 결과, 각종 포유동물 세포 중에서도 콜라겐 분자의 발현량이 적은 세포를 숙주로서 외래 유전자를 고발현 가능한 벡터에 콜라겐 유전자 컨스트럭트를 도입하는 것에 의해, 숙주세포 유래의 콜라겐의 혼재가 거의 보이지 않는 인간·콜라겐을 대량으로 제조할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 이와 같은, 도입한 콜라겐 유전자를 대량으로 발현시켜, 숙주세포에 있어서 우선적으로 인간·콜라겐을 생산시킨다고 하는 콜라겐의 제조방법에 대해서는 지금까지 보고가 없다.

즉, 본 발명자들은 3중 나선구조를 갖는 단백질의 하나인 콜라겐의 발현량이 적은 포유동물을 숙주로서 외래 유전자를 고발현하는 것이 가능한 벡터에, 인간·콜라겐 유전자를 도입하여 얻어진 컨스트럭트를 도입하는 것에 의해, 인간·콜라겐을 복잡한 정제공정을 필요로 하지 않고 대량으로 제조하는 방법을 개발하는 것에 성공하여, 이것에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 〔1〕~〔15〕를 제공하는 것이다.

〔1〕 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 3중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법.

(a) 3중 나선구조를 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 벡터에 도입하는 공정

(b) 상기 백터를 사용한 유전자 도입에 의해, 포유동물 세포를 형질전환시키는 공정

(c) 상기 형질전환체를 배양 또는 육종하고, 상기 세포 또는 그의 배양상청으로부터 3중 나선구조를 갖는 단백질을 회수하는 공정

〔2〕 3중 나선구조를 갖는 단백질이 인간·콜라겐 또는 그의 부분 펩티드인 〔1〕기재의 방법.

〔3〕 인간·콜라겐이 적어도 1종류 이상의 α사슬로 되는 인간·콜라겐인 〔2〕기재의 방법.

〔4〕 인간·콜라겐이 인간·Ⅰ형 콜라겐인 〔2〕기재의 방법.

〔5〕 인간·Ⅰ형 콜라겐이 α1사슬과 α2사슬의 복합체인 〔4〕기재의 방법.

〔6〕 인간·콜라겐이, 인간·Ⅱ형 콜라겐인 〔2〕기재의 방법.

〔7〕 인간·콜라겐이, 인간·Ⅲ형 콜라겐인 〔2〕기재의 방법.

〔8〕 3중 나선구조를 갖는 단백질을 코드하는 DNA가, 이하의 (a) 또는 (b) 기재의 DNA로부터 선택되는 1개 이상의 DNA인 〔1〕기재의 방법.

(a) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의, 염기서열을 포함하는 DNA

(b) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의, 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA

〔9〕 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인, 〔1〕내지〔8〕 중 어느 하나에 기재의 방법.

〔10〕 포유동물 세포가 인간 태아 신장세포(HEK293)인, 〔1〕내지〔8〕 중 어느 하나에 기재의 방법.

〔11〕 3중 나선구조를 갖는 단백질을 코드하는 DNA가 도입되는 벡터가 pNOW/CMV-AA인, 〔1〕내지〔10〕 중 어느 하나에 기재의 방법.

〔12〕〔1〕내지〔11〕 중 어느 하나에 기재의 방법에 따라 제조된 인간·콜라겐.

〔13〕 이하의 (a) 또는 (b) 기재의 DNA로부터 선택되는 1개 이상의 DNA가 도입된 벡터.

(a) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA

(b) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA

〔14〕〔13〕기재의 벡터를 보유하는 포유동물 세포.

〔15〕〔13〕기재의 벡터, 또는 〔14〕기재의 포유동물 세포를 포함하는, 3중 나선구조를 갖는 단백질을 제조하기 위한 키트.

도면의 간단한 설명

도 1은 인간 Ⅰ형 α1사슬 콜라겐 발현 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각 hColⅠa1: 인간 Ⅰ형 α1사슬 콜라겐 cDNA, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, BGHPA: 소 성장호르몬 유전자 폴리 A 부가 시그널, PSVd: 인핸서를 결실시킨 시미안 바이러스 40 프로모터, DHFR: 마우스 디히드로엽산 환원효소 cDNA, SVpA: 시미안 바이러스 40 폴리 A 부가 시그널, ColElori: 대장균 중에서의 복제기점, Neor: 포유동물 세포 중에서의 선택 마커(G418 내성) 및 대장균 중에서의 선택 마커(카나마이신 내성)를 나타낸다.

도 2는 인간 Ⅰ형 α2사슬 콜라겐 발현 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각 hColⅠa2: 인간 Ⅰ형 α2사슬 콜라겐 cDNA, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, BGHPA: 소 성장호르몬 유전자 폴리 A 부가 시그널, PSVd: 인핸서를 결실시킨 시미안 바이러스 40 프로모터, DHFR: 마우스 디히드로엽산 환원효소 cDNA, SVpA: 시미안 바이러스 40 폴리 A 부가 시그널, ColElori: 대장균 중에서의 복제기점, Neor: 포유동물 세포 중에서의 선택 마커(G418 내성) 및 대장균 중에서의 선택 마커(카나마이신 내성)를 나타낸다.

도 3은 인간 Ⅱ형 α1사슬 콜라겐 발현 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각 hColⅡa1: 인간 Ⅱ형 α1사슬 콜라겐 cDNA, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, BGHPA: 소 성장호르몬 유전자 폴리 A 부가 시그널, PSVd: 인핸서를 결실시킨 시미안 바이러스 40 프로모터, DHFR: 마우스 디히드로엽산 환원효소 cDNA, SVpA: 시미안 바이러스 40 폴리 A 부가 시그널, ColElori: 대장균 중에서의 복제기점, Neor: 포유동물 세포 중에서의 선택 마커(G418 내성) 및 대장균 중에서의 선택 마커(카나마이신 내성)를 나타낸다.

도 4는 인간 Ⅲ형 α1사슬 콜라겐 발현 컨스트럭트를 나타내는 도면이다. 각각 hColⅢa1: 인간 Ⅲ형 α1사슬 콜라겐 cDNA, PCMV: 사이토메갈로바이러스 프로모터, BGHPA: 소 성장호르몬 유전자 폴리 A 부가 시그널, PSVd: 인핸서를 결실시킨 시미안 바이러스 40 프로모터, DHFR: 마우스 디히드로엽산 환원효소 cDNA, SVpA: 시미안 바이러스 40 폴리 A 부가 시그널, ColElori: 대장균 중에서의 복제기점, Neor: 포유동물 세포 중에서의 선택 마커(G418 내성) 및 대장균 중에서의 선택 마커(카나마이신 내성)를 나타낸다.

도 5는 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅰ형 콜라겐(100 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅰ형 콜라겐을 나타낸다.

도 6은 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐의 펩신에 의한 분해산물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐(185 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅰ형 콜라겐(20배 농축)을 나타낸다.

도 7은 정제 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐 및 그의 펩신 분해물의 웨스턴 블롯팅에 의한 검출을 나타내는 사진이다. A. 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α1사슬 항체에 의한 검출, 레인 1: 인간 Ⅰ형 콜라겐(50 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅰ형 콜라겐, 레인 3: 재조합 Ⅰ형 콜라겐의 펩신 분해물을 나타낸다. B. 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α2사슬 항체에 의한 검출, 레인 1: 인간 Ⅰ형 콜라겐(10 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅰ형 콜라겐, 레인 3: 재조합 Ⅰ형 콜라겐의 펩신 분해물을 나타낸다.

