JP2022537640A - ペルオキシソームにおける修飾タンパク質の発現 - Google Patents

Abstract

本明細書中の開示は、ペルオキシソーム中でタンパク質を作製するための方法及び組成物、並びにペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための細胞を作製するための方法を含む。ペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための細胞、及び本明細書に記載されるペルオキシソームを含有する真核細胞中でタンパク質を産生するための方法もまた、本明細書に開示される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／８４７，７６９号の利益を主張する。

電子書式の一覧と表のシーケンスの参照
本出願は、２０２０年５月７日に作成され、サイズが２３５ＫＢであり、ＰＢＦＡＢ００１ＷＯ２ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴと題された電子配列リストと共に出願される。電子配列リスト中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

当技術分野では、細胞中のタンパク質を産生及び修飾する改善された方法が必要とされている。細胞内で産生され、修飾されたタンパク質は、様々な方法で使用される。

本明細書では、例えば人工材料に使用することが可能な、タンパク質及びタンパク質前駆体を産生するように、細胞を遺伝的に改変するための方法及び組成物が提供される。

本明細書は、フィルム開発における製品のための基材、丸剤（薬物及び栄養補助食品中のゼラチン）のためのカプセル、食品添加物（例えば、ゼラチンの全てのもの）及び食品及び合成肉のためのコラーゲン、合成皮革などのテキスタイル、美容製品、並びに生物医学材料（足場、縫合糸、移植片、細胞増殖材料（expanding cells）、ゲルなど）などの材料のための前駆体（precursors）として作用しうるタンパク質を製造するための方法を記載することを企図する。このような方法を使用することはまた、今日使用されている標準的な製造方法より製造物のカーボンフットプリントを減少させる材料を提供するであろう。

材料の製造に使用され得るタンパク質前駆体が企図される。従来的に製造されたテキスタイルと比較して温室効果ガス放出を低下させる細胞工学及び組織工学技術を用いて、例えば、人工的に製造されたテキスタイルのような、次世代のテキスタイルが企図される。

タンパク質前駆体は例えば、フェイスクリーム、注射可能な薬物、及び創傷包帯に見出すことができるコラーゲン由来製品として使用しうる。

タンパク質及びタンパク質前駆体（例えば、人工材料において使用しうるもの）を産生するように細胞を遺伝的に改変するための方法及び組成物が、本明細書中で提供される。

本明細書中に提供されるいくつかの実施形態は、ペルオキシソーム中で改変タンパク質を産生するために遺伝子改変細胞を作製するための方法及び組成物に関する。本明細書に記載の修飾タンパク質は、テキスタイル、人工皮膚又は他の材料などの材料を製造するための構成要素（building blocks）として使用することができる。細胞産生系における使用のために、いくつかのテキスタイルにおいて見出されるタンパク質の産生が意図される。

本明細書中に提供されるいくつかの実施形態は、ペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生するための細胞を作製する方法に関する。いくつかの実施形態では、前記方法は、細胞を提供する工程、細胞に第１の核酸を導入する工程、及び細胞に第２の核酸を導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする第１の配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は真正細菌又は古細菌である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞がＡｒｘｕｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｏｇａｔａｅａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はＹａｒｒｏｗｉａ属から選択される。いくつかの実施形態では、第１の核酸及び／又は第２の核酸がプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的又は誘導性である。いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列は配列番号１（ＳＬＫ）、配列番号２（ＲＬＸＸＸＸＸ（Ｈ／Ｑ）Ｌ）、又は配列番号３（ＬＧＲＧＲＲＳＫＬ）に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はタグを含む。いくつかの実施形態では、タグは切断可能（cleavable）である。いくつかの実施形態では、前記方法は第３の核酸を細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の核酸はペルオキシソーム標的化配列に融合された第２の異種修飾酵素をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は１Ｄａ、５Ｄａ、１０Ｄａ、２０Ｄａ、３０Ｄａ、４０Ｄａ、５０Ｄａ、６０Ｄａ、７０Ｄａ、８０ｋＤａ、９０Ｄａ、１００Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、４００Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ、１ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２４０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、若しくは３００ｋＤａ、又は前述の値のうち任意の２つによって定義される範囲内の任意のサイズを有する。いくつかの実施形態では、酵素は修飾を生成する。いくつかの実施形態では、修飾はタンパク質の折り畳みである。いくつかの実施形態では、タンパク質は折り畳みを解かれる（unfolded）。いくつかの実施形態では、修飾はタンパク質の折り畳み、ヒドロキシル化、グリコシル転移、酸化、及び／又は異性化である。いくつかの実施形態では、酵素はプロリルヒドロキシラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパク質シャペロン、又はプロリルイソメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、酵素はグリコシルトランスフェラーゼ、プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、又はプロリルヒドロキシラーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、又は絹タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、酵素がグリコシルトランスフェラーゼ、プロリルヒドロキシラーゼ、又はプロリルイソメラーゼを含む。タンパク質がコラーゲンであるいくつかの実施形態では、コラーゲンがＩ型ヘテロトリマーコラーゲン、１型アルファホモトリマーコラーゲン、又はＩＩＩ型ホモトリマーコラーゲンをもたらすように修飾される。いくつかの実施形態では、コラーゲンはＣｏｌ１Ａ１又はＣｏｌ１Ａ２を含む。いくつかの実施形態では、プロリル－４－ヒドロキシラーゼがＰＤＩドメインの欠失を有するように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、酵素は、改善された発現及びペルオキシソームへのインポートのために遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、改善された発現及びペルオキシソームへのインポートのために遺伝的に改変される。いくつかの実施形態では、核酸は酵母細胞などの真核細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列への異種タンパク質の融合が異種タンパク質にペルオキシソームを標的とさせ、それによって、ペルオキシソームを標的とさせられていない酵素から異種タンパク質を分離する。いくつかの実施形態では、修飾酵素のペルオキシソーム標的化配列への融合が修飾酵素にペルオキシソームを標的とさせ、それによってペルオキシソームを標的とさせられていない基質又は酵素から修飾酵素を分離する。いくつかの実施形態では、異種タンパク質はＣＯＬｓｙｎ１、ＣＯＬｓｙｎ２、ＣＯＬｓｙｎ３、ＣＯＬｓｙｎ４、又はＣＯＬｓｙｎ１、ＣＯＬｓｙｎ２、ＣＯＬｓｙｎ３、若しくはＣＯＬｓｙｎ４のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸は、未改変又は天然に存在する第１の核酸と比較して、異種タンパク質中の少なくとも１つの疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸又は非疎水性アミノ酸に置換するように設計される。

本明細書中に提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に提供される任意の方法によって製造される、ペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための真核細胞に関する。

本明細書中に提供されるいくつかの実施形態は、ペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための真核細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする配列を含む第１の核酸と、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の核酸と、を含む。

本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、修飾タンパク質を産生するためのペルオキシソームを含む真核細胞に関する。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質はペルオキシソーム中で修飾される。いくつかの実施態様において、細胞はＰａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列は配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された第２のタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。

本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ペルオキシソームを含有する真核細胞において修飾タンパク質を産生する方法に関する。いくつかの実施形態では、真核細胞がペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記方法によって製造された細胞又は本明細書に記載の代替物のいずれか一種の細胞を提供すること、真核細胞中で異種タンパク質を発現させること、及び異種修飾酵素がペルオキシソーム中で異種タンパク質を修飾して修飾タンパク質を産生するような条件下で真核細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ペルオキシソーム標的化配列に融合されている。いくつかの実施形態では、前記方法はペルオキシソームのカーゴ（cargo）を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ペルオキシソームのカーゴの増加は、真核細胞にオレイン酸又はメタノールを提供することによって行われる。

本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、ペルオキシソームを含有する真核細胞において修飾タンパク質を産生する方法に関する。いくつかの実施形態では、真核細胞がペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する。いくつかの実施形態では、前記方法は、真核細胞中で異種タンパク質を発現させること、及び異種修飾酵素がペルオキシソーム中で異種タンパク質を修飾して修飾タンパク質を産生するような条件下で真核細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、異種タンパク質は、ペルオキシソーム標的化配列に融合されている。いくつかの実施形態では、前記方法はペルオキシソームのカーゴを増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ペルオキシソームのカーゴの増加は、真核細胞にオレイン酸又はメタノールを提供することによって行われる。

本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、修飾タンパク質を産生する方法に関する。いくつかの実施形態では、前記方法は、修飾タンパク質が産生されるような条件下で、ペルオキシソームを含有する真核細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、真核細胞が、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する。いくつかの実施形態では、異種修飾酵素が、培養条件下で異種タンパク質を修飾してペルオキシソーム中において修飾タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、前記方法はペルオキシソームのカーゴを増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ペルオキシソームのカーゴの増加は、真核細胞にオレイン酸又はメタノールを提供することによって行われる。

本明細書中に提供されるいくつかの実施形態は、修飾タンパク質の収率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、前記方法は、修飾タンパク質が産生されるような条件下で、ペルオキシソームを含有する真核細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、真核細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する。いくつかの実施形態では、異種タンパク質の発現がプロモーターの影響下にある。いくつかの実施形態では、化学的誘導物質の添加によって異種タンパク質の産生を誘導し、異種修飾酵素が、培養条件下で異種タンパク質を修飾してペルオキシソーム中において修飾タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、前記方法はペルオキシソームのカーゴを増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ペルオキシソームのカーゴの増加は、真核細胞にオレイン酸又はメタノールを提供することによって行われる。

いくつかの実施形態は、細胞中のペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットがＧＦＰ－ｘ－ｅＰＴＳ１又はｘ－ＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１を含む第１の核酸構築物と、ＧＦＰ－ｘ－ｅＰＴＳ１又はｙ－ＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１を含む第２の核酸構築物とを含む。いくつかの実施形態では、ｘはペルオキシソームに標的化される異種タンパク質をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態ではｙはペルオキシソームに標的化される修飾酵素をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態では、修飾酵素がペルオキシソーム中で異種タンパク質を修飾することができる酵素である。

