CN111133097A - 表达合成卡尔文循环的酵母 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酵母,所述酵母包含表达合成卡尔文循环的核苷酸序列表达系统,所述核苷酸序列表达系统包含异源基因,所述异源基因至少包括a)编码核酮糖二磷酸羧化酶(EC编号4.1.1.39)类的酶的基因(RuBisCO基因);和b)编码核酮糖磷酸激酶(EC编号2.7.1.19)类的酶的基因(PRK基因),其进行表达;其中所述酵母可选地包含表达目的基因(GOI)的异源表达构建物,和/或其中所述RuBisCO基因和所述PRK基因中的每一个均与编码过氧化物酶体靶向信号(PTS)的核苷酸序列融合。
Description
技术领域
本发明涉及包含异源基因的酵母,其表达合成卡尔文循环(synthetic Calvincycle),并涉及在培养酵母的同时固定二氧化碳的方法。
背景技术
温室气体排放及相关气候变化是我们社会最紧迫的问题之一。使用CO2而不是化石资源作为工业生产过程的碳源,可以显著限制温室气体的排放。生物技术是生物经济的关键技术之一。许多饲料和食品应用以及基础化学和医药生产都是以微生物作为催化剂开始的。这些过程主要基于植物源性资源,例如糖,但很少直接基于大气CO2。然而,植物源性碳的增加使用与土地利用的变化和其他对地球的有害影响有关。因此,生产生物体直接固定二氧化碳是理想的。大多数天然固碳生物使用(太阳)光作为能源,这使得它们完全独立于用于生长的有机碳,这样是有益的。然而,在液体微生物培养中,光分布可能是一个巨大的技术问题,通常这些微生物的生长和生产速度都很低。用于生物技术生产的经典宿主生物在生产率方面要有效得多,但它们依赖于有机碳。
对于酵母系统(如酿酒酵母,Saccharomyces cerevisiae)或细菌系统(大肠杆菌,Escherichia coli),二氧化碳固定通路的基因改造已经显示是可行的。在酵母酿酒酵母中,已表明二氧化碳固定是可行的,同时麦芽糖或木糖发酵导致乙醇产量增加(Guadalupe-Medina et al.Biotechnol.Biofuels 2013,6:125;Li et al.Scientific Reports 2017,7:43875)。然而,在这个系统中,不可能将碳同化与NADH形式的能源供应解耦合。因此,生物质的同化不仅来源于CO2,还来源于木糖、麦芽糖或其他糖(如葡萄糖和半乳糖)。
在大肠杆菌中,构建了一种能产生生物质的功能性卡尔文循环,该功能性卡尔文循环与产生ATP和NADH的能量供应通路解耦合。在这里,丙酮酸被用作能量产生底物。然而,首批改造的克隆需要进一步的进化步骤,以便能在CO2和丙酮酸的存在下生长(Antonovskyet al.Cell 2016,166:115-125)。没有酵母菌株能够只在第二单碳分子(如甲醇)的存在下高度同化二氧化碳。甲醇是一种有价值的可再生原料,它也可以应用绿色能源通过固定的二氧化碳形成。
WO2015/177800A2公开了能够固碳的重组微生物,如细菌或酵母。相关基因如RuBisCO在胞质溶胶(Cytosol)中表达。除了二氧化碳以外,有机碳源如戊糖、己糖或有机酸也都是生物质生产所必需的。
US2017/0002368A1/WO2015/107469A1公开了经修饰以表达功能性I型RuBisCO酶和II类磷酸核酮糖激酶的酵母。还公开了这些酶的表达在所述酵母中重现了卡尔文循环,使酵母能够使用二氧化碳。作为一个例子,酿酒酵母设计成在胞质溶胶中表达异源RuBisCO基因。除二氧化碳外,还用葡萄糖作为额外的碳源。
Peng-Fei Xia等(ACS Synthetic Biology 2016,6(2):276-283)描述了在用于木糖发酵的酿酒酵母中的合成还原戊糖磷酸通路。
Frey等(Journal of the American Chemical Society 2016,138(32):10072-10075)描述了一种合成的羧酶体模拟物,这是一种蓝藻碳固定细胞器,用于包封RuBisCO和碳酸酐酶(CO)两种酶。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(与Komagataella sp.同义)是一种成熟的(well-established)微生物宿主生物。用于巴斯德毕赤酵母的众多菌株改造方法提高了各种产物的生产率,同时研究也致力于用于生产目的的启动子。它以其高蛋白分泌能力而闻名,目前多种蛋白质都生产于这个微生物细胞工厂(Gasser et al.Microb.CellFact.2013,14:196)。最近,报道描述了这种酵母如何实现甲基营养生活方式(Ruβmayer etal.BMC Biol.2015,13:80)。
促使广泛使用的微生物细胞工厂固碳,并将高生产率与低植物源性碳需求结合起来,将是非常理想的。其目的是为生物基产物提供一种底盘细胞,其特点是高生长率和生产率,但碳源需求低于目前使用的菌株。这样的底盘细胞可以用来生产低碳足迹的化学品或药物蛋白质。
发明内容
本发明目的是构建一种改进的微生物,它能够固定二氧化碳,用于生产生物质和生物基产物(bio-based production)。
该目的由权利要求的主题解决并在此进一步描述。
根据本发明,提供一种酵母,其包含异源基因,表达合成卡尔文循环,用于生物质生产,或用作宿主细胞以生产一系列不同的产物类别,包括(小)代谢物、化学品、重组蛋白或细胞生物质。
根据一具体实施例,所述酵母包含表达合成卡尔文循环的核苷酸序列表达系统,所述核苷酸序列表达系统包含合成卡尔文循环的异源基因,所述异源基因至少包括:
a)编码核酮糖二磷酸羧化酶(EC编号4.1.1.39)类的酶的基因(RuBisCO基因);和
b)编码核酮糖磷酸激酶(EC编号2.7.1.19)类的酶的基因(PRK基因);
可选地,其中所述RuBisCO基因和所述PRK基因中的每一个与编码过氧化物酶体靶向信号(PTS)的核苷酸序列融合,
可选地,其中所述酵母进一步包含表达目的基因(GOI)的异源表达构建物。
PTS有助于将相应基因表达到酵母过氧化物酶体中。已经有利地证明RuBisCO和PRK基因在酵母过氧化物酶体中的表达能够支持仅来自二氧化碳的生物质同化。因此,可以构建一种碳固定酵母菌株,其包含能够以二氧化碳生长的所有必要的酶。
然而,根据一具体实施例,酵母将合成卡尔文循环表达到胞质溶胶中。该类实施例可使用合成卡尔文循环的一个或多个或每个异源基因,而无需编码PTS的核苷酸序列。
根据另一具体实施例,酵母包含表达合成卡尔文循环的核苷酸序列表达系统,所述核苷酸序列表达系统包含合成卡尔文循环的异源基因,并且进一步包含表达目的基因(GOI)的异源表达构建物,其中所述合成卡尔文循环至少包含以下异源基因:
a)编码核酮糖二磷酸羧化酶(EC编号4.1.1.39)类的酶的基因(RuBisCO基因);和
b)编码核酮糖磷酸激酶(EC编号2.7.1.19)类的酶的基因(PRK基因)。
特别地,GOI编码目的蛋白(POI),或一种或多种将碳源转化为代谢物的酶。
特别地,所述碳源是C1碳分子,优选为CO2、CO3 2-、HCO3 -和/或甲醇。