도 8은 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅱ형 콜라겐(100 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅱ형 콜라겐을 나타낸다.

도 9는 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅱ형 콜라겐(10 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅱ형 콜라겐(10배 희석)을 나타낸다.

도 10은 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 펩신에 의한 분해산물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅱ형 콜라겐(100 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅱ형 콜라겐(5배 농축)을 나타낸다.

도 11은 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 펩신에 의한 분해물의 웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅱ형 콜라겐(10 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅱ형 콜라겐을 나타낸다.

도 12는 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅲ형 콜라겐(100 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅲ형 콜라겐을 나타낸다.

도 13은 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐 및 그의 펩신 분해물의 웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 나타내는 사진이다. 레인 1: 인간 Ⅲ형 콜라겐(10 ㎍/mL), 레인 2: 재조합 Ⅲ형 콜라겐(10배 희석), 레인 3: 재조합 Ⅲ형 콜라겐 펩신 분해물을 나타낸다.

도 14는 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐 정제물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석을 나타내는 사진이다. A. Ⅰ형 콜라겐, 레인 1: 인간 Ⅰ형 콜라겐, 레인 2: 재조합 Ⅰ형 콜라겐을 나타낸다. B. Ⅲ형 콜라겐, 레인 1: 인간 Ⅲ형 콜라겐, 레인 2: 재조합 Ⅲ형 콜라겐을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태를 나타내고, 본 발명에 대하여 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 3중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

(b) 상기 벡터를 사용한 유전자 도입에 의해, 포유동물 세포를 형질전환시키는 공정

(c) 상기 형질전환체를 배양 또는 육종하고, 상기 세포 또는 그의 배양상청으로부터 3중 나선구조를 갖는 단백질을 회수하는 공정.

본 발명의 「3중 나선구조를 갖는 단백질」이란 3중 나선구조를 갖는 한 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 콜라겐 또는 콜렉틴을, 보다 바람직하게는 콜라겐을 들 수 있다. 3중 나선구조를 갖는 단백질이란 배양제조 단계에서 3중 나선이 구축되는 단백질이어도 되고, 배양제조 후의 정제 등의 조작에 의해 3중 나선구조가 구성되는 것이어도 된다. 3중 나선구조를 취할 수 있는 단백질이지만, 한가닥 사슬 구조의 상태에서 대량으로 제조시켜도 된다.

콜라겐에는 20수 종류의 상이한 형, 또는 그들을 구성하는 약 25종류의 α사슬이 존재하는 것이 알려져 있고, 그들을 코드하는 유전자는 각각 클로닝되어, 염기서열이 해명되어 있다("Connective Tissue and Its Heritable Disorders", pp145-165, Weily-Liss Inc. 발행 (1992)). 그리고 이들의 유전자는 모두, 당업자에게 공지의 유전자 재조합 기술(예를 들면 "Molecular Colning" 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press 발행 (1989))에 의해 본 발명에 있어서 사용되는 외래 유전자를 고발현하는 것이 가능한 벡터에 도입하는 것이 가능하다. 본 발명에서 사용하는 인간·콜라겐 cDNA는 이들의 클로닝된 콜라겐 cDNA의 어느 것이어도 되고, 또한 이들 콜라겐의 부분 펩티드도 포함한다.

본 발명의 콜라겐의 유래는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 포유동물 유래, 보다 바람직하게는 인간 유래의 콜라겐을 들 수 있다.

추가로 콜라겐의 아미노서열의 일부를 치환, 결실 등 개변한 것이나, 콜라겐 유래가 아닌 아미노산서열을 부가한 것도 본 발명의 콜라겐에 포함된다. 또한, 벡터를 숙주 포유동물 세포에 도입하여, 단백 분자를 발현하고 있는 형질도입 세포를 얻는 방법은 공지로서, 본 발명에 있어서도 동일한 방법을 적용하는 것이 가능하다.

상기의 외래 유전자 고발현 벡터가 도입된 세포에 있어서 콜라겐이 재조합 단백질로서 합성되어 있는 것은 이하에 의해 조사할 수 있다. 즉 시판의 인간·콜라겐에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅 등의 면역화학적인 방법에 의해 콜라겐 펩티드인 것을 확인하는 것이 가능하다. 통상 콜라겐은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(Nature, 227, 680-685 (1970))에 있어서는 분자량대로는 영동되지 않으므로, 콜라겐을 마커로서 동시에 전기영동 후, 마츠다이라들의 방법(J. Biol. Chem., 261, 10035-10038 (1987))에 따라서 나일론막 또는 니트로셀룰로오스막에 전사하고, 항콜라겐 항체와의 반응성을 조사하는 것이 가능하다. 또한 발현 벡터에 의해 생산된 재조합 콜라겐 산물 중에, 3중 나선구조를 갖는 분자가 존재하는 것은 다음과 같이 하여 조사하는 것이 가능하다.

통상의 섬유성 콜라겐은 3개의 서브유닛(α사슬)으로 형성되는 세가닥 사슬의 분자로, 분자 내에 3중 나선구조를 갖고 있다. 그리고, 3중 나선구조를 갖는 콜라겐은 펩신 소화에 대해서 내성을 갖는 것이 알려져 있다. 이에, 상기의 외래 유전자 고발현 벡터가 도입된 세포의 배양상청을 산성조건하에서 펩신 소화하고, 팹신 내성의 구조를 갖는지를 조사하는 것에 의해, 이 단백질 시료에 세가닥 사슬 분자가 존재하고 있는 것을 나타내는 것이 가능하다.

즉, 본 발명에 있어서는 펩신 처리를 실시한 단백질 시료를 환원조건하의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 제공하였다. 그 결과, 얻어진 재조합 콜라겐은 천연 콜라겐과 마찬가지의 펩신 내성을 나타내는 것이 명백해져, 상기의 외래 유전자 고발현 벡터가 도입된 세포의 배양상청 중에는 펩신 처리에 대해서 내성의 성질을 갖는 콜라겐 펩티드가 포함되는 것으로 추찰되었다. 이상의 결과로부터 본 발명의 발현 벡터는, 숙주세포에 있어서 생체 내에 보여지는 것과 동등한 특성 즉, 펩신 내성의 콜라겐을 합성시키는 능력을 갖는 것이 나타내어진다.

본 발명의 3중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법 및 정제방법을 이하에 나타내나, 이들의 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 숙주세포로서 배양에 사용되는 포유동물 세포는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 CHO 세포 또는 HEK293 세포를 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 CHO 세포 또는 HEK293 세포는 현탁배양하는 것에 의해 대량 배양화가 가능하다. 예를 들면, 약화 네오마이신 인산전위효소 유전자, 마우스 디히드로엽산 환원효소 유전자, 인간·콜라겐 또는 인간·콜라겐의 부분 펩티드를 코드하는 cDNA를 모두 갖는 인간·콜라겐 발현 벡터를 형질도입하여 얻어진 재조합 CHO 세포 1×10⁸~1×10⁹개를 100 mL~1 L의 배양액으로 셰이커 플라스크 또는 스피너 플라스크에서 배양하는 것이 가능하다. 이것을 적당한 시간 배양한 후, 배양상청을 모아 단백질을 대량으로 추출하는 것이 가능하다.