タンパク質及び酵素を細胞のペルオキシソームに仕向ける例を表す概略図を示す。 いくつかの実施形態による、遺伝子改変された酵母の発酵、翻訳的に修飾されたタンパク質（translationally modified proteins）の精製の概略図を示す。 野生型（上段）又は欠失ＰＥＸ５遺伝子で修飾され融合タンパク質を発現する（下段）、Ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の顕微鏡データの画像を示す。融合体は、合成コラーゲンペプチド及びコラーゲン修飾酵素に融合したＮ－末端ＧＦＰ及びＣ－末端ｅＰＴＳ１を含む。 異なる工業用酵母宿主ＰＢＨ００１、ＰＢＨ００２、及びＰＢＨ００４のそれぞれを代表する株ＰＢ００００９５、ＰＢ０００１６３、ＰＢ０００２９７における、ＧＦＰ及びＣ－末端ｅＰＴＳ１に融合したコラーゲン変異体の蛍光局在化を示す。 ＹＰＤ又はＹＰガラクトースプレート上で連続希釈された株のコロニー増殖を示す。株はＧＡＬ－ＳｉｇＤ１－３５１－ｅＰＴＳ１（上）又はＧＡＬ－ＳｉｇＤ１－３５１（下）を発現する。 ペルオキシソーム局在化ＲＦＰ－ｔｅｖ－ＴＦＰ－ｅＰＴＳ１基質（パネルＡ）又は細胞質ＲＦＰ－ｔｅｖ－ＹＦＰ基質（パネルＢ）に対するペルオキシソーム局在化ＴＥＶ－ＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１プロテアーゼ活性のウェスタンブロットの画像を示す。ＴＥＶプロテアーゼの発現は、異なる構成的又は誘導的プロモーター及び増殖条件により制御された。（１)ｐＴＥＦ１、（２)ｐＲＰＬ１８Ｂ、（３)ｐＧＡＬ１、デキストロースにより抑制、（４)ｐＧＡＬ１、ラフィノース及びデキストロースにより抑制、（５)ｐＧＡＬ１、がラフィノース及びガラクトースにより誘導。ウェスタンブロットを抗ｔＲＦＰ抗体でプローブして、全長５４ｋＤａ基質又は２７ｋＤａ切断産物を認識した。 ペルオキシソーム中のコラーゲンに対するＢａｎｔ Ｐ４Ｈヒドロキシラーゼ活性を示す。パネルＡは、株のリストを示す。Ｂａｎｔ Ｐ４ＨはＴＤＨ３プロモーターから発現され、コラーゲン基質はＴＥＦ１プロモーターから発現される。パネルＢは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを用いた各株からのコラーゲン基質のアラインメントを示す。コンセンサス配列は、１．ＰＢ０００２２４；２．ＰＢ０００２４８；及び３．ＰＢ０００２４９が同じ配列（配列番号７１）を示し、４．ＰＢ０００２２５；５．ＰＢ０００２５４及び６．ＰＢ０００２５５が同じ配列（配列番号７２）を示すことを表す。アミノ酸の下の灰色のボックスは、酸化されることがＬＣＭＳＭＳによって同定されたプロリン位置を示す。パネルＣは、各修正サイトにおけるＬＣＭＳＭＳ結果の詳細を示す。 ＧＦＰタグに融合したｅＰＴＳ１タグ付き全長コラーゲンであるＡｍＣｏｌ１Ａ又はＡｍＣｏｌ１Ａ２、及びｍＲｕｂｙタグに融合したｅＰＴＳ１タグ付きＢａｎｔＰ４Ｈヒドロキシラーゼ酵素の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中におけるインビボ蛍光局在化を示す。画像は、それぞれ、ＧＦＰ及びｍＲｕｂｙ検出のための個々のＦＩＴＣ及びＴｅｘａｓＲｅｄチャネルとして示される。マージされた画像はＦＩＴＣ及びＴｅｘａｓＲｅｄチャネルのオーバーラップであり、両方のタンパク質の共局在化を意味する。

定義
本明細書で提供されるタイトル、見出し、及びサブ見出しは、本開示の様々な態様を限定するものとして解釈されるべきではない。したがって、以下で定義される用語は、その全体が本明細書を参照することによって、より完全に定義される。

別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は、単数を含むものとする。

本出願では、特に断らない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。多項従属クレームの文脈において、「又は」の使用は選択肢においてのみ、２以上の先行する独立クレーム又は従属クレームに言及する。また、「要素（element）」又は「構成要素（component）」などの用語は特に断らない限り、１つのユニットを含む要素及び構成要素の両方、並びに２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成要素を包含する。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに任意の単数形の単語の使用は明示的かつ明白に１つの参照に限定されない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。本明細書で使用される用語「含む」及びその文法的変形は、リスト内の項目の列挙が列挙された項目に置換又は追加され得る他の同様の項目を排除するものではないように、非限定的であることが意図される。

本明細書に記載される任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲又は整数範囲は特に指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合にはその分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。

単位、接頭辞、及び記号は、Systeme International de Unites（ＳＩ）で受容される形式で示される。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。測定値は、有効数字及び測定に関連する誤差を考慮して、近似値であると理解される。

本開示に従って利用される以下の用語は別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。

本明細書で使用される用語「約」は明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。用語「約」は一般に、当業者が列挙された値と同等である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と考える数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／－５～１０％）を指す。少なくとも及び約のような用語が数値又は範囲のリストに先行する場合、用語は、リストに提供される値又は範囲のすべてを修飾する。場合によっては、用語「約」が最も近い有効数字に四捨五入された数値を含むことができる。

「ペルオキシソーム」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、例えば、非常に長鎖の脂肪酸、分岐鎖の脂肪酸、Ｄ－アミノ酸、及びポリアミンの異化、活性酸素種の還元、プラスマロゲン（すなわち、哺乳動物の脳及び肺の正常な機能に重要なエーテルリン脂質）の生合成のためのオルガネラを含み得るが、これらに限定されない。ペルオキシソームはまた、いくつかの酵母において、グリオキシレートサイクル、解糖及びメタノール並びに／又はアミン酸化及び同化のために機能し得る。ペルオキシソームはまた、それ自体の天然酵素を有し得る。限定するものではないが、酵素は例えば、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ及び尿酸オキシダーゼのような酸化酵素のためのカタラーゼを含むことができる。本明細書中の実施形態において、ペルオキシソームはタンパク質を作製するために、又はタンパク質の修飾のために機能し得る。

タンパク質への「修飾（Modifications）」は、本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有する。限定するものではないが、修飾には一次、二次、三次、及び四次構造でのタンパク質の変化；共有結合修飾の付加、タンパク質の折り畳み、多サブユニット複合体の四次構造へのタンパク質の集合、並びに翻訳後修飾が含まれ得る。プロリルヒドロキシル化に加えて他の修飾もまた、ペルオキシソームにおいて達成可能である。ペルオキシソームは、修飾酵素による修飾基質として働く多くの小分子に対して自然に透過性（naturally permeable）である。実際、ペルオキシソームは、約７００ダルトンより小さい分子がこのオルガネラ中に自由に拡散することができるサイズゲーティング（size gating）を有することが決定されている。ペルオキシソーム中に自由に拡散できない基質は、輸送されなければならない。輸送は、ペルオキシソーム膜を標的とする膜タンパク質を介して、特異的に又は無差別にインポートされ得る。

「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片、並びに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）若しくは天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー形態）のモノマー、又は両方の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン又はプリン塩基部分に変化（alterations）を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による１つ若しくは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、又は糖はエーテル若しくはエステルとして官能基が付加され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの、立体的及び電子的に類似の構造体と置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又はその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、又はそのような結合の類似結合によって結合され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホロアミダートなどが含まれる。用語「核酸分子」はまた、ポリアミド骨格に結合した天然に存在するか又は改変された核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」を含む。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであってよい。いくつかの選択肢において、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする配列を含む核酸配列が提供される。いくつかの選択肢では、核酸はＲＮＡ又はＤＮＡである

「真核生物」細胞は藻類細胞、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞（例えばＴ細胞）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞がコマガテラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、及びオガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）からなるメチロトローフ酵母の属から選択される。いくつかの実施形態では、細胞はさらなる出芽酵母の属であるＡｒｘｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＹａｒｒｏｗｉａから選択される。

「真正細菌細胞」は、本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有する。真正細菌細胞は、主にリン脂質からなる細胞膜によって取り囲まれている。この膜は細胞の内容物を包み込み、細胞質の栄養分、タンパク質や他の必須成分を細胞内に保持する障壁として働く。しかし、真核細胞とは異なり、真正細菌は通常、核、ミトコンドリア、葉緑体及び真核細胞に存在する他の細胞小器官などの大きな膜結合構造を細胞質に欠いている。タンパク質発現のための真正細菌は例えば、大腸菌を含み得る。

「古細菌」は、明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有する。古細菌（Archaebacteria又はArchaea）は、極端に熱い水熱ベントによって海底などの極端な環境に生息しうる。古細菌も真正細菌も非常に類似している。どちらも単細胞の原核生物で、細胞壁と細胞膜を有する。それらの間の主な違いは、それらの化学構造とそれらが生きている場所である。例としては好熱菌、好塩菌、及びメタン生成菌が挙げられるが、これらに限定されない。

「プロモーター」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの選択肢では、プロモーターが構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、共通ヌクレオチド配列によって特徴づけられる場合が多い。これらのプロモーターエレメントとしてはＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント（ＤＳＥ；ＭｃＧｅｈｅｅら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：５５１（１９９３）；その全体が参照により組み込まれる）、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、血清応答因子（ＳＲＥ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１：４７（１９９０）；その全体が参照により組み込まれる）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、及びＣＲＥ/ＡＴＦ(Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９３８（１９９２）；その全体が参照により組み込まれる）、ＡＰ２（Ｙｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７２８（１９９４）；その全体が参照により組み込まれる）、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．３：２５３（１９９３）；その全体が参照により組み込まれる）；及びオクタマー因子（一般に、Ｗａｔｓｏｎら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ第４版(Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、１９８７；その全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）、並びにＬｅｍａｉｇｒｅ及びＲｏｕｓｓｅａｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ. ３０３:１（１９９４）；その全体が参考として援用される）が挙げられる。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、構成的に活性、抑制性又は誘導性であり得る。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質に応じて増大する。これとは対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質による調節を受けない。本明細書中のいくつかの実施形態において、提供される核酸は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターがタンパク質翻訳のための酵母プロモーターである。いくつかの実施形態において、細胞がピキアである場合、プロモーターは、メタノール誘導性プロモーター、ＰAOX1又は構成的プロモーターＰGAPを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターがｐＡＯＸ、ｐＧａｌ、ｐＣｕｐ、ｐＧＥＭ、又はｐＺＰＭを含む。

ペルオキシソーム標的化シグナル（peroxisomal targeting signal：ＰＴＳ）は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、レセプターが認識して結合するペルオキシソームタンパク質の領域を含み得る。このモチーフを含むタンパク質は、ペルオキシソームに局在する。本明細書中のいくつかの実施形態では、ＰＴＳに作動可能に連結されたタンパク質配列を含む核酸が提供される。

「タンパク質タグ」又は「タグ」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、組換えタンパク質上に遺伝的にグラフトされたペプチド配列を含み得る。しばしば、これらのタグは化学物質によって、又は酵素的手段（例えば、タンパク質分解又はインテインスプライシング）によって、除去することが可能である。タグは例えば、精製又は可溶化のためのアフィニティータグとしてのような、種々の目的のためにタンパク質に付着される。タグはまた、ペルオキシソーム中にある間のタンパク質安定性のために、タンパク質又は酵素に付加され得る。本明細書中のいくつかの実施形態において、ペルオキシソームにおいて修飾のために発現されるタンパク質はタグを含む。いくつかの実施形態では、タグがヒスチジン（例えば、ＨＩＳ６）、マルトース結合タンパク質、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、Ｆｃドメイン、及びＳｔｒｅｐタグからなる群より選択される。

「タンパク質」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子を含み得る。従って、タンパク質はペプチド（これはペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸モノマーの鎖であり、任意の１つ以上のアミノ酸によって形成される）を含み得る。タンパク質又はペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含むことができ、タンパク質又はペプチド配列に含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。限定するものではないが、アミノ酸は例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、シスチン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、ピロリジン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、オルニチン、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びセレノシステインである。タンパク質はまた、非天然アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸取り込みは、アンバーコドン抑制によって行われる。タンパク質はまた、例えば、炭水化物基などの非ペプチド成分を含むことができる。炭水化物置換基及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加され得、細胞の型によって変わる。タンパク質はそれらのアミノ酸骨格構造に関して本明細書中で定義される。炭水化物基のような置換基が一般的に特定されないが、それにもかかわらず存在し得る。本明細書中に記載されるいくつかの選択肢において、ペルオキシソーム中で修飾タンパク質を作製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質がコラーゲン、ゼラチン又は絹タンパク質を含む。いくつかのテキスタイルでは、グロブリン様タンパク質、ケラチン、コラーゲン加水分解物、コラーゲンペプチド及びコラーゲンなどのタンパク質も考えられる。

