KR20220062230A - 퍼옥시좀에서 변형 단백질의 발현 - Google Patents

퍼옥시좀에서 변형 단백질의 발현 Download PDF

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제네비에브 엠. 비다네스
존 듀버
제브 가트너
쉬락 바지라니
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프로베넌스 바이오 엘엘씨
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Abstract

본 명세서의 개시내용은 퍼옥시좀에서 단백질을 만드는 방법 및 조성물, 및 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하기 위한 세포를 만드는 방법을 포함한다. 또한 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하기 위한 세포 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포에서 단백질을 생산하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다.

Description

퍼옥시좀에서 변형 단백질의 발현
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 14일자로 출원된 미국 가출원 제62/847,769호의 이익을 주장하며, 상기 미국 가출원은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
전자 형식의 서열 목록 및 표에 대한 참조
본 출원은 235KB 크기이며 2020년 5월 7일자로 생성된 PBFAB001WO2SEQLIST.TXT의 파일명의 전자식 서열 목록과 함께 제출된다. 이 전자식 서열 목록의 정보는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
분야
예를 들어 인공 재료에 사용될 수 있는 단백질 및 단백질 전구체를 생산하기 위해 세포를 유전적으로 변형시키는 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다.
세포에서 단백질을 생산 및 변형하는 개선된 방법에 대한 이 분야의 요구가 있다. 세포에서 생산 및 변형된 단백질은 다양한 방식으로 사용된다.
필름 개발 제품의 기질; 알약의 캡슐(약물 및 기능식품의 젤라틴); 식품 첨가제(예를 들어, 모든 젤라틴 물질) 및 식품용 콜라겐과 같은 물질의 전구체로 작용할 수 있는 단백질을 생산하는 방법이 본 명세서에 기술되며 합성 육류, 합성 가죽과 같은 직물, 미용 제품 및 생물의학 재료(골격, 봉합사, 이식편, 확장 세포, 겔 등)가 고려된다. 이러한 방법의 사용으로 현재 사용되는 표준 제조 방법에서 제품 탄소 발자국을 줄이는 물질 또한 제공할 수 있다.
물질의 생산에 사용될 수 있는 단백질 전구체가 고려된다. 예를 들어, 통상적으로 생산되는 직물과 비교하여 온실 가스 배출이 더 낮은 세포 공학 및 조직 공학 기술을 사용한 인공 제작 직물과 같은 차세대 직물이 고려된다.
단백질 전구체는 예를 들어 얼굴 크림, 주사가능한 약물 및 상처 드레싱에서 발견될 수 있는 콜라겐 유래 제품으로 사용될 수 있다.
예를 들어 인공 물질에 사용될 수 있는, 단백질 및 단백질 전구체를 생산하기 위해 세포를 유전적으로 변형시키는 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 퍼옥시좀에서 변형 단백질(modified protein)을 생산하기 위해 유전자 변형 세포를 만드는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 변형 단백질(modified protein)은 직물, 인공 피부 또는 다른 물질과 같은 물질을 생산하기 위한 빌딩 블록으로 사용될 수 있다. 일부 직물에서 발견되는 단백질의 생산이 세포 생산 시스템에서 사용하기 위해 고려된다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 세포를 만드는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포를 제공하는 단계, 세포에 제1 핵산을 도입하는 단계 및 세포에 제2 핵산을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제1 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소(heterologous modification enzyme)를 암호화하는 제2 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 세균 또는 고세균 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 효모 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 아르술라(Arxula), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 코마가탤라(Komagataella), 오가타에아(Ogataea), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 속으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 및/또는 제2 핵산은 프로모터(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 항시성 또는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀-표적화 서열은 서열번호 1(SLK), 서열번호 2(RLXXXXX(H/Q)L) 또는 서열번호 3(LGRGRRSKL)에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 태그(tag)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 절단가능하다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포에 제3 핵산을 도입하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 제2 이종 변형 효소를 암호화하는 제3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 1Da, 5Da, 10Da, 20Da, 30Da, 40Da, 50Da, 60Da, 70Da, 80Da, 90Da, 100Da, 200Da, 300Da, 400Da, 500Da, 600Da, 700Da, 800Da, 900Da, 1kDa, 5kDa, 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 110kDa, 120kDa, 130kDa, 140kDa, 150kDa, 160kDa, 170kDa, 180kDa, 190kDa, 200kDa, 210kDa, 220kDa, 230kDa, 240kDa, 250kDa, 260kDa, 270kDa, 280kDa, 290kDa 또는 300kDa, 또는 임의의 상기 2개의 값으로 정의되는 범위 사이의 임의의 크기의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 효소는 변형을 생성한다. 일부 실시형태에서, 변형은 단백질의 접힘이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 접히지 않는다. 일부 실시형태에서, 변형은 단백질 접힘, 하이드록실화, 글리코실 전이, 산화 및/또는 이성질체화이다. 일부 실시형태에서, 효소는 프롤릴 하이드록실화효소, 글리코실 전이효소, 리실 산화효소, 단백질 샤페론 또는 프롤릴 이성질체화효소이다. 일부 실시형태에서, 효소는 글리코실 전이효소, 프롤릴 이성질체화효소, 단백질 이황화 이성질체화효소, 하이드록실 전이효소 또는 프롤릴 하이드록실화효소이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 콜라겐, 젤라틴 또는 실크 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소는 글리코실 전이효소, 프롤릴 하이드록실화효소 또는 프롤릴 이성질체화효소이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 콜라겐이고, 콜라겐은 I형 이종삼량체, 1형 알파 동종삼량체 또는 III형 동종삼량체 콜라겐을 형성하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 콜라겐은 Col1A1 또는 Col1A2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프롤릴-4-하이드록실화효소는 PDI 도메인의 결실을 갖도록 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, 효소는 개선된 발현 및 퍼옥시좀으로의 도입을 위해 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 개선된 발현 및 퍼옥시좀으로의 도입을 위해 유전자 변형된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 효모 세포와 같은 진핵 세포에서의 단백질 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀 표적화 서열에 대한 이종 단백질의 융합은 이종 단백질의 퍼옥시좀으로의 표적화를 초래하고, 이에 의해 퍼옥시좀으로 표적화되지 않은 효소로부터 이종 단백질을 분리한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀 표적화 서열에 대한 변형 효소(modification enzyme)의 융합은 변형 효소의 퍼옥시좀으로의 표적화를 초래하고, 이에 의해 퍼옥시좀으로 표적화되지 않은 기질 또는 효소로부터 변형 효소를 분리한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 COLsyn1, COLsyn2, COLsyn3, COLsyn4, 또는 COLsyn1, COLsyn2, COLsyn3 또는 COLsyn4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산은 변형되지 않은 제1 핵산 또는 천연발생인 제1 핵산과 비교하여 이종 단백질에서 적어도 하나의 소수성 아미노산이 친수성 또는 비-소수성 아미노산으로 대체되도록 조작된다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하기 위한, 본 명세서에서 제공된 임의의 방법으로 제조된, 진핵 세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하기 위한 진핵 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 암호화하는 제2 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 변형 단백질을 생산하기 위한 퍼옥시좀을 포함하는 진핵 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 퍼옥시좀에서 변형된다. 일부 실시형태에서, 세포는 파스토리스(Pastoris)이다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀-표적화 서열은 서열번호 1, 2 또는 3에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 제2 단백질을 암호화하는 제3 핵산을 더 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기술된 방법으로 제조된 세포 또는 본 명세서에 기술된 대안적인 것들 중 임의의 하나의 세포를 제공하는 단계, 진핵 세포에서 이종 단백질을 발현하는 단계 및 이종 변형 효소가 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하도록 하는 조건 하에서 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된다. 일부 실시형태에서, 방법은 퍼옥시좀의 화물(cargo)을 증가시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 것은 진핵 세포에 올레산 또는 메탄올을 제공하여 수행된다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현한다. 일부 실시형태에서, 방법은 진핵 세포에서 이종 단백질을 발현하는 단계 및 이종 변형 효소가 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하도록 하는 조건 하에서 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된다. 일부 실시형태에서, 방법은 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 것은 진핵 세포에 올레산 또는 메탄올을 제공하여 수행된다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 변형 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 변형 단백질이 생산되도록 하는 조건 하에서 퍼옥시좀 함유 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종 변형 효소는 배양 조건 하에서 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 것은 진핵 세포에 올레산 또는 메탄올을 제공하여 수행된다.
본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태는 변형 단백질의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 변형 단백질이 생산되도록 하는 조건 하에서 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현한다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질의 발현은 프로모터의 영향 하에 있다. 일부 실시형태에서, 이종 변형 효소는 배양 조건 하에서 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하고 화학적 유도제의 첨가로 이종 단백질의 생산을 유도한다. 일부 실시형태에서, 방법은 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 것은 진핵 세포에 올레산 또는 메탄올을 제공하여 수행된다.
일부 실시형태는 세포의 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 GFP-x-ePTS1 또는 x-FLAG-ePTS1을 포함하는 제1 핵산 작제물 및 GFP-y-ePTS1 또는 y-FLAG-ePTS1을 포함하는 제2 핵산 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, x는 퍼옥시좀으로 표적화되는 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열이다. 일부 실시형태에서, y는 퍼옥시좀으로 표적화되는 변형 효소를 암호화하는 핵산 서열이다. 일부 실시형태에서, 변형 효소는 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시킬 수 있는 효소이다.
도 1은 단백질 및 효소를 세포의 퍼옥시좀으로 향하게 하는 예시를 나타내는 개략도를 보여준다.
도 2는 일부 실시형태에 따른 유전자 변형 효모의 발효, 번역적으로 변형된 단백질 정제의 개략도를 보여준다.
도 3은 야생형(윗줄) 또는 삭제된 PEX5 유전자로 변형된(아랫줄) 융합 단백질을 발현하는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주의 현미경 이미지를 나타낸다. 융합은 합성 콜라겐 펩타이드 및 콜라겐 변형 효소에 융합된 N-말단 GFP 및 C-말단 ePTS1을 포함한다.
도 4는 각각 서로 다른 산업성 효모 숙주 PBH001, PBH002 및 PBH004를 대표하는 PB000095, PB000163, PB000297 균주에서 GFP 및 C-말단 ePTS1에 융합된 콜라겐 변이체의 형광 국소화(localization)를 보여준다.
도 5는 YPD 또는 YP 갈락토스 플레이트 상에서 연속 희석된 균주의 콜로니 성장을 보여준다. 균주는 GAL-SigD1-351-ePTS1(상단) 또는 GAL-SigD1-351(하단)을 발현한다.
도 6은 퍼옥시좀-국소화 RFP-tev-TFP-ePTS1 기질(A) 상에서 또는 세포질의 RFP-tev-YFP 기질(B) 상에서 퍼옥시좀-국소화 TEV-FLAG-ePTS1 단백질분해효소 활성의 웨스턴 블롯 이미지를 보여준다. TEV 단백질분해효소 발현은 다음의 서로 다른 항시성 또는 유도성 프로모터 및 성장 조건에 의해 조절되었다: (1) pTEF1, (2) pRPL18B, (3) 덱스트로스에 의해 억제되는 pGAL1, (4) 라피노스 및 덱스트로스에 의해 억제되는 pGAL1 및 (5) 라피노스 및 갈락토스에 의해 유도되는 pGAL1. 웨스턴 블롯에서 전장 54kDa 기질 또는 27kDa 절단 산물을 인식하는 항-tRFP 항체를 사용하여 조사하였다.
도 7은 퍼옥시좀 내 콜라겐 상에서 Bant P4H 하이드록실화효소 활성을 보여준다. A는 균주 목록을 나타낸다. Bant P4H는 TDH3 프로모터에서 발현되고 콜라겐 기질은 TEF1 프로모터에서 발현된다. B는 Geneious 소프트웨어를 사용하여 각 균주로부터의 콜라겐 기질을 정렬한 것을 보여준다. 일치하는 서열은 1. PB000224; 2. PB000248; 및 3. PB000249가 같은 서열(서열번호 71)을 나타내고, 4. PB000225; 5. PB000254; 및 6. PB000255가 같은 서열(서열번호 72)을 나타냄을 보여준다. 아미노산 아래의 회색 상자는 LCMSMS에 의해 산화되는 것으로 확인된 프롤린 위치를 나타낸다. C는 각 변형 부위의 LCMSMS 결과에 대한 세부 정보를 보여준다.
도 8은 사카로마이세스 세레비지에에서 GFP 태그에 융합된 ePTS1-태깅 전장 콜라겐 AmCol1A 또는 AmCol1A2 및 mRuby 태그에 융합된 ePTS1-태깅 BantP4H 하이드록실화효소의 생체 내 형광 국소화를 보여준다. 이미지는 각각 GFP 및 mRuby 검출을 위한 개별 FITC 및 TexasRed 채널로 표시된다. 병합 이미지는 FITC 및 TexasRed 채널을 겹친 것으로 두 단백질의 공동국소화를 의미한다.
정의
본 명세서에서 제공되는 표제, 제목 및 부제목은 본 개시의 다양한 양상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어들은 명세서의 전체를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어들은 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수적 용어는 복수를 포함하고 복수적 용어는 단수를 포함할 것이다.
본 명세서에서 "또는"의 사용은 달리 정해지지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 다중 종속항의 맥락에서, "또는"의 사용은 대안적으로만 하나 초과의 앞선 독립항 또는 종속항을 다시 가리킨다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 달리 구체적으로 정해지지 않는 한 하나의 구성 단위를 포함하는 요소 및 성분 및 하나 초과의 하위 구성 단위를 포함하는 요소 및 성분 모두를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태 및 임의의 단어의 임의의 단수적 사용은 명시적이고 명확하게 하나의 지시 대상으로 제한되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의해야 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "포함" 및 이의 문법적인 변형체는 목록 내 항목이 나열된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않도록 비-제한적인 것으로 의도된다.
본 명세서에 기술된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 이의 분수(예를 들어 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
단위, 접두사 및 기호는 국제단위계(SI)에서 인정되는 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 측정치는 유효 숫자 및 측정치와 관련된 오류를 고려하여 근사치로 이해된다.
본 개시내용에 따라 이용되는 다음의 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:
본 명세서에 사용된 용어 "약"은, 명확하게 지시되든 그렇지 않든, 예를 들어 범자연수, 분수 및 백분율을 포함하는 숫자 값을 의미한다. 용어 "약"은 일반적으로 이 분야의 기술자가 인용된 값과 동등한 것으로 간주하는 숫자 값(예를 들어, 같은 기능 또는 결과를 갖는 값)의 범위(예를 들어, 인용된 범위의 +/- 5 내지 10%)를 의미한다. 적어도 및 약과 같은 용어가 숫자 값 또는 범위의 목록 앞에 오는 경우, 이 용어는 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수식한다. 일부의 경우, 용어 약은 가장 가까운 유효숫자로 반올림된 숫자 값을 포함할 수 있다.