特别地,合成卡尔文循环分别功能性地包含将二氧化碳同化到生物质中的所有必要的酶和使用二氧化碳作为碳源的所有必要的酶。除了异源RuBisCO和PRK基因外,一个或多个进一步的内源或异源基因可以被该酵母包含并表达以支持卡尔文循环。
特别地,本文所述的酵母包含一个或多个内源基因以及异源基因以完成合成卡尔文循环。
特别地,合成卡尔文循环包含一个或多个进一步的异源基因。特别地,所述一个或多个异源基因是以下的任何基因:
a)编码磷酸甘油酸激酶(EC编号2.7.2.3)类的酶的基因(PGK1基因),和/或
b)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC编号1.2.1.12)类的酶的基因(TDH3基因);和/或
c)编码磷酸丙糖异构酶(EC编号5.3.1.1)类的酶的基因(TPI1基因);和/或
d)编码转酮酶(EC编号2.2.1.1)类的酶的基因(TKL1基因),
可选地,其中所述PGK1、TDH3、TPI1和TKL1基因中的一个或多个,或每一个,与编码PTS的核苷酸序列融合。
或者,所述PGK1、TDH3、TPI1和TKL1基因中的一个或多个是所述酵母的内源或自体基因,并且可与异源基因共表达。
特别地,所述异源基因包括所述RuBisCO基因、所述PRK基因、所述PGK1基因、所述TDH3基因、所述TPI1基因和所述TKL1基因。
特别地,合成卡尔文循环包含以下异源基因:所述RuBisCO基因、所述PRK基因、所述PGK1基因、所述TDH3基因、所述TPI1基因和所述TKL1基因。
特别地,
a)所述RuBisCO基因源于细菌,优选硫杆菌(Thiobacillus)属;和/或
b)所述PRK基因源于植物,优选苋(Amaranthaceae)科;和/或
c)所述PGK1基因源于酵母,优选Ogataea属;和/或
d)所述TDH3基因源于酵母,优选Ogatae酵母属;和/或
e)所述TPI1基因源于酵母,优选Ogatae酵母属;和/或
f)所述TKL1基因源于酵母,优选Ogatae酵母属。
特别地,
a)所述RuBisCO基因源于脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans),优选地包含图5所示的酶编码核苷酸序列SEQ ID NO:1,尤其是标识为SEQ ID NO:37的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达核酮糖二磷酸羧化酶的功能活性变体;和/或
b)所述PRK基因源于菠菜(Spinacia oleracea),优选地包含图5所示的酶编码核苷酸序列,SEQ ID NO:2,尤其是标识为SEQ ID NO:38的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达核酮糖磷酸激酶的功能活性变体;和/或
c)所述PGK1基因源于Ogataea polymorpha,优选地包含图5所示的酶编码核苷酸序列,SEQ ID NO:3,尤其是标识为SEQ ID NO:39的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达磷酸甘油酸激酶的功能活性变体;和/或
d)所述TDH3基因源于Ogataea polymorpha,优选地包含图5所示的酶编码核苷酸序列,SEQ ID NO:4,尤其是标识为SEQ ID NO:40的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶的功能活性变体;和/或
e)所述TPI1基因源于Ogataea parapolymorpha,优选地包含图5所示的酶编码核苷酸序列,SEQ ID NO:5,尤其是标识为SEQ ID NO:41的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达磷酸丙糖异构酶的功能活性变体;和/或;和/或
f)所述TKL1基因源于Ogataea parapolymorpha,优选地包含图5所示的酶编码核苷酸序列,SEQ ID NO:6,尤其是标识为SEQ ID NO:42的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达转酮酶的功能活性变体。
特别地,编码各酶并进一步包含PTS编码序列的核苷酸序列选自由SEQ ID NO:1至6组成的组。这些序列在3’端包含PTS编码序列。示例性PTS编码序列是标识为SEQ ID NO:44的“TCCAAGTTG”或“TCTAAGTTG”(SEQ ID NO:45)。
然而众所周知,如本文中进一步描述的,核苷酸序列可以包含替代性的PTS编码序列。PTS分别将基因和基因编码的酶表达到酵母过氧化物酶体中。使用包含PTS的酶序列的合成卡尔文循环在这里称作“过氧化物酶体卡尔文循环”。
特别地,编码不含PTS编码序列的相应酶的核苷酸序列选自由SEQ ID NO:37至42组成的组。在没有PTS编码序列时,基因编码的酶定位到酵母胞质溶胶(cytosol)中。在本文中,使用不含PTS的酶序列的合成卡尔文循环被称为“胞质溶胶卡尔文循环”。
根据一具体的实施方案,将所述RuBisCO基因和所述PRK基因中的每一个与编码PTS的核苷酸序列融合,以在酵母过氧化物酶体中表达合成卡尔文循环。
根据另一实施例,所述RuBisCO基因和所述PRK基因中的一个或两者,不含编码PTS的核苷酸序列,例如以将所述基因表达到所述酵母的胞质溶胶中。
特别地,所述PTS包含3-9个氨基酸的氨基酸序列。
特别地,所述PTS包括任意组合的3-5个氨基酸的氨基酸序列,或由任意组合的3-5个氨基酸的氨基酸序列组成,所述氨基酸选自由丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸组成的组,这种PTS在此也称为PTS1。特别地,所述PTS1是SKL、VNL、DKL、TKL、ARL、AKl、PNL、ARF或PML中任一个的氨基酸序列。所选PTS1可以经优化用于指导所述异源基因表达到所述酵母的过氧化物酶体室。
特别地,所述PTS1包括3-5个氨基酸或由3-5个氨基酸组成,所述氨基酸选自由丝氨酸、赖氨酸和亮氨酸组成的组。
特别地,所述PTS1优选地融合到所述异源基因表达产物中的一个产物的羧基末端。
根据一具体实施例,所述PTS包括5-9个氨基酸,或由5-9个氨基酸组成,其包含标识为SEQ ID NO:12的序列,这些PTS在此也称为PTS2:
SEQ ID NO:12:XX(X)nXX,
其中,位置1处的X是R或K中的任一个;
其中,位置2处的X是L、V或I中的任一个;
其中,位置3处的X是一个或多个(n=1-5)氨基酸,其中每个所述氨基酸是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是H或Q中的任一个;
其中,位置5处的X是L或A中的任一个。
换句话说,标识为SEQ ID NO:12的序列如下:
XXXXXXXXX,
其中,位置1处的X是R或K中的任一个;
其中,位置2处的X是L、V或I中的任一个;
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X为无氨基酸或任何氨基酸;