「コラーゲン」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、皮膚及び他の結合組織において見出される構造タンパク質を含み得る。本明細書中のいくつかの実施形態において、コラーゲンは、ペルオキシソームにおいて修飾される。

「ゼラチン」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、例えば、コラーゲンから調製される水溶性タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、ゼラチンは、ペルオキシソームにおける修飾のために提供される。

「イソメラーゼ」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、特定の化合物の異性体への変換を触媒する酵素を含み得る。当業者は例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、シス－トランスイソメラーゼ、及び分子内トランスフェラーゼなどの多くのタイプのイソメラーゼが存在することを理解するであろう。

「ヒドロキシルトランスフェラーゼ」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、プロリルヒドロキシラーゼ及びリシルオキシダーゼのような酵素を含み得る。

「グリコシルトランスフェラーゼ」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、そして例えば、グリコシド結合を確立する酵素を含み得る。

当業者は、遺伝子発現レベルが多くの因子（例えば、プロモーター配列及び調節エレメント）に依存することを理解する。最大のタンパク質選択のもう一つの因子は、転写産物遺伝子のコドンを宿主の典型的なコドン使用に適応させることである。大部分の細菌や酵母細胞について述べたように、たとえばコドンの小さなサブセットはｔＲＮＡ種によって認識され、翻訳選択を導く。翻訳選択はタンパク質発現の重要な制限となりうる。この観点で、多くの合成遺伝子は、それらのタンパク質発現レベルを増加させるように設計され得る。コドン最適化の設計プロセスは、稀なコドンを、最大のタンパク質発現効率を増加させることが知られているコドンに変更することであり得る。いくつかの選択肢において、コドン選択が記載され、ここでコドン選択は、より高いレベルの転写及びタンパク質収率のために最適化された合成遺伝的転写物を作製すると当業者に知られているアルゴリズムを使用することによって行われる。コドン最適化のためのアルゴリズムを含むプログラムは、当業者に公知である。プログラムは例えば、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭ、ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）アルゴリズムなどを含むことができる。さらに、合成コドン最適化配列は例えば、Integrated DNA Technologies及び他の商業的に入手可能なＤＮＡ配列決定サービスから商業的に入手することができる。いくつかの選択肢において、タンパク質は、改変のためのタンパク質の遺伝子が酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ）における発現のためにコドン最適化されるように調製される。いくつかの選択肢において、タンパク質又は酵素が記載され、ここで、タンパク質又は酵素のための完全な遺伝子転写物のための遺伝子は、酵母ペルオキシソームにおける修飾のためのタンパク質の濃度を増加させ得る、酵母のような真核細胞における発現のためにコドン最適化される。

「精製」は本明細書に照らして読まれる場合、その平易かつ通常の意味を有し、例えば、高度に精製された細胞、ペルオキシソーム及びタンパク質の単離を含み得る。細胞精製の方法において、細胞は支持体（例えば、プラスチック又はポリカーボネートの表面、ビーズ、粒子、プレート、又はウェル）に付着したリガンドに結合するそれらの能力によって、単離、分離、又は選択され得る。細胞は特定の細胞表面マーカーに基づいて結合することができ、これにより細胞を精製することができる。ペルオキシソームの場合、当業者は、例えば遠心分離などのペルオキシソーム精製のための方法を理解するであろう。タンパク質を精製することもできる。タンパク質精製の方法は当業者に公知であり、例えば、サイズ排除及びアフィニティークロマトグラフィーなどである。

テキスタイル及びアクセサリー（accessories）は、頻繁に購入され、最も頻繁に交換される消費者製品である。さらに、ほとんどの衣服は長持ちせず、頻繁な交換を必要とする。衣服については、回転率が高く、生産量が多く、エネルギー集約的に消費されるため、衣服は資源消費と温室効果ガス排出の点で重要な製品カテゴリーとなっている。

衣服を作ることに関連する問題を回避するために、衣服及びアクセサリーのカーボンフットプリントなどのいくつかの領域に対処する必要がある。カーボンフットプリントは、組織、事象、製品、又は人によって引き起こされる温室効果ガス排出の総セットとして説明することができる。本明細書では、テキスタイル生産に関連するカーボンフットプリントを低下させるための方法及び細胞を扱う。例えば、衣類のアイテムのカーボンフットプリントはそのアイテムのライフサイクルにわたって排出される二酸化炭素（ＣＯ_２）及び他の温室効果ガスの総量であり、ＣＯ_２当量のキログラムとして表される。これには、原材料の製造、アイテムの製造、材料及び完成アイテムの輸送、包装、多数の洗浄及び乾燥サイクルを含む使用段階、並びに使用済み廃棄において発生するすべての温室効果ガスが含まれる。

他の材料のためのタンパク質前駆体も考えられる。細胞によって産生されるタンパク質はいくつかの材料（例えば、フィルム開発のための製品；丸剤（薬物及び栄養補助食品中のゼラチン）のためのカプセル；食品添加物（例えば、ゼラチンの全て）及び食品及び合成肉のためのコラーゲン、合成皮革、美容製品、並びに生物医学材料（足場、縫合糸、移植片、増殖細胞、ゲルなど）の前駆体であり得る。

高カーボンフットプリントに関連する問題を回避するために、テキスタイルを製造するための前駆体を製造する方法が記載される。本明細書の実施形態に記載されるように、ペルオキシソームなどの細胞小器官内の細胞において修飾タンパク質を作製する方法である。ペルオキシソームは普遍的で多機能性の細胞小器官であり、主として細胞の脂質代謝における役割が知られている。ペルオキシソームは正常な機能の一部として酸化還元反応を触媒する可能性のあるペルオキシソーム酵素を含み、これらのオルガネラは、酸化ストレス関連シグナル伝達経路の潜在的調節因子としてもますます認識されている。

プロセシングをペルオキシソーム内で起こすために、シグナル伝達配列によってタンパク質がペルオキシソームに移動するように仕向けてもよい。シグナル伝達配列をコードする配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結され得る。タンパク質の翻訳後、タンパク質はペルオキシソームに仕向けられる。

ペルオキシソームは、１９６５年の発見以来十分に記載されている（Ｓａｂａｔｉｎｉら; ＰＮＡＳ Ａｕｇｕｓｔ １３，２０１３．１１０（３３）１３２３４－１３２３５及びＰｕｒｄｕｅら；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（２００１）１７:７０１－５２; 参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ペルオキシソームはＤＮＡとリボソームを欠く小さな細胞小器官で、１枚の膜で裏打ちされている。ペルオキシソームタンパク質は核の遺伝子にコードされており、細胞質基質の遊離リボソーム上で合成された後、既存のペルオキシソームに取り込まれる。細胞の寿命の間、ペルオキシソームは例えば、タンパク質及び脂質の付加によって拡大し得、そして最終的に分裂して新しい１つのペルオキシソームを形成しうる。

ペルオキシソームのサイズ及び酵素組成は変化し得る。しかしながら、ペルオキシソームは全て、分子状酸素を使用して種々の基質を酸化し、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を形成する酵素を含みうる。ペルオキシソームは、Ｈ_２Ｏ_２ベースの呼吸並びに脂肪酸β酸化のために知られている。限定するものではないが、ペルオキシソームの機能は例えば、エーテル脂質（プラスマロゲン）合成及びコレステロール合成、発芽種子におけるグリオキシレートサイクル（「グリオキシソーム」）、光呼吸、トリパノソーマにおける解糖（「グリコソーム」）、並びに酵母におけるメタノール及び／又はアミンの酸化及び同化を含み得る。

ペルオキシソームでプロセシングを受けるよう仕向けられたタンパク質は、折りたたまれたタンパク質のペルオキシソーム基質への侵入を指示するＣ－及び／又はＮ－末端標的化配列を有しうる。翻訳と細胞質リボソームからの放出の後、新たに合成されペルオキシソームに標的化されるタンパク質は、細胞小器官に輸送される前に、細胞質基質で成熟した立体構造に折りたたまれることがある。折りたたみはシャペロンタンパク質の助けによっても起こりうる。ペルオキシソームへのタンパク質の輸送にはＡＴＰ加水分解が必要であるが、いくつかの輸送系とは異なり、ペルオキシソーム膜を横切る電気化学的勾配はない。輸送のためのタグは、以前に記載されている（Ｐｕｒｄｕｅら）。いくつかの実施形態において、タンパク質は、シャペロンタンパク質の補助によって折りたたまれる。

ペルオキシソームに標的化されるいくつかのタンパク質の取り込み標的化シグナル（uptake-targeting signal）は、Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ配列（１文字コードのＳＫＬ）又はタンパク質のＣ－末端の関連配列である。ＳＫＬシグナルは細胞質基質中で可溶性受容体タンパク質（例えば、ペルオキシン）に結合し得る。ペルオキシン（ＰＴＳ）には、ＰＴＳ１やＰＴＳ２などいくつかのクラスがある。その結果生じるＰＴＳ１Ｒ－カタラーゼ複合体は、受容体タンパク質に結合する。ペルオキシソーム膜にある細胞質受容体（例えばＰＴＳ１に対するＰｅｘ５ｐやＰＴＳ２に対するＰｅｘ７ｐなど）が同定されており、それに続いて標的タンパク質がペルオキシソーム内に輸送される。ＳＫＬ配列は、ペルオキシソームに入った後、カタラーゼから切断されない。

限定するものではないが、基質タンパク質はＮ－末端に取り込み標的化配列を有する前駆体（precursors with an N-terminal uptake-targeting sequence）として合成され得る。このタイプの取り込み標的化シグナルをもつタンパク質は、ＰＴＳ１Ｒと同様にペルオキシソーム膜上のＰｅｘ１４ｐ受容体に前駆体タンパク質をエスコートするＰＴＳ２Ｒと名づけられた別の細胞質受容体タンパク質に結合する。このようなタンパク質のインポートに続いて、Ｎ－末端標的化配列が切断される。ペルオキシソーム膜タンパク質も遊離ポリリボソーム上で合成され、合成後ペルオキシソームに取り込まれる。タンパク質をペルオキシソーム膜に標的化するシグナルはＳＫＬ配列を含まないが、この取り込みプロセスについてはほかにほとんど知られていない。

プロリルヒドロキシル化に加えて他の修飾もまた、ペルオキシソームにおいて達成可能である。例えば、コラーゲンのようなタンパク質基質は、ペルオキシソームインポートタグでタグ付けすることを介してグリコシルトランスフェラーゼ酵素をペルオキシソームに同時インポートすることによって、グリコシル化され得る。ペルオキシソームは、修飾酵素による修飾基質として働く多くの小分子に対して自然に透過性である。ペルオキシソーム中に自由に拡散できない基質は、輸送されなければならない。輸送は、ペルオキシソーム膜に標的化された膜タンパク質を介して、特異的に又は無差別にインポートされ得る。