약화 네오마이신 인산전위효소 유전자, 마우스 디히드로엽산 환원효소 유전자, 인간·콜라겐 또는 인간·콜라겐의 부분 펩티드를 코드하는 cDNA를 모두 갖는 인간·콜라겐 발현 벡터를 형질도입하여 얻어진 재조합 CHO 세포의 배양상청에 있어서는, 3중 나선구조를 갖는 세가닥 사슬 콜라겐 분자와 동시에 정상인 세가닥 사슬 분자를 형성하지 않았던 콜라겐도 존재한다. 전술과 같이, 3중 나선구조를 갖지 않는 콜라겐 분자는 펩신에 의해 소화된다. 이로 인해, 3중 나선구조를 갖지 않는 콜라겐 분자는 펩신에 의해 분해 제거하는 것이 가능하다. 이 처리에 의해 동시에 콜라겐 이외의 배양상청 중의 단백질도 분해 제거하는 것이 가능하다. 이상의 성질을 이용하여, 약화 네오마이신 인산전위효소 유전자, 마우스 디히드로엽산 환원효소 유전자, 인간·콜라겐 또는 인간·콜라겐의 부분 펩티드를 코드하는 cDNA를 모두 갖는 인간·콜라겐 발현 벡터를 형질도입하여 얻어진 재조합 CHO 세포의 배양상청 중에 존재하는 전 단백질을 직접 펩신 처리하여 비콜라겐성 단백질을 분해 제거하는 동시에, 3중 나선구조를 갖지 않는 콜라겐도 분해 제거하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 대상으로 하는 인간·콜라겐은 현재 알려져 있는 Ⅰ형~ⅩⅩⅠ형 콜라겐을 포함하는 모든 인간·콜라겐이며, 이들 콜라겐의 부분 펩티드도 포함한다. 본 발명의 콜라겐 형은 특별히 제한되지 않으나, 대표예로서 Ⅰ형, Ⅱ형, Ⅲ형, Ⅳ형, Ⅴ형, Ⅶ형, Ⅸ형, ⅩⅠ형, ⅩⅡ형, ⅩⅦ형, 또는 ⅩⅧ형 등을 들 수 있고, 바람직하게는 Ⅰ형, Ⅱ형, Ⅲ형을 들 수 있다. Ⅰ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅸ, ⅩⅠ형은 각각 2, 3종류의 α사슬로 되고, Ⅱ, Ⅲ, Ⅶ, ⅩⅡ, ⅩⅦ, ⅩⅧ형은 각각 1종류의 α사슬로 된다. 이들은 각각 Ⅰ형: [α1(Ⅰ)]₂α2(Ⅰ), Ⅱ형: [α1(Ⅱ)]₃, Ⅲ형: [α1(Ⅲ)]₃, Ⅳ형: [α1(Ⅳ)]₂α2(Ⅳ), Ⅴ형: [α1(Ⅴ)]₂α2(Ⅴ)와 α1(Ⅴ)α2(Ⅴ)α3(Ⅴ), Ⅶ형: [α1(Ⅶ)]₃, Ⅸ형: α1(Ⅸ)α2(Ⅸ)α3(Ⅸ), ⅩⅠ형: α1(ⅩⅠ)α2(ⅩⅠ)α3(ⅩⅠ), ⅩⅡ형: [α1(ⅩⅡ)]₃, ⅩⅦ형: [α1(ⅩⅦ)]₃, 또는 ⅩⅧ형: [α1(ⅩⅧ)]₃라고 하는 분자구성을 가지나, 본 발명의 콜라겐 분자구성은 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 콜라겐 분자구성은 천연의 콜라겐 유래의 분자구성에 한정되는 것이 아니라, 종류가 상이한 3종류의 α사슬을 인위적으로 복합시켜도 된다.

본 발명의 Ⅰ형 콜라겐의 α1사슬을 코드하는 DNA의 염기서열을 서열번호: 1에, Ⅰ형 콜라겐의 α2사슬을 코드하는 DNA의 염기서열을 서열번호: 4에, Ⅱ형 콜라겐의 α1사슬을 코드하는 DNA의 염기서열을 서열번호: 7에, Ⅲ형 콜라겐의 α1사슬을 코드하는 DNA의 염기서열을 서열번호: 7에, Ⅲ형 콜라겐의 α1사슬을 코드하는 DNA의 염기서열을 서열번호: 10에 각각 나타낸다.

본 발명의 콜라겐을 코드하는 DNA로서, 바람직하게는 서열번호: 1, 4, 7, 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열로 되는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호: 1, 4, 7, 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열로 되는 올리고뉴클레오티드에, 선택적으로 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 선택적으로 하이브리다이즈함이란, 사전에 정해진 서열을 갖는 분자(즉 제2의 폴리펩티드)가 DNA 또는 RNA의 시료 중에 존재하는 경우, 적절하게 스트린젠트한 하이브리다이제이션 조건하에서 하이브리다이즈하는 이중가닥이 되거나, 또는 본질적으로 서로만 결합하는 핵산분자를 가리킨다. 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면 통상 42℃, 2×SSC, 0.1% SDS의 조건이고, 바람직하게는 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS의 조건이며, 더욱 바람직하게는 65℃, 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 조건이나, 이들 조건에 특별히 제한되지 않는다. 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로서는 온도나 염농도 등 복수의 요소가 생각되고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택하는 것으로 최적의 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 제조되는 콜라겐은 N 말단 및 C 말단에 프로펩티드가 결합되어 있는 프로콜라겐 분자의 상태여도 되고, 프로펩티드가 제거된 상태여도 된다.

본 발명에 있어서 「콜라겐의 부분 펩티드」란, 콜라겐을 코드하는 cDNA의 20% 이상(예를 들면 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%)의 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드를 말한다. 또한, 이들 콜라겐의 아미노산서열의 일부분을 개변한 것이나 비콜라겐 아미노산서열을 부가한 것도 포함한다.

본 발명에 있어서 「콜라겐 발현량이 적은 포유동물 세포」란, 1×10⁶세포/mL로 배양한 경우에 50 ng/mL 이하의 콜라겐 생산량인 세포를 말하고, 보다 바람직하게는 CHO 세포, HEK293 세포를 적합하게 들 수 있다. 본 발명에 있어서 「고발현」이란, 10 ㎍/mL 이상의 콜라겐 발현, 바람직하게는 50 ㎍/mL 이상의 콜라겐 발현을 말한다.

본 발명에 있어서 「외래 유전자를 고발현하는 것이 가능한 벡터」란, 예를 들면 상기 벡터에 포함되는 포유동물 세포에 있어서의 약제 선택 마커 유전자의 작용이 미약하므로 포유동물 세포 염색체 상의 전사가 왕성한 영역에 선택적으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 벡터를 말하고, 바람직하게는 pNOW/CMV-AA 벡터를 들 수 있다. pNOW/CMV-AA 벡터는 일본국 특허공개 평10-179169호 공보에 공지이다. 본 발명에 있어서 배양방법은 부유, 부착배양 중 어느 것이어도 된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕pNOW/CMV-AA 벡터의 조제

pNOW/CMV-AA 벡터는 공지의 방법(일본국 특허공개 평10-179169호 공보)에 의해 조제한 것을 사용하였다.