其中,位置5处的X为无氨基酸或任何氨基酸;
其中,位置6处的X为无氨基酸或任何氨基酸;
其中,位置7处的X为无氨基酸或任何氨基酸;
其中,位置8处的X是H或Q中的任一个;
其中,位置9处的X是L或A中的任一个。
示例性PTS选自由PTS组成的组,所述PTS包括标识为SEQ ID NO:13-36中任一个氨基酸序列或由标识为SEQ ID NO:13-36中任一个氨基酸序列组成:
SEQ ID NO:13:RLXXXXXHL,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:14:RLXXXXXHA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:15:RLXXXXXQL,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:16:RLXXXXXQA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:17:RVXXXXXHV,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:18:RVXXXXXHA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:19:RVXXXXXQV,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:20:RVXXXXXQA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:21:RIXXXXXHI,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:22:RIXXXXXHA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:23:RIXXXXXQI,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:24:RIXXXXXQA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:25:KLXXXXXHL,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:26:KLXXXXXHA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:27:KLXXXXXQL,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:28:KLXXXXXQA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:29:KVXXXXXHV,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:30:KVXXXXXHA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:31:KVXXXXXQV,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:32:KVXXXXXQA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:33:KIXXXXXHI,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:34:KIXXXXXHA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:35:KIXXXXXQI,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸;
SEQ ID NO:36:KIXXXXXQA,
其中,位置3处的X是任何氨基酸;
其中,位置4处的X是任何氨基酸;
其中,位置5处的X是任何氨基酸;
其中,位置6处的X是任何氨基酸;
其中,位置7处的X是任何氨基酸。
特别地,所述PTS与所述异源基因表达产物的氨基末端或羧基末端的任一个融合,或所述PTS被融合,使得编码PTS的核苷酸序列在任何位置并入到基因序列中,从而导致过氧化物酶体表达。
特别地,酵母经进一步改造以表达辅助因子,例如分子伴侣。
特别地,酵母包含在所述酵母胞质溶胶中表达一种或多种分子伴侣的进一步的异源基因,所述分子伴侣协助至少一种所述酶的共价折叠和/或组装。特别地,分子伴侣是用于RuBisCO酶正确折叠的辅助因子,从而支持酶功能。
特别地,所述分子伴侣选自由热休克蛋白和分子伴侣素(chaperonin)家族的蛋白质组成的组,优选源于细菌。
特别地,所述分子伴侣为至少:
a)GroEL,其源于大肠杆菌,优选地由以下序列编码:图5所示的分子伴侣编码核苷酸序列SEQ ID NO:7,尤其是标识为SEQ ID NO:43的核苷酸序列,或与上述任何一种具有至少90%序列一致性的表达分子伴侣的功能活性变体;和
b)GroES,其源于大肠杆菌,优选由以下序列编码:标识为SEQ ID NO:8的核苷酸序列,或其具有至少90%序列一致性的表达分子伴侣的功能活性变体。
特别地,甲基营养型和非甲基营养型酵母(例如毕赤酵母属)包含内源性基因PGK1、TDH3、TPI1和TKL1(除异源RuBisCO和PRK基因外,这些内源性基因也可以在酵母过氧化物酶体室中表达),以及内源性基因GroEL和GroES(在酵母胞质溶胶中),从而表达功能性卡尔文循环。然而,一个或多个内源性基因的过度表达可能是有利的。因此,表达卡尔文循环相关酶的任何内源性基因都可以过度表达,例如,通过合适的启动子构建或共表达辅助因子。或者,可以将表达与内源酶相同类型的酶的异源基因额外地引入酵母,或者代替内源基因。
在另一个实施例中,有利的是,RuBisCO、PRK、PGK1、TDH3、TPI1和TKL1基因中的每一个均与酵母异源并整合到酵母基因组中以在宿主细胞过氧化物酶体中表达。此外,GroEL和GroES基因中的每一个都与酵母异源并整合到酵母基因组中以在宿主细胞胞质溶胶中表达。
特别地,合成卡尔文循环或所述分子伴侣的一个或多个所述异源基因,或表达目的基因(GOI)的异源表达构建物中使用的任何一个或多个序列,尤其是GOI,都进行密码子优化,用于在所述酵母中表达。特别地,本文所述的每个异源基因都经过密码子优化。
特别地,所述异源基因可操作地连接于启动子。具体地,每一个所述异源基因可操作地连接于启动子。
具体的启动子类型至少包括组成型、诱导型、合成型、间隔特异型(compartment-specific)和发育阶段特异型启动子。
特别地,所述启动子是甲醇诱导型启动子中的任何一个,其促进天然甲醇诱导基因的表达(Gasser,B.,Steiger,M.G.,&Mattanovich,D.(2015).Methanol regulatedyeast promoters:production vehicles and toolbox for syntheticbiology.Microbial Cell Factories,14:196)。