修飾はまた、ペルオキシソームの細胞質表面においても起こり得る。限定するものではないが、これらの修飾には例えば、ユビキチン化及びリン酸化が含まれ得る。

シャペロンタンパク質はまた、ペルオキシソーム転位のためにタグ化され得る。このように、シャペロンはペルオキシソーム内で移動したタンパク質を正しく折りたたむためにペルオキシソームにおいて使用されることがある。

修飾タンパク質の製造のために遺伝子改変された細胞を作る方法
いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生するための細胞を作製する方法が提供される。工程は細胞を提供する工程、第１の核酸を細胞に導入する工程（ここで、第１の核酸はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする第１の配列を含む）、及び第２の核酸を細胞に導入する工程（ここで、第２の核酸はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の配列を含む）を含み得る。細胞は真核細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、導入は、塩化カルシウムの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、導入がエレクトロポレーションなど、当業者に知られている標準的な形質転換技術によって行われる。

いくつかの実施形態では、細胞が酵母細胞、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris又はOgataea polymorphaである。Pastoris細胞については例えば、核酸がメタノールの存在下でタンパク質の誘導を可能にするプロモーターを有し得る。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の核酸がプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的又は誘導性である。

いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列が配列番号１（ＳＬＫ）、配列番号２（ＲＬＸＸＸＸＸ（Ｈ／Ｑ）Ｌ）、又は配列番号３（ＬＧＲＧＲＲＳＫＬ）に示される配列を含む。

いくつかの実施形態では、タンパク質はタグを含む。いくつかの実施形態では、タグは切断可能である。タグは、ペルオキシソームの環境内においてタンパク質を溶解性にする又はタンパク質を安定化するタグでありうる。

いくつかの実施形態において、前記方法は第３の核酸を細胞に導入することをさらに含み、ここで、第３の核酸は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された第２の異種修飾酵素をコードする第３の配列を含む。

いくつかの実施形態では、酵素がヒドロキシル化、酸化、グリコシル転移及び異性化から選択される修飾の群から選択される修飾を触媒する。

いくつかの実施形態では、酵素がグリコシルトランスフェラーゼ、イソメラーゼ（例えば、プロリル及びジスルフィド）、ヒドロキシルトランスフェラーゼ（例えば、プロリルヒドロキシラーゼ及びリシルオキシダーゼ）を含む。

いくつかの実施形態では、酵素がグリコシルトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、プロリルイソメラーゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ又はプロリルヒドロキシラーゼから選択される。

いくつかの実施形態では、タンパク質がコラーゲン、ゼラチン又は絹タンパク質を含む。

図１に示すように、細胞は、ペルオキシソーム中における移動のためにタグ付けされたタンパク質及び酵素をコードする核酸を含む。翻訳後、Ｃ－末端又はＮ－末端タグはタンパク質及び酵素の移動をペルオキシソームへシグナル伝達し、それらはペルオキシソームでさらにプロセシングされる。

細胞
いくつかの実施形態における、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つの方法によって製造される、ペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための真核細胞。いくつかの実施形態において、細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする配列を含む第１の核酸、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は修飾タンパク質を産生するためのペルオキシソームを含み、ここで前記真核細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質と、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素と、を発現することができる。いくつかの実施形態では、前記細胞は修飾タンパク質を産生するためのペルオキシソームを含み、ここで前記真核細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする第１の核酸配列と、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の核酸配列とを含む（図１参照）

いくつかの実施形態では、ペルオキシソームを含む、修飾タンパク質を産生するための真核細胞が提供され、ここでペルオキシソームは、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質と、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素とを含む。

いくつかの実施形態では、タンパク質はペルオキシソーム中で修飾される。いくつかの実施態様において、細胞はＰａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列が配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に示される配列を含む。細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された第２のタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。

細胞は、標準的な発酵ブロスにおける発酵のために使用され得る。当業者は、タンパク質産生のために細胞を増殖させるための標準的な方法を理解するであろう。いくつかの実施形態において、発酵は、誘導剤の存在下又はメタノールの存在下で実施され得る。

大量のタンパク質が大規模生産に必要とされるいくつかの実施形態では、細胞は発酵槽中で増殖される。Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris及びOgataea多型の利点は、それらが多産増殖速度（prolific growth rate）で増殖する可能性があることである。発酵槽は、ｐＨ制御、酸素制限、栄養制限及び温度変動による制限を防止するために使用され得る。発酵槽は、撹拌を増加させるだけでなく、空気流に純粋な酸素を補うことによって空気流を増加させることにより、溶解酸素（ＤＯ）レベルを上昇させることを可能にする。また、新鮮な培地又は増殖制限栄養素が、枯渇した栄養素を補充し得る率で容器にポンプ輸送され得る「供給モード」で発酵槽を運転できるので、栄養制限も最小化され得る。発酵槽はまた、メタノールの存在に対して細胞を調整するためにメタノール流速を制御することを可能にし得、また毒性を引き起こし得る過剰なメタノール添加を防止しつつタンパク質合成のために丁度十分なメタノールの添加を可能にするために適切な速度でメタノールを提供し得る。

修飾されたタンパク質を産生する方法
いくつかの実施形態では、ペルオキシソームを含有する真核細胞において修飾タンパク質を産生する方法が提供され、ここで真核細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する。この方法は、本明細書中の実施形態の方法によって製造された細胞又は本明細書中の実施形態のうちいずれか１つの細胞を提供する工程、真核細胞中で異種タンパク質を発現する工程（ここで、この異種タンパク質はペルオキシソーム標的化配列に融合されている）、及びこの真核細胞を、この異種改変酵素がペルオキシソーム中で異種タンパク質を修飾して修飾タンパク質を産生するような条件下で培養することを包含する。

いくつかの実施形態では、ペルオキシソームを含有する真核細胞において修飾タンパク質を産生する方法が提供され、ここで真核細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する。この方法は真核細胞中で異種タンパク質を発現させる工程（ここで、この異種タンパク質はペルオキシソーム標的化配列に融合されている）、及びこの真核細胞を、この異種改変酵素がペルオキシソーム中で異種タンパク質を修飾して修飾タンパク質を産生するような条件下で培養する工程を包含し得る。

いくつかの実施形態では、改変タンパク質を産生する方法を含む、真核細胞中で改変タンパク質を産生する方法が提供される。この方法はペルオキシソームを含む真核細胞を、修飾タンパク質が産生されるような条件下で培養する工程を包含し、ここで、真核細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現し、ここで、異種修飾酵素は、培養条件下で異種タンパク質を修飾してペルオキシソーム中において修飾タンパク質を産生する。

いくつかの実施形態における、改変タンパク質の収率を増加させる方法を含む、真核細胞において改変タンパク質を産生する方法。いくつかの実施形態において、真核細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris又はOgataea polymorpha由来である。この方法はペルオキシソームを含有する真核細胞を、修飾タンパク質が産生されるような条件下で培養することを含み、ここで、真核細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質（ここで、異種タンパク質の発現はプロモーターの影響下にある）、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現し；ここで、異種修飾酵素は培養条件下でペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生するように異種タンパク質を修飾する。いくつかの実施形態において、本方法は、化学的誘導物質の添加によって異種タンパク質の産生を誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態ではこの方法がペルオキシソームのカーゴを増加させることをさらに含み、ここで、ペルオキシソームのカーゴの増加は真核細胞にオレイン酸又はメタノールを提供することによって行われる。

いくつかの実施形態では、細胞は本明細書中に記載されるように、１種以上の核酸で形質転換される（例えば、図２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、形質転換細胞を発酵させる。いくつかの実施形態では、発酵及びタンパク質翻訳の誘導後に移動させ、次いで細胞を回収する。いくつかの実施形態では、細胞を遠心分離する。

いくつかの実施形態では、次いで、細胞を溶解のために調製する。ホモジナイザーを用いて酵母細胞を破壊することができる。ホモジナイザーは細胞懸濁液を加圧し、圧力を突然解放することによって細胞を溶解することができる。これにより、細胞を溶解することができる液体剪断が生じる。古いタイプのホモジナイザー、フレンチプレス及びＭａｎｔｏｎ－Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーの典型的な操作圧力は６０００～１０，０００ｐｓｉである。妥当な程度の溶解を達成するためには、複数回（少なくとも３回）の通過が必要である。ただし、動作圧力が高いと、動作温度が上昇する可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、圧力セルが使用前に冷却される（４℃）。温度制御に加えて、いくつかの実施形態では、発泡によるタンパク質の不活性化を回避するように注意を払うべきである。そのため圧力は、徐々に増しながら加えられてもよい。いくつかの実施形態においては、溶解はまた、プロテアーゼの阻害剤の存在下で行われなければならない。

現代のホモジナイザーは、はるかに高い圧力で操作することができるので、酵母細胞を溶解するのにより適している。例えば、Avestin Emulsiflex－Ｃ５は、Pichia pastoris細胞を３０，０００ｐｓｉ(２００ＭＰａ）で溶解するために使用され得る。

また、細胞溶解には、ガラスビーズ（０．４～０．５ｍｍ）との撹拌によって酵母細胞を破壊するガラスビーズボルテックスを使用してもよい。細胞懸濁液の過熱を避けるために、氷上で冷却するサイクルを数サイクル（３０～６０秒）にわたり攪拌しなければならない。破壊率（Breakage）は可変であるが、５０％を十分超え（９５％までとなり）うる。上記の方法は少量（１５ｍｌまで）について記載されているが、特殊な装置を用いて数リットルまでスケールアップすることができる。

また、細胞を溶解するために酵素的溶解を使用してもよい。酵母細胞の酵素溶解はチモラーゼ（zymolase）及びライチカーゼ（lyticase）などの多くの酵素による細胞壁の消化に基づいており、最も広く使用されている。

いくつかの実施形態では、溶解後、上清を遠心分離し、粒子状物質を除去するために濾過することもできる。ペルオキシソームの精製は当業者に公知であり、遠心分離機中の勾配によって実施されてもよい。ペルオキシソームはまた、市販のキット（例えば、Sigma AldrichによるPeroxisome Isolation Kit)によって単離されてもよい。

ペルオキシソームの溶解に続いて、溶解物は、目的のタンパク質について精製され得る。粗精製後、溶解ペルオキシソームからタンパク質を分離してもよい。精製の技術は、当業者に公知である。タンパク質の型及びタンパク質の特徴によって異なるタイプの精製技術を考慮し得よう。限定されるものではないが、沈殿によってタンパク質を単離するために、硫酸アンモニウム沈殿のような工程をとってもよい。ショ糖勾配遠心分離もまた、サンプル中の異なるサイズの分子を分離するために使用され得る。タンパク質を再び折り畳む（refold）方法が既知である場合には、非変性又は変性条件におけるサイズ排除クロマトグラフィーが広く使用される。タンパク質はまた、それらの電荷又は疎水性に基づいて分離され得る。また、タンパク質にタグ付与される場合、タンパク質はカラム又は樹脂へのアフィニティークロマトグラフィー又は固定化によって分離されてもよい。

次いで、目的のタンパク質は例えば、修飾について質量分析によって分析され得る。酵素のようなタンパク質もまた、活性アッセイにおいて分析され得る。

また、ペルオキシソーム内における移動のためにタンパク質の種類を解析することもできる。安定性のためにタンパク質を操作する方法は、当業者に公知である。限定するものではないが、これはタンパク質のｐＨを人工的に変化させるために切断可能なタグを付着させることや、ペルオキシソームに移動されるタンパク質のｐＨを人工的に変化させるためにいくつかの突然変異を作り出すことを含み得る。