〔실시예 2〕콜라겐 발현 벡터의 제작(1): 인간 Ⅰ형 α1사슬 cDNA의 단리

인간 Ⅰ형 α1사슬 콜라겐의 유전자는 이미 클로닝되어, 그 염기서열이 보고되어 있다(EMBL 유전자 데이터베이스 등록명 NM 000088). 그 서열을 서열번호: 1에 나타낸다. 인간 Ⅰ형 α1 cDNA는 인간 정소 유래 cDNA로부터 폴리메라아제 체인 리액션(PCR)법("PCR Technology", Stockton Press 발행(1989))에 의해 증폭되었다. 즉, 인간 정소 유래 cDNA(벡톤, 디킨슨사)를 주형으로서 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드(GCGGCCGCCACCATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG)와 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드(TTCTAGATTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA)를 프라이머로서 서열번호: 1의 전장 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 즉, 시판의 PCR 증폭 키트(TaKaRa LA Taq with GC Buffer: 다카라 바이오사)를 사용하여, 94℃, 5분간의 가열처리 후, 변성(94℃, 20초), 프라이머 어닐링(60℃, 30초), 증폭(72℃, 3분 30초)의 3스텝을 35회 반복하고, 추가로 72℃, 7분간 처리하여 반응을 종료하였다. 이후, 본 실시예 기재의 PCR 반응은 모두 동일한 반응 사이클로 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고, PCR 산물 클로닝 벡터(pT7Blue kits: Novagen사)와 라이게이션 키트(DNA ligation kit ver.2: 다카라 바이오사)를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지(디프코사) 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA가 얻어졌다. 이 플라스미드 DNA로부터 잘라낸 인간 Ⅰ형 α1사슬 콜라겐을 코드하는 DNA 단편과 실시예 1에서 조제한 외래 유전자 고발현 벡터 pNOW/CMV-AA의 Not Ⅰ와 Xba Ⅰ 절단물을 DNA ligation kit ver.2를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주 에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 1콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA(pNOW-hColⅠa1, 도 1)가 얻어졌다.

〔실시예 3〕콜라겐 발현 벡터의 제작(2): 인간 Ⅰ형 α2사슬 cDNA의 단리

인간 Ⅰ형 α2사슬 콜라겐의 유전자는 이미 클로닝되어 그 염기서열이 보고되어 있다(EMBL 유전자 데이터베이스 등록명 NM 000089). 그 서열을 서열번호: 4에 나타낸다. 인간 Ⅰ형 α2 cDNA는 인간 간장 유래 cDNA로부터 PCR법에 의해 증폭되었다. 즉, 인간 간장 유래 cDNA(와코 순약공업)를 주형으로서 서열번호: 5의 올리고뉴클레오티드(GCGGCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGA)와 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드(ACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAAT)를 프라이머로서 서열번호: 4의 전장 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고, PCR 산물 클로닝 벡터(pT7Blue kits: Novagen사)와 라이게이션 키트(DNA ligation kit ver.2: 다카라 바이오사)를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지(디프코사) 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 4콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA가 얻어졌다. 이 플라스미드 DNA로부터 잘라낸 인간 Ⅰ형 α2사슬 콜라겐을 코드하는 DNA 단편과 외래 유전자 고발현 벡터 pNOW/CMV-AA의 Not Ⅰ와 Xba Ⅰ 절단물을 DNA ligation kit ver.2를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 1콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA(pNOW-hColⅠa2, 도 2)가 얻어졌다.

〔실시예 4〕콜라겐 발현 벡터의 제작(3): 인간 Ⅱ형 α1사슬 cDNA의 단리

인간 Ⅱ형 α1사슬 콜라겐의 유전자는 이미 클로닝되어 그 염기서열이 보고되어 있다(EMBL 유전자 데이터베이스 등록명 NM 001844.1). 그 서열을 서열번호: 7에 나타낸다. 인간 Ⅱ형 α1 cDNA는 인간 정소 유래 cDNA로부터 PCR법에 의해 증폭되었다. 즉, 인간 정소 유래 cDNA(벡톤, 디킨슨사)를 주형으로서 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드(GGCCCCGCGGTGAGCCATGATTCGCCTCG)와 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드(TCTAGATTACAAGAAGCAGACCGGCCCTAT)를 프라이머로서 서열번호: 7의 전장 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고, PCR 산물 클로닝 벡터(pT7Blue kits: Novagen사)와 라이게이션 키트(DNA ligation kit ver.2: 다카라 바이오사)를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지(디프코사) 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 4콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA가 얻어졌다. 이 플라스미드 DNA로부터 잘라낸 인간 Ⅱ형 α1사슬 콜라겐을 코드하는 DNA 단편과 외래 유전자 고발현 벡터 pNOW/CMV-AA의 Not Ⅰ와 Xba Ⅰ 절단물을 DNA ligation kit ver.2를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 1콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA(pNOW-hColⅡa1, 도 3)가 얻어졌다.

〔실시예 5〕콜라겐 발현 벡터의 제작(4): 인간 Ⅲ형 α1사슬 cDNA의 단리

인간 Ⅲ형 α1사슬 콜라겐의 유전자는 이미 클로닝되어 그 염기서열이 보고되어 있다(EMBL 유전자 데이터베이스 등록명 X14420). 그 서열을 서열번호: 10에 나타낸다. 인간 Ⅲ형 α1 cDNA는 인간 간장 유래 cDNA로부터 PCR법에 의해 증폭되 었다. 즉, 인간 간장 유래 cDNA(와코 순약공업)를 주형으로서 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드(GCGGCCGCCACCATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGGA)와 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드(TCTAGATTATAAAAAGCAAACAGGGCCAAC)를 프라이머로서 서열번호: 10의 전장 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 아가로스겔 전기영동에 의해 분리하고, PCR 산물 클로닝 벡터(pT7Blue kits: Novagen사)와 라이게이션 키트(DNA ligation kit ver.2: 다카라 바이오사)를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지(디프코사) 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 4콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA가 얻어졌다. 이 플라스미드 DNA로부터 잘라낸 인간 Ⅲ형 α1사슬 콜라겐을 코드하는 DNA 단편과 외래 유전자 고발현 벡터 pNOW/CMV-AA의 Not Ⅰ와 Xba Ⅰ 절단물을 DNA ligation kit ver.2를 사용하여 연결하였다. 대장균 XL-Ⅰ Blue주에 연결된 DNA를 도입 후, LB 한천배지 상에 출현한 암피실린 내성의 성질을 갖는 1콜로니를 배양하는 것에 의해 플라스미드 DNA(pNOW-hColⅢa1, 도 4)가 얻어졌다.

〔실시예 6〕인간 Ⅰ형 콜라겐의 생산: 발현 벡터 pNOW-hColⅠa1과 pNOW-hColⅠa2에 의한 인간 Ⅰ형 콜라겐의 유전자 도입과 G418 내성 초기 클론의 확립

실시예 2 및 3에서 얻어진 pNOW-hColⅠa1과 pNOW-hColⅠa2의 각각 1 ㎍을 리포펙틴법(퀴아겐사제 에펙텐 트랜스펙션 시약)을 사용하여, 25 ㎠의 배양 플라스크 중 150만개의 DHFR 결손 CHO 세포(CHO 세포 DG44주; Dr. Gail Urlaub로부터 양수)에 유전자 도입하였다. 도입방법은 제조업자의 사용설명서에 따랐다. 48시간 후 트립신 처리에 의해 세포를 박리하고, 세포수 계측 후, 50만개의 세포를 100 mL의 0.8 ㎎/mL의 G418을 포함하는 10% 투석 소 태아 혈청 첨가 Iscove's Modified Dalbecco's Medium 배지로 희석 후, 96웰 마이크로타이터 플레이트 10매(960웰) 중에 뿌리고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 약 3주간 배양하고, 197웰 중 생존세포를 1 mL의 0.8 ㎎/mL의 G418을 포함하는 10% 투석 소 태아 혈청 첨가 Iscove's Modified Dalbecco's Medium 배지와 함께 24웰 플레이트로 옮겨 컨플루언트가 될 때까지 배양하였다. 배양상청을 폐기한 후 PBS(인비트로젠사) 1 mL를 각 웰에 첨가하고 다시 배양상청을 폐기하였다. 이것에 0.5 mL의 CHO 세포용 CD 배지 ProCHO4(다카라 바이오사)를 첨가하고 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 96시간 배양하였다. 계속해서 배양상청 중의 인간 Ⅰ형 콜라겐 생산량의 검토를 행하였다.