"퍼옥시좀"은 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 매우 긴 사슬 지방산, 분지형 사슬 지방산, D-아미노산 및 폴리아민의 이화작용, 반응성 산소종의 환원, 플라스말로겐(즉, 포유동물의 뇌 및 폐의 일반적인 기능에 중요한 에테르 인지질)의 생합성을 위한 세포소기관을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 퍼옥시좀은 또한 일부 효모에서 글리옥실산 회로, 해당 작용(gylycolysis) 및 메탄올 및/또는 아민 산화 및 동화작용을 위해 기능할 수 있다. 퍼옥시좀은 또한 고유의 천연 효소를 가질 수 있다. 제한 없이, 이 효소는 예를 들어 D-아미노산 산화효소 및 요산 산화효소와 같은 산화적 효소를 위한 카탈라제를 포함할 수 있다. 본 명세서의 실시형태에서, 퍼옥시좀은 단백질을 만들거나 단백질을 변형시키는 기능을 할 수 있다.
단백질에 대한 "변형"은 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 갖는다. 제한 없이, 변형은 공유 변형의 추가, 단백질의 폴딩, 다중-하위유닛 복합체의 4차 구조로의 단백질의 조립 및 번역-후 변형과 같은, 단백질의 1차, 2차, 3차 및 4차 구조의 변화를 포함할 수 있다. 프롤릴 하이드록실화 외에 다른 변형 또한 퍼옥시좀에서 달성될 수 있다. 퍼옥시좀은 변형 효소(modifying enzyme)에 의해 변형되는 기질의 역할을 하는 많은 작은 분자에 대해 자연적으로 투과성이다. 사실, 퍼옥시좀은 약 700달톤 미만의 분자가 이 세포소기관으로 자유롭게 확산될 수 있는 크기 게이팅을 갖는 것으로 결정되었다. 퍼옥시좀으로 자유롭게 확산될 수 없는 기질은 수송되어야 한다. 수송은 퍼옥시좀 막을 표적으로 하는 막 단백질을 통해, 특별하게 또는 무차별적으로, 이루어질 수 있다.
"핵산" 또는 "핵산 분자"는, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)과 같은, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 생성되는 단편, 및 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제의 작용 및 엑소뉴클레아제의 작용 중 임의의 것으로 생성되는 단편을 의미한다. 핵산 분자는 자연-발생 뉴클레오타이드(예를 들어 DNA 및 RNA)인 단량체, 또는 자연-발생 뉴클레오타이드의 유사체(예를 들어, 자연-발생 뉴클레오타이드의 거울상이성질 형태), 또는 이 둘의 조합으로 구성될 수 있다. 변형 뉴클레오타이드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에서의 변형을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어 하나 이상의 수산기가 할로겐, 알킬기, 아민 및 아지도기로 대체되는 것을 포함하거나, 당이 에테르 또는 에스터로 기능화될 수 있다. 또한, 전체 당 모이어티가, 아자-당(aza-sugar) 및 탄소고리 당 유사체와 같은, 입체적으로 전자적으로 유사한 구조로 대체될 수 있다. 염기 모이어티 변형의 예시에는 알킬화 퓨린 및 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 잘 알려진 헤테로고리 대체물이 포함된다. 핵산 단량체는 인산다이에스터 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 인산다이에스터 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한, 폴리아미드 백본에 부착된 자연-발생 또는 변형 핵산 염기를 포함하는, "펩타이드 핵산"이라 불리는 것을 포함한다. 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 일부 대안에서, 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열이 제공된다. 일부 대안에서, 핵산은 RNA 또는 DNA이다.
"진핵" 세포는 조류 세포, 균류 세포(예를 들어 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포(예를 들어, T-세포)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포는 코마가탤라, 피키아, 한세눌라 및 오가타에아로 이루어지는 메틸영양체성 효모의 속(genus)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 추가 출아효모 속인 아르술라, 칸디다, 클루베로마이세스(Kluveromyces), 사카로마이세스 및 야로위아로부터 선택된다.
"세균 세포"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 갖는다. 세균 세포는 주로 인지질로 만들어진 세포막으로 둘러쌓인다. 이 막은 세포의 내용물을 둘러싸고 세포 내 세포질의 영양소, 단백질 및 다른 필수 구성 요소를 유지하는 장벽 역할을 한다. 그러나, 진핵 세포와는 달리, 세균에는 일반적으로 세포질 내에 진핵 세포에 존재하는 핵, 미토콘드리아, 엽록체 및 다른 세포소기관과 같은 큰 막-결합 구조가 없다. 단백질 발현을 위한 세균에는 예를 들어 대장균(E. coli)이 포함될 수 있다.
"고세균"은 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 갖는다. 고세균 또는 원시세균은 극도로 뜨거운 열수 분출구로 인한 해저면과 같은 극한 환경에서 생존할 수 있다. 고세균과 세균은 매우 유사하다. 이들 모두 세포벽 및 세포막을 갖는 단-세포 원핵생물이다. 이들 사이의 주요 차이는 화학적 구조와 생존하는 곳이다. 예시로 호열성 세균, 호염성 세균 및 메탄생성균이 포함될 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
"프로모터"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 대안에서, 프로모터는 유전자의 구조 유전자의 전사 시작 부위에 근접한 5' 비-암호화 영역에 위치한다. 전사의 개시에서 기능하는 프로모터의 서열 요소는 종종 공통 뉴클레오타이드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소는 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소(DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993); 이의 전체가 참조에 의해 원용됨), 고리형 AMP 반응 요소(CRE), 혈청 반응 요소(SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990); 이의 전체가 참조에 의해 원용됨), 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE) 및 다른 전사 인자, 예를 들어 CRE/ATF(O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992); 이의 전체가 참조에 의해 원용됨), AP2(Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994); 이의 전체가 참조에 의해 원용됨), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993); 이의 전체가 참조에 의해 원용됨) 및 옥타머 인자(octamer factor)(일반적으로, 문헌[Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed.](The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987; 이의 전체가 참조에 의해 원용됨) 및 문헌[Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)](이의 전체가 참조에 의해 원용됨) 참조)에 대한 결합 부위를 포함한다. 본 명세서에 사용된 프로모터는 항시 활성, 억제성 또는 유도성일 수 있다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 대조적으로, 프로모터가 항시성 프로모터인 경우 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 본 명세서의 일부 실시형태에서, 제공되는 핵산은 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 단백질 번역을 위한 효모 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 세포는 피키아이고, 프로모터는 메탄올 유도성 프로모터 PAOX1 또는 항시성 프로모터 PGAP을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 pAOX, pGal, pCup, pGEM 또는 pZPM을 포함한다.
퍼옥시좀 표적화 신호(PTS)는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 수용체가 인식하고 결합하는 퍼옥시좀 단백질의 영역을 포함할 수 있다. 이러한 모티프를 함유하는 단백질은 퍼옥시좀으로 국소화된다. 본 명세서의 일부 실시형태에서, PTS에 작동 가능하게 연결된 단백질 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
"단백질 태그" 또는 "태그"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 재조합 단백질 상에 유전적으로 이식된 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 태그는 종종 화학 작용제 또는 효소적 수단, 예를 들어 단백질 분해 또는 인테인 스플라이싱(intein splicing)으로 제거될 수 있다. 태그는 다양한 목적, 예를 들어 정제 또는 가용화를 위한 친화성 태그와 같은 목적을 위해 단백질에 부착된다. 태그는 또한 퍼옥시좀에 있는 동안의 단백질 안정성을 위해 단백질 또는 효소에 부가될 수 있다. 본 명세서의 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀에서의 변형을 위해 발현되는 단백질은 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 히스티딘(예를 들어, HIS6), 말토스-결합 단백질, GST, FLAG, Fc 도메인 및 스트렙-태그(Strep-tag)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"단백질"은 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 고분자를 포함할 수 있다. 따라서 단백질은 임의의 하나 이상의 아미노산에 의해 형성되는, 펩타이드(아미드) 결합으로 연결되는 아미노산 단량체들의 사슬인 펩타이드로 구성될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유할 수 있고, 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 제한 없이, 아미노산은 예를 들어 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 아스파트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 시스틴, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 하이드록시프롤린, 이소루신, 루신, 피롤리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 오르니틴, S-아데노실메티오닌 및 셀레노시스테인이다. 단백질은 또한 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비천연 아미노산의 혼입은 앰버 코돈 억제로 수행된다. 단백질은 또한 예를 들어 탄수화물기와 같은 비-펩타이드 구성 요소를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩타이드 치환기는 단백질을 생산하는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 단백질은 본 명세서에서 아미노산 백본 구조의 관점에서 정의된다; 탄수화물기와 같은 치환기는 일반적으로 지정되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다. 본 명세서에 기술된 일부 대안에서, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 만드는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 변형 단백질은 콜라겐, 젤라틴 또는 실크 단백질을 포함한다. 일부 직물에서, 글로불린-유사 단백질, 케라틴, 콜라겐 가수분해물, 콜라겐 펩타이드 및 콜라겐과 같은 단백질 또한 고려된다.
"콜라겐"은 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 피부 및 다른 결합 조직에서 발견되는 구조 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서의 일부 실시형태에서, 콜라겐은 퍼옥시좀에서 변형된다.
"젤라틴"은 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 콜라겐으로부터 제조되는 수용성 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 젤라틴은 퍼옥시좀에서의 변형을 위해 제공된다.
"이성질체화효소"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 특정 화합물을 이성질체로 전환하는 것을 촉매하는 효소를 포함할 수 있다. 이 분야의 기술자들은 예를 들어 라세미화효소, 에피머화효소, 시스-트랜스 이성질체화효소 및 분자내 전이효소와 같은 많은 유형의 이성질체화효소가 있다는 것을 이해할 것이다.
"하이드록실 전이효소"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 프롤릴 하이드록실화효소 및 리실 산화효소와 같은 효소를 포함할 수 있다.
"글리코실전이효소"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 글리코시드 결합을 형성하는 효소를 포함할 수 있다.
이 분야의 기술자들은 유전자 발현 수준이 프로모터 서열 및 조절 요소와 같은 많은 인자들에 의존한다는 것을 인식할 것이다. 최대 단백질 선택을 위한 또 다른 인자는 전사 유전자의 코돈을 숙주의 전형적인 코돈 사용에 적응시키는 것이다. 예를 들어 대부분의 세균 및 효모 세포에 대해 언급된 바와 같이, 코돈의 작은 부분집합이 tRNA 종에 의해 인식되어 번역 선택으로 이어지며, 이는 단백질 발현 상의 중요한 제한이 될 수 있다. 이러한 양상에서, 단백질 발현 수준을 증가시키기 위해 많은 합성 유전자가 설계될 수 있다. 코돈 최적화 설계 과정은 희귀 코돈을 최대 단백질 발현 효율을 증가시키는 것으로 알려진 코돈으로 변경하는 것일 수 있다. 일부 대안에서, 코돈 선택이 기술되며, 여기서 코돈 선택은 더 높은 수준의 전사 및 단백질 수율을 위해 최적화된 합성 유전자 전사체를 생성하기 위한 이 분야의 기술자에게 알려진 알고리즘을 사용하여 수행된다. 코돈 최적화 알고리즘을 함유하는 프로그램들이 이 분야의 기술자들에게 알려져 있다. 프로그램에는 예를 들어 OptimumGeneTM, GeneGPS® 알고리즘 등이 포함될 수 있다. 추가로, Integrated DNA Technologies 및 다른 상업적으로 이용가능한 DNA 시퀀싱 서비스로부터 합성 코돈 최적화 서열을 상업적으로 얻을 수 있다. 일부 대안에서, 변형 단백질에 대한 유전자가 효모, 예를 들어 피키아에서의 발현을 위해 코돈 최적화되도록 단백질이 제조된다. 일부 대안에서, 단백질 또는 효소가 기술되며, 여기서 단백질 또는 효소의 완전 유전자 전사체에 대한 유전자는 진핵 세포, 예를 들어 효모에서의 발현을 위해 코돈 최적화되고, 이는 효모 퍼옥시좀에서의 변형을 위한 단백질의 농도를 증가시킬 수 있다.
"정제"는 본 명세서에 비추어 볼 때 평범하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어 고도로 정제된 세포, 퍼옥시좀 및 단백질의 단리를 포함할 수 있다. 세포 정제의 방법에서, 세포는 플라스틱 또는 폴리 카보네이트 표면, 비드, 입자, 플레이트 또는 웰과 같은 지지체에 부착된 리간드에 결합하는 능력으로 단리, 분리 또는 선택될 수 있다. 세포는 특정 세포 표면 마커를 기반으로 결합할 수 있으며, 이는 정제를 가능하게 한다. 퍼옥시좀의 경우, 이 분야의 기술자들은 예를 들어 원심분리와 같은 퍼옥시좀 정제 방법을 이해할 것이다. 또한 단백질이 정제될 수 있다. 단백질 정제 방법은 예를 들어 크기 배제 및 친화성 크로마토그래피와 같은 이 분야의 기술자들에게 알려져 있다.
섬유 및 악세서리는 자주 구매하고 가장 자주 교체되는 소비재이다. 게다가, 대부분의 의류는 오래 지속되지 않으며 잦은 교체를 필요로 한다. 의류의 경우, 높은 회전률, 대량 생산 및 에너지-집약적 사용으로 인해 자원 소비 및 온실 가스 배출의 관점에서 중요한 제품 범주이다.
의류 제작과 관련된 문제를 방지하려면, 의류 및 악세서리의 탄소 발자국과 같은 여러 영역을 해결해야 할 것이다. 탄소 발자국은 조직, 사건, 제품 또는 사람으로 인해 발생하는 총 온실 가스 배출 집합으로 설명될 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이 직물 생산과 관련된 탄소 발자국을 낮추는 방법 및 세포가 있다. 예를 들어 의류 품목의 탄소 발자국은 품목의 수명 주기에 걸쳐 배출되는 이산화탄소(CO2) 및 다른 온실 가스의 총량으로, CO2 등가 킬로그램으로 나타낸다. 이는 원자재의 제조, 품목의 제조, 재료 및 완제품의 운송, 포장, 수많은 세탁 및 건조 주기를 포함하는 사용 단계 및 수명-종료 처리에서 생성되는 모든 온실 가스를 포함한다.
다른 물질을 위한 단백질 전구체도 고려된다. 세포에 의해 생산되는 단백질은 필름 개발용 제품; 알약용 캡슐(약물 및 기능식품의 젤라틴); 식품 첨가제(예를 들어 모든 젤라틴 물질) 및 식품용 콜라겐과 같은 여러 물질의 전구체일 수 있으며 합성 육류, 합성 가죽, 미용 제품 및 생물의학 재료(골격, 봉합사, 이식편, 확장 세포, 겔 등)가 고려된다.
높은 탄소 발자국에 관련된 문제를 제거하기 위해, 직물을 생산하기 위한 전구체를 만드는 방법이 기술된다. 본 명세서의 실시형태에 기술된 바와 같이 퍼옥시좀과 같은 세포소기관 내에서 변형 단백질을 만드는 방법이 있다. 퍼옥시좀은 세포 지질 대사에서 역할을 하는 것으로 주로 알려진 흔하고 다기능성인 세포소기관이다. 퍼옥시좀은 정상 기능의 일부로서 산화환원 반응을 촉매할 수 있는 퍼옥시좀 효소를 포함하며, 또한 이 세포소기관은 점차 산화 스트레스-관련 신호전달 경로의 잠재적인 조절자로서 인식되고 있다.