特别地,所述启动子是组成型的任何启动子。
根据一具体实施例,所述酵母包含另一核苷酸序列表达系统,所述另一核苷酸序列表达系统表达目的蛋白(POI),或将碳源转化为代谢物的一种或多种酶,特别是有机小分子发酵产物,其由酵母宿主细胞表达的代谢通路产生。特别地,启动子可操作地连接到GOI,特别地所述GOI是编码POI或用于产生代谢物的酶的核苷酸序列,其启动子与编码POI的核苷酸序列在自然情况下不相关联。POI具体地是异源多肽或蛋白质。特别地,POI是真核蛋白质,优选哺乳动物蛋白质。在多种具体情况下,POI是多聚蛋白质,特别是二聚体或四聚体。
特别地,GOI表达盒还包含编码能够使POI分泌的信号肽的核苷酸序列,优选地,其中编码信号肽的核苷酸序列位于编码POI的核苷酸序列的5’-端附近。
特别地,所述碳源是C1碳分子,优选为CO2、CO3 2-、HCO3 -和/或甲醇。
特别地,所述代谢物选自由以下组成的组:有机酸,优选以下任一:柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸、甲酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、酒石酸、衣康酸、抗坏血酸或延胡索酸;脂类,优选以下任一:脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇或脂类;醇,优选以下任一:乙醇、丁醇、丙醇、丁二醇或丙二醇;多元醇,优选以下任一:阿拉伯糖醇、赤藓糖醇或木糖醇;碳水化合物,优选以下任一:葡萄糖、果糖或木糖。
特别地,所述代谢物是由通路产生的酵母代谢物,所述通路是在酵母中自然产生的,或由于使用一个或多个异源基因而人工产生的。
特别地,所述POI选自由治疗蛋白质或工业相关技术酶组成的组。特别地,选自治疗蛋白组的所述POI优选为任何抗体分子或其抗原结合片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子。特别地,选自技术酶组的所述POI优选源于水解酶、转移酶、氧化还原酶、裂解酶、异构酶或连接酶的组。
水解酶组中的具体POI是催化化学键水解的酶或其工程变体(engineeredvariant)。水解酶组中的具体POI包括淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、β-木聚糖酶、果胶酶、α-岩藻糖苷酶、唾液酸酶、植酸酶、纤维素酶或蛋白酶。
转移酶组中的具体POI是催化功能性化学基团转移的酶或其工程变体。转移酶组中的具体POI包括甲基转移酶、羟甲基转移酶、甲酰基转移酶、羧基转移酶、氨甲酰基转移酶或转谷氨酰胺酶。
氧化还原酶组中的具体POI是催化还原或氧化的酶或其工程变体。氧化还原酶组中的具体POI包括乳酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、漆酶、过氧化物酶或多酚氧化酶。
裂解酶组中的具体POI是C-O、C-C或C-N形式的化学键的酶或其工程变体。裂解酶组中的具体POI包括丙酮酸脱羧酶或天冬氨酸氨裂解酶。
异构酶组中的具体POI是将一种化学异构体转化为另一种化学异构体的酶或其工程变体。异构酶组中的具体POI包括蛋白质二硫键异构酶或木糖异构酶。
连接酶组中的具体POI是催化共价键形成的酶或其工程变体。连接酶组中的具体POI包括蔗糖合成酶或γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。
一具体的POI是抗原结合分子,例如抗体或其片段。具体的POI中包括抗体,例如单克隆抗体(mAbs)、免疫球蛋白(Ig)或免疫球蛋白G类(IgG)、重链抗体(HcAb’s),或其片段,例如抗原结合片段(Fab)、Fd、单链可变片段(scFv),或其工程变体,例如Fv二聚体(双体)、Fv三聚体(三体)、Fv四聚体或微抗体和单域抗体,如VH、VHH或V-NAR。进一步的抗原结合分子可选自(选择性的)骨架蛋白,例如经设计的库尼茨(Kunitz)结构域、Adnectin、亲和体(Affibody)、抗运载蛋白(Anticalin)和锚蛋白重复蛋白(DARPin)。
特别地,所述酵母为重组细胞或细胞系,也称为宿主细胞或宿主细胞系。特别地,所述酵母为产生POI或代谢物的生产细胞系。特别地,提供表达POI或代谢物的酵母作为底盘细胞,通过将编码POI或代谢物通路的相关基因引入酵母基因组或通过游离表达来制备生产细胞系。
特别地,所述酵母(这里也指宿主细胞)为甲基营养型酵母、源于甲基营养型酵母,或由野生型甲基营养型酵母改造得到。
以甲醇作为单一碳源生长的能力发现有利于将卡尔文循环构建进入该生物体,因为除了RuBisCO和PRK外的大多数相关酶和四个辅助步骤已经存在于甲基营养型酵母的过氧化物酶体中。
特别地,所述酵母选自由以下属组成的组:毕赤酵母(Pichia)、Komagataella、汉逊酵母属(Hansenula)、Ogataea、假丝酵母属(Candida)和球拟酵母属(Torulopsis)。
特别地,所述酵母选自由以下组成的组:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母(K.phaffii)和K.pseudopastoris。特别优选的酵母是巴斯德毕赤酵母、Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母或K.pseudopastoris,例如任何巴斯德毕赤酵母菌株CBS 704(Centralburea voor Schimmelcultures(荷兰微生物菌种保藏中心),NL)、CBS 2612、CBS 7435、CBS 9173-9189、DSMZ 70877、X-33、GS115、KM71和SMD1168。
特别地,所述酵母是通过改造内源性DAS1基因座和/或DAS2基因座(locus)以敲除相应的内源性基因功能或表达而产生。
特别地,所述酵母是例如,除了改造内源性DAS1基因座和/或DAS2基因座外,还通过改造内源性AOX1基因座以敲除相应的内源性基因功能或表达而产生。
在野生型甲基营养型酵母中敲除一个或多个所述内源性基因后,所述酵母不再包含编码在甲醇利用通路中同化作用的第一步骤的基因,但仍标定为用于本文所述目的的“甲基营养型”。
特别地,通过将本文所述的一个或多个异源基因引入到DAS1和DAS2基因座中的任何一个或两者中,以及可选地也引入到AOX1基因座中,而将甲醇利用通路的同化支路敲除。根据一具体的实施例,RuBisCO和PRK两个基因只并入到AOX1和/或DAS1和/或DAS2基因座之一。
在另一实施例中,在不干扰或中断甲醇利用通路的任何内源性基因的情况下引入(例如通过合适的敲入方法)本文所述的一个或多个异源基因。
特别地,巴斯德毕赤酵母的至少两个自然基因,尤其是DAS1(ORF ID:PP7435_Chr3-0352)和DAS2(ORF ID:PP7435_Chr3-0350)被所述异源基因替代。