〔실시예 7〕pNOW-hColⅠa1과 pNOW-hColⅠa2 형질도입 세포 클론에 의한 인간 Ⅰ형 콜라겐 생산량의 검정

생산량의 검정은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 실시하였다. 배양상청의 12.5 μL와 등량의 트리스 SDSβ-ME 샘플처리액(다이이찌 화학)을 혼합하고, 95℃, 5분간의 열처리를 행하였다. 이것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(PAGEL, ATTO사)에 중층하고, 전기영동으로 전개하였다. 전기영동 종료 후, 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(아마샴 바이오사이언스사)으로 처리하는 것에 의해 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅰ형 콜라겐의 검출과 정량을 행하였다. 비교대조로서는 12.5~100 ㎍/mL 농도의 인간 Ⅰ형 콜라겐(코스모 바이오사)을 동일하게 처리하여 사용하였다.

〔실시예 8〕인간 Ⅰ형 콜라겐의 생산

G418 내성 세포주 중, 인간 Ⅰ형 콜라겐 생산이 가장 높았던 클론을 계대배양하여 안정화시켰다. 인간 Ⅰ형 콜라겐의 생산 레벨은 배지당 85 ㎍/mL(4일간)였다.

〔실시예 9〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석

유전자 증폭에 의해 얻어진 인간 Ⅰ형 콜라겐을 대량으로 생산하고 있는 세포 클론을 세포배양액 IS CHO-CD(IS 재팬사)를 사용하여 25 ㎠ 배양 플라스크 속에서 1×10⁶개/mL가 되도록 조제하였다. 이것을 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 96시간 배양한 후 배양액을 회수하고, 원심분리조작에 의해 세포를 제거하여 배양상청으로 하였다. 배양상청의 12.5 μL와 등량의 트리스 SDSβ-ME 샘플처리액(다이이찌 화학사)을 혼합하고, 95℃, 5분간의 열처리를 행하였다. 이것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(PAGEL, ATTO사)에 중층하고, 전기영동으로 전개하였다. 이하의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 동일하게 하여 실시하였다. 전기영동 종료 후, 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(아마샴 바이오사이언스사)으로 처리하는 것에 의해 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅰ형 콜라겐의 검출을 행하였다. 비교대조로서는 100 ㎍/mL 농도의 인간 Ⅰ형 콜라겐을 동일하게 처리하여 사용하였다. 도 5에 인간 Ⅰ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석결과를 나타낸다. 배양상청 중에 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐 α1사슬로 생각되는 150 kDa, 170 kDa 위치의 폴리펩티드 및 재조 합 인간 Ⅰ형 콜라겐 α2사슬로 생각되는 130 kDa, 150 kDa 위치의 폴리펩티드가 검출되었다.

〔실시예 10〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐의 펩신에 의한 분해와 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석

인간 Ⅰ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청의 펩신 분해는 99.7% 초산을 배양상청에 최종농도 0.5 M가 되도록 첨가하고, 이것에 펩신(시그마사)을 최종농도 24 유닛/mL가 되도록 첨가한 후 20℃, 2시간 실시하였다. 이하의 펩신 분해는 동일하게 하여 실시하였다. 펩신에 의한 분해에 의해 얻어진 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석을 행하였다. 비교대조로서는 185 ㎍/mL의 시판의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐(벡톤, 디킨슨사)을 사용하였다. 도 6에 펩신에 의한 분해산물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석결과를 나타낸다. 펩신 처리를 실시한 경우, 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐은 시판의 인간 Ⅰ형 아텔로콜라겐과 마찬가지로 α1사슬로 생각되는 130 kDa 위치의 폴리펩티드 및 α2사슬로 생각되는 120 kDa 위치의 폴리펩티드로서 검출되었다. 이것은 인간 Ⅰ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청 중에는 천연형과 실질적으로 동등한 펩신 내성의 성질을 갖는 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐이 포함되어 있는 것을 나타내고 있었다.

〔실시예 11〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐의 웨스턴 블롯팅에 의한 분석

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 종료 후의 폴리아크릴아미드 겔을 트랜스 퍼 완충액에 담근 후, 통상적인 방법에 따라 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅰ형 콜라겐을 PVDF 멤브레인에 전사하였다. 블록 에이스(Block Ace)에 의한 블로킹 후, 2 ㎍/mL 농도의 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α1사슬 항체와 그것에 이어 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) 표지 항염소 IgG항체를 반응시켰다. 반응한 항체는 HRP의 활성을 검출하는 방법으로 TMB 퍼옥시다아제시약(후나코시사)을 사용하여 행하였다. 비교대조로서는 50 ㎍/mL의 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐(벡톤, 디킨슨사)을 사용하였다. 인간 Ⅰ형 콜라겐 α2사슬의 검출은 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α1사슬 항체 대신에 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α2사슬의 항체를 사용하여 실시하였다. 비교대조로서는, 10 ㎍/mL의 인간 Ⅰ형 콜라겐을 사용하였다. 도 7에 웨스턴 블롯팅에 의한 분석결과를 나타낸다. 배양상청 중에 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α1사슬 항체가 결합할 수 있는 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐 α1사슬로 생각되는 170 kDa 위치의 폴리펩티드 및 항인간 Ⅰ형 콜라겐 α2사슬 항체가 결합할 수 있는 재조합 인간 Ⅰ형 콜라겐 α2사슬로 생각되는 130 kDa, 150 kDa 위치의 폴리펩티드가 검출되었다.

〔실시예 12〕배양상청 중의 인간 Ⅰ형 콜라겐의 정제

인간 Ⅰ형 콜라겐을 포함하는 배양상청 100 mL를 사용하여 이하와 같이 정제를 행하였다.

원심농축 필터(VIVASPIN20(MWCO 10,000: 자르토리우스사)로 4℃에서 3,000 rpm의 원심분리에 의해 0.45 ㎛의 멤브레인 필터(밀리포아사)로 여과한 100 mL의 배양상청을 30 mL로 농축하였다.

4℃에서 30 mL의 90% 황산암모늄용액을 상기 농축 배양상청 중에 교반하면서 서서히 첨가하여 염석하고, 황산암모늄 전부를 첨가한 후 1시간 교반하였다. 그 후, 얼음 속에서 1시간 정치한 후, 고속냉각 원심기로 4℃에서 18,000 rpm×30분간 원심분리를 행하였다. 염석에 의해 불용화한 용액 중의 콜라겐은 용액 위로 떠오르므로 그것을 회수하고, 5 mL의 D-PBS(시그마사)로 완전하게 용해시켰다. 이것을 0.45 ㎛의 멤브레인 필터(밀리포아사)로 여과한 후에 D-PBS로 평형화 한 Superose 6(아마샴 바이오사이언스사)를 사용한 겔 여과에 의해 정제하고, 최초에 출현하는 피크를 분취하였다. 모은 피크의 프랙션(fraction)을 VIVASPIN6(MWCO 100,000)로 약 20배로 농축하고, 농축한 콜라겐 용액에 D-PBS를 적량 첨가하여 추가로 농축하고, 저분자 프래그먼트를 제거하였다. 이 D-PBS를 첨가하는 조작을 3회 이상 행하였다.