퍼옥시좀 내에서의 처리를 위해, 신호전달 서열에 의해 단백질이 퍼옥시좀으로 이동하도록 지시될 수 있다. 신호전달 서열을 암호화하는 서열은 단백질을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이에 따라 단백질의 번역 후, 단백질은 퍼옥시좀으로 이동하게 된다.
퍼옥시좀은 1965년에 발견된 이후 잘 기술되어 있다(문헌[Sabatini et al.; PNAS August 13, 2013. 110 (33) 13234-13235] 및 문헌[Purdue et al.; Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. 17:701-52]; 이의 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 퍼옥시좀은 DNA와 리보솜이 없는 작은 세포소기관이며 단일 막으로 둘러싸여 있다. 퍼옥시좀 단백질은 핵 유전자에 의해 암호화되고, 세포질의 리보솜 상에서 합성되고, 기존 퍼옥시좀에 혼입된다. 세포의 수명 동안, 퍼옥시좀은 예를 들어 단백질 및 지질의 추가로 확대될 수 있고 결국 나뉘어 새로운 하나의 퍼옥시좀을 형성할 수 있다.
퍼옥시좀의 크기 및 효소 조성은 다양할 수 있다. 그러나, 퍼옥시좀은 분자 산소를 사용하여 다양한 기질을 산화함으로써 과산화수소(H2O2)를 형성하는 효소를 모두 함유할 수 있다. 퍼옥시좀은 H2O2-기반 호흡 및 지방산 β-산화로 알려져 있다. 제한 없이, 퍼옥시좀의 기능은 예를 들어 에테르 지질(플라스말로겐) 합성 및 콜레스테롤 합성, 발아 종자에서의 글리옥실산 회로("글리옥시좀"), 광호흡, 트리파노솜의 해당과정("글리코솜") 및 효모에서 메탄올 및/또는 아민 산화 및 동화를 포함할 수 있다.
퍼옥시좀의 처리를 위해 지시된 단백질은 폴딩된 단백질의 퍼옥시좀 매트릭스로의 진입을 지시하는 C- 및/또는 N-말단 표적화 서열을 가질 수 있다. 번역 및 세포질 리보솜으로부터의 방출 후, 퍼옥시좀을 표적으로 하는 새롭게 합성된 단백질은 세포소기관으로의 진입 전에 세포질에서 성숙한 형태로 폴딩될 수 있다. 폴딩은 또한 샤페론 단백질의 도움으로 이루어질 수 있다. 퍼옥시좀으로의 단백질 진입은 ATP 가수분해를 필요로 하지만, 일부 수송 시스템과 달리, 퍼옥시좀 막을 가로질러 전기화학적 구배는 없다. 수송을 위한 태그는 이전에 기술되었다(Purdue et al.). 일부 실시형태에서, 단백질은 샤페론 단백질의 도움으로 폴딩된다.
퍼옥시좀을 표적으로 하는 일부 단백질에 대한 흡수-표적화 신호는 단백질의 C-말단의 Ser-Lys-Leu 서열(1문자 코드로는 SKL) 또는 관련 서열이다. SKL 신호는 세포질에서 페록신과 같은 가용성 수용체 단백질에 결합할 수 있다. PTS1 및 PTS2와 같이, 여러 종류의 페록신(PTS)이 있다. 생성된 PTS1R-카탈라제 복합체는 수용체 단백질에 결합한다. PTS1의 경우 Pex5p, PTS2의 경우 Pex7p와 같은 이후 표적 단백질이 퍼옥시좀 내부로 수송되는 세포질 수용체가 퍼옥시좀 막에서 확인되었다. SKL 서열은 퍼옥시좀으로의 진입 후 카탈라제로부터 잘리지 않는다.
제한 없이, 매트릭스 단백질은 N-말단 흡수-표적화 서열과 함께 전구체로서 합성될 수 있다. 이러한 유형의 흡수-표적화 신호를 갖는 단백질은, PTS1R과 같이, 전구체 단백질을 퍼옥시좀 막의 Pex14p 수용체로 호송하는 PTS2R이라는 다른 세포질 수용체 단백질에 결합한다. 이러한 단백질의 진입 후, N-말단 표적화 서열은 잘린다. 퍼옥시좀 막 단백질은 또한 유리 폴리리보솜 상에서 합성되고 합성 후 퍼옥시좀으로 혼입된다. 단백질을 퍼옥시좀 막으로 표적화하는 신호는 SKL 서열을 함유하지 않지만, 흡수 과정에 대해서는 거의 알려지지 않았다.
프롤릴 하이드록실화 이외의 다른 변형 또한 퍼옥시좀에서 달성할 수 있다. 예를 들어, 퍼옥시좀 진입 태그로 태깅하는 것을 통해 글리코실전이효소를 퍼옥시좀에 함께 진입시켜 콜라겐과 같은 단백질 기질을 글리코실화할 수 있다. 퍼옥시좀은 변형 효소에 의해 변형하는 기질의 역할을 하는 많은 소분자에 자연적으로 투과성이다. 퍼옥시좀으로 자유롭게 확산될 수 없는 기질은 수송되어야 한다. 수송은 퍼옥시좀 막에 표적화된 막 단백질을 통해, 특이적으로 또는 무차별적으로 이루어질 수 있다.
변형은 또한 퍼옥시좀의 세포질 표면에서 발생할 수 있다. 제한 없이, 이러한 변형은 예를 들어 유비퀴틴화 및 인산화를 포함할 수 있다.
샤페론 단백질 또한 퍼옥시좀 전이를 위해 태깅될 수 있다. 이와 같이, 퍼옥시좀에서 전이된 단백질의 적절한 폴딩을 위해 샤페론이 퍼옥시좀에서 사용될 수 있다.
변형 단백질의 생산을 위한 유전자 변형 세포를 만드는 방법
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하기 위한 세포를 만드는 방법이 제공된다. 세포를 제공하는 단계, 세포에 제1 핵산을 도입하는 단계로서, 제1 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제1 서열을 포함하는, 단계 및 세포에 제2 핵산을 도입하는 단계로서, 제2 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 암호화하는 제2 서열을 포함하는, 단계를 포함할 수 있다. 세포는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 도입은 염화칼슘의 존재 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 도입은 전기천공과 같은 이 분야의 기술자에게 알려진 표준 형질전환 기술로 수행된다.
일부 실시형태에서 세포는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 오가타에아 폴리모파(Ogataea polymorpha)와 같은 효모 세포이다. 파스토리스 세포의 경우, 예를 들어 핵산은 메탄올의 존재 하에서 단백질의 유도를 허용하는 프로모터를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 핵산은 프로모터(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 항시성 또는 유도성이다.
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀-표적화 서열은 서열번호 1(SLK), 서열번호 2(RLXXXXX(H/Q)L) 또는 서열번호 3(LGRGRRSKL)에 기재된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 태그는 절단가능하다. 태그는 퍼옥시좀의 환경 내에서 단백질의 용해성 또는 안정성을 허용하는 태그일 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포에 제3 핵산을 도입하는 단계로서, 제3 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 제2 이종 변형 효소를 암호화하는 제3 서열을 포함하는, 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소는 하이드록실화, 산화, 글리코실 전이 및 이성질체화로부터 선택된 변형의 군으로부터 선택된 변형을 촉매한다.
일부 실시형태에서, 효소는 글리코실 전이효소, 이성질체화효소(예를 들어, 프롤릴 및 이황화), 하이드록실 전이효소(예를 들어, 프롤릴 하이드록실화효소 및 리실 산화효소)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 효소는 글리코실 전이효소, 이성질체화효소, 프롤릴 이성질체화효소, 하이드록실 전이효소 또는 프롤릴 하이드록실화효소로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 단백질은 콜라겐, 젤라틴 또는 실크 단백질을 포함한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 세포는 퍼옥시좀 내 전이를 위해 태깅된 단백질 및 효소를 암호화하는 핵산을 포함한다. 번역 후, C-말단 또는 N-말단 태그는 이들이 추가로 처리되는 퍼옥시좀으로의 단백질 및 효소의 전이 신호를 보낸다.
세포
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하기 위한 진핵 세포는 본 명세서에 기술된 임의의 하나의 실시형태의 방법으로 제조된다. 일부 실시형태에서, 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 암호화하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 변형 단백질을 생산하기 위한 퍼옥시좀을 포함하며, 여기서 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 변형 단백질을 생산하기 위한 퍼옥시좀을 포함하며, 여기서 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함한다(도 1 참조).
일부 실시형태에서, 변형 단백질을 생산하기 위한 퍼옥시좀을 포함하는 진핵 세포로서, 퍼옥시좀은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 포함하는, 진핵 세포가 제공된다.
일부 실시형태에서, 단백질은 퍼옥시좀에서 변형된다. 일부 실시형태에서, 세포는 파스토리스이다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀-표적화 서열은 서열번호 1, 2 또는 3에 기재된 서열을 포함한다. 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 제2 단백질을 암호화하는 제3 핵산을 더 포함한다.
세포는 표준 발효 액체 배지에서 발효를 위해 사용될 수 있다. 이 분야의 기술자들은 단백질 생산을 위해 세포를 성장시키는 표준 방법을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 발효는 유도제 또는 메탄올의 존재 하에서 수행될 수 있다.
대량의 단백질이 대규모 생산에서 요구되는 일부 실시형태에서, 세포는 발효기에서 성장된다. 사카로마이세스 세레비지에, 피키아 파스토리스 및 오가타에아 폴리모파의 이점은 이들이 풍부한 성장률로 성장할 수 있다는 것이다. 발효기는 pH 조절, 산소 제한, 영양 제한 및 온도 변동에 따른 제한을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 발효기는 교반을 증가시킬 뿐만 아니라 기류를 증가시키고, 기류에 순수 산소를 보충하여 기류를 증가시켜 용존 산소(DO) 수준을 높이는 것이 가능하다. 또한 고갈되는 영양소를 보충할 수 있는 속도로 신선한 배지 또는 성장 제한 영양소가 용기에 펌핑되는 "공급 모드"에서 발효기가 작동될 수 있기 때문에, 영양 제한을 최소화할 수 있다. 또한 발효기는 메탄올의 존재에 대해 세포를 길들이기 위해 메탄올 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 독성을 유발할 수 있는 과도한 메탄올의 추가를 방지하면서 단백질 합성을 위해 충분한 메탄올의 추가가 허용되는 적절한 속도로 메탄올을 제공할 수 있다.
변형 단백질을 생산하는 방법
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법으로, 진핵 세포가 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현하는, 방법이 제공된다. 방법은 본 명세서의 임의의 하나의 실시형태의 방법으로 제조된 세포 또는 본 명세서의 임의의 하나의 실시형태의 세포를 제공하는 단계, 진핵 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 단계로서, 이종 단백질은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된, 단계 및 이종 변형 효소가 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하도록 하는 조건 하에서 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법으로서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현하는, 방법이 제공된다. 방법은 진핵 세포에서 이종 단백질을 발현하는 단계로서, 이종 단백질은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된, 단계 및 이종 변형 효소가 퍼옥시좀에서 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하도록 하는 조건 하에서 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형 단백질을 생산하는 방법을 포함하는 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 다음 단계를 포함한다: 변형 단백질이 생산되도록 하는 조건 하에서 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포를 배양하는 단계로서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현하고, 이종 변형 효소는 이종 단백질을 변형하여 배양 조건 하에서 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는, 단계.
일부 실시형태에서, 변형 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 포함하는 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 사카로마이세스 세레비지에, 피키아 파스토리스 또는 오가타에아 폴리모파로부터의 것이다. 방법은 변형 단백질이 생산되도록 하는 조건 하에서 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포를 배양하는 단계로서, 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현하고, 이종 단백질의 발현은 프로모터의 영향 하에서 이루어지고, 이종 변형 효소는 이종 단백질을 변형하여 배양 조건 하에서 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는, 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 화학유도제의 추가로 이종 단백질의 생산을 유도하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 단계로서, 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 것은 진핵 세포에 올레산 또는 메탄올을 제공하여 수행되는, 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 핵산으로 형질전환된다(예를 들어, 도 2 참조). 일부 실시형태에서, 형질전환 세포를 발효시킨다. 일부 실시형태에서, 전이가 뒤따르는, 발효 및 번역을 위한 단백질 유도 후, 세포가 수확된다. 세포는 일부 실시형태에서 원심분리된다.
일부 실시형태에서, 세포가 용해를 위해 준비된다. 균질기가 효모 세포의 파쇄에 사용될 수 있다. 균질기는 세포 현탁액에 압력을 가하고 갑자기 압력을 해제하여 세포를 용해할 수 있다. 이것은 세포를 용해할 수 있는 액체 전단을 생성한다. 구형 균질기, 프렌치 프레스 및 만톤-가울린 균질기에서의 전형적인 작동 압력은 6000 내지 10,000psi이다. 합리적인 정도의 용해를 달성하려면 여러 번(적어도 3번)의 통과가 필요하다. 하지만 높은 작동 압력은 작동 온도의 상승을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 사용하기 전에 압축 세포를 냉각(4℃)한다. 온도 조절에 더해, 일부 실시형태에서 발포에 의한 단백질의 불활성화를 피하기 위해 주의를 기울여야 한다. 따라서, 압력을 증가시키면서 적용할 수 있다. 또한 일부 실시형태에서 용해는 단백질 분해효소 저해제의 존재 하에서 이루어져야 한다.
현대식 균질기는 더 높은 압력에서 작동할 수 있기 때문에 효소 세포를 용해시키기에 보다 적합하다. 예를 들어, 30,000psi(200MPa)에서 피키아 파스토리스 세포를 용해시키기 위해 Avestin Emulsiflex-C5가 사용될 수 있다.
또한 유리 비드(0.4 내지 0.5㎜)와 함께 교반하여 효모 세포를 파쇄하는 세포 용해를 위해 유리 비드 볼텍싱이 사용될 수 있다. 여러 번의 교반(30 내지 60초)은 세포 현탁액의 과열을 피하기 위해 얼음에서 냉각시키는 주기가 사이에 배치되어야 한다. 파손은 가변적이지만, 50%를 넘길 수 있다(최대 95%). 위의 방법은 소량(최대 15㎖)에 대해 기술되었지만 특수 장치를 사용하여 수 리터까지 규모를 키울 수 있다.
또한 세포를 용해시키기 위해 효소적 용해가 사용될 수 있다. 효모 세포의 효소적 용해는 가장 널리 사용되는 자이몰라제(zymolase) 및 라이티카제(lyticase)와 같은 여러 효소에 의한 세포벽의 소화를 기반으로 한다.
일부 실시형태에서, 용해 후, 상등액을 스핀다운시키고 또한 미립자 물질을 제거하기 위해 여과할 수 있다. 퍼옥시좀의 정제는 이 분야의 기술자들에게 알려져 있으며 원심분리기에서 구배에 의해 수행될 수 있다. 또한 퍼옥시좀은 상업적 키트(예를 들어 Sigma Aldrich의 Peroxisome Isolation Kit)로 단리될 수 있다.