考慮され得る他のタグは、タンパク質又はそのドメインに移動されることが知られているタンパク質のタグである。Ｐｕｒｄｕｅらに記載されているように、共通配列ＸＸ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ_{（３－７）}（Ｔ／Ｓ）ＸＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ(配列番号４）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ_{（３－７）}は示された位置の任意のアミノ酸の３～７アミノ酸を表す）は、ペルオキシソーム中のタンパク質の移動又は安定性を可能にし得るペルオキシソームタンパク質中の保存配列である。

本明細書に記載の方法、細胞又は組成物のいくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列に融合した異種タンパク質などのタンパク質が、真核細胞又は酵母細胞などの細胞中のペルオキシソームに局在する。いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化配列に融合された修飾酵素などの酵素が、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質を、真核細胞又は酵母細胞などの細胞中のペルオキシソームに局在化及び／又は同時局在化する。いくつかの実施形態では、タンパク質及び／又は酵素はＰＴＳ１又はｅＰＴＳ１などのペルオキシソーム標的化シグナルに融合されている。例えば、ｅＰＴＳ１は、いくつかの実施形態において、ペルオキシソーム標的化配列である。ｅＰＴＳ１タグ及びｅＰＴＳ１タグをコードする核酸配列の例は、配列番号３（ＬＧＲＧＲＲＳＫＬ）及び配列番号１２（ＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＧ）に提供される。

ペルオキシソーム標的化配列の使用によって、種々のタンパク質及び酵素を、ペルオキシソームを標的とさせることができる。例えば、ペルオキシソーム標的化配列を用いて、１～５、５～１０、１０～２５、２５～５０、５０～７５、７５～１００ｋＤａ、１００～２００ｋＤａ、又は２００～３００ｋＤａ、又はそれ以上の分子量、又は前述のｋＤａ範囲のいずれかを包含する値の範囲を有するタンパク質及び酵素に、ペルオキシソームを標的とさせることができる。いくつかの実施形態では、ペルオキシソーム標的化対象であるタンパク質及び／又は酵素をコードする配列を有し且つペルオキシソーム標的化配列をコードする核酸が、ペルオキシソームを含む細胞に移され、細胞が前記タンパク質及び／又は酵素を翻訳し、それをペルオキシソームに輸送する。ペルオキシソームを標的とさせ得るタンパク質及び酵素のさらなる例としては、構造タンパク質、コラーゲン、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロキシラーゼ、イソメラーゼ、切断酵素、蛍光タンパク質、及びホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標的化対象であるタンパク質及び／又は酵素は、蛍光タグ（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、又はＣＦＰ）、フラグタグ（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ここで、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｙ＝チロシン、及びＫ＝リジン、配列番号５）、又はヒスチジンタグ（例えば、Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ、配列番号６）のようなタグを含む。このようなタグはタンパク質及び／又は酵素の位置を精製及び／又は同定するために使用され得るが、これらに限定されない。精製技術はタグを使用してタンパク質及び／又は酵素を精製するためのアフィニティー精製又はニッケルカラムのようなイオンカラムの使用を含み得るが、これらに限定されない。使用され得る他のタグとしては、カルモジュリン（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ、配列番号７）、ＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号８）、Ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号９）、ＳＢＰ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ、配列番号１０）、及び／又はＳｔｒｐ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１１）タグが挙げられる。

ＧＦＰタグの例は、配列番号１３に提供される（ＭＲＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ）。いくつかの実施形態は、配列番号１４（ＡＴＧＣＧＴＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＣＣＣＴＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＴＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＡＣＴＡＡＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＧＴＡＣＡＡＡＡＣＧＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＡＴＴＴＴＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＴＣＣＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＧＴＡＡＣＣＧＣＡＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＧＣＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＡ）の核酸配列のようなＧＦＰタグをコードする核酸又はその断片を含む。

以下に述べる実施例は本発明の純粋に例示的なものであることを意図しており、本発明をいかなる方法においても限定するものとみなされるべきではない。これらの実施例は、以下の実験が実施された全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保する努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差と逸脱を考慮に入れるべきである。特に述べない限り、部とは、質量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は℃単位で表されており、また圧力は大気圧又はその近傍である。

実施例１：複数の酵母宿主におけるコラーゲン変異体又はＰ４ＨＢのペルオキシソームへの局在化
ＧＦＰが局在化の可視化のために含まれ、ｅＰＴＳ１がペルオキシソームへの標的化のために含まれ、ｘが目的のタンパク質である、ＧＦＰ－ｘ－ｅＰＴＳ１構築物を作製した。目的のタンパク質の非限定的な例としては、合成コラーゲンペプチドＣＯＬｓｙｎ１ａ、ＣＯＬｓｙｎ２、ＣＯＬｓｙｎ３、ＣＯＬｓｙｎ４、ＣＯＬｓｙｎ５及びＣＯＬｓｙｎ６、並びにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＰ４ＨＢが挙げられる（表１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、Ｐ４ＨＢはＢａｎｔＰ４ＨＢ、ＡｐｍｉＰ４ＨＢ、ＢｔａｕＰ４ＨＡ１、ＢｔａｕＰ４ＨＢ、ＢｔＰ４ＨＢ、又はＧＦＰ－Ｂ５Ｐ４ＨＢ－ｅＰＴＳ１、又はそれらの断片若しくは誘導体である。これらの目的のタンパク質をコードする核酸は、別々の構築物に包含された。目的のタンパク質の各々を有するペプチドを産生した構築物を、細胞中の蛍光フォーカスとして可視化された野生型（ＷＴ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株のペルオキシソームに取り込ませた（図３）。ペルオキシソーム取り込み受容体（ｐｅｘ５Δ）を欠く株では、拡散的な細胞質局在化のみが見られた。これらの結果は、いくつかの実施形態において、タンパク質又は酵素を、酵母細胞などの細胞中のペルオキシソームを標的とさせるために、本明細書中に記載されるようなペルオキシソーム標的化ペプチドを使用しうることを示す。他の非限定的な目的のタンパク質の例及びコードするヌクレオチド配列のいくつかの例もまた、表１に示される。いくつかの実施形態において、目的のタンパク質又はコード核酸は、配列番号１５～７０のいずれか１つ以上と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、又は前述のパーセンテージのいずれか２つによって規定される範囲の同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列からなるか又はそれを含む。いくつかの実施形態は、ペルオキシソームを標的とさせ得る、複数の目的のタンパク質を含む。

種々のコラーゲン変異体が、複数の工業用酵母宿主に局在することが観察されている（図４）。全長コラーゲンの非限定的な例には、ＡｍＣＯＬ１Ａ１、ＡｍＣＯＬ１Ａ２、ＢｔＣＯＬ１Ａ１、ＢｔＣＯＬ１Ａ２、及びそれらの断片が含まれる。より小さいコラーゲン断片の非限定的な例には、ＣＯＬｓｙｎ１、ＣＯＬｓｙｎ２、ＣＯＬｓｙｎ３、ＣＯＬｓｙｎ４、ＣＯＬｓｙｎ、ＣＯＬｓｙｎ５、及びＣＯＬｓｙｎ６、ＢｔＣｏｌ１Ａ１ ４０３－１１Ｐ、並びにＢｔＣｏｌ１Ａ１ ４０３－０Ｐが含まれる。図４は、３つの異なる工業用酵母宿主であるＰＢＨ００１、ＰＢＨ００２、ＰＢＨ００４におけるＧＦＰ－コラーゲン変異体のｅＰＴＳ１依存性蛍光局在化を示す。一般的な工業用酵母宿主にはＡｒｘｕｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属、Ｏｇａｔａｅａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、又はＹａｒｒｏｗｉａ属が含まれるが、これらに限定されない。

ペルオキシソームへの局在化が観察されるタンパク質のサイズは、３１ｋＤａ(ＧＦＰ－ＣＯＬＳｙｎ１）～１９５ｋＤａ(ＢｔＣｏｌ１Ａ２）の範囲である。したがって、かなりの範囲のタンパク質サイズをペルオキシソームにインポートすることができる。

実施例２：毒性化合物からの保護
いくつかの実施形態では、タンパク質及び／又は酵素のペルオキシソーム標的化は、別の酵素又は基質から物理的に分離することによって、タンパク質及び／又は酵素をペルオキシソームを区画化（compartmentalize）する。これは、分離されたタンパク質、酵素、及び／又は基質の間の相互作用又は活性を防止するために使用され得る。例えば、ＳｉｇＤなどの毒性又は阻害性タンパク質を区画化しうる。

いくつかの実施形態においては、酵素をその基質から物理的に分離するための酵素のペルオキシソーム区画化が、基質に対する活性を防止するために使用される。ペルオキシソーム中の毒性タンパク質を隔離することによって毒性タンパク質が発現される場合、活性を区画化する能力を説明するためには細胞生存率が救われる（cell viability is rescued）。

病原性細菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、腸粘膜に侵入して胃腸炎を起こす一般的な原因である。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが分泌する病原因子の１つはＳｉｇＤであり、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させると重度の増殖阻害を引き起こすことが実証されている推定イノシトールホスファターゼである。その毒性は、ホスファターゼドメインを欠くが酵母及びヒト細胞の両方でアクチン細胞骨格の構成に影響を及ぼすＳｉｇＤ Ｎ－末端ドメイン（ＳｉｇＤ１－３５１）に関連している（ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４６２－５８２２．２００５．００５６８．ｘ）。

ペルオキシソーム区画化によって細胞質アクチン細胞骨格基質へのＳｉｇＤ１－３５１の接近を除くことにより、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅをＳｉｇＤ阻害増殖効果から保護することができる。

図５は、毒性タンパク質ＳｉｇＤ１－３５１がペルオキシソーム中に隔離された場合に宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに付与される保護を実証するための例である。誘導性ＧＡＬプロモーターの制御下でＳｉｇＤ１－３５１－ｅＴＰＳ１又はＳｉｇＤ１－３５１のいずれかが組み込まれた株を、発現を抑制するためにＹＰＤプレート上で連続的に希釈し、又は発現を誘導するためにＹＰガラクトースを配置した。抑制すると、両株は等しくよく増殖した。発現を誘導すると、ペルオキシソームに局在化された毒素（ＳｉｇＤ１－３５１－ｅＴＰＳ１）を有する株は増殖できたが、細胞質で発現した毒素（ＳｉｇＤ１－３５１）は宿主に対する致死性を有した。

一例は下記のデザインを含む。毒性ＳｉｇＤ発現を制御する誘導性ＧＡＬプロモーターを有する発現カセットの使用、酵素細胞に形質転換した別々の発現カセットにおけるＳｉｇＤの毒性のある変異体（ＳｉｇＤ１－３５１）及び毒性のない変異体（ＳｉｇＤ１－３５１（１１８－１４２Δ））の発現、発現カセットによる融合タンパク質ＧＦＰ－ｘ－ｅＰＴＳ１の生産、ここでｘは毒性のある又は毒性のないＳｉｇＤ変異体、及び以下の株バックグラウンドの１つを有する別々の酵母細胞群の形質転換が挙げられる: ＰＥＸ５（ペルオキシソームインポート）及びＰＥＸ５Δ（ペルオキシソームインポートを欠く）。この例では、以下の実験技術が実施される：グルコース（抑制）プレート及びガラクトース（誘導）プレート上の細胞の連続希釈によって成長欠陥を示すこと、及びＧＦＰ蛍光による局在化の実証。