원래의 배양상청 100 mL에 대해 최종적으로 얻어진 정제 콜라겐 용액이 약 300 μL가 되도록 농축한 것을 SDS-PAGE에 의해 전기영동하여 정제도의 확인을 행하였다.

〔실시예 13〕인간 Ⅱ형 콜라겐의 생산시험: 발현 벡터 pNOW-hColⅡa1에 의한 인간 Ⅰ형 콜라겐의 유전자 도입과 G418 내성 초기 클론의 확립

1 ㎍의 pNOW-hColⅡa1을 25 ㎠의 배양 플라스크 중의 150만개의 CHO 세포 DG44주에 리포펙틴법을 사용하여 유전자 도입하였다. 도입방법은 제조업자의 사용설명서에 따랐다. 48시간 후 트립신 처리에 의해 세포를 박리하고, 세포수의 계측 후 50만개의 세포를 100 mL의 0.8 ㎎/mL의 G418을 포함하는 10% 투석 소 태아 혈청 첨가 Iscove's Modified Dalbecco's Medium 배지로 희석 후, 96웰 마이크로타이터 플레이트 10매(960웰) 중에 뿌리고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 약 3주간 배양하고, 126웰 중의 생존세포를 1 mL의 0.8 ㎎/mL의 G418을 포함하는 10% 투석 소 태아 혈청 첨가 Iscove's Modified Dalbecco's Medium 배지와 함께 24웰 플레이트로 옮겨 컨플루언트가 될 때까지 배양하였다. 배양상청을 폐기한 후 PBS(인비트로젠사) 1 mL를 각 웰에 첨가하고 다시 배양상청을 폐기하였다. 이것에 0.5 mL의 CHO 세포용 무혈청 배지세포용 CD 배지 ProCHO4(다카라 바이오사)를 첨가하고 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 96시간 배양하였다. 계속해서 배양상청 중의 인간 Ⅱ형 콜라겐 생산량의 검토를 행하였다.

〔실시예 14〕pNOW-hColⅡa1 형질도입 세포 클론에 의한 인간 Ⅱ형 콜라겐 생산량의 검정

생산량의 검정은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 실시하였다. 배양상청의 7.5 μL와 등량의 트리스 SDSβ-ME 샘플처리액(다이이찌 화학사)을 혼합하고, 95℃, 5분간의 열처리를 행하였다. 이것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(PAGEL, ATTO사)에 중층하고, 전기영동으로 전개하였다. 전기영동 종료 후, 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(아마샴 바이오사이언스사)으로 처리하는 것에 의해 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅱ형 콜라겐의 검출과 정량을 행하였다. 비교대조로서는 12.5~100 ㎍/mL 농도의 인간 Ⅱ형 콜라겐(코스모 바이오사)을 동일하게 처리하여 사용하였다.

〔실시예 15〕G418 내성 세포주의 유전자 증폭

G418 내성 세포주 중, 인간 Ⅱ형 콜라겐 생산이 가장 높았던 클론을 계대배 양하여 안정화시킨 후, MTX에 의한 유전자 증폭을 행하였다. 처음에 5 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 1주간, 25 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 1주간, 50 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 1주간, 250 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 3주간, 1 μM의 MTX를 포함하는 배지에서 추가로 3주간 증폭시킨 결과, 25 nM의 MTX의 시점에서 인간 Ⅱ형 콜라겐의 생산 레벨은 배지당 70 ㎍/mL(4일간)로 상승하였다. 유전자 증폭에 사용하는 MTX 농도는 일반적으로 10 nM~10 μM 사이의 다단계로 되어, 최종농도로서는 10 μM가 잘 사용되나, 세포에 대한 독성의 문제로부터 고농도 폭로는 안정한 재조합 세포주의 수립에는 문제가 있다. 이로 인해 저농도 MTX로 고생산성이 달성될 수 있는 것도 중요한 평가기준이 되어, 본 실험에서는 1 μM까지로 하였다. 또한 통상 셀렉션을 포함한 MTX 폭로기간은 6~12개월이 되는 것에 대해서, 본 실험에서는 약 9주간으로 행하였다. 이러한 실험조건에도 불구하고 유효한 인간 Ⅱ형 콜라겐의 생산량 증가가 보였다. 이하의 G418 내성 세포주의 유전자 증폭도 동일하게 하여 실시하였다.

〔실시예 16〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석

유전자 증폭에 의해 얻어진 인간 Ⅱ형 콜라겐을 대량으로 생산하고 있는 세포 클론을 세포배양액 IS CHO-CD(IS 재팬사)를 사용하여 25 ㎠ 배양 플라스크 중에서 1×10⁶개/mL가 되도록 조제하였다. 이것을 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 96시간 배양한 후 배양액을 회수하고, 원심분리조작에 의해 세포를 제거하여 배양상청 으로 하였다. 배양상청의 7.5 μL와 등량의 트리스 SDSβ-ME 샘플처리액(다이이찌 화학)을 혼합하고, 95℃, 5분간의 열처리를 행하였다. 이것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(PAGEL, ATTO사)에 중층하고, 전기영동으로 전개하였다. 이하의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 동일하게 하여 실시하였다. 전기영동 종료 후, 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(아마샴 바이오사이언스사)으로 처리하는 것에 의해 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅱ형 콜라겐의 검출을 행하였다. 비교대조로서는 100 ㎍/mL 농도의 인간 Ⅱ형 콜라겐(코스모 바이오사)을 동일하게 처리하여 사용하였다. 도 8에 인간 Ⅱ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석결과를 나타낸다. 배양상청 중에 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐으로 생각되는 170 kDa, 200 kDa 위치의 폴리펩티드가 검출되었다.

〔실시예 17〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 웨스턴 블롯팅에 의한 분석

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 종료 후의 폴리아크릴아미드 겔을 트랜스퍼 완충액에 담근 후, 통상적인 방법에 따라 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅱ형 콜라겐을 PVDF 멤브레인에 전사하였다. 블록 에이스에 의한 블로킹 후, 1 ㎍/mL 농도의 항인간 Ⅱ형 콜라겐 사슬 항체(코스모 바이오사)와 그것에 이어 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) 표지 항토끼 IgG항체를 반응시켰다. 반응한 항체는 HRP의 활성을 검출하는 방법으로 TMB 퍼옥시다아제시약(후나코시사)을 사용하여 행하였다. 비교대조로서는 10 ㎍/mL의 인간 Ⅱ형 콜라겐(코스모 바이오사)을 사용하였다. 배양 상청 중에 항인간 Ⅱ형 콜라겐 사슬 항체가 결합할 수 있는 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐으로 생각되는 170 kDa의 폴리펩티드가 검출되었다(도 9).

〔실시예 18〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐의 펩신에 의한 분해와 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의한 분석

펩신에 의한 분해에 의해 얻어진 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석을 행하였다. 비교대조로서는 100 ㎍/mL의 인간 Ⅱ형 콜라겐(코스모 바이오사)을 사용하였다. 도 10에 펩신에 의한 분해산물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석결과를 나타낸다. 펩신 처리를 실시한 경우, 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐은 시판의 인간 Ⅱ형 아텔로콜라겐과 마찬가지로 130 kDa의 폴리펩티드로서 검출되었다. 이것은 인간 Ⅱ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청 중에는 실질적으로 천연형과 동등한 펩신 내성의 성질을 갖는 재조합 인간 Ⅱ형 콜라겐이 포함되어 있는 것을 나타내고 있었다. 웨스턴 블롯팅에 의한 분석에 있어서도 마찬가지의 결과가 얻어졌다(도 11).