퍼옥시좀의 용해 후, 관심있는 단백질을 위해 용해물을 정제할 수 있다. 대량 정제 후, 단백질을 용해된 퍼옥시좀으로부터 분리할 수 있다. 정제 기술은 이 분야의 기술자들에게 알려져 있다. 단백질의 유형 및 특성에 따라, 다른 유형의 정제 기술이 고려될 수 있다. 제한 없이 침전으로 단백질을 단리하기 위해 황산암모늄 침전과 같은 단계가 취해질 수 있다. 또한 시료 내 서로 다른 크기의 분자를 분리하기 위해 수크로스 구배 원심분리가 사용될 수 있다. 단백질의 리폴딩 방법이 알려진 경우 크기 배제 크로마토그래피가 비-변성 또는 변성 조건에서 주로 사용된다. 또한 전하 또는 소수성을 기반으로 단백질을 분리할 수 있다. 또한 단백질이 태깅된 경우, 친화성 크로마토그래피 또는 컬럼 또는 수지에 고정화하여 단백질을 분리할 수 있다.
예를 들어 질량분석법으로 관심있는 단백질의 변형에 대해 분석할 수 있다. 또한 효소와 같은 단백질은 활성 분석법으로 분석할 수 있다.
또한 퍼옥시좀의 전이에 대해 단백질의 유형을 분석할 수 있다. 안정성을 위해 단백질을 조작하는 방법이 이 분야의 기술자들에게 알려져 있다. 제한 없이, 이는 단백질의 pH를 인공적으로 변화시키기 위해 절단가능한 태그를 부착하는 것 또는 퍼옥시좀으로 전이될 단백질의 pH를 인공적으로 변화시키기 위해 몇몇 돌연변이를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
고려될 수 있는 다른 태그는 단백질 또는 이의 도메인으로 전이되는 것으로 알려진 단백질의 태그이다. 문헌[Purdue et al.]에 기술된, 공통 서열 XX(K/R)(K/R)X(3-7)(T/S)XX(D/E)X(서열번호 4)로서, X는 임의의 아미노산이고, X(3-7)은 지시된 위치에서 임의의 아미노산 중 3 내지 7개의 아미노산 범위를 나타내는, 서열은 퍼옥시좀에서 단백질의 전이 또는 안정성을 허용할 수 있는 퍼옥시좀 단백질에 보존된 서열이다.
본 명세서에 기술된 방법, 세포 또는 조성물의 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀 표적화 서열에 융합된 이종 단백질과 같은 단백질은 진핵 세포 또는 효모 세포와 같은 세포 내 퍼옥시좀에 국소화된다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀 표적화 서열에 융합된 변형 효소와 같은 효소는 진핵 세포 또는 효모 세포와 같은 세포의 퍼옥시좀에 국소화되거나 퍼옥시좀 표적화 서열에 융합된 이종 단백질과 함께 국소화된다. 일부 실시형태에서, 단백질 및/또는 효소는 PTS1 또는 ePTS1과 같은 퍼옥시좀 표적화 신호에 융합된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 ePTS1은 퍼옥시좀 표적화 서열이다. ePTS1 태그 및 ePTS1 태그를 암호화하는 핵산 서열의 예시는 서열번호 3(LGRGRRSKL) 및 서열번호 12(TTGGGAAGAGGTAGAAGATCCAAATTG)에 제공된다.
다양한 단백질 및 효소가 퍼옥시좀 표적화 서열을 사용하여 퍼옥시좀으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 25, 25 내지 50, 50 내지 75, 75 내지 100kDa, 100 내지 200kDa 또는 200 내지 300kDa, 또는 더 높은, 또는 전술된 kDa 범위 중 임의의 것을 포함하는 값의 범위의 분자량을 갖는 단백질 및 효소가 퍼옥시좀 표적화 서열로 퍼옥시좀에 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 퍼옥시좀으로 표적화될 단백질 및/또는 효소를 암호화하고 퍼옥시좀 표적화 서열을 암호화하는 서열을 갖는 핵산이 퍼옥시좀을 포함하는 세포로 전달되고, 세포는 단백질 및/또는 효소를 번역하고 퍼옥시좀으로 이들을 수송한다. 퍼옥시좀으로 표적화될 수 있는 단백질 및 효소의 추가적인 예시에는 구조 단백질, 콜라겐, 키나제, 포스파타제, 하이드록실화효소, 이성질체화효소, 절단 효소, 형광 단백질 및 호르몬이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적화될 단백질 및/또는 효소는 형광성 태그(예를 들어, GFP, YFP 또는 CFP), 플래그 태그(예를 들어 DYKDDDDK, 여기서 D=아스파트산, Y=타이로신 및 K=라이신, 서열번호 5) 또는 히스티딘 태그(예를 들어, His-His-His-His-His-His, 서열번호 6)와 같은 태그를 포함한다. 이러한 태그는, 제한 없이, 단백질 및/또는 효소의 정제 및/또는 위치 확인을 위해 사용될 수 있다. 정제 기술은 태그(들)를 사용하여 단백질 및/또는 효소를 정제하기 위한 친화성 정제 또는 니켈 칼럼과 같은 이온 칼럼의 사용을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 다른 태그에는 칼모듈린(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL, 서열번호 7), HA(YPYDVPDYA, 서열번호 8), Myc(EQKLISEEDL, 서열번호 9), SBP(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP, 서열번호 10) 및/또는 Strp(WSHPQFEK, 서열번호 11) 태그가 포함된다.
GFP 태그의 예시가 서열번호 13(MRKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK)에 제공된다. 일부 실시형태는 서열번호 14(ATGCGTAAAGGCGAAGAGCTGTTCACTGGTGTCGTCCCTATTCTGGTGGAACTGGATGGTGATGTCAACGGTCATAAGTTTTCCGTGCGTGGCGAGGGTGAAGGTGACGCAACTAATGGTAAACTGACGCTGAAGTTCATCTGTACTACTGGTAAACTGCCGGTTCCTTGGCCGACTCTGGTAACGACGCTGACTTATGGTGTTCAGTGCTTTGCTCGTTATCCGGACCATATGAAGCAGCATGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCGGAAGGCTATGTGCAGGAACGCACGATTTCCTTTAAGGATGACGGCACGTACAAAACGCGTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTAAACCGCATTGAGCTGAAAGGCATTGACTTTAAAGAGGACGGCAATATCCTGGGCCATAAGCTGGAATACAATTTTAACAGCCACAATGTTTACATCACCGCCGATAAACAAAAAAATGGCATTAAAGCGAATTTTAAAATTCGCCACAACGTGGAGGATGGCAGCGTGCAGCTGGCTGATCACTACCAGCAAAACACTCCAATCGGTGATGGTCCTGTTCTGCTGCCAGACAATCACTATCTGAGCACGCAAAGCGTTCTGTCTAAAGATCCGAACGAGAAACGCGATCATATGGTTCTGCTGGAGTTCGTAACCGCAGCGGGCATCACGCATGGTATGGATGAACTGTACAAA)의 핵산 서열 또는 이의 단편과 같은 GFP 태그를 암호화하는 핵산을 포함한다.
실시예
아래에서 논의된 실시예는 순수하게 발명의 예시적인 것으로 의도되며 어떤 식으로든 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 실시예는 아래의 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만 일부 실험적 오류 및 편차가 고려되어야 할 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.
실시예 1: 다수의 효모 숙주에서 콜라겐 변이체 또는 P4HB의 퍼옥시좀으로의 국소화
GFP-x-ePTS1 작제물을 생산하였으며, 이때 GFP는 국소화의 가시화를 위해 포함되었고, ePTS1은 퍼옥시좀으로의 표적화를 위해 포함되었고, x는 관심있는 단백질이다. 관심있는 단백질의 비-제한적 예시에는 합성 콜라겐 펩타이드 COLsyn1a, COLsyn2, COLsyn3, COLsyn4, COLsyn5 및 COLsyn6, 및 단백질 이황화-이성질체화효소 P4HB가 포함된다(표 1 참조). 일부 실시형태에서, P4HB는 BantP4HB, ApmiP4HB, BtauP4HA1, BtauP4HB, BtP4HB 또는 GFP-B5P4HB-ePTS1, 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 이들 관심있는 단백질을 암호화하는 핵산은 별도의 작제물에 포함되었다. 각각의 관심있는 단백질을 갖는 펩타이드를 생성한 작제물을 세포에서 형광 초점으로서 가시화된 야생형(WT) 사카로마이세스 세레비지에 균주의 퍼옥시좀에 도입하였다(도 3). 퍼옥시좀 도입 수용체(pex5Δ)가 없는 균주에서, 확산 세포질 국소화만 보였다. 이러한 결과는 일부 실시형태에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼옥시좀 표적화 펩타이드가 효모 세포와 같은 세포에서 퍼옥시좀으로 단백질 또는 효소를 표적화기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 관심있는 단백질의 다른 비-제한 예시 및 암호화 뉴클레오타이드 서열의 일부 예시가 표 1에 나타나 있다. 일부 실시형태에서, 관심있는 단백질 또는 암호화 핵산은 서열번호 15 내지 70 중에서 임의의 하나 이상과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 또는 전술된 백분율 중 임의의 둘로 정의되는 범위와 동일한 아미노산 또는 핵산 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 실시형태는 퍼옥시좀으로 표적화될 수 있는 다수의 관심있는 단백질을 포함한다.
다양한 콜라겐 변이체가 여러 산업용 효모 숙주에서 국소화되는 것으로 관찰되었다(도 4). 전장 콜라겐의 비-제한 예시에는 AmCOL1A1, AmCOL1A2, BtCOL1A1, BtCOL1A2 및 이의 단편이 포함된다. 더 작은 콜라겐 단편의 비-제한 예시에는 COLsyn1, COLsyn2, COLsyn3, COLsyn4, COLsyn, COLsyn5 및 COLsyn6, BtCol1A1 403-11P 및 BtCol1A1 403-0P가 포함된다. 도 4는 3종의 다른 산업용 효모 숙주 PBH001, PBH002, PBH004에서 GFP-콜라겐 변이체의 ePTS1-의존적 형광 국소화를 보여준다. 일반적인 산업용 효모 숙주에는 아르술라, 칸디다, 한세눌라, 클루이베로마이세스, 코마가탤라, 오가타에아, 피키아, 사카로마이세스 또는 야로위아가 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
퍼옥시좀에 국소화되는 것으로 관찰된 단백질의 크기는 31kDa(GFP-COLSyn1) 내지 195kDa(BtCol1A2)의 범위이다. 따라서, 상당한 범위 크기의 단백질을 퍼옥시좀에 도입할 수 있다.
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실시예 2: 독성 화합물로부터의 보호
일부 실시형태에서, 단백질 및/또는 효소를 퍼옥시좀에 표적화하는 것은 다른 효소 또는 기질로부터 물리적으로 분리함으로써 구획화한다. 이것은 분리된 단백질(들), 효소(들) 및/또는 기질(들) 사이의 상호작용 또는 활성을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, SigD와 같은 독성적 또는 저해성 단백질이 구획화될 수 있다.
효소를 기질로부터 물리적으로 분리하기 위한 퍼옥시좀 구획화는 기질 상의 활성을 방지하기 위해 일부 실시형태에서 사용된다. 활성을 구획화하는 능력을 설명하자면, 퍼옥시좀에 독성 단백질을 격리함으로써 독성 단백질이 발현될 때 세포 생존력이 구제된다.
병원성 세균 살모넬라(Salmonella)는 장의 점막을 침범하여 위장염을 일으키는 일반적인 원인이다. 살모넬라에 의해 분비되는 병원성 인자 중 하나가 사카로마이세스 세레비지에에서 발현될 때 심각한 성장 저해를 유발하는 것이 입증된 이노시톨 포스파타제로 추정되는 SigD이다. 독성은 포스파타제 도메인이 없지만 효모 및 인간 세포 모두에서 엑틴 세포골격의 구성에 영향을 미치는 SigD N-말단 도메인(SigD1-351)과 연결된다(doi:10.1111/j.1462-5822.2005.00568.x).
퍼옥시좀 구획화에 의해 SigD1-351이 세포질 엑틴 세포골격 기질에 접근하는 것을 제거함으로써, 사카로마이세스 세레비지에는 SigD 저해 성장 효과로부터 보호될 수 있다.
도 5는 독성 단백질 SigD1-351이 퍼옥시좀에 격리될 때 숙주 사카로마이세스 세레비지에가 보호되는 것을 입증하는 예시이다. 유도성 GAL 프로모터의 조절 하에서 SigD1-351-eTPS1 또는 SigD1-351과 통합된 균주를 YPD 플레이트 상에서 연속 희석하여 발현을 억제하거나 YPGalactose 플레이트 상에서 연속 희석하여 발현을 유도하였다. 억제된 경우, 두 균주 모두 동등하게 잘 자랐다. 발현이 유도된 경우, 퍼옥시좀 국소화 독소(SigD1-351-eTPS1)를 갖는 균주는 성장할 수 있었지만 세포질에 발현된 독소(SigD1-351)는 숙주에 치명적이었다.
실시예는 다음의 설계를 포함한다: 독성 SigD 발현을 조절하기 위한 유도성 GAL 프로모터를 갖는 발현 카세트의 사용, 효모 세포로 형질전환된 별도의 발현 카세트에서 SigD의 독성(SigD1-351) 및 비-독성 변이체(SigD1-351(118-142Δ))의 발현, 발현 카세트에 의한 융합 단백질 GFP-x-ePTS1의 생산으로서, 여기서 x는 독성 또는 비-독성 SigD 변이체인, 융합 단백질 GFP-x-ePTS1의 생산 및 다음 균주 배경 중 하나로 별도의 효모 세포군 각각의 형질전환: PEX5(퍼옥시좀 도입) 및 pex5Δ(퍼옥시좀 도입이 없음). 본 실시예에서, 다음의 실험 기술이 수행된다: 포도당(억제) 및 갈락토스(유도) 플레이트 상에서 세포를 연속 희석하여 성장 결함을 보여주고, GFP 형광으로 국소화를 입증함.
실시예 3: 퍼옥시좀에서의 번역-후 변형을 수행하기 위한 효소 및 기질의 공동-국소화
다양한 종류의 번역-후 변형(PTM)이 퍼옥시좀에서 발생하는 것으로 입증될 수 있다. 효소와 이의 기질 또는 단백질 기질을 퍼옥시좀 장벽으로 분리하는 것이 일부 실시형태에서 기질에 대한 효소의 활성을 방지하기 위해 사용된다. 따라서, 기질 또는 효소의 격리가 사용될 수 있다. 예를 들어, 이것은 퍼옥시좀-격리 단백질로부터 세포 내용물을 보호하거나 그 반대의 경우의 예시일 수 있다.
일부 실시형태에서, 또 다른 단백질의 번역-후 변형(PTM)을 수행하는 변형 효소가 세포의 퍼옥시좀에 다른 단백질과 함께 공동-국소화된다. PTM의 예시로는 글리코실화(또는 다른 당 부가), 이성질체화, 절단, 단백질분해효소 절단, 단백질가수분해성 분해, 하이드록실화, 단백질가수분해, 인산화, 탈인산화, 유비퀴틴화(및 유비퀴틴-유사 변형 유사 네딜화(neddylation), 수모화(sumoylation)), 메틸화, 니트로실화, 아세틸화 및 지질화(GPI 고정, 프레닐화, 미리스토일화(myristolation) 포함)가 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 다른 PTM 반응도 고려된다. 일부 실시형태에서, 효소, 효소의 보조인자 및 효소의 기질이 세포질 및/또는 퍼옥시좀으로 공동-국소화된다.