実施例３：ペルオキシソームで翻訳後修飾を行うための酵素と基質の共局在化
種々のクラスの翻訳後修飾（ＰＴＭ）が、ペルオキシソームにおいて生じることが実証され得る。いくつかの実施形態において、ペルオキシソームバリアによる酵素とその基質又はタンパク質基質との分離が、基質に対する酵素の活性を防止するために使用される。基質又は酵素の隔離をこうして使用することができる。例えば、これは、ペルオキシソーム隔離タンパク質（peroxisome-sequestered protein）からの細胞内容物の保護又はその逆の例であり得る。

いくつかの実施形態では、細胞のペルオキシソーム中で、他のタンパク質に対して翻訳後修飾（ＰＴＭ）を行う修飾酵素が前記他のタンパク質と一緒に共局在化される。ＰＴＭの例としてはグリコシル化（又は他の糖付加）、異性化、切断、プロテアーゼ切断、タンパク質分解（proteolytic degradation）、ヒドロキシル化、タンパク質分解（proteolysis）、リン酸化、脱リン酸化、ユビキチン化（及びユビキチン様修飾、例えばネジル化（neddylation）、スモイル化（sumoylation））、メチル化、ニトロシル化、アセチル化、及び脂質化（lipidation：ＧＰＩアンカーリング、プレニル化、ミリストレーションを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。他のＰＴＭ反応も考えられる。いくつかの実施形態では、酵素、酵素の補因子のいずれか、及び酵素の基質が、細胞質及び／又はペルオキシソームに共局在化される。

いくつかの実施形態では酵素、酵素の補因子のいずれか、及び酵素の基質は細胞質及び／又はペルオキシソームに共局在化される。これは、いくつかの実施形態において、酵素及び基質が同じ領域に共局在化される場合、修飾が起こることを実証するために使用される。したがって、共局在化を使用して、ＰＴＭなどの修飾を実行することができる。

本明細書中に開示される方法及び組成物における使用に適切なＰＴＭの例としては、プロテアーゼ切断、リン酸化、脱リン酸化、ヒドロキシル化、異性化、グリコシル化、及びプレニル化が挙げられる。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ切断、リン酸化及び脱リン酸化のうちの１つ以上が、好ましいＰＴＭである。

図８は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるヒドロキシラーゼ酵素（ＢａｎｔＰ４Ｈ）とコラーゲン基質（ＡｍｉｓＣＯＬ１Ａ１又はＡｍｉｓＣＯＬ１Ａ２）のインビボでの共局在を示す。蛍光顕微鏡による局在化をモニターするために、ＢａｎｔＰ４ＨはｍＲｕｂｙ融合タグとＧＦＰ融合タグを有するコラーゲン基質とを含む。蛍光フォーカスがｅＰＴＳ１ペルオキシソーム局在化シグナルで観察され、マージされた画像は、ヒドロキシラーゼとコラーゲンとの重複局在化を実証する。ｍＲｕｂｙを有する例示的な配列は例えば、配列番号５１～５２を含み得る。

実施例４：タンパク質分解
いくつかの実施形態では、ペルオキシソームにおいてペプチド切断が生じ得ることを実証するために、ＴＥＶプロテアーゼが使用される。例えば、いくつかの実施形態において、切断は、プロテアーゼ及び基質の両方が同じ細胞内区画（細胞質又はペルオキシソームなど）にある場合にのみ起こり得る。ＴＥＶプロテアーゼがペルオキシソームに隔離されており、細胞質内でその標的を切断できないことを示す例は、細胞質内の他の潜在的標的もＴＥＶ開裂を受けておらず、したがってペルオキシソームに区画化された酵素から保護されている、ということを示している。いくつかの実施形態において、発現されたタンパク質／酵素が細胞に対して毒性である場合、ペルオキシソーム区画化によってその細胞基質からそれを分離することは、タンパク質／酵素からの保護を細胞に提供する。基質／タンパク質がペルオキシソーム中に隔離され、細胞質中のＴＥＶプロテアーゼによって切断され得ないという例は、基質がまた、細胞質中の他の酵素にさらされず、したがって、タンパク質分解のような細胞からの望ましくない修飾から、基質／タンパク質が保護される、ということを示唆する。したがって、いくつかの実施形態では、いくつかのタンパク質を選択的に標的化し他を標的化しないことは、いくつかのタンパク質の所望の修飾をもたらし、且つ／又は望ましくない修飾を防止する。

いくつかの実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＴＥＶプロテアーゼと切断用ＴＥＶ認識部位（ＴＥＶｒｓ）を含む基質とが、強力なプロモーターから発現される。ＹＦＰ又はＲＦＰへの融合は、細胞質又はペルオキシソームへの局在を顕微鏡観察で示すであろう。基質（ＹＦＰ－ＴＥＶｒｓ－ＩＧＦ２－ＦＬＡＧ）のタンパク質分解はウェスタンブロットにより分析されよう。

いくつかの実施形態では、ペルオキシソームを標的とさせることができる他の修飾プロテアーゼには基質メタロプロテイナーゼＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－１３、及びＭＭＰ－１４；Ｎ－プロテイナーゼＡＤＡＭＴＳ－２、ＡＤＡＭＴＳ－３、ＡＤＡＭＴＳ－１４；並びにＣ－プロテイナーゼＢＭＰ－１、ｍＴＬＳ、及びＴＬＬ－１が含まれるが、これに限定されない。

いくつかの実施形態において、ペルオキシソームに標的化されるタンパク質は、ＴＥＶ切断可能なタグを含む。例として、切断可能なタグを有するタンパク質の例はＢｔＣｏｌ１Ａ２－ＴＥＶ－ＧＦＰ－ＨＩＳ－ｅＰＴＳ１（配列番号６４）であり、ここで、完全長ウシコラーゲンＩ型α２タンパク質は、ペルオキシソーム局在化、可視化及び精製のために使用することができるＮ－末端タグから、ＴＥＶプロテアーゼによって分離され得る。さらなる例は、任意のタグ配列、標的化配列、ドメイン、若しくは断片、又はそれらの誘導体と組み合わせた、本明細書中に開示される任意のタンパク質配列を含み得る。このような配列の例としては、例えば、配列番号５７～６８が挙げられ得る。

ＴＥＶプロテアーゼは、タバコエッチングウイルス（ＴＥＶ）由来の配列特異的システインプロテアーゼである。異種酵素活性がペルオキシソームにおいて達成され得ることを実証するためのこの実施例において、ＴＥＶプロテアーゼは、その局在化をペルオキシソームに仕向けるためのＮ－末端ｅＰＴＳ１シグナル配列と共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現された。ＴＥＶ活性を試験するために作製した基質は、ＴＥＶ認識アミノ酸配列であるＧｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－ＳｅｒをＮ－末端ＲＦＰ及びＣ－末端ＹＦＰに隣接させることによって作製した。この基質を、ｅＰＴＳ１配列を用いて（図６、パネルＡ）又は用いずに（図６、パネルＢ）発現させた。ＴＥＶプロテアーゼ及び基質の両方が発現され、ペルオキシソーム中に共局在化された時、ウェスタンブロット上の５４ｋＤａのフルサイズの基質バンドの消失及び２７ｋＤａのＲＦＰ切断産物の出現によって証明されるように、基質は完全に切断された（図６、パネルＡ、レーン１、２、及び５）。しかしながら、ＴＥＶプロテアーゼの発現が抑制された場合、ペルオキシソーム局在化基質は切断されないままであった（図６、パネルＡ、レーン３及び４）。対照として、基質は細胞質で発現したが、ＴＥＶプロテアーゼはペルオキシソームを標的とした。様々な量の基質切断が観察され、ＴＥＶプロテアーゼ発現を駆動するプロモーターの強さ（ｐＲＰＬ１８Ｂ＜ｐＴＥＦ１＜ｐＧＡＬ１）と直接相関していた（図６、パネルＢ、レーン１、２、及び５）。ＴＥＶプロテアーゼがペルオキシソームに輸送されている間は細胞質中で依然として活性であったが、基質への接近は高度の発現に依存していたことを、これらの結果は示唆している。比較すると、ＴＥＶプロテアーゼの発現レベルの差異にもかかわらず、基質及びプロテアーゼがペルオキシソーム中に共局在化されたときにはＴＥＶ切断活性は完了しており、共区画化が基質修飾の効率をいかに改善することができるかの例を実証している。

実施例５：リン酸化と脱リン酸化
いくつかの実施形態では、特定のキナーゼ（セリン／トレオニンキナーゼ又はチロシンキナーゼなど）及び／又はホスファターゼ及びそれらの基質が同時発現することが同定される。例えば、ＭＥＫがその基質ＭＡＰＫ１をリン酸化するところであるペルオキシソームを、ＭＥＫ及びＭＡＰＫ１が標的とするように、ＭＥＫ及びＭＡＰＫ１はペルオキシソーム標的化ペプチドとの融合ペプチドを生成するように１つの核酸又は別個の核酸中にコードされうる。さらに、さらなる酵素及び基質（例えば、Ｒａｆ－１）が加えられてもよい。

実施例６：ヒドロキシル化
いくつかの実施形態では、Ｐ４Ｈジオキシゲナーゼによるペルオキシソーム中のコラーゲンのヒドロキシル化が実証される。例えば、ウシＰ４Ｈサブユニットを用いた設計を用いることができる。あるいは、単一の細菌Ｐ４Ｈ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ又はｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）が使用され得る。いくつかの実施形態では、培地にアスコルビン酸及び／又はα－ケトグルタル酸塩及び鉄（ＩＩ）を補充し、補因子及び／又は補充物がペルオキシソームに入ることができれば、そこで特定の化学修飾が起こり得ることが実証される。このような場合、コラーゲンは質量分析法によって酸化について分析される。いくつかの実施形態では、酵素活性をさらに実証するために、インビトロアッセイが使用される。

異種ヒドロキシル化活性がインビボでペルオキシソームにおいて達成され得ることを実証するために、プロリル－４－ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）酵素及びコラーゲン基質をＳｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて共発現させた。炭疽菌由来のＰ４Ｈ酵素は、合成コラーゲン様ペプチドをインビトロでヒドロキシル化することがこれまでに明らかにされており(Schnicker及びDey、２０１６）、細胞質（ＢａｎｔＰ４Ｈ）又はペルオキシソーム（ＢａｎｔＰ４Ｈ－ｅＰＴＳ１）のいずれかにおいて発現されていた。コラーゲンヘリックスはＧＸＹ反復で構成され、ここで、Ｇはグリシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であるが、しばしばプロリンであり、Ｙは任意のアミノ酸であるが、しばしばプロリンである。Ｙ位のプロリンは、ヘリックス安定性のために優先的にヒドロキシル化される(Gorres及びRaines、２０１０）。この研究のために設計された基質はウシコラーゲン１型α１のらせん領域の９９アミノ酸断片であり、これは１１個のＹ位置プロリンを含む（ＢｔＣｏｌ１Ａ１ ４０３－１１Ｐ）。Ｙ位置プロリンヒドロキシル化を制御するために、１１個のプロリンをアラニン又はバリンに変異させた（ＢｔＣｏｌ１Ａ１ ４０３－０Ｐ）。これらの基質を、インビボ局在化のモニタリング（図８参照）及び精製のためのＮ－末端ＧＦＰとＣ－末端ｅＰＴＳ１ペルオキシソーム局在化配列と一緒に、発現させた。