特别地,巴斯德毕赤酵母的自然基因AOX1(ORF ID:PP7435_Chr4-0130)被任一所述异源基因替代。
特别地,巴斯德毕赤酵母基因组中的三个基因被删除,即AOX1、DAS1和DAS2,以下异源基因整合到基因组中(尤其是在AOX1、DAS1和DAS2敲除位点处):PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES和RuBisCO。
特别地,TDH3、PRK和PGK1整合在AOX1基因座中,受PAOX1、PFDH1和PALD4启动子的控制。特别地,RuBisCO、GroEL和GroES引入到DAS1基因座中,受PDAS1、PPDC1和PRPP1b启动子的控制。特别地,TKL1和TPI1引入到DAS2基因座中,受PDAS2和PSHB17启动子的控制。
特别地,选择启动子来表达异源基因,其在相应的基因整合基因座处对细胞是内源性的。特别地,自然内源性启动子用于表达一个或多个异源基因,例如巴斯德毕赤酵母的自然PAOX1和/或PDAS1,和/或PDAS2。
或者,可以使用外源或合成启动子。
特别地,可以使用同种异基因(allogenic)启动子(同种,但引入到不同位置)。或者,可以使用与酵母宿主细胞异源的启动子。示例性同种异基因启动子为内源性基因的任何启动子,其优选甲醇诱导(例如SHB17的启动子序列(ORF ID:PP7435_Chr2-0185),PSHB17位于编码序列上游500-1000bps)(Gasser,B.,Steiger,M.G.,&Mattanovich,D.(2015).Methanol regulated yeast promoters:production vehicles and toolbox forsynthetic biology.Microbial Cell Factories,14:196)。
根据一具体实施例,控制一个或多个所述异源基因表达的启动子为甲醇诱导型。示例性启动子为以下中任一个:PSHB17:(PP7435_chr2(3400617…341606)、PALD4:PP7435_chr2(1466285…1467148)、PFDH1:PP7435_chr3(423504…424503)、PAOX1:PP7435_chr4(237941…238898)、PDAS1:PP7435_chr3(634140…634688)、PDAS2:PP7435_chr3(632201…633100)、PPMP20 PP7435_Chr1-1351(2418089…2419089)、PFBA1-2 PP7435_Chr1(1163622…114622)、PPMP47 PP7435_Chr3(2033195…2034195)、PFLD PP7435_Chr3(262519…263519)、PFGH1 PP7435_Chr3(555586…556586)、PTAL1-2 cbs7435(644081…645081),或甲醇诱导基因的任何其他启动子序列(Gasser,B.,Steiger,M.G.,&Mattanovich,D.(2015).Methanolregulated yeast promoters:production vehicles and toolbox for syntheticbiology.Microbial Cell Factories,14:196)。
根据另一具体实施例,控制一个或多个所述异源基因表达的启动子为组成型。示例性启动子为以下中任一个:PGAP PP7435_Chr2(1585003…1586003)、PTEF2 PP7435_Chr1(2751497…2752497)、PRPL2A PP7435_Chr4(1576422…1577422)、PCS1 PP7435_Chr1(4023…5023)、PFBA1-1 PP7435_Chr1(679746…680746)、PRPP1B PP7435_Chr4(46235…463235)、PGPM1PP7435_Chr3(646226…647226)、PPDC1 PP7435_Chr3(1860826...1861826)、PPOR1PP7435_Chr2(737738…738738)、PLAT1 PP7435_Chr1(637999…638999)、PPpPfk PP7435_Chr4(1169499…1170499)或PADH2 PP7435_Chr2(1519404…1520404)。
特别地,改造酵母以使得本文所述的每个异源基因都受与所述异源基因在自然下不相关联的启动子的控制。
本发明还提供了在细胞培养物(a cell culture)中培养本文所述酵母的方法,包括在生长阶段使用气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物作为碳源培养酵母,从而在细胞培养物中获得积累的(accumulated)酵母生物质。
特别地,酵母生物质积累至至少0.1g/L细胞干重,更优选至少1g/L细胞干重,优选至少10g/L细胞干重。通常地,在发酵装置中培养积累的酵母生物质,其中酵母培养在10到20g/L细胞干重间。
根据一具体实施例,重组酵母在分批培养、补料分批培养或连续培养条件下培养,和/或在含有气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物(例如作为唯一碳源,或与一种或多种补充碳源结合)的介质中培养。
特别地,分批培养阶段作为第一步骤a)进行,补料分批培养阶段或连续培养阶段作为第二步骤b)进行。
特别地,第二步骤b)在补料分批培养或连续培养阶段中使用提供补充碳源(优选C1碳源)的补料介质。
根据一具体的方面,酵母以补料分批模式进行培养。
特别地,酵母包含与启动子可操作地连接的所述异源基因,优选地,其中所述启动子由甲醇诱导,并且其中将甲醇添加到培养基后,紧随着是所述生长阶段,从而诱导功能性卡尔文循环的表达。
特别地,如果将相应的异源性酶编码核苷酸序列融合到PTS序列,则功能性卡尔文循环表达到过氧化物酶体中。
或者,如果相应的异源酶编码核苷酸序列未与PTS序列融合,则功能性卡尔文循环表达到胞质溶胶中。
特别地,该方法还包括在生产阶段使用碳源培养所述积累的酵母生物质以分别产生所述POI和代谢物,例如作为唯一碳源或与一个或多个补充碳源组合。
根据一具体方面,本发明提供了一种利用编码POI的异源目的基因转化酵母来产生POI的方法,其中该酵母表达本文进一步描述的合成卡尔文循环。
根据另一具体方面,本发明提供了一种利用编码酵母用于代谢物生产的酶的异源目的基因转化酵母以生产酵母代谢物的方法,其中该酵母表达本文进一步描述的合成卡尔文循环。
根据另一具体方面,本发明提供了一种利用表达本文进一步描述的合成卡尔文循环的酵母来生产酵母生物质的方法。
特别地,所述生长阶段以分批培养模式进行,所述生产阶段以补料分批或连续培养模式进行。
如本文所述,酵母进行代谢改造以引入合成(或完全或部分异源)碳固定模块。将创建卡尔文循环的异源基因的表达引导至过氧化物酶体,这证明是非常有效的。因此,二氧化碳可以用作生物质生产的唯一碳源。特别地,培养基通入二氧化碳气体。