일부 실시형태에서, 효소, 효소의 보조인자 및 효소의 기질이 세포질 및/또는 퍼옥시좀으로 공동-국소화된다. 이것은 효소와 기질이 같은 영역에 공동-국소화될 때 변형이 발생한다는 것을 입증하기 위해 일부 실시형태에서 사용된다. 따라서, 공동-국소화는 PTM과 같은 변형을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 적합한 PTM의 예시로는 단백질분해효소 절단, 인산화, 탈인산화, 하이드록실화, 이성질체화, 글리코실화 및 프레닐화가 포함된다. 일부 실시형태에서, 단백질분해효소 절단, 인산화 및 탈인산화 중 하나 이상이 바람직한 PTM이다.
도 8은 사카로마이세스 세레비지에에서 하이드록실화효소(BantP4H) 및 콜라겐 기질(AmisCOL1A1 또는 Amis COL1A2)의 생체 내 공동-국소화를 입증한다. BantP4H는 형광 현미경으로 국소화를 모니터하기 위한 GFP 융합 태그와 함께 mRuby 융합 태그 및 콜라겐 기질을 함유한다. ePTS1 퍼옥시좀 국소화 신호로 형광 초점이 관찰되며 병합된 이미지는 하이드록실화효소와 콜라겐의 국소화가 겹치는 것을 보여준다. mRuby를 갖는 예시적 서열로는 예를 들어 서열번호 51 내지 52가 포함될 수 있다.
실시예 4: 단백질 가수 분해
일부 실시형태에서, 펩타이드 절단이 퍼옥시좀에서 발생할 수 있음을 보여주기 위해 TEV 단백질분해효소가 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 절단은 단백질분해효소와 기질이 같은 세포하 구획(예를 들어 세포질 또는 퍼옥시좀)에 존재할 때만 발생할 수 있다. TEV 단백질분해효소가 퍼옥시좀에 격리되어 세포질에서 표적을 자를 수 없음을 보여주는 예시는 세포질 내 다른 잠재적인 표적 또한 TEV-절단의 대상이 되지 않고 그러므로 퍼옥시좀 구획화 효소로부터 보호된다는 것을 보여준다. 일부 실시형태에서, 발현된 단백질/효소가 세포에 독성인 경우, 퍼옥시좀 구획화를 통해 이를 세포 기질로부터 분리하는 것은 단백질/효소로부터 세포를 보호하는 것을 제공한다. 기질/단백질이 퍼옥시좀에 격리되어 세포질의 TEV 단백질분해효소에 의해 잘릴 수 없다는 예시는 기질이 세포질 내 다른 효소의 대상이 되지 않으므로 기질/단백질이 단백질가수분해성 분해와 같은 세포로부터의 원치않는 변형으로부터 보호된다는 것을 시사한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 일부 단백질의 선택적인 표적화는 일부 단백질의 원하는 변형을 초래하면서 다른 단백질은 그렇게 되지 않고/않거나 원치않는 변형을 방지한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 세레비지에에서, TEV 단백질분해효소와 절단을 위한 TEV 인식 부위(TEVrs)를 함유하는 기질이 강력한 프로모터에 의해 발현되어야 한다. YFP 또는 REP와의 융합은 현미경으로 세포질 또는 퍼옥시좀에 국소화되는 것을 입증할 것이다. 기질(YFP-TEVrs-IGF2-FLAG)의 단백질가수분해는 웨스턴 블롯으로 분석될 것이다.
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀으로 표적화될 수 있는 다른 변형 단백질분해효소로는 매트릭스 금속단백질분해효소 MMP-1, MMP-2, MMP-8, MMP-13 및 MMP-14; N-단백질분해효소 ADAMTS-2, ADAMTS-3, ADAMTS-14; 및 C-단백질분해효소 BMP-1, mTLS 및 TLL-1이 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀으로 표적화되는 단백질은 TEV-절단가능 태그를 함유한다. 예를 들어, 절단가능 태그를 갖는 단백질의 예시는 BtCol1A2-TEV-GFP-HIS-ePTS1(서열번호 64)이며, 여기서 전장 소 1형 콜라겐 알파 2 단백질은 TEV 단백질분해효소에 의해 퍼옥시좀 국소화, 가시화 및 정제를 위해 사용될 수 있는 N-말단 태그로부터 분리될 수 있다. 추가 예시로는 임의의 태그 서열, 표적화 서열, 도메인 또는 단편, 또는 이의 유사체와 조합된 본 명세서에 개시된 임의의 단백질 서열이 포함될 수 있다. 이러한 서열의 예시로는 예를 들어 서열번호 57 내지 68이 포함될 수 있다.
TEV 단백질분해효소는 담배 식각 바이러스(TEV)의 서열 특이적 시스테인 단백질분해효소이다. 이종 효소 활성이 퍼옥시좀에서 달성될 수 있음을 보여주는 예시에서, TEV 단백질분해효소를 퍼옥시좀으로의 국소화를 지시하는 N-말단 ePTS1 신호 서열과 함께 사카로마이세스 세레비지에에서 발현시켰다. TEV 활성을 시험하기 위한 기질은 TEV 인식 아미노산 서열 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser의 양 옆에 N-말단 RFP 및 C-말단 YFP를 배치하여 생성하였다. 이 기질을 ePTS1 서열과 함께(도 6의 패널 A) 또는 이 서열없이(도 6의 패널 B) 발현시켰다. TEV 단백질분해효소와 기질이 모두 발현되어 퍼옥시좀에 공동-국소화되었을 때, 웨스턴 블롯 상에서 54kDa의 전체 크기 기질 밴드가 사라지고 27kDa RFP 절단 산물이 나타난 것으로 입증된 바와 같이 기질은 완전히 잘렸다(도 6의 패널 A의 1, 2 및 5번 레인). 그러나, TEV 단백질분해효소의 발현이 억제되었을 때, 퍼옥시좀-국소화 기질은 잘리지 않은 채로 남았다(도 6의 패널 A의 3 및 4번 레인). 대조군으로서, 기질은 세포질에서 발현시켰으나 TEV 단백질분해효소는 퍼옥시좀으로 표적화하였다. 다양한 양의 기질 절단이 관찰되었고 TEV 단백질분해효소의 발현을 구동하는 프로모터의 강도 pRPL18B < pTEF1 < pGAL1과 직접적인 상호관련성이 있었다(도 6의 패널 B의 1, 2 및 5번 레인). 이러한 결과는 TEV 단백질분해효소가 퍼옥시좀으로 도입되었지만 기질에 접근하는 것은 높은 발현에 의존하였기 때문에 TEV 단백질분해효소가 세포질에서 여전히 활성이 있음을 시사한다. 상대적으로, TEV 단백질분해효소의 발현 수준의 차이에도 불구하고 기질과 단백질분해효소가 퍼옥시좀에 공동-국소화될 때 TEV 절단 활성은 완료되었으며 이는 공동-구획화 또한 기질 변형 효율을 개선할 수 있는 방법이라는 예시를 보여준다.
실시예 5: 인산화 및 탈인산화
일부 실시형태에서, 특이적 인산화효소(세린/트레오닌 인산화효소 또는 타이로신 인산화효소) 및/또는 포스파타제 및 이들의 기질의 공동-발현이 확인된다. 예를 들어, MEK 및 이의 기질 MAPK1은 MEK가 MAPK1을 인산화하는 퍼옥시좀으로 MEK 및 MAPK1를 표적화하는 퍼옥시좀-표적화 펩타이드와 MEK 및 MAPK1의 융합 펩타이드를 생산하기 위한 핵산에 또는 별도의 핵산에 암호화될 수 있다. 또한, 추가 효소 및 기질, 예를 들어 Raf-1이 추가될 수 있다.
실시예 6: 하이드록실화
일부 실시형태에서, 퍼옥시좀에서 P4H 이산소화효소에 의한 콜라겐의 하이드록실화를 보여준다. 예를 들어, 소 P4H 서브유닛을 사용하는 설계를 사용할 수 있다. 대안적으로, 단일 세균성 P4H(바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 미미바이러스(mimivirus))가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지에 아스코르브산 및/또는 알파-케토글루타르산염 및 철(II)을 보충하며, 보조인자 및/또는 보충물이 퍼옥시좀에 들어갈 수 있는 경우 거기서 특이적 화학적 변형이 발생할 수 있음이 입증된다. 이러한 경우, 산화에 대해 질량-분광법으로 콜라겐을 분석한다. 일부 실시형태에서, 효소 활성을 추가 입증하기 위한 시험관내 분석을 사용한다.
이종 하이드록실화 활성이 생체 내 퍼옥시좀에서 달성될 수 있음을 입증하기 위해, 프롤릴-4-하이드록실화효소(P4H) 및 콜라겐 기질을 사카로마이세스 세레비지에에서 공동-발현시켰다. 바실러스 안트라시스의 P4H 효소가 합성 콜라겐-유사 펩타이드를 하이드록실화한다는 것이 이전에 시험관 내에서 입증되었으며(Schnicker and Dey, 2016) 이를 세포질(BantP4H) 또는 퍼옥시좀(BantP4H-ePTS1)에서 발현시켰다. 콜라겐 헬릭스는 GXY의 반복으로 이루어지며, 여기서 G는 글라이신, X는 임의의 아미노산이지만 종종 프롤린이고, Y는 임의의 아미노산이지만 종종 프롤린이다. Y 위치의 프롤린은 나선형 안정성을 위해 바람직하게는 하이드록실화된다(Gorres and Raines, 2010). 본 연구를 위해 설계된 기질은 11번 Y-위치 프롤린을 함유하는 소 1형 콜라겐 알파 1(BtCol1A1 403-11P)의 나선형 영역의 99개 아미노산 단편이었다. Y-위치 프롤린 하이드록실화에 대한 대조군으로, 11번 프롤린을 알라닌 또는 발린으로 돌연변이시켰다(BtCol1A1 403-0P). 이들 기질을 생체 내 국소화 모니터(도 8 참조) 및 정제를 위한 N-말단 GFP 및 C-말단 ePTS1 퍼옥시좀-국소화 서열과 함께 발현시켰다.
BantP4H 효소와 콜라겐 기질의 조합을 발현하는 세포(도 7의 패널 A)를 칸막이형 진탕 플라스크의 YPD에서 초기 대수증식기까지 30℃에서 배양한 다음 수확하였다. 세포 용해 후, 기질을 GFP-Trap 비드 상에서 정제하고, 10% PAGE 겔 상에서 전기영동하고, 쿠마시 블루로 염색하고, 겔에서 잘라내고, 프롤린 잔기의 산화에 대한 LCMSMS 분석을 위해 MS Bioworks에 보냈다.
질량 분광법 결과 퍼옥시좀에서 공동-발현될 때 콜라겐 기질의 세 부위에서 BantP4H-특이적 산화가 나타났다. PB000225, PB000254 및 PB000255 균주에서, BtCol1A1 403-11P_ePTS1 기질은 P264 위치 Y-위치 프롤린이 산화되었다. BtCol1A1 403-0P_ePTS1 대조군 기질에서 대응하는 위치는 알라닌으로 돌연변이(A264)되었고 산화가 관찰되지 않았다(도 7의 패널 B). P264에서 확인된 변형을 자세히 검토하면, PB000225(총 38개 중 1개가 변형됨) 및 PB000225(총 42개 중 2개가 변형됨) 균주에서 각각 2.6% 및 4.8%인 것에 비교하여 BantP4H가 퍼옥시좀에 공동-국소화된 PB000254 균주(총 33개 중 4개 변형됨)에서 이 위치에 12.1% 산화가 있다. 유사하게, 두 개의 추가 Y-위치 프롤린 P300 및 P324에서의 산화가 PB000254 균주에서만 관찰되었고 다른 5가지의 균주에서는 관찰되지 않았다(도 7의 패널 C). 종합하면, 이러한 결과는 효소와 기질 모두가 퍼옥시좀에 공동-국소화되면 콜라겐 기질 상의 3개의 Y-위치 프롤린이 Bant-P4H에 의해 특이적으로 하이드록실화된다는 것을 보여준다. 403-0P-ePTS1 또는 403-11P-ePTS1을 갖는 예시적 서열로는 예를 들어 서열번호 53 내지 56 및 65 내지 68이 포함된다.
실시예 7: 효모 퍼옥시좀에서 콜라겐의 발현
퍼옥시좀 표적화 태그를 통해 콜라겐 단백질이 퍼옥시좀에 도입된다. 퍼옥시좀 표적화 태그를 사용하여 프롤릴 하이드록실화효소 및 프롤릴 이성질체화효소를 유사하게 퍼옥시좀에 도입한다. 퍼옥시좀에서 프롤릴 하이드록실화효소를 콜라겐과 공동-배양하면 적절한 3중 나선 구조를 형성할 수 있다. I형 이종삼량체, 1형 알파 동종삼량체 및 III형 동종삼량체 콜라겐 모두를 기술된 방식으로 생산한다. I형 콜라겐의 경우, 전장 Col1A1(프로-알파1 사슬) 및 Col1A2(프로-알파2 사슬)뿐만 아니라 Col1A1(알파1 사슬) 및 Col1A2(알파2 사슬)의 발현 개선을 위한 문헌[Olsen et al (2001)]에서 보여주는 텔로단백질(teloprotein)을 단리하기 위한 N- 및 C-말단의 절단물을 사카로마이세스 세레비지에에서 발현시킨다. 유사하게, 프롤릴-4-하이드록실화효소를 전장으로 뿐만 아니라 발현 개선을 위한 PDI 도메인(Toman 2000)의 절단물로 발현시키고 퍼옥시좀에 도입한다.
실시예 8: 퍼옥시좀의 화물 증가시키기
임의의 다양한 통상의 프로토콜을 사용하여 발효기에서 효모를 배양한다. 유도를 통해 퍼옥시좀 용량을 증가시킬 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에의 경우, 올레산염의 사용을 통한 것일 수 있고, 피키아 파스토리스 및 오가타에아 폴리모프의 경우 메탄올의 사용을 통한 것일 수 있다. 구획화 및 정제하려는 단백질을 퍼옥시좀-표적화 태그 PTS1, PTS2 또는 이들 태그의 강화 버전으로 태깅한다. 발효-후, 프렌치 프레스 또는 라이티카제(lyticase)를 사용한 세포벽 소화 후 균질화하는 것과 같은 많은 통상적인 용해 방법을 사용하여 효모 세포의 원형질막을 용해할 수 있다. 핵, 원형질막 및 다른 세포 잔해를 제거하기 위해 저속 원심분리를 사용한다. 밀도 구배 원심분리와 같은 다른 방법으로 생성된 상등액으로부터 퍼옥시좀을 추가 정제할 수 있다. 퍼옥시좀 정제의 대안적인 방법은 친화성 정제를 위한 스트렙타비딘 또는 폴리히스티딘 펩타이드와 같은 친화성 태그로 퍼옥시좀 막 단백질을 유전적으로 태깅하는 것이다. 이후 이렇게 정제된 퍼옥시좀을 예를 들어 삼투 용해(J Cell Biol. 2007 Apr 23; 177(2): 289-303; 이의 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨)를 사용하여 용해한다. 고속 원심분리를 통해 퍼옥시좀 잔해를 제거하고 원하는 화물 단백질을 함유하는 가용성 분획을 수집할 수 있다. 원할 경우, 친화성 정제를 사용하여 이러한 원하는 단백질을 추가 정제할 수 있다. 제한 없이, 화물 단백질을 예를 들어 폴리-히스티딘, 말토스-결합 단백질, 글루타치온 S-전이효소와 같은 임의의 여러 이용가능한 펩타이드 또는 단백질 폴드 친화성 태그로 태깅하고, 각각의 프로토콜을 사용하여 정제할 수 있다. 대안적으로, 이온 크로마토그래피 또는 겔 여과와 같은 다른 정제 방법을 사용할 수 있다.