ＢａｎｔＰ４Ｈ酵素とコラーゲン基質との組み合わせを発現する細胞（図７、パネルＡ）を、バッフル付き振盪フラスコ中で、３０℃で初期対数期までＹＰＤ中で増殖させ、次いで回収した。細胞溶解後、基質をＧＦＰ－Ｔｒａｐビーズ上で精製し、１０％ＰＡＧＥゲル上で泳動し、クーマシーブルーで染色し、ゲルから切り出し、プロリン残基の酸化についてのＬＣＭＳＭＳによる分析のためにＭＳ Ｂｉｏｗｏｒｋｓに送付した。

ペルオキシソーム中で同時発現した場合のコラーゲン基質上の３つの部位でのＢａｎｔＰ４Ｈ特異的酸化が、質量分析の結果明らかになった。ＢｔＣｏｌ１Ａ１ ４０３－１１ＰＢ０００２２５株、ＰＢ０００２５４株、及びＰＢ０００２５５株において、Ｐ＿ｅＰＴＳ１基質はＹ位プロリンであるＰ２６４位で酸化された。ＢｔＣｏｌ１Ａ１ ４０３－０Ｐ＿ｅＰＴＳ１対照基質中の対応する位置をアラニンに変異させたところ（Ａ２６４）、酸化は観察されなかった（図７、パネルＢ）。Ｐ２６４で同定された修飾を詳細に調べると、ＢａｎｔＰ４Ｈがペルオキシソーム中に共局在するＰＢ０００２５４株（計３４のうち４つの修飾）中のこの位置で１２．１％の酸化があり、これに対して、ＰＢ０００２２５株（計３８のうち１つの修飾）及びＰＢ０００２２５株（計４２のうち２つの修飾）中での酸化はそれぞれ２．６％及び４．８％であった。同様に、２つの追加のＹ位プロリンであるＰ３００及びＰ３２４での酸化はＰＢ０００２５４株でのみ観察され、他の５つの株では観察されなかった（図７、パネルＣ）。これらの結果は合わせると、酵素及び基質の両方がペルオキシソームに共局在化している場合にはコラーゲン基質上の３つのＹ位プロリンがＢａｎｔ－Ｐ４Ｈによって特異的にヒドロキシル化されることを示している。４０３－０Ｐ－ｅＰＴＳ１又は４０３－１１Ｐ－ｅＰＴＳ１を有する例示的な配列には、例えば、配列番号５３～５６及び配列番号６５～６８が含まれる。

実施例７：酵母ペルオキシソームにおけるコラーゲンの発現
コラーゲンタンパク質は、ペルオキシソーム標的化タグを介してペルオキシソームにインポートされる。プロリルヒドロキシラーゼ及びプロリルイソメラーゼは同様に、ペルオキシソーム標的化タグを用いてペルオキシソームにインポートされる。プロリルヒドロキシラーゼ酵素とペルオキシソーム中のコラーゲンとの共インキュベーションは、適切な三重らせん構造の形成を可能にする。Ｉ型ヘテロ三量体、１型αホモ三量体、及びＩＩＩ型ホモ三量体コラーゲンは全て、記載された様式で産生される。コラーゲンＩ型については、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＣｏｌ１Ａ１（α１鎖）及びＣｏｌ１Ａ２（α２鎖）の発現の改善についてＯｌｓｅｎら（２００１）が示したテロタンパク質を単離するために、完全長Ｃｏｌ１Ａ１（ｐｒｏ－α１鎖）及びＣｏｌ１Ａ２（ｐｒｏ－α２鎖）の両方を発現させるとともに、Ｎ－末端及びＣ－末端の両方の切断を発現させる。同様に、プロリル－４－ヒドロキシラーゼは、完全長並びにＰＤＩドメインの切断（Ｔｏｍａｎ ２０００）として発現され、発現が改善され、ペルオキシソームにインポートされる。

実施例８：ペルオキシソームのカーゴを増加させる
酵母は、様々な従来のプロトコルのいずれかを用いて発酵槽中で増殖させる。ペルオキシソーム容量は、誘導によって増加させることができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、これはオレイン酸塩の使用によるものであり得、Pichia pastoris及びOgataea polymorphaの場合、これはメタノールの使用によるものであり得る。区画化され精製されることが望まれるタンパク質は、ペルオキシソーム標的化タグであるＰＴＳ１、ＰＴＳ２、又はこれらのタグの増強されたバージョンで、タグ付けされる。発酵後、酵母細胞の原形質膜は多くの従来の溶解方法（例えば、フレンチプレスやライチカーゼ（lyticase）を使用した細胞壁消化、及び続いてのホモジナイゼーション）を使用して溶解され得る。低速遠心分離を使用して、核及び原形質膜並びに他の細胞破片を除去する。ペルオキシソームは、密度勾配遠心分離のような他の方法によって、得られた上清からさらに精製され得る。ペルオキシソーム精製の別の方法は、アフィニティー精製を可能にするために、ストレプトアビジン又はポリヒスチジンペプチドのような親和性タグでペルオキシソーム膜タンパク質に遺伝的にタグを付けることである。次いで、これらの精製されたペルオキシソームを、例えば、浸透圧溶解を使用して溶解する（J Cell Biol．２００７年４月２３日；１７７（２）：２８９－３０３；その全体が本明細書中に参考として含まれる）。ペルオキシソーム残屑は高速遠心分離によって除去することができ、所望のカーゴタンパク質を含有する可溶性画分を収集することができる。所望であれば、この所望のタンパク質は、アフィニティー精製を用いてさらに精製され得る。限定するものではないが、カーゴタンパク質は例えば、ポリヒスチジン、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼなどの多数の利用可能なペプチド又はタンパク質フォールド親和性タグのいずれかでタグ付けされ、それらのそれぞれのプロトコルを使用して精製されてもよい。あるいは、イオンクロマトグラフィー又はゲル濾過のような他の精製方法が使用されてもよい。

実施例９：酵母ペルオキシソームにおける翻訳後修飾タンパク質の発現－個々のタンパク質のペルオキシソームへの局在（ｅＰＴＳ１に基づく標的化）
大きさと機能を基としたクラスを異とするタンパク質が、ペルオキシソーム標的化配列を用いて典型的な酵母細胞のペルオキシソームに局在することが示される。標的化され得るタンパク質及びタンパク質の型の非限定的な例を表３に列挙する。ペルオキシソーム標的化のメカニズムは保存されており、したがってプラットフォームは、Pichia pastoris/Komagataella phaffii、Hansenula polymorpha/Ogataea parapolymorpha、及びCandida boidiniiなどのメチロトローフ酵母を含む他の生物において使用することができる。ＧＦＰ－ｘ－ｅＰＴＳ１及びｘ－ＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１構築物を産生する。構築物において、ＧＦＰは局在化の可視化のために使用され、ＧＦＰが機能を妨害する場合にはＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１がタンパク質発現のために使用され、「ｘ」は標的化されるべき目的のタンパク質又は酵素を表す。いくつかの構築物配列及びいくつかの実施形態の詳細は、表１及び表２に提供される。

実施例１０：ジスルフィド結合生成
いくつかの実施形態では、修飾はジスルフィド結合形成である。例えば、異種タンパク質及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）が同時発現され、ペルオキシソームを標的とする設計が使用される。このような場合、異種タンパク質は、質量分析によってジスルフィドについて分析される。

インビボでのペルオキシソームにおけるジスルフィド結合形成を実証するために、ヒトインスリン、αインターフェロン、及びマパカルシン（mapacalcine）を発現する異種遺伝子をＰＤＩと一緒に同時発現させる。ＥＲを通常標的とするＯｇａｔａｅａ ＰＤＩ（ＯｇＰＤＩ）は、過剰発現され且つペルオキシソームを標的とするように設計される。ヒトインスリン前駆体（Ｂａｅｓｈａｎら、２０１４）、αインターフェロン（Ｓｈｉら、２００７）及びマッパカルシン（Ｎｏｕｂｈａｎｉら、２０１５）を、Pichia pastorisからの最適化コドンを使用して合成する。この構築物は、目的の標的遺伝子のための発現カセット、修飾酵素のための発現カセット、及び選択マーカーのための発現カセットを含む、３つの発現カセットを用いて設計される。

各カセットは、プロモーター、発現された遺伝子（目的の遺伝子又は修飾酵素遺伝子又は選択マーカー遺伝子）及びターミネーターを有する。目的の遺伝子及び修飾酵素遺伝子は、翻訳融合物として、それぞれ、蛍光タグＧＦＰ及びｍＲｕｂｙを含むように設計される。目的の遺伝子も修飾酵素も、３’末端にｅＰＴＳ１配列を導入することによってペルオキシソームを標的とするようになる。マパカルシン及びＯｇＰＤＩを共発現する構築物全体の配列を配列番号７３に示す。さらなるカセットには、ヒトインスリン前駆体（配列番号７４）、αインターフェロン（配列番号７５）、マパカルシン（配列番号７６）、ＯｇＰＤＩ(配列番号７７）の核酸配列が含まれる

これらのカセットを発現するトランスジェニックは最初に、ペルオキシソームへの標的化を確認する蛍光マーカーについてスクリーニングされる。トランスジェニック株から精製された目的の異種タンパク質を、質量分析によってジスルフィド形成について分析する。

実施例１１：リン酸化
いくつかの実施形態では、修飾はリン酸化である。例えば、ヒトβ－カゼインＩＩ(Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８４; Ｔｈｕｒｍｏｎｄら、１９９７）及びカゼイン上の特定のセリン及びトレオニンアミノ酸をリン酸化する特定のタンパク質キナーゼ、すなわちヒトカゼインキナーゼ（Ｖｏｓｓら、１９９１）が、同時発現のために同定される。ヒトβ－カゼインＩＩの最適化コドン配列を配列番号７８に示し、カゼインキナーゼＩＩサブユニットβの最適化コドン配列を配列番号７９に示す。

形質転換のための構築物は、ジスルフィド結合形成の実証（実施例１０に記載）に使用したのと同じ骨格を使用して生成する。カゼインを目的の遺伝子として使用し、カゼインキナーゼを修飾酵素として使用する。リン酸化はペルオキシソームにおける主要な調節形成であり、ペルオキシソームにおいて発現される標的カゼインは、カゼインキナーゼの同時発現さえ必要としないかもしれない。組換えカゼインは、ひとたび生成されれば、精製され、スレオニン及びセリンのリン酸化型について質量分析法によって分析される。いくつかの実施形態において、リン酸化活性はインビトロでアッセイされる。

実施例１２：アセチル化
いくつかの実施形態では、修飾はＮ－末端アセチル化である。例えば、ニワトリ卵オボアルブミン（Ｉｔｏ及びＭａｔｓｕｄｏｍｉ、２００５）及びＮ－末端グリシンのアセチル化を促進する特異的アセチル化複合体ＮａｔＢ（Ｒｏｖｅｒｅら、２００８）が同時発現のために同定される。オボアルブミンの最適化コドン配列を配列番号８０に示し、酵母ＮａｔＢ複合体（Ｎａａ２０及びＮａａ２５）に対応する２つの遺伝子をそれぞれ配列番号８１及び配列番号８２に示す。