根据一具体方面,本发明还提供了一种在包含本文所述合成卡尔文循环的酵母中生产有机产物(例如POI或代谢物)的方法,其中至少20%或至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%产物总有机碳的碳源为气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物。特备地,这种碳源用作结构碳,即构建到有机物质结构中的碳原子。
根据一具体方面,本发明还提供了使用本文描述的酵母的用途,其用于使用气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物为碳源(例如,作为唯一碳源或与补充碳源结合)来生产POI和/或代谢物。
令人惊讶的是,可以提供一种巴斯德毕赤酵母的基因工程菌株,该菌株可以积累生物质,并固定大气二氧化碳,而能量由有机碳提供。功能性卡尔文循环的所有反应都可以有利地定位于过氧化物酶体或胞质溶胶,使得整个C1同化通路可以定位在同一细胞室中,并与普通碳代谢分离。因此,碳代谢分为两个亚系统:一个亚系统依赖于CO2进行生物质同化,另一个亚系统依赖于碳源,如甲醇作为能源,例如用于生成还原当量。这种模块化设计使能量供应模块能被另一个模块替代。例如,氢等其他还原底物可用于生成NADH,从而实现净固碳(net carbon fixation)。
根据一具体实例,通过代谢改造产生一新型巴斯德毕赤酵母菌株,它能够高效地将二氧化碳同化至生物质。利用这项技术,可以利用二氧化碳作为生物技术应用的有价值资源,并将其同化到各种生物基产物中。根据该实例,该工程化巴斯德毕赤酵母菌株具有利用CO2作为唯一碳源的能力。对于能源供应,由于模块化的代谢设计,任何产生NADH的来源都可以利用。甲醇氧化可用于该目的。该酵母系统在固定二氧化碳方面明显优于其他工程化系统,例如大肠杆菌或酿酒酵母。
利用本文所述的合成卡尔文循环的酵母或巴斯德毕赤酵母平台的优点是能够将生物质累积到超过100g/L的很高的细胞密度。因此,基于该微生物底盘的CO2固定平台可以达到高的时空产率。此外,常规生物反应器可以用于培养,无需特制的光生物反应器。该平台可研发用于各种产物类别,包括小代谢物、化学品、重组蛋白或细胞生物质。
在本文所述的实施例中,二氧化碳同化通路定位于过氧化物酶体,从而取代巴斯德毕赤酵母天然的甲醛同化能力。甲醇仅用于生成NADH形式的还原当量。该能量生成步骤用于二氧化碳的净固定。然而,可使用产生NADH的替代还原底物(例如甘油、葡萄糖、木糖、麦芽糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、乙醇)。
在另一实施例中,二氧化碳同化通路定位于胞质溶胶。这种酵母有利地用于使用人工表达系统生产POI或酵母代谢物。
例如,表5(实施例2)所列基因的编码序列整合到巴斯德毕赤酵母中。异源基因RuBisCO、PRK、PGK1、TDH3、TPI1和TKL1的C-端蛋白序列分别改造为含有PTS,PTS引导所述基因在过氧化物酶体中进行表达。GroEL和GroES基因编码辅助因子(分子伴侣),在胞质溶胶中表达。
如实施例部分中进一步所述的,毕赤酵母基因组中的3个基因被删除,即aox1、das1和das2,8个基因整合到基因组中。简单来说,在AOX1、DAS1和DAS2的三个删除位点处,将源于巴斯德毕赤酵母以外物种的异源基因整合到基因组中,所述异源基因为PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES和RuBisCO。所有引入的基因是卡尔文循环的一部分(尤其是PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL和RuBisCO基因),都已经改造为含有C-端过氧化物酶体靶向信号(PTS),以使其划分(comparmentalization)至过氧化物酶体。GroEL、GroES不含PTS,并在胞质溶胶中表达。将异源基因的编码序列与合适的启动子和终止子序列结合,例如巴斯德毕赤酵母的甲醇诱导启动子和巴斯德毕赤酵母的终止子序列。所有表达盒的侧翼(flanked)都有相应的整合位点,以取代上述三个基因,即aox1、das1和das2。
根据进一步实施例,毕赤酵母基因组中的3个基因被删除,即aox1、das1和das2,8个基因整合到基因组中。简单来说,在AOX1、DAS1和DAS2的三个删除位点上,将PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES和RuBisCO整合到基因组中。将这些基因的编码序列(CDS)与巴斯德毕赤酵母的甲醇诱导启动子和巴斯德毕赤酵母的终止子序列结合。所有的表达盒(启动子、CDS、终止子)都是通过金门(Golden Gate)克隆构建的,侧翼具有相应的整合位点以取代上述三个基因aox1、das1和das2。为了促进在提到的三个基因座处通过同源重组进行整合,接着采用了CRISPR/Cas9策略。简单来说,携带Cas9表达盒和gRNA表达构建物的质粒与线性DNA整合片段进行共转化。设计gRNA以定位于靠近编码序列5’端(aox1、das1)或5’端(das2)的aox1、das1或das2基因座。经克隆PCR筛选整合了DNA构建物的菌株后,通过释放选择压力,CRIPSR/Cas9质粒就很容易丢失。因此,产生了只携带整合表达盒的菌株,而无需任何额外的选择标记。通过PCR和Sanger测序验证了三个整合基因座的正确整合。
结果表明,碳同化也可以通过代谢通路在胞质溶胶中发生。
遵循代谢改造策略(删除3个基因并在巴斯德毕赤酵母胞质溶胶中表达8个蛋白),可以在巴斯德毕赤酵母中建立功能性卡尔文循环。这使得二氧化碳固定并同化到巴斯德毕赤酵母的生物质中。由于删除DAS1、DAS2导致甲醇的同化通路受阻,甲醇仅用于生成NADH形式的还原当量。该能量生成步骤对于二氧化碳的净固定是必要的。然而,其他可以产生NADH的还原底物(例如H2)也可以用为替代物。
附图说明
图1:工程化GaT_pp_10菌株(GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)能够在甲醇和CO2存在下生长,而GaT_pp_12和GaT_pp_13则不能生长。CBS7435 wt细胞在存在两种底物下生长良好,因为甲醇可用于生物质和能量生成。在分批培养阶段(16.0g*L-1)培养细胞,直到细胞干重(CDW)为~10g*L-1,然后补入0.5-1.0%甲醇脉冲(pulse)和恒定流入5%二氧化碳。CDW值通过OD测量值计算得出(相关性:1OD单位=0.191g CDW*L-1),标准误差线表示4个测量值的标准误差。
图2:甲醇摄入率测定期间的生长。只有CBS7435 wt和RuBisCO阳性的GaT_pp_10菌株(GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)能在甲醇和CO2中生长。GaT_pp_12和GaT_pp_13菌株在观察的时间范围内没有显示任何生长。