실시예 9: 효모 퍼옥시좀에서 번역-후 변형된 단백질의 발현 - 개별 단백질의 퍼옥시좀으로의 국소화(ePTS1-기반 표적화)
퍼옥시좀 표적화 서열을 사용하여 크기 및 기능 기반 다른 종류의 단백질을 전형적인 효모 세포의 퍼옥시좀에 국소화하는 것을 입증한다. 표적화될 수 있는 단백질 및 단백질 유형의 비-제한 예시가 표 3에 나열되어 있다. 퍼옥시좀 표적화 기작이 유지되므로, 피키아 파스토리스/코마가탤라 파피(Komagataella phaffii), 한세눌라 폴리모파/오가타에아 파라폴리모파(Ogataea parapolymorpha) 및 칸디다 보이디니(Candida boidinii)와 같은 메틸영양성 효모를 포함하는 다른 유기체에서 플랫폼을 사용할 수 있다. GFP-x-ePTS1 및 x-FLAG-ePTS1 작제물을 생산한다. 작제물에서, GFP는 국소화의 가시화를 위해, FLAG-ePTS1는 단백질 발현 및 GFP가 기능을 방해하는 경우를 위해 사용되며, "x"는 표적화할 관심있는 단백질 또는 효소를 나타낸다. 일부 작제물 서열 및 일부 실시형태의 세부사항은 표 1 및 2에 제공된다.
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실시예 10: 이황화 결합 형성
일부 실시형태에서, 변형은 이황화 결합 형성이다. 예를 들어, 이종 단백질 및 단백질 이황화 이성질체화효소(PDI)가 공동-발현되고 퍼옥시좀에 표적화되는 설계가 사용된다. 이러한 경우, 질량-분광법으로 이종 단백질의 이황화를 분석한다.
생체 내 퍼옥시좀에서의 이황화 결합 형성을 입증하기 위해, 인간 인슐린, 알파 인터페론 및 마파칼신(mapacalcine)을 발현하는 이종 유전자를 PDI와 함께 공동-발현시킨다. 일반적으로 ER로 표적화되는 오가타에아 PDI(OgPDI)가 과발현되고 퍼옥시좀으로 표적화되도록 설계한다. 인간 인슐린 전구체(Baeshan et al, 2014), 알파 인터페론(Shi et al, 2007) 및 마파칼신(Noubhani et al, 2015)은 피키아 파스토리스에 최적화된 코돈을 사용하여 합성한다. 관심있는 표적 유전자에 대한 발현 카세트, 변형 효소에 대한 발현 카세트 및 선택가능 마커에 대한 발현 카세트를 포함하는 세 가지 발현 카세트로 작제물을 설계한다.
각 카세트는 프로모터, 발현 유전자(관심있는 유전자 또는 변형 효소 유전자 또는 선택가능 마커 유전자) 및 터미네이터를 갖는다. 관심있는 유전자 및 변형 효소 유전자는 번역적 융합으로서 각각 GFP 및 mRuby 형광 태그를 포함하도록 설계한다. 관심있는 유전자 및 변형 효소 유전자 모두 3' 말단의 ePTS1 서열의 도입에 의해 퍼옥시좀으로 표적화된다. 마파칼신 및 OgPDI을 공동-발현하는 전체 작제물의 서열은 서열번호 73에 기재되어 있다. 추가 카세트는 인간 인슐린 전구체(서열번호 74), 알파 인터페론(서열번호 75), 마파칼신(서열번호 76), OgPDI(서열번호 77)에 대한 핵산 서열을 포함한다.
초기에 퍼옥시좀으로의 표적화를 확인하는 형광 마커에 대해 이들 카세트를 발현하는 형질전환체를 스크리닝한다. 질량 분광법으로 형질전환체 균주로부터 정제된 관심있는 이종 단백질의 이황화 형성에 대해 분석한다.
실시예 11: 인산화
일부 실시형태에서, 변형은 인산화이다. 예를 들어, 인간 베타-카세인 II(Greenberg et al, 1984; Thurmond et al, 1997) 및 특정 단백질 인산화효소, 즉 카세인의 특정 세린 및 트레오닌 아미노산을 인산화하는 인간 카세인 인산화효소(Voss et al, 1991)의 공동-발현에 대해 확인한다. 인간 베타-카세인 II의 코돈 최적화 서열은 서열번호 78에 카세인 인산화효소 II 서브유닛 베타의 코돈 최적화 서열은 서열번호 79에 기재되어 있다.
이황화 결합 형성의 입증을 위해 사용된 것과 같은 방식으로(실시예 10에 기재된 바와 같이) 형질전환을 위한 작제물을 생성한다. 카세인은 관심있는 유전자로 사용되고 카세인 인산화효소는 변형 효소로 사용된다. 인산화는 퍼옥시좀 내 조절의 주요 형태이며, 퍼옥시좀에서 발현되는 표적 카세인은 카세인 인산화효소의 공동-발현을 필요로하지 않을 수도 있다. 일단 생성되면, 재조합 카세인을 정제하고 질량-분광법으로 트레오닌 및 세린의 인산화 형태에 대해 분석한다. 일부 실시형태에서, 인산화 활성은 시험관 내에서 분석한다.
실시예 12: 아세틸화
일부 실시형태에서, 변형은 N-말단 아세틸화이다. 예를 들어, 암닭 달걀 오브알부민(Ito & Matsudomi, 2005) 및 특정 아세틸화 복합체 NatB(Rovere et al, 2008)로서 N-말단 글라이신의 아세틸화를 촉진하는 NatB의 공동-발현을 확인한다. 오브알부민의 코돈 최적화 서열은 서열번호 80에 기재되어 있고 효모 NatB 복합체(Naa20 및 Naa25)에 해당하는 두 유전자는 각각 서열번호 81 및 82에 기재되어 있다.
이황화 결합 형성의 입증을 위해 사용된 것과 같은 방식으로(실시예 10에 기재된 바와 같이) 형질전환을 위한 작제물을 생성한다. 오브알부민은 관심있는 유전자로 사용되고 NatB 복합체의 두 유전자는 변형 효소를 구성한다. 효모의 많은 단백질이 N-말단 아세틸화되며, 퍼옥시좀에서 발현되는 표적 오브알부민은 카세인 인산화효소가 없어도 N-말단 아세틸화를 보일 수 있다. 일단 생성되면 재조합 카세인을 정제하고 질량-분광법으로 N-말단 글라이신의 아세틸화에 대해 분석한다.
본 명세서에서 복수적 및/또는 단수적 용어의 사용과 관련하여, 이 분야의 기술자들은 문맥 및/또는 적용에 적절하게 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 바꿀 수 있다. 명확성을 위해 다양한 단수적/복수적 순열이 본 명세서에 명시적으로 기재될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서 및 특히 첨부된 청구범위(예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에 사용된 용어들은 일반적으로 "개방된" 용어로서 의도된 것임을 이 분야의 기술자들은 이해할 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이로 제한되지 않는"으로 이해되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 이해되어야 하고, 용어 "포함한다"는 "포함하지만 이로 제한되지 않는다"로 이해되어야 하는 등). 또한 청구항의 기재에서 특정 수가 의도된 경우, 이러한 의도는 청구항에서 명시적으로 기재될 것이고, 이러한 기재가 없는 경우 이러한 의도가 없음을 이 분야의 기술자들은 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위한 것으로서, 다음의 첨부된 청구범위에는 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 문구의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 문구를 사용하는 것으로 인해, 그렇지 않은 경우가 청구범위를 단지 하나를 함유하는 실시형태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"의 문구를 사용한 경우와 그렇지 않은 경우가 같은 청구항에 포함되는 경우에도 마찬가지이다(예를 들어, 단수적인 표현은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 함). 또한, 청구항의 기재에서 특정 수가 명시적으로 기재된 경우에도, 이 분야의 기술자들은 이러한 기재가 기재된 수 이상을 의미하는 것으로 해석되어야 함을 인식할 것이다(예를 들어, 다른 수식어가 없는 "두 기재들"의 단순한 기재는 적어도 두 기재들 또는 둘 이상의 기재들을 의미함). 또한, "A, B 및 C 중 적어도 하나" 등과 같은 관례적인 문구가 사용된 경우, 일반적으로 이러한 구성은 이 분야의 기술자가 그 관례를 이해하는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A를 단독으로 갖는 시스템, B를 단독으로 갖는 시스템, C를 단독으로 갖는 시스템, A와 B를 함께 갖는 시스템, A와 C를 함께 갖는 시스템, B와 C를 함께 갖는 시스템 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템 등을 포함하지만 이로 제한되지 않을 것임). "A, B 또는 C 중 적어도 하나" 등과 같은 관례적인 문구가 사용된 경우, 일반적으로 이러한 구성은 이 분야의 기술자가 그 관례를 이해하는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A를 단독으로 갖는 시스템, B를 단독으로 갖는 시스템, C를 단독으로 갖는 시스템, A와 B를 함께 갖는 시스템, A와 C를 함께 갖는 시스템, B와 C를 함께 갖는 시스템 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템 등을 포함하지만 이로 제한되지 않을 것임). 또한, 발명의 설명에서든, 청구범위에서든 또는 도면에서든, 둘 이상의 대안적인 용어를 나타내는 실질적으로 이접적인 임의의 단어 및/또는 문구는 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나 또는 용어들 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 함을 이 분야의 기술자들은 이해할 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 양상이 마쿠쉬 군으로 기술된 경우, 이 분야의 기술자들은 개시내용이 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원들의 하위군의 관점에서도 기술된다는 것을 인식할 것이다.
임의의 일 양상의 실시형태의 특징이 본 명세서에서 확인된 모든 양상 및 실시형태에 적용가능하다. 더욱이, 임의의 일 양상의 실시형태의 특징이 독립적으로, 부분적으로 또는 전체적으로 본 명세서에 기술된 다른 실시형태와 임의의 방식으로 결합가능하며, 예를 들어 하나, 둘 또는 셋 또는 그 이상의 실시형태가 전체적으로 또는 부분적으로 결합가능하다. 또한, 임의의 일 양상의 실시형태의 특징은 다른 양상 또는 실시형태에 대해 선택적으로 만들어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> PROVENANCE BIO, LLC THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> EXPRESSION OF MODIFIED PROTEINS IN A PEROXISOME <130> PBFAB.001WO2 <140> PCT/US2020/032512 <141> 2020-05-12 <150> US 62/847769 <151> 2019-05-14 <160> 82 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peroxisome targeting sequence <400> 1 Ser Leu Lys 1 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peroxisome targeting sequence <220> <221> VARIANT <222> (3)...(7) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = H or Q <400> 2 Arg Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peroxisome targeting sequence <400> 3 Leu Gly Arg Gly Arg Arg Ser Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> 1,2,5-11,13,14,16 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (3)...(4) <223> Xaa = K 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gacccgccgg cccccccggc cgagatggca tccctggaca acctggactt 420 cccggacccc ctggaccccc cggacctccc ggaccccctg gcctcggagg aaactttgct 480 ccccagttgt cttacggcta tgatgagaaa tcaacaggaa tttccgtgcc tggtcccatg 540 ggtccttctg gtcctcgtgg tctccctggc ccccctggcg cacctggtcc ccaaggtttc 600 caaggccccc ctggtgagcc tggcgagcca ggagcctcag gtcccatggg tccccgtggt 660 ccccctggcc cccctggcaa gaacggagat gatggcgaag ctggaaagcc tggtcgtcct 720 ggtgagcgcg ggcctcccgg acctcagggt gctcggggat tgcctggaac agctggcctc 780 cctggaatga agggacacag aggtttcagt ggtttggatg gtgccaaggg agatgctggt 840 cctgctggcc ccaagggcga gcctggtagc cccggtgaaa atggagctcc tggtcagatg 900 ggcccccgtg gtctgcctgg tgagagaggt cgccctggag cccctggccc tgctggtgct 960 cgaggaaatg atggtgcgac tggtgctgct gggccccctg gtcccactgg ccccgctggt 1020 cctcctggtt tccctggtgc tgtgggtgct aagggtgaag gtggtcccca aggaccccga 1080 ggttctgaag gtccccaggg tgtacgtggt gagcctggcc cccctggccc tgctggtgct 1140 gctggccctg ctggcaaccc tggtgctgat ggacagcctg gtgctaaagg agccaatggc 1200 gctcctggta ttgctggtgc 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tatcctgggc cataagctgg aatacaattt taacagccac aatgtttaca tcaccgccga 1260 taaacaaaaa aatggcatta aagcgaattt taaaattcgc cacaacgtgg aggatggcag 1320 cgtgcagctg gctgatcact accagcaaaa cactccaatc ggtgatggtc ctgttctgct 1380 gccagacaat cactatctga gcacgcaaag cgttctgtct aaagatccga acgagaaacg 1440 cgatcatatg gttctgctgg agttcgtaac cgcagcgggc atcacgcatg gtatggatga 1500 actgtacaaa ggttctcatc atcatcatca tcacttggga agaggtagaa gatccaaatt 1560 gtaactcgag agcttttgat taagccttct agtccaaaaa acacgttttt ttgtcattta 1620 tttcattttc ttagaatagt ttagtttatt cattttatag tcacgaatgt tttatgattc 1680 tatatagggt tgcaaacaag catttttcat tttatgttaa aacaatttca ggtttacctt 1740 ttattctgct tgtggtgacg cgtgtatccg cccgctcttt tggtcaccca tgtatgctga 1800 cggggtcatc acggctcatc atgcgccaaa caaatgtgtg caatacacgc tcggatgact 1860 gcatgatgac cgcactgact ggggacagca gatccaccta agcctgtgag agaagcagac 1920 acccgacaga tcaaggcagt taaacgcctt gccaacaggg agttcttcag agacatggag 1980 gctcaaaacg aaattattga cagcctagac atcaatagtc atacaacaga aagcgaccac 2040 ccaactttgg ctgataatag cgtataaaca atgcatactt tgtacgttca aaatacaatg 2100 cagtagatat atttatgcat attacatata atacatatca cataggaagc aacaggcgcg 2160 ttggactttt aattttcgag gaccgcgaat ccttacatca cacccaatcc cccacaagtg 2220 atcccccaca caccatagct tcaaaatgtt tctactcctt ttttactctt ccagattttc 2280 tcggactccg cgcatcgccg taccacttca aaacacccaa gcacagcata ctaaatttcc 2340 cctctttctt cctctagggt gtcgttaatt acccgtacta aaggtttgga aaagaaaaaa 2400 gacaccgcct cgtttctttt tcttcgtcga aaaaggcaat aaaaattttt atcacgtttc 2460 tttttcttga aaattttttt ttttgatttt tttctctttc gatgacctcc cattgatatt 2520 taagttaata aacggtcatc aatttctcaa gtttcagttt catttttctt gttctattac 2580 aacttttttt acttcttgct cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aagttttaat 2640 tacaaaagat ctatggtgtc caaaggagag gagttaatca aggaaaacat gagaatgaaa 2700 gttgtcatgg agggctccgt taatggtcac caattcaagt gtacagggga aggtgaaggt 2760 aatccttaca tgggtacaca aactatgaga attaaagtaa ttgaaggcgg accactacca 2820 tttgcatttg acattctggc aacgtcattc atgtacggat cacgaacttt catcaagtac 2880 cctaaaggta taccagactt tttcaagcaa tcttttccag agggttttac atgggaaagg 2940 gttacaagat acgaagatgg gggtgtcgtc acagttatgc aagatacttc attagaagat 3000 ggctgccttg tctatcatgt gcaagtaaga ggggtgaatt ttccttctaa cggacctgtg 3060 atgcagaaaa agaccaaagg ttgggaacca aatactgaaa tgatgtaccc agctgatgga 3120 ggtttgagag gctacacaca catggcgctt aaagttgatg gtggaggtca tttgtcttgt 3180 agttttgtta ccacttatcg ttctaaaaag actgttggca atatcaaaat gccaggaata 3240 catgctgtag accacagact agaaagactc gaagagagcg ataacgaaat gttcgttgta 3300 cagagagagc atgccgtagc caaatttgct ggcttaggcg gtggtatgga tgaattgtat 3360 aagggttctg ctgtggccaa aggtgacgcc gacgaagccg ccattgcgtc gccggattcc 3420 gctgttgtga agttgacagc agaatccttc gagtcgttta tcaaggagaa cccgctcgtt 3480 ttggctgagt tctttgcgcc atggtgtggc cactgcaagc gtcttggacc agagtttagc 3540 gctgctgccg acaaacttgt cgagaaagac atcaagttgg cccagattga ttgcacccaa 3600 gagagagatc tatgtgcgga ctatggtatc cgtggttatc catctctcaa ggtcttcaga 3660 ggcaacaaca cgccatccga gtaccagggc caaagagaac aagatgcaat tgtcagctac 