形質転換のための構築物は、ジスルフィド結合形成の実証（実施例１０に記載）に使用したのと同じ骨格を使用して生成する。オボアルブミンは目的の遺伝子として用いられ、ＮａｔＢ複合体の２つの遺伝子は修飾酵素を構成する。酵母の多くのタンパク質はＮ－末端がアセチル化されており、ペルオキシソームに発現している標的オボアルブミンは、カゼインキナーゼがなくてもＮ－末端のアセチル化を示すことがある。組換えカゼインは、ひとたび生成されれば、精製され、Ｎ－末端グリシンのアセチル化について質量分析によって分析される。

本明細書における複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は文脈及び／又は用途に適切であるように、複数から単数へ、及び／又は単数から複数へと読み替えることができる。様々な単数／複数の置換は明確性の観点から本明細書に明示的に記載されていることがある。

当業者であれば、一般に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体）は一般に、「開いた」用語として意図されることを理解するであろう（例えば、「含む（including）」という用語は「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（includes）」という用語は、「含むがこれに限定されない」などと解釈されるべきである）。特定の数の導入されたクレームの列挙が意図される場合、そのような意図はクレームに明示的に列挙され、そのような列挙がない場合、そのような意図は存在しないことが、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、請求範囲の記載を導入するために、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という導入語句の使用を含みうる。しかしながら、そのような語句の使用は、特定のクレームの不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によるクレームの記載の導入は、たとえ同じクレームが「１以上」又は「少なくとも１以上」の導入語句及び「ａ」又は「ａｎ」のような不定冠詞を含む場合であっても、そのような導入されたクレームの記載を含む特定のクレームのいずれかをそのような記載のみを含む実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではなく（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は「少なくとも１以上」を意味すると解釈されるべきである）、同じことがクレームの記載を導入するために使用される定冠詞の使用にもあてはまる。加えて、たとえ導入された請求項引用の具体的な数が明示的に引用されたとしても、そのような引用は、少なくとも引用された数はあることを意味する（例えば、他の修飾語が無く単に「２つ（two recitations）」と記載されていた場合は、「少なくとも２つ」又は「２つ又はそれ以上」を意味する）と解釈されるべきであることを、当業者は認識するであろう。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣなどのうちの少なくとも１つ（at least one of A, B, and C, etc.）」に類似する慣例的表現が使用される場合、一般に、そのような構文は、当業者がその慣例的表現を理解することを意図する（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」はＡのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＡとＣ、ＢとＣ、並びに／又はＡとＢとＣ、などを有するシステムを含むが、それらに限定されない）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどのうちの少なくとも１つ（at least one of A, B, or C, etc.）」に類似する慣例的表現が使用される場合、一般に、そのような構文は、当業者がその慣例的表現を理解することを意図する（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」はＡのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＡとＣ、ＢとＣ、並びに／又はＡとＢとＣ、などを有するシステムを含むが、それらに限定されない）。さらに、説明、特許請求の範囲、又は図面のいずれかにおいて、２つ以上の代替的用語を提示する実質的に任意の離接的な単語及び／又は句は、前記用語のうちの１つ、前記用語のうちのいずれか、又は前記用語の両方を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されよう。

さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して説明される場合、当業者は、本開示がそれによって、マーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても説明されることを認識するであろう。

１つの態様の実施形態の特徴のいずれも、本明細書で識別されるすべての態様及び実施形態に適用可能である。さらに、１つの態様の実施形態の特徴のいずれも、本明細書で説明される他の実施形態と、いかようにも、独立して、部分的に又は全体的に組み合わせることができ、例えば、１つ、２つ、又は３つ以上の実施形態を、全体的に又は部分的に組み合わせることができる。さらに、１つの態様の実施形態の特徴のうちのいずれも、他の態様又は実施形態に対するオプションとされうる。

Claims (42)

1. ペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生する方法であって、
   細胞を提供すること；
   第１の核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記第１の核酸はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする第１の配列を含む；及び
   第２の核酸を前記細胞に導入すること、ここで、前記第２の核酸はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の配列を含む、
   を含む方法。
2. 前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が酵母細胞である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記細胞が、Ａｒｘｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、又はＹａｒｒｏｗｉａから選択される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１の核酸及び／又は前記第２の核酸がプロモーターを含む、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記プロモーターが構成的又は誘導性である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ペルオキシソーム標的化配列が、配列番号１（ＳＬＫ）、配列番号２（ＲＬＸＸＸＸＸ（Ｈ／Ｑ）Ｌ）、又は配列番号３（ＬＧＲＧＲＲＳＫＬ）に記載の配列を含む、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記タンパク質がタグを含む、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記タグが切断可能である、請求項８に記載の方法。
10. 前記方法が第３の核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記第３の核酸が、ペルオキシソーム標的化配列に融合された第２の異種修飾酵素をコードする第３の配列を含む、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記異種タンパク質が、１Ｄａ、５Ｄａ、１０Ｄａ、２０Ｄａ、３０Ｄａ、４０Ｄａ、５０Ｄａ、６０Ｄａ、７０Ｄａ、８０Ｄａ、９０Ｄａ、１００Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、４００Ｄａ、５００Ｄａ、６００Ｄａ、７００Ｄａ、８００Ｄａ、９００Ｄａ、１ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２１０ｋＤａ、２２０ｋＤａ、２３０ｋＤａ、２４０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、３００ｋＤａ、若しくは前述の値のうち任意の２つによって定義される範囲にある任意のサイズ、又は３００ｋＤａまでの分子量を有する、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記酵素が修飾を生じる、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記修飾が、ヒドロキシル化、タンパク質の折り畳み、酸化、タンパク質分解、リン酸化、脱リン酸化、及び／又は異性化である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記酵素が、プロリルヒドロキシラーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパク質シャペロン又はプロリルイソメラーゼを含む、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記酵素が、プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、又はプロリルヒドロキシラーゼから選択される、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記タンパク質が、コラーゲン、ゼラチン又は絹タンパク質を含む、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記核酸が、酵母細胞などの真核細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化されている、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記酵素がプロリルヒドロキシラーゼ又はプロリルイソメラーゼを含む、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記タンパク質がコラーゲンであり、前記コラーゲンが修飾されて、Ｉ型ヘテロトリマーコラーゲン、１型アルファホモトリマーコラーゲン、又はＩＩＩ型ホモトリマーコラーゲンを生じる、請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記異種タンパク質がＣｏｌ１Ａ１又はＣｏｌ１Ａ２を含む、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記酵素がプロリル－４－ヒドロキシラーゼを含む、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記プロリル－４－ヒドロキシラーゼが、ＰＤＩドメインを欠失しているように遺伝的に改変されている、請求項２１に記載の方法。
23. 前記酵素が、改善された発現及びペルオキシソームへのインポートのために遺伝的に改変されている、請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記タンパク質が、改善された発現及びペルオキシソームへのインポートのために遺伝的に改変されている、請求項１～請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ペルオキシソーム標的化配列への前記異種タンパク質の融合が前記ペルオキシソームへの前記異種タンパク質の標的化をもたらし、それによって前記ペルオキシソームへ標的化されていない酵素から前記異種タンパク質を分離する、請求項１～請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ペルオキシソーム標的化配列への前記修飾酵素の融合が前記ペルオキシソームへの前記修飾酵素の標的化をもたらし、それによって前記ペルオキシソームへ標的化されていない基質又は酵素から前記修飾酵素を分離する、請求項１～請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記異種タンパク質が、ＣＯＬｓｙｎ２、ＣＯＬｓｙｎ３、又はＣＯＬｓｙｎ２若しくはＣＯＬｓｙｎ３のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記第１の核酸は、未改変又は天然に存在する第１の核酸と比較して、前記異種タンパク質中の少なくとも１つの疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸又は非疎水性アミノ酸に置換するように設計される、請求項１～請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の方法により製造される、ペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための真核細胞。
30. ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質をコードする配列を含む第１の核酸；及び
    ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素をコードする第２の核酸
    を含む、ペルオキシソーム中でタンパク質を産生するための真核細胞。
31. ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、及び
    ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素
    を発現することができる、ペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生するための真核細胞。
32. 前記タンパク質が前記ペルオキシソーム中で修飾される、請求項３０～請求項３１のいずれか一項に記載の真核細胞。
33. 前記細胞がパストリスである、請求項２９～請求項３２のいずれか一項に記載の真核細胞。
34. 前記ペルオキシソーム標的化配列が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に記載の配列を含む、請求項２９～請求項３３のいずれか一項に記載の真核細胞。
35. ペルオキシソーム標的化配列に融合されたタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、請求項２９～請求項３４のいずれか一項に記載の真核細胞。
36. ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現する真核細胞中で、修飾タンパク質を産生する方法であって：
    請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の方法によって製造された細胞、又は請求項２９～請求項３５のいずれか一項に記載の細胞を、提供すること；
    前記真核細胞において異種タンパク質を発現すること、ここで、前記異種タンパク質は、ペルオキシソーム標的化配列に融合されている；及び
    前記異種修飾酵素が前記ペルオキシソーム中で前記異種タンパク質を修飾して修飾タンパク質を産生するような条件下で前記真核細胞を培養すること
    を含む方法。
37. 真核細胞中で修飾タンパク質を産生する方法、ここで前記細胞はペルオキシソームを含み、前記真核細胞はペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現し、
    前記方法は：
    真核細胞において異種タンパク質を発現すること、ここで、前記異種タンパク質は、ペルオキシソーム標的化配列に融合されている；及び
    前記異種修飾酵素がペルオキシソーム中で前記異種タンパク質を修飾して修飾タンパク質を産生するような条件下で前記真核細胞を培養すること
    を含む。
38. 修飾タンパク質が産生されるような条件下でペルオキシソームを含む真核細胞を培養することを含む、修飾タンパク質の製造方法、ここで、
    前記真核細胞は、ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、及びペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素を発現し、
    前記異種修飾酵素は、前記培養条件下で前記異種タンパク質を修飾して前記ペルオキシソーム中において前記修飾タンパク質を産生する。
39. 修飾タンパク質が産生されるような条件下でペルオキシソームを含む真核細胞を培養することを含む、修飾タンパク質の収率を増加させる方法、ここで、
    前記真核細胞は：
    ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種タンパク質、ここで前記異種タンパク質の発現はプロモーターの影響下にある；及び
    ペルオキシソーム標的化配列に融合された異種修飾酵素
    を発現し、
    前記異種修飾酵素は、前記培養条件下で前記異種タンパク質を修飾して前記ペルオキシソーム中において前記修飾タンパク質を産生する。
40. 前記異種タンパク質の産生が化学的誘導物質によって誘導される、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ペルオキシソームのカーゴを増加させることをさらに含み、ここで前記ペルオキシソームのカーゴを増加させることが、前記真核細胞にオレイン酸又はメタノールを提供することによって行われる、請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
42. 細胞内のペルオキシソーム中で修飾タンパク質を産生するためのキットであって、
    ＧＦＰ－ｘ－ｅＰＴＳ１又はｘ－ＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１を含む第１の核酸構築物、ここでｘはペルオキシソームに標的化される異種タンパク質をコードする核酸配列である；及び
    ＧＦＰ－ｙ－ｅＰＴＳ１又はｙ－ＦＬＡＧ－ｅＰＴＳ１を含む第２の核酸構築物、ここでｙは前記ペルオキシソームに標的化される修飾酵素をコードする核酸配列である、
    を含み、
    前記修飾酵素は前記ペルオキシソーム中で前記異種タンパク質を修飾するように構成される、キット。
    

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