图3:摄入率测定研究期间的甲醇消耗。在实施例4所示发酵1培养的第6天,测定了甲醇摄入率,并显示了CBS7435 wt细胞对甲醇的利用率最高,其次是经改造的GaT_pp_10菌株(GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)。缺少RuBisCO的菌株(GaT_pp_12和GaT_pp_13)表现出对甲醇的利用缓慢(对比图2中的对应的线)。
图4:工程化GaT_pp_10菌株(技术复制体GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)的生长依赖于作为碳源的二氧化碳的供应。将工程化GaT_pp_10(GaT_pp_10a(圆)和GaT_pp_10b(尖))的生物质形成过程与对照菌株相比较,所述对照菌株缺少RuBisCO(GaT_pp_12a(矩形)(GaT_pp_12b(三角))。在分批培养阶段(16.0g甘油*L-1,从t0开始)培养细胞,直到CDW为~10g*L-1,然后用0.5%甲醇(w/v)诱导(在t1),然后补入1%(w/v)甲醇脉冲(t2至发酵2结束)。诱导后,只有GaT_pp_10b和GaT_pp_12b同时补入5%CO2。在3天(t3)和出现显著增长(GaT_pp_10b)后,设置GaT_pp_10b和GaT_pp_12b的CO2供应为0%,而增加GaT_pp_10a和GaT_pp_12a的CO2供应到5%。CDW值通过OD测量值计算(相关性:1OD单位=0.191g CDW*L-1),标准误差线指示4个测量值的标准误差。
图5:异源基因的核苷酸序列
PTS:下划线
终止密码子:粗体和斜体的TAA
如图5所示,一些基因编码序列额外地包含编码PTS的核苷酸序列和/或终止密码子。众所周知,基因编码序列可与该PTS编码序列一起使用或不与该PTS编码序列一起使用,并且可选地与TAA或替代终止密码子(如果有的话)一起使用。
SEQ ID NO:1:脱氮硫杆菌RuBisCO酶II型的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:1的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是PTS编码序列“TCCAAGTTG”(SEQ IDNO:44),以及3’端的终止密码子“TAA”。
SEQ ID NO:2:菠菜PRK酶II型的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:2的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是PTS编码序列“TCCAAGTTG”(SEQ ID NO:44)。
SEQ ID NO:3:Ogataea polymorpha PGK1酶的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:3的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是PTS编码序列“TCTAAGTTG”(SEQ IDNO:45),以及3’端的终止密码子“TAA”。
SEQ ID NO:4:Ogataea polymorpha TDH3酶的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:4的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是PTS编码序列“TCTAAGTTG”(SEQ IDNO:45),以及3’端的终止密码子“TAA”。
SEQ ID NO:5:Ogataea parapolymorpha TPI1酶的核苷酸序列。标识为SEQ IDNO:5的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是PTS编码序列“TCTAAGTTG”(SEQ ID NO:45),以及3’端的终止密码子“TAA”。
SEQ ID NO:6:Ogataea parapolymorpha TKL1酶的核苷酸序列。标识为SEQ IDNO:6的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是PTS编码序列“TCTAAGTTG”(SEQ ID NO:45),以及3’端的终止密码子“TAA”。
SEQ ID NO:7:大肠杆菌GroEL分子伴侣蛋白的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:7的核苷酸序列由以下组成:5’端开始的酶编码序列,然后是3’端的终止密码子“TAA”。
SEQ ID NO:8:大肠杆菌GroES分子伴侣蛋白的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:8的核苷酸序列由酶编码序列组成。
SEQ ID NO:37:脱氮硫杆菌RuBisCO酶II型的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:37的核苷酸序列由没有终止密码子的酶编码序列组成。
SEQ ID NO:38:菠菜PRK酶II型的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:38的核苷酸序列由没有终止密码子的酶编码序列组成。
SEQ ID NO:39:Ogataea polymorpha PGK1酶的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:39的核苷酸序列由没有终止密码子的酶编码序列组成。
SEQ ID NO:40:Ogataea polymorpha TDH3酶的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:40的核苷酸序列由没有终止密码子的酶编码序列组成。
SEQ ID NO:41:Ogataea parapolymorpha TPI1酶的核苷酸序列。标识为SEQ IDNO:41的核苷酸序列由没有终止密码子的酶编码序列组成。
SEQ ID NO:42:Ogataea parapolymorpha TKL1酶的核苷酸序列。标识为SEQ IDNO:42的核苷酸序列由没有终止密码子的酶编码序列组成。
SEQ ID NO:43:大肠杆菌GroEL分子伴侣蛋白的核苷酸序列。标识为SEQ ID NO:43的核苷酸序列由没有终止密码子的分子伴侣编码序列组成。
图6:工程化GaT_pp_22菌株(GaT_pp_22I和GaT_pp_22II)能够在甲醇和二氧化碳存在下生长。在分批培养阶段(15.0g*L-1)培养细胞,直到细胞干重(CDW)为~8g*L-1,然后补入0.5-1.0%(v/v)甲醇脉冲和恒定流入5%CO2。CDW值通过OD测量值计算得出(相关性:1OD单位=0.191g CDW*L-1),标准误差线表示4个测量值的标准误差。