3720 atgatcaagc aagccctacc tccagtgtcg ttgcttgagg atacggctga tctgctggac 3780 gctctggccg atctgagcga accaatgatc ttgcaagttc tgccacctga ctcgaagtct 3840 tccggcaacg aaacgttcca ttcgttggcc aaccgtctta gaaacgactt caggttcgtg 3900 tctacctcca accctgagta tgttgagaaa tacgtcaagg aaaagtccac tccaacctac 3960 gttgttttca gaccgggtga aaagattgag gacgcatctg ttctcaccaa caagactata 4020 gacgaagagg gattgcagag attcattagt gttgagacta agcctctttt cggcgaggtc 4080 accggtgcca cgttccaggc ctacatggac tccaaacttc ctttagcata ctttttctat 4140 gaagaggagt ctcagaaggc tgctgtcgca gacgaaatca ctaagttggc caagaaatat 4200 agaggcgaga tcaatttcgc cggactggag gccaagaaat acggaatgca cgctaaaaac 4260 ctcaacatgc aagaaaagtt cccactgttt gccattcacg atctgcaagg cgacctaaag 4320 tacggcatcc cacaagataa ggatctggac ttctctgaga ttcctaaatt tgtcgaaaac 4380 ttcaagaagg gcaagctgaa gccaattgtc aagagcgagc ctattccaga gactcaagag 4440 gaggctgtct accacttggt cggctacgag cacgacaaga tcgtcaacca aaagaaggac 4500 gttctggtcg agtactatgc tccatggtgt ggtcactgca agagacttgc ccctacatat 4560 gaggagctgg ctgctatcta caagaacgac accgctgcta gtgccaaggt cgtgatcgcc 4620 aagattgacc acaccgctaa cgatgttgcg ggcgtcgaga tcaccggata ccctaccatt 4680 ttcctttatc cagctgacgg ttctggtccg gtcaattacg agggacaaag aactttggag 4740 tccctagctt ctttcattca agagaagggt acctttggtg ttgacggttt ggccatcaga 4800 ggcgctaaga gcggcggagc tgataaaccg gagtccgaca ctaaggacag tactggatcc 4860 ttgggaagag gtagaagatc caaattgtaa ctcgagtggc gcgaatttct tatgatttat 4920 gatttttatt attaaataag ttataaaaaa aataagtgta tacaaatttt aaagtgactc 4980 ttaggtttta aaacgaaaat tcttattctt gagtaactct ttcctgtagg tcaggttgct 5040 ttctcaggta tagcatgagg tcgctcttat tgaccacacc tctaccggca tgccgagcaa 5100 atgcctgcaa atcgctcccc atttcgctgg aaatctgctc gtcagtggtg ctcacactga 5160 cgaatcatgt acagatcata ccgatgactg cctggcgact cacaactaag caagacagcc 5220 ggaaccagcg ccggcgaaca ccactgcata tatggcatat cacaacagtc cacgtctcaa 5280 gcagttacag agatgttacg aaccactagt gcactgcagt acagtttagc ttgcctcgtc 5340 cccgccgggt cacccggcca gcgacatgga ggcccagaat accctccttg acagtcttga 5400 cgtgcgcagc tcaggggcat gatgtgactg tcgcccgtac atttagccca tacatcccca 5460 tgtataatca tttgcatcca tacattttga tggccgcacg gcgcgaagca aaaattacgg 5520 ctcctcgctc cagacctgcg agcagggaaa cgctcccctc acagacgcgt tgaattgtcc 5580 ccacgccgcg cccctgtaga gaaatataaa aggttaggat ttgccactga ggttcttctt 5640 tcatatactt ccttttaaaa tcttgctagg atacagttct cacatcacat ccgaacataa 5700 acaaaaatgg gtactacctt agatgataca gcctacagat acagaacatc agtccctggt 5760 gatgctgaag caattgaggc tttagacggt tcattcacca ccgacaccgt ctttagagta 5820 accgccaccg gtgatggatt taccttaaga gaagtcccag tcgaccctcc attaactaaa 5880 gtctttccag atgatgaatc tgatgacgaa agcgacgacg gagaagatgg tgacccagat 5940 tcaagaactt tcgtagcata cggtgatgac ggtgatttgg ctggttttgt agtcgtttct 6000 tattcaggtt ggaatagaag gttgaccgtt gaagatatag aagtcgcccc agagcataga 6060 ggtcatggtg taggaagagc tttgatgggt ttggctacag aatttgcaag agagagagga 6120 gccggtcatt tatggttaga agttactaat gttaacgccc ctgctatcca tgcttataga 6180 agaatgggtt tcacattatg tggtttagat actgctttat atgatggaac agcatctgac 6240 ggtgaacagg ccttgtatat gtctatgcct tgcccttaaa gtaactgaca ataaaaagat 6300 tcttgttttc aagaacttgt catttgtata gtttttttat attgtagttg ttctatttta 6360 atcaaatgtt agcgtgattt atattttttt tcgcctcgac atcatctgcc cagatgcgaa 6420 gttaagtgcg cagaaagtaa tatcatgcgt caatcgtatg tgaatgctgg tcgctatact 6480 g 6481 <210> 74 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human insulin precursor <400> 74 Met Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala 20 25 30 Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 35 40 45 Phe Glu Asn Tyr Cys Asn 50 <210> 75 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha interferon <400> 75 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln 165 <210> 76 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mapacalcine <400> 76 Ile Cys Asn Gly Gln Trp Thr Ser Val Gly Ser Ala Gly Leu Tyr Tyr 1 5 10 15 Thr Ile Lys Ala Asp Ser Met Cys Val Asp Ile His Tyr Thr Asp Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Pro Ser Cys Gln Gly Leu Gln Val Ile Gly Pro Cys Asn 35 40 45 Arg Tyr Gln Asn Gly Pro Arg Asp Phe Val Ala Cys Gln Thr Ser Gly 50 55 60 Gly Ser Gly His Pro Ile Cys Ile Gln Ser Thr Asn Gly Asn Ile Glu 65 70 75 80 Leu Cys Ala Asn Cys Tyr Cys Pro Gln 85 <210> 77 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OgPDI <400> 77 Met Ala Val Ala Lys Gly Asp Ala Asp Glu Ala Ala Ile Ala Ser Pro 1 5 10 15 Asp Ser Ala Val Val Lys Leu Thr Ala Glu Ser Phe Glu Ser Phe Ile 20 25 30 Lys Glu Asn Pro Leu Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly 35 40 45 His Cys Lys Arg Leu Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Asp Lys Leu 50 55 60 Val Glu Lys Asp Ile Lys Leu Ala Gln Ile Asp Cys Thr Gln Glu Arg 65 70 75 80 Asp Leu Cys Ala Asp Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr Pro Ser Leu Lys Val 85 90 95 Phe Arg Gly Asn Asn Thr Pro Ser Glu Tyr Gln Gly Gln Arg Glu Gln 100 105 110 Asp Ala Ile Val Ser Tyr Met Ile Lys Gln Ala Leu Pro Pro Val Ser 115 120 125 Leu Leu Glu Asp Thr Ala Asp Leu Leu Asp Ala Leu Ala Asp Leu Ser 130 135 140 Glu Pro Met Ile Leu Gln Val Leu Pro Pro Asp Ser Lys Ser Ser Gly 145 150 155 160 Asn Glu Thr Phe His Ser Leu Ala Asn Arg Leu Arg Asn Asp Phe Arg 165 170 175 Phe Val Ser Thr Ser Asn Pro Glu Tyr Val Glu Lys Tyr Val Lys Glu 180 185 190 Lys Ser Thr Pro Thr Tyr Val Val Phe Arg Pro Gly Glu Lys Ile Glu 195 200 205 Asp Ala Ser Val Leu Thr Asn Lys Thr Ile Asp Glu Glu Gly Leu Gln 210 215 220 Arg Phe Ile Ser Val Glu Thr Lys Pro Leu Phe Gly Glu Val Thr Gly 225 230 235 240 Ala Thr Phe Gln Ala Tyr Met Asp Ser Lys Leu Pro Leu Ala Tyr Phe 245 250 255 Phe Tyr Glu Glu Glu Ser Gln Lys Ala Ala Val Ala Asp Glu Ile Thr 260 265 270 Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Arg Gly Glu Ile Asn Phe Ala Gly Leu Glu 275 280 285 Ala Lys Lys Tyr Gly Met His Ala Lys Asn Leu Asn Met Gln Glu Lys 290 295 300 Phe Pro Leu Phe Ala Ile His Asp Leu Gln Gly Asp Leu Lys Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Pro Gln Asp Lys Asp Leu Asp Phe Ser Glu Ile Pro Lys Phe Val 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Lys Gly Lys Leu Lys Pro Ile Val Lys Ser Glu Pro 340 345 350 Ile Pro Glu Thr Gln Glu Glu Ala Val Tyr His Leu Val Gly Tyr Glu 355 360 365 His Asp Lys Ile Val Asn Gln Lys Lys Asp Val Leu Val Glu Tyr Tyr 370 375 380 Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Arg Leu Ala Pro Thr Tyr Glu Glu 385 390 395 400 Leu Ala Ala Ile Tyr Lys Asn Asp Thr Ala Ala Ser Ala Lys Val Val 405 410 415 Ile Ala Lys Ile Asp His Thr Ala Asn Asp Val Ala Gly Val Glu Ile 420 425 430 Thr Gly Tyr Pro Thr Ile Phe Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ser Gly Pro 435 440 445 Val Asn Tyr Glu Gly Gln Arg Thr Leu Glu Ser Leu Ala Ser Phe Ile 450 455 460 Gln Glu Lys Gly Thr Phe Gly Val Asp Gly Leu Ala Ile Arg Asp Ala 465 470 475 480 Lys Ser Gly Gly Ala Asp Lys Pro Glu Ser Asp Thr Lys Asp Ser Thr 485 490 495 <210> 78 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human beta-Casein II <400> 78 atgaaagtcc ttattttagc ttgccttgtc gcattggctc tggcaagaga gacgattgaa 60 tcactaagta gttccgaaga aagtatcacc gaatataaaa aggtcgagaa ggtgaagcat 120 gaagaccagc aacagggcga agacgagcat caagacaaga tttaccctag tttccaacca 180 cagcctttaa tttatccctt cgtggaacca ataccatatg gcttcctgcc acaaaatatc 240 ctgcccttag cccaacccgc cgtcgttctg ccagtgcctc aacctgagat catggaagtt 300 ccaaaagcca aggatactgt ttatactaaa ggacgtgtga tgcctgtttt aaaatctccc 360 accattcctt tctttgatcc ccaaatccca aaacttactg accttgagaa cctacatcta 420 cccctaccac ttttacagcc actaatgcaa caggtgcctc agcctattcc tcagacccta 480 gctctaccac cacagcccct ttggtctgtc ccccaaccca aggttcttcc catacctcaa 540 caagtagttc catacccaca acgtgctgtc cctgtgcagg ctctgctact gaaccaggaa 600 ttgttactga atcctaccca ccaaatctac ccagtgactc agcccttagc cccagtacat 660 aatcccatca gtgtt 675 <210> 79 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Casein Kinase II <400> 79 atgtcatcct ccgaggaagt cagttggatc tcatggttct gcggtctgag gggcaacgag 60 tttttctgtg aggtagatga agactatatt caagacaagt tcaatctgac gggacttaat 120 gaacaggttc ctcactacag acaagcacta gacatgatat tagacctgga gcctgacgaa 180 gaactagaag ataaccccaa tcagtcagat ctaatcgaac aagccgcaga gatgttgtat 240 ggcttgatac acgccagata catattaact aaccgtggta ttgcacagat gttggaaaag 300 tatcagcaag gtgattttgg atattgcccc agagtatatt gcgagaacca acctatgtta 360 cccataggac tttctgatat tcctggagag gctatggtga aattgtactg ccctaaatgt 420 atggatgttt acactcctaa atcttcccgt catcatcata cggatggcgc ttattttgga 480 actggttttc cccacatgtt gttcatggtc caccctgagt ataggccaaa aagacctgca 540 aatcaatttg ttcctagact ttatggattt aagatacatc caatggctta ccaactgcag 600 ttacaagctg ctagtaattt taaatctcca gtcaaaacca ttaga 645 <210> 80 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ovalbumin <400> 80 ggttctatcg gagcagctag tatggaattc tgtttcgacg tgttcaagga attaaaagtc 60 catcatgcta atgaaaacat attctactgc ccaattgcca ttatgtcagc cctggccatg 120 gtgtacctag gtgccaaaga ttccacgaga actcaaataa ataaggttgt tagattcgac 180 aagttgccag gtttcggtga tagtattgaa gcccagtgcg gaacgtctgt taacgttcac 240 agttccctaa gagacatttt aaatcaaatc acaaagccca acgacgtgta ttcattttcc 300 ttagcctcca ggctgtacgc cgaggaaaga tatccaattt tgcccgaata cctgcagtgc 360 gtaaaagagc tgtatagagg cggacttgaa ccaataaatt tccagaccgc tgctgaccaa 420 gcccgtgagt tgataaactc ctgggtcgag tcccaaacta atggaatcat acgtaacgtg 480 ctgcaaccaa gtagtgttga ctcacagacc gcaatggttt tggttaacgc tatcgtattt 540 aaaggtttgt gggagaaagc attcaaagac gaagacacac aagccatgcc tttcagagtg 600 acggagcagg agagtaagcc agtacagatg atgtaccaga ttggcctttt cagagttgct 660 tccatggcct cagagaagat gaaaatcctg gagcttccat ttgcttctgg tactatgtcc 720 atgctagtgc ttctgcccga cgaagtgtct ggattggagc aattagaatc tatcataaac 780 tttgaaaagt taacagagtg gacttcttca aacgtaatgg aggaacgtaa gattaaagtt 840 tacctaccac gtatgaaaat ggaagaaaag tataatttga cctctgttct gatggcaatg 900 ggcataaccg acgtattcag ttcttcagca aatttatccg gcatatcctc tgcagaatct 960 ctaaagatat ctcaggccgt acacgccgct cacgcagaaa ttaacgaggc cggacgtgag 1020 gtagtaggat ccgctgaggc cggtgtggac gctgcatctg tgtctgagga gtttagagcc 1080 gaccaccctt ttctattctg tattaaacat atagccacta atgccgttct tttcttcggt 1140 aggtgcgtct cacca 1155 <210> 81 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NatB complex Naa20 <400> 81 atgaccgata caagaaaatt