〔실시예 19〕인간 Ⅲ형 콜라겐의 생산시험. 발현 벡터 pNOW-hColⅢa1에 의한 인간 Ⅲ형 콜라겐의 유전자 도입과 G418 내성 초기 클론의 확립

1 ㎍의 pNOW-hColⅢa1을 사용하여 25 ㎠의 배양 플라스크 중의 150만개의 CHO 세포 DG44주에 리포펙틴법을 사용하여 유전자 도입하였다. 도입방법은 제조업자의 사용설명서에 따랐다. 48시간 후 트립신 처리에 의해 세포를 박리하고, 세포수의 계측 후 30만개의 세포를 100 mL의 0.8 ㎎/mL의 G418을 포함하는 10% 투석 소 태아 혈청 첨가 Iscove's Modified Dalbecco's Medium 배지로 희석 후, 96웰 마이 크로타이터 플레이트 10매(960웰) 중에 뿌리고, 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 약 3주간 배양한 결과, 117웰에만 세포의 생존이 보였다(G418 내성주). 생존세포를 1 mL의 0.8 ㎎/mL의 G418을 포함하는 10% 투석 소 태아 혈청 첨가 Iscove's Modified Dalbecco's Medium 배지와 함께 24웰 플레이트로 옮겨 컨플루언트가 될 때까지 배양하였다. 배양상청을 폐기한 후 PBS(인비트로젠사) 1 mL를 각 웰에 첨가하고 다시 배양상청을 폐기하였다. 이것에 0.5 mL의 CHO 세포용 무혈청 배지 CHO-S-SFM Ⅱ(인비트로젠사)를 첨가하고 5% 탄산가스 존재하에서 37℃, 72시간 배양하였다. 계속해서 배양상청 중의 인간 Ⅲ형 콜라겐 생산량의 검토를 행하였다.

〔실시예 20〕pNOW-hColⅢa1 형질도입 세포 클론에 의한 인간 Ⅲ형 콜라겐 생산량의 검정

생산량의 검정은 도트 블로트법으로 실시하였다. 나일론 멤브레인 위에 72시간 배양상청 1 μL와 시판의 인간 Ⅲ형 콜라겐(벡톤, 디킨슨사)의 CHO 세포용 무혈청 배지 CHO-S-SFM Ⅱ에 의한 2배 희석계열(0.125~8 ㎍/mL)과 CHO-S-SFM Ⅱ 각각 1 μL를 도트하고, 1시간의 풍건, 블록 에이스에 의한 블로킹 후, 1 ㎍/mL 농도의 항인간 Ⅲ형 콜라겐 항체(코스모 바이오사)와 그것에 이어 HRP 표지 항토끼 IgG항체를 반응시켰다. 반응한 항체는 슈퍼시그널 웨스트 피코 시약으로 HRP의 활성을 검출하는 방법으로 루미노 캡쳐를 사용하여 행하였다.

〔실시예 21〕G418 내성 세포주의 유전자 증폭

G418 내성 세포주 중, 인간 Ⅲ형 콜라겐 생산이 가장 높았던 클론을 계대배양하여 안정화시킨 후, MTX에 의한 유전자 증폭을 행하였다. 처음에 15 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 2주간, 60 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 2주간, 250 nM의 MTX를 포함하는 배지에서 2주간, 1 μM의 MTX를 포함하는 배지에서 추가로 4주간 증폭시킨 결과, 인간 Ⅲ형 콜라겐의 생산 레벨은 배지당 225 ㎍/mL(3일간)로 상승하였다.

〔실시예 22〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석

유전자 증폭에 의해 얻어진 인간 Ⅲ형 콜라겐을 대량으로 생산하고 있는 세포 클론을 세포배양액 IS CHO-CD(IS 재팬사)를 사용하여 25 ㎠ 배양 플라스크 중에서 1×10⁶개/mL가 되도록 조제하였다. 이것을 5% 탄산가스 존재하에 37℃에서 96시간 배양한 후 배양액을 회수하고, 원심분리조작에 의해 세포를 제거하여 배양상청으로 하였다. 배양상청의 6 μL와 등량의 트리스 SDSβ-ME 샘플처리액(다이이찌 화학사)을 혼합하고, 95℃, 5분간의 열처리를 행하였다. 이것을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(PAGEL, ATTO사)에 중층하고, 전기영동으로 전개하였다. 이하의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 동일하게 하여 실시하였다. 전기영동 종료 후, 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액(아마샴 바이오사이언스사)으로 처리하는 것에 의해 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅲ형 콜라겐의 검출을 행하였다. 비교대조로서는 100 ㎍/mL 농도의 인간 Ⅲ형 콜라겐(벡톤, 디킨슨사)을 동일하게 처리하여 사용하였다. 도 12에 인간 Ⅲ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 분석결과를 나타낸다. 배양상청 중에 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐으로 생각되는 140 kDa, 170 kDa 위치의 폴리펩티드가 검출되었다.

〔실시예 23〕배양상청 중의 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐의 웨스턴 블롯팅에 의한 분석

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 종료 후의 폴리아크릴아미드 겔을 트랜스퍼 완충액에 담근 후, 통상적인 방법에 따라 폴리아크릴아미드 겔 중의 인간 Ⅲ형 콜라겐을 PVDF 멤브레인에 전사하였다. 블록 에이스에 의한 블로킹 후, 1 ㎍/mL 농도의 항인간 Ⅲ형 콜라겐 사슬 항체(코스모 바이오사)와 그것에 이어 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) 표지 항토끼 IgG항체를 반응시켰다. 반응한 항체는 HRP의 활성을 검출하는 방법으로 TMB 퍼옥시다아제시약(후나코시사)을 사용하여 행하였다. 비교대조로서는 100 ㎍/mL의 인간 Ⅲ형 콜라겐(벡톤, 디킨슨사)을 사용하였다. 배양상청 중에 항인간 Ⅲ형 콜라겐 사슬 항체가 결합할 수 있는 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐으로 생각되는 140 kDa, 170 kDa 위치의 폴리펩티드가 검출되었다(도 13).

펩신 처리를 실시한 경우, 배양상청 중의 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐은 시판의 인간 Ⅲ형 아텔로콜라겐(벡톤, 디킨슨사)과 마찬가지로 130 kDa 위치의 폴리펩티드로서 검출되었다. 이것은 인간 Ⅲ형 콜라겐 생산세포 클론으로부터 얻어진 배양상청 중에서는 천연형과 실질적으로 동등한 펩신 내성의 성질을 갖는 재조합 인간 Ⅲ형 콜라겐이 포함되어 있는 것을 나타내고 있었다.

〔실시예 24〕배양상청 중의 인간 Ⅰ형 및 Ⅲ형 콜라겐의 정제

인간 Ⅰ형 또는 Ⅲ형 콜라겐을 포함하는 배양상청 100 mL를 사용하여 실시예 12와 마찬가지로 조작하여 정제를 행하였다. 원래의 배양상청 100 mL에 대해 최종적으로 얻어진 정제 콜라겐 용액이 약 300 μL가 되도록 농축한 것을 SDS-PAGE에 의해 전기영동하여 정제도의 확인을 행하였다(도 14).

본 발명에 의해, 포유동물 세포를 숙주로 하여 고수준이면서도 또한 천연형에 보다 가까운 재조합 인간·콜라겐의 생산을 가능하게 하는 발현 벡터 및 인간·콜라겐 생산세포를 제공하는 것이 가능하다. 또한, 헤테로트리머의 인간·콜라겐 생산세포를 제공하는 것도 가능하다.

본 발명의 제조방법은 콜라겐 뿐만 아니라, 3중 나선구조를 갖는 콜렉틴 등의 단백질에도 적용하는 것이 가능하다.

더욱이, 본 발명의 콜라겐 제조방법에 있어서 종류가 상이한 α사슬을 동시에 발현시키는 것으로, 천연에서는 본래 제조되는 경우가 없는(지금까지 발현되고 있지 않은) 신규한 분자구성의 3중 나선구조를 갖는 콜라겐을 대량으로 제조할 수 있을 가능성이 있다. 이들 신규한 분자구성의 3중 나선구조를 갖는 콜라겐은, 기지의 콜라겐과는 상이한 성질을 갖고 있는 것으로 생각되어, 신규 재료로서의 응용이 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. OSAKA PREFECTURAL GOVERNMENT <120> Method for preparing of protein having triple helix structure <130> F2-A0501P <150> JP 2005-102999 <151> 2005-03-31 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgttcagct ttgtggacct ccggctcctg ctcctcttag cggccaccgc cctcctgacg 60 cacggccaag aggaaggcca agtcgagggc caagacgaag acatcccacc aatcacctgc 120 gtacagaacg gcctcaggta ccatgaccga gacgtgtgga aacccgagcc ctgccggatc 180 tgcgtctgcg acaacggcaa ggtgttgtgc gatgacgtga tctgtgacga gaccaagaac 240 tgccccggcg ccgaagtccc cgagggcgag tgctgtcccg tctgccccga cggctcagag 300 tcacccaccg accaagaaac caccggcgtc gagggaccca agggagacac tggcccccga 360 ggcccaaggg gacccgcagg cccccctggc cgagatggca tccctggaca gcctggactt 420 cccggacccc ccggaccccc cggacctccc ggaccccctg gcctcggagg aaactttgct 480 ccccagctgt cttatggcta tgatgagaaa tcaaccggag gaatttccgt gcctggcccc 540 atgggtccct ccggtcctcg tggtctccct ggcccccctg gtgcacctgg tccccaaggc 600 ttccaaggtc cccctggtga gcctggcgag cctggagctt caggtcccat gggtccccga 660 ggtcccccag gtccccctgg aaagaatgga gatgatgggg aagctggaaa acctggtcgt 720 cctggtgagc gtgggcctcc tgggcctcag ggtgcccgag gattgcccgg aacagctggc 780 ctccctggaa tgaagggaca cagaggtttc agtggtttgg atggtgccaa gggagatgct 840 ggtcctgctg gtcctaaggg tgagcctggc agccctggtg aaaatggagc tcctggtcag 900 atgggccccc gtggcctgcc tggtgagaga ggtcgccctg gagcccctgg ccctgctggt 960 gctcgtggaa atgatggtgc tactggtgct gccgggcccc ctggtcccac cggccccgct 1020 ggtcctcctg gcttccctgg tgctgttggt gctaagggtg aagctggtcc ccaagggccc 1080 cgaggctctg aaggtcccca gggtgtgcgt ggtgagcctg gcccccctgg ccctgctggt 1140 gctgctggcc ctgctggaaa ccctggtgct gatggacagc ctggtgctaa aggtgccaat 1200 ggtgctcctg gtattgctgg tgctcctggc ttccctggtg cccgaggccc ctctggaccc 1260 cagggccccg gcggccctcc tggtcccaag ggtaacagcg gagaacctgg tgctcctggc 1320 agcaaaggag acactggtgc taagggagag cctggccctg ttggtgttca aggaccccct 1380 ggccctgctg gagaggaagg aaagcgagga gctcgaggtg aacccggacc cactggcctg 1440 cccggacccc ctggcgagcg tggtggacct ggtagccgtg gtttccctgg cgcagatggt 1500 gttgctggtc ccaagggtcc cgctggtgaa cgtggttctc ctggccctgc tggccccaaa 1560 ggatctcctg gtgaagctgg tcgtcccggt gaagctggtc tgcctggtgc caagggtctg 1620 actggaagcc ctggcagccc tggtcctgat ggcaaaactg gcccccctgg tcccgccggt 1680 caagatggtc gccccggacc cccaggccca cctggtgccc gtggtcaggc tggtgtgatg 1740 ggattccctg gacctaaagg tgctgctgga gagcccggca aggctggaga gcgaggtgtt 1800 cccggacccc ctggcgctgt cggtcctgct ggcaaagatg gagaggctgg agctcaggga 1860 ccccctggcc ctgctggtcc cgctggcgag agaggtgaac aaggccctgc tggctccccc 1920 ggattccagg gtctccctgg tcctgctggt cctccaggtg aagcaggcaa acctggtgaa 1980 cagggtgttc ctggagacct tggcgcccct ggcccctctg gagcaagagg cgagagaggt 2040 ttccctggcg agcgtggtgt gcaaggtccc cctggtcctg ctggtccccg aggggccaac 2100 ggtgctcccg gcaacgatgg tgctaagggt gatgctggtg cccctggagc tcccggtagc 2160 cagggcgccc ctggccttca gggaatgcct ggtgaacgtg gtgcagctgg tcttccaggg 2220 cctaagggtg acagaggtga tgctggtccc aaaggtgctg atggctctcc tggcaaagat 2280 ggcgtccgtg gtctgaccgg ccccattggt cctcctggcc ctgctggtgc ccctggtgac 2340 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Claims

이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는, 3중 나선구조를 갖는 단백질의 제조방법.

(a) 3중 나선구조를 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 벡터에 도입하는 공정

(b) 상기 백터를 사용한 유전자 도입에 의해, 포유동물 세포를 형질전환시키는 공정

(c) 상기 형질전환체를 배양 또는 육종하고, 상기 세포 또는 그의 배양상청으로부터 3중 나선구조를 갖는 단백질을 회수하는 공정
제1항에 있어서, 3중 나선구조를 갖는 단백질이 인간·콜라겐 또는 그의 부분 펩티드인 방법.
제2항에 있어서, 인간·콜라겐이 적어도 1종류 이상의 α사슬로 되는 인간·콜라겐인 방법.
제2항에 있어서, 인간·콜라겐이 인간·Ⅰ형 콜라겐인 방법.
제4항에 있어서, 인간·Ⅰ형 콜라겐이 α1사슬과 α2사슬의 복합체인 방법.
제2항에 있어서, 인간·콜라겐이 인간·Ⅱ형 콜라겐인 방법.
제2항에 있어서, 인간·콜라겐이 인간·Ⅲ형 콜라겐인 방법.
제1항에 있어서, 3중 나선구조를 갖는 단백질을 코드하는 DNA가 이하의 (a) 또는 (b)의 DNA로부터 선택되는 1개 이상의 DNA인 방법.

(a) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA

(b) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 태아 신장세포(HEK293)인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 3중 나선구조를 갖는 단백질을 코드하는 DNA가 도입되는 벡터가 pNOW/CMV-AA인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 인간·콜라겐.
이하의 (a) 또는 (b)의 DNA로부터 선택되는 1개 이상의 DNA가 도입된 벡터.

(a) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA

(b) 서열번호: 1, 4, 7, 또는 10 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA
제13항의 벡터를 보유하는 포유동물 세포.
제13항의 벡터, 또는 제14항의 포유동물 세포를 포함하는, 3중 나선구조를 갖는 단백질을 제조하기 위한 키트.