taaggcaaca gatttatttt cctttaacaa cataaatctg 60 gacccactta ccgaaacatt taacatatca ttttaccttt catatcttaa caagtggccc 120 tccttatgcg tagtacaaga gtccgatctt tcagacccca cgttgatggg ttatattatg 180 ggcaagtccg aaggaacagg caaagagtgg cacacgcatg ttaccgccat cacagtggcc 240 ccaaattcac gtagattggg ccttgccagg acaatgatgg attacttgga gacggtcggt 300 aactctgaga acgccttctt cgtggacctg ttcgtcaggg catccaacgc cctagcaatt 360 gacttttaca aaggattggg ctactctgtc taccgtagag tgattggtta ttacagtaac 420 cctcatggca aagatgaaga ctctttcgac atgagaaaac cattgtctag ggatgtaaac 480 agggagtcaa tcagagaaaa cggtgagaac tttaagtgct cacccgcaga tgtgagtttt 540 <210> 82 <211> 2433 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NatB complex Naa25 <400> 82 atgaggagga gtggctccaa ggagagtact attgtatact cagctttgag tcttgctcag 60 gccggaagag gacccgaagc actggccttg cttgagcccc tgaagtcaac tccaatcaat 120 tctcttgagt tattggatat catacaggct gtatacgatg atcaaaagaa aggagaagaa 180 tccttcgttt tctgggagaa gttccttcag acttatggta agcaggagaa aaatttactg 240 gcttacttca aggcttctat tagaattaaa tctctgagtc accaacgtaa ggctgcagtg 300 gagctgcaaa agaactttcc aagtaggaaa cacacgttat gggttattag tagtctttat 360 ttactgtcca aaaaatccga gaacgaagtt gagcagaggc tgctgaaggc tctagctgaa 420 aaaaccgcta aattaatttt tgaaaaacca accggatata ttgattcttg tgaggaattc 480 catttgtatc tggacgtact acttctagta ggtgataaag atagggctct tgacgcttta 540 attcaccaag acgcagatag attcgtcgac gctgatgctg acctactgct tcgtaaatta 600 gaactattag caagttgtgc aagatgggat tcactgttta ctttctccct gagtttgttc 660 cagactggta acacggactg gaaagtctgt aaagcactac tagattctgc ctccaacgat 720 gatagtaagt tagtaccatt gaaggattgc atacttaaag cattatctac gtcttctact 780 aaaagaaatt tacacctgct atggattgaa gcatccgcac gtttctttcc cgaggaacac 840 gagtcagcac tattaggcta cataaagaaa ctttacatga agcccattgt cttcgaggat 900 cttaggccat atctgctgaa actaaacgtc gatgcacagc accgtttgtt ggacgctttc 960 aagctagctg atttgggcga gtcaaatgag tcacagaagg tcgataaatt atacgctgag 1020 gttcttctgt tgaaaatcca cttcctgcta ttcgagagtt tcacagccga gagtgtggta 1080 gactacgttc gtcgttgttt cgttgccttt gagaaaggac tttcactgtc taaaggactt 1140 ttgccaacgg acttcactca tggatatgag gctcttctgt tagcagtaca ttcccttatt 1200 tatatgtggg aaggtaacaa ggatttaaaa ccagcagaaa agcaggcatt aattttcgac 1260 gctatttgcc tgttagaaaa gggtataaca tacagtcaac ataatttcca cctgaaactt 1320 cccctgataa ggttatacct actgcttgac ggaggattcc ccgcagcagc aaaagtttac 1380 gatactatga gtataaagca aattcagaac gatacattag atcactattt actgaccagg 1440 gctaccacat attacccctc ttccgtcacg tcacattata taaattcatc cttaaagata 1500 tatggctcta acgagttcga aaccccagaa atgatttcta tggcatatga ggacggcgca 1560 tacagtcaga tcgaggacat gcgtaatttt agatctaggc ttgaccattc cacctggaag 1620 agtatatccc tagtcgaaag ggccaggata cactatctta ccgcatttaa gcctcctaaa 1680 cagtacctac ccaagtgttc cagtcctaaa gataaccgtg acctaaaggt gttcgctgat 1740 tacggatcag acaagcttcc taccgtggag gaaagtctaa ggaactcccc caagcccgat 1800 acgttgtgga tccacctaac tgtaatcggt cattccttag ttcaggatag tattgtgaat 1860 ggcgattttg agaaggccgt tctgtcagcc aaagaaatgg aagtcttgtg tgaaaataac 1920 gatctgtcta agcaactaac atcagaagag atcgtgcaca tgaagctact aatccaatta 1980 ggacttttaa gtgtgaaggt taagaatgga gattatgaaa actcctcttt tgagactatc 2040 gagaacctta tagaaagttt cgattatgaa aacagtactc ccctaagtca gttgacaaag 2100 tataccgaga tcatcaatga tttaatcacc tgcttgaact catttttgta tcatgtaagt 2160 gctactaaga aaaaggaatt cacacgtcaa taccagttgc tgaaaaatat aagttccaac 2220 aaacttggat caatctctgg tatcaccaaa cataagaaga aagctgccag aaagtacgtt 2280 tccgagctgt tgagtaattc ttggctaagt aacctatctg agacccaggt cccttacgat 2340 ccaaagtttg caaagcaagt gggtgagggt atgatcgact cttatataca gacaacggac 2400 gcagtgtcaa aattaccaaa gttcgtgaag ttt 2433

Claims (42)

  1. 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법으로서,
    세포를 제공하는 단계;
    상기 세포에 제1 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 제1 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 제1 서열을 포함하는, 상기 제1 핵산을 도입하는 단계; 및
    상기 세포에 제2 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 제2 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 암호화하는 제2 서열을 포함하는, 상기 제2 핵산을 도입하는 단계
    를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 효모 세포인, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 아르술라(Arxula), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 코마가탤라(Komagataella), 오가타에아(Ogataea), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia)로부터 선택되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 및/또는 제2 핵산은 프로모터(들)를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프로모터는 항시성 또는 유도성인, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퍼옥시좀-표적화 서열은 서열번호 1(SLK), 서열번호 2(RLXXXXX(H/Q)L) 또는 서열번호 3(LGRGRRSKL)에 기재된 서열을 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 태그를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 태그는 절단가능한, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포에 제3 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하되, 상기 제3 핵산은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 제2 이종 변형 효소를 암호화하는 제3 서열을 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질은 1Da, 5Da, 10Da, 20Da, 30Da, 40Da, 50Da, 60Da, 70Da, 80Da, 90Da, 100Da, 200Da, 300Da, 400Da, 500Da, 600Da, 700Da, 800Da, 900Da, 1kDa, 5kDa, 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 110kDa, 120kDa, 130kDa, 140kDa, 150kDa, 160kDa, 170kDa, 180kDa, 190kDa, 200kDa, 210kDa, 220kDa, 230kDa, 240kDa, 250kDa, 260kDa, 270kDa, 280kDa, 290kDa 또는 300kDa, 또는 임의의 상기 2개의 값으로 정의되는 범위 사이의 임의의 크기, 또는 최대 300kDa의 분자량을 갖는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 변형을 생성하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 변형은 하이드록실화, 단백질 폴딩, 산화, 단백질 분해, 인산화, 탈인산화 및/또는 이성질체화인, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 프롤릴 하이드록실화효소, 리실 산화효소, 단백질 샤페론 또는 프롤릴 이성질체화효소를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 프롤릴 이성질체화효소, 단백질 이황화 이성질체화효소, 하이드록실 전이효소 또는 프롤릴 하이드록실화효소로부터 선택되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 콜라겐, 젤라틴 또는 실크 단백질을 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 효모 세포와 같은 진핵 세포에서의 단백질 발현을 위해 코돈 최적화되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 프롤릴 하이드록실화효소 또는 프롤릴 이성질체화효소를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 콜라겐이고, 상기 콜라겐은 I형 이종삼량체, 1형 알파 동종삼량체 또는 III형 동종삼량체 콜라겐을 형성하도록 변형되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질은 Col1A1 또는 Col1A2를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 프롤릴-4-하이드록실화효소를 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 프롤릴-4-하이드록실화효소는 PDI 도메인의 결실을 갖도록 유전자 변형되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 개선된 발현 및 퍼옥시좀으로의 전입을 위해 유전자 변형되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 개선된 발현 및 퍼옥시좀으로의 전입을 위해 유전자 변형되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퍼옥시좀 표적화 서열에 대한 상기 이종 단백질의 융합은 상기 이종 단백질의 상기 퍼옥시좀으로의 표적화를 초래하고, 이에 의해 상기 퍼옥시좀으로 표적화되지 않은 효소로부터 상기 이종 단백질을 분리하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퍼옥시좀 표적화 서열에 대한 상기 변형 단백질의 융합은 상기 변형 단백질의 상기 퍼옥시좀으로의 표적화를 초래하고, 이에 의해 상기 퍼옥시좀으로 표적화되지 않은 기질 또는 효소로부터 상기 변형 단백질을 분리하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질은 COLsyn2, COLsyn3, 또는 COLsyn2 또는 COLsyn3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산은 변형되지 않은 제1 핵산 또는 천연발생인 제1 핵산과 비교하여 상기 이종 단백질에서 적어도 하나의 소수성 아미노산이 친수성 또는 비-소수성 아미노산으로 대체되도록 조작되는, 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하는 진핵 세포.
  30. 퍼옥시좀에서 단백질을 생산하는 진핵 세포로서,
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 핵산; 및
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 암호화하는 제2 핵산
    을 포함하는, 진핵 세포.
  31. 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 진핵 세포로서,
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소
    를 발현할 수 있는, 진핵 세포.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 단백질이 상기 퍼옥시좀에서 변형되는, 진핵 세포.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 파스토리스(Pastoris)인, 진핵 세포.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퍼옥시좀-표적화 서열은 서열번호 1, 2 또는 3에 기재된 서열을 포함하는, 진핵 세포.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 단백질을 암호화하는 제3 핵산을 더 포함하는, 진핵 세포.
  36. 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법으로서,
    상기 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현하고,
    제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 세포 또는 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항의 세포를 제공하는 단계;
    상기 진핵 세포에서 이종 단백질을 발현하는 단계로서, 상기 이종 단백질은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합되는, 상기 이종 단백질을 발현하는 단계; 및
    상기 이종 변형 효소가 상기 퍼옥시좀에서 상기 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하도록 하는 조건 하에서 상기 진핵 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  37. 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법으로서,
    상기 세포는 퍼옥시좀을 포함하고, 상기 진핵 세포는 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소를 발현하고,
    진핵 세포에서 이종 단백질을 발현하는 단계로서, 상기 이종 단백질은 퍼옥시좀-표적화 서열에 융합되는, 상기 이종 단백질을 발현하는 단계; 및
    상기 이종 변형 효소가 퍼옥시좀에서 상기 이종 단백질을 변형시켜 변형 단백질을 생산하도록 하는 조건 하에서 상기 진핵 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 진핵 세포에서 변형 단백질을 생산하는 방법.
  38. 변형 단백질을 생산하는 방법으로서,
    상기 변형 단백질이 생산되도록 하는 조건 하에서 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 상기 진핵 세포는
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질 및
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소
    를 발현하고, 상기 이종 변형 효소가 상기 배양 조건 하에서 상기 퍼옥시좀에서 상기 이종 단백질을 변형시켜 상기 변형 단백질을 생산하는, 변형 단백질을 생산하는 방법.
  39. 변형 단백질의 수율을 증가시키는 방법으로서,
    상기 변형 단백질이 생산되도록 하는 조건 하에서 퍼옥시좀을 함유하는 진핵 세포를 배양하는 단계를 포함하되, 상기 진핵 세포는
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 단백질로서, 상기 이종 단백질의 발현이 프로모터의 영향 하에 있는, 단백질 및
    퍼옥시좀-표적화 서열에 융합된 이종 변형 효소
    를 발현하고, 상기 이종 변형 효소가 상기 배양 조건 하에서 상기 퍼옥시좀에서 상기 이종 단백질을 변형시켜 상기 변형 단백질을 생산하는, 변형 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 이종 단백질의 생산은 화학적 유도제에 의해 유도되는, 변형 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 방법은 상기 퍼옥시좀의 화물(cargo)을 증가시키는 단계를 더 포함하되, 상기 퍼옥시좀의 화물을 증가시키는 것은 상기 진핵 세포에 올레산 또는 메탄올을 제공하여 수행되는, 변형 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
  42. 세포의 퍼옥시좀에서 변형 단백질을 생산하는 키트로서,
    GFP-x-ePTS1 또는 x-FLAG-ePTS1을 포함하는 제1 핵산 작제물로서, x는 퍼옥시좀으로 표적화되는 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열인, 상기 제1 핵산 작제물 및
    GFP-y-ePTS1 또는 y-FLAG-ePTS1을 포함하는 제2 핵산 작제물로서, y는 퍼옥시좀으로 표적화되는 변형 효소를 암호화하는 핵산 서열이고, 상기 변형 효소는 상기 퍼옥시좀에서 상기 이종 단백질을 변형시키도록 구성된, 상기 제2 핵산 작제물
    을 포함하는, 키트.
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