图7:表达羧肽酶B(CpB)的菌株(GaT_pp_31)的上清液。样品在MOPS电泳缓冲液中用NuPAGETM10%Bis-Tris蛋白凝胶(Thermofisher Scientific,US)分离,并进行银染;1为将菌株GaT_pp_31接种在含0.5%(v/v)甲醇的YNB培养基中时的上清液样品,2为接种菌株GaT_pp_31(甲醇浓度保持在1%(v/v))72小时后的上清液样品,左侧蛋白梯:PageRulerTM预染蛋白梯(ThermoFisher Scientific,US),右侧蛋白梯:BenchMarkTM蛋白梯(ThermoFisherScientific,US),图片经过后处理,使用ImageJ裁去不必要的泳道。
图8:表达人血清白蛋白(HSA)的菌株GaT_pp_35(P)和GaT_pp_38(C)的上清液。样品在MOPS电泳缓冲液中用NuPAGETM10%Bis-Tris蛋白凝胶(ThermoFisher Scientific,US)分离,并进行银染。
1-4:具有过氧化物酶体(P)版通路的GaT_pp_35接种于添加0.5%甲醇的YNB后0小时(1)、24小时(2)、48小时(3)和72小时(4)的上清液样品,5:空道,6-13:具有胞质溶胶(P)版通路的GaT_pp_38接种0小时(6、7)、24小时(8、9)、48小时(10、11)和72小时(12、13)后的上清液样品,分别接种了GaT_pp_38的两个不同克隆(克隆1:6/8/10/12,克隆2:7/9/11/13),左侧蛋白梯:PageRulerTM预染蛋白(ThermoFisher Scientific,US)。
具体实施方式
本说明书中使用的特定术语具有以下含义。
本文所用的“卡尔文循环”一词应理解为微生物和植物利用基因和酶以确保二氧化碳固定的过程。在这个过程中,二氧化碳和水转化为代谢过程和细胞过程必需的有机化合物。有许多野生型生物体利用天然卡尔文循环生产有机化合物,如蓝藻,或紫色细菌或绿色细菌。卡尔文循环需要各种酶来确保适当的调控,可以分为三个主要阶段:碳固定、还原和核酮糖的再生。每一个阶段都受到严格的调控并需要独特和特定的酶。
在卡尔文循环的第一阶段,发生碳固定。二氧化碳与核酮糖1,5-二磷酸结合形成两个3-磷酸甘油酸分子。催化这种特异反应的酶是核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCO)。RuBisCO是碳固定过程中使用的第一种酶,能够酶促处理其底物核酮糖1,5-二磷酸。
在卡尔文循环的第二阶段,发生还原。在阶段1中合成的3-磷酸甘油酸分子还原为甘油醛-3-磷酸。
在卡尔文循环的第三阶段,发生RuBisCO再生。这个特异阶段涉及一系列的反应,其中需要多种酶以确保适当的调控。这一阶段的特点是早期阶段产生的3-磷酸甘油酸分子转化回核酮糖1,5-二磷酸。参与该过程的酶包括:磷酸丙糖异构酶、醛缩酶、果糖-1,6-二磷酸酶、转酮醇酶、景天庚糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulase-1,7-bisphosphatase)、磷酸戊糖异构酶、磷酸戊糖差向异构酶和磷酸核酮糖激酶。以下是每种酶及其在核酮糖1,5-二磷酸再生中的作用的简单概要,按其在该特异阶段出现的顺序排列。
卡尔文循环的关键酶是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)复合物,通过捕获二氧化碳分子将核酮糖-1,5-二磷酸转化成两个3-磷酸甘油酸分子,核酮糖磷酸激酶也称为磷酸核酮糖激酶(PRK)。
存在几种形式的RuBisCO(Tabita et al.,J Exp Bot,59,1515-24,2008),其中最具代表性的是I型和II型。I型由两种亚基组成:大亚基(RbcL)和小亚基(RbcS)。功能性酶复合物是由八个L亚基和八个S亚基组成的十六聚体。这些亚基的正确组装还需要至少一种特异分子伴侣:RbcX的介入(Liu et al.,Nature,463,197-202,2010)。II型简单得多:它是由两个相同的RbcL亚基形成的二聚体。
II型RuBisCO酶例如可从重组微生物中获得,通过RuBisCO基因(例如脱氮硫杆菌,SEQ ID NO:1)与分子伴侣共表达,特别是与细菌分子伴侣例如GroES和GroEL共表达。
核酮糖-1,5-二磷酸是RuBisCO的底物,在PRK的催化下,由核酮糖-5-磷酸与ATP反应形成。已知两类PRK:在变形菌门中发现的Ⅰ类酶是八聚体,而在蓝细菌和植物中发现的Ⅱ类酶是四聚体或二聚体(Hariharan,T.,Johnson,P.J.,&Cattolico,R.A.(1998).Purification and characterization of phosphoribulokinase from the marinechromophytic alga Heterosigma carterae.Plant Physiology,117(1),321-9)。II型PRK由PRK基因编码,例如来自菠菜的PRK基因(SEQ ID NO:2)。
没有包含RuBisCO和/或PRK的野生型酵母,这就是为什么酵母被认为是非自养(或异养)生物体。然而,其他卡尔文循环酶的存在是因为它们用于其他酵母代谢过程。
与光合生物体中存在的天然卡尔文循环相反,酵母可以设计成仅作为合成卡尔文循环来表达功能性卡尔文循环。本文的合成卡尔文循环应理解为利用编码至少RuBisCO和PRK酶的异源基因的卡尔文循环。如果碳固定通路在酵母中是具有活性的(即,它通过非自然产生的或非天然的、合成的碳固定途径利用二氧化碳),以生产用于作为生物质前体的碳水化合物,则这种合成卡尔文循环在这里应理解为功能性的。因此,本文描述的异源基因以它们彼此相对定位的方式表达(例如,在同一细胞室中,例如过氧化物酶体或在类似于羧酶体的合成室中),使得它们能够发挥碳固定的作用。合成卡尔文循环的功能可以按如下进行测试:提出的通路的功能可以在任何工程化生物体中验证,所述生物体通过以13C标记的二氧化碳为碳源生长,表达全部所述异源酶。将源于二氧化碳的13C并入形成生物质的生物质前体代谢物,包括3-磷酸甘油酸、甘油醛3-磷酸、磷酸二羟基丙酮、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、景天庚酮糖-1,7-二磷酸和核酮糖-1,5-二磷酸。13C标记可根据以下公开的LC-MS和GC-MS规程进行测定(Ruβmayer,H.,Buchetics,M.,Gruber,C.,Valli,M.,Grillitsch,K.,Modarres,G.,Gasser,B.(2015).Systems-level organization of yeastmethylotrophic lifestyle.BMC Biology,13(1),80;Mairinger,T.,Steiger,M.,Nocon,J.,Mattanovich,D.,Koellensperger,G.,Hann,S.,2015.GC-QTOFMS baseddetermination of isotopologue and tandem mass isotopomer fractions of primarymetabolites for 13C-metabolic flux analysis.Anal.Chem.acs.analchem.5b03173.doi:10.1021/acs.analchem.5b03173)。
术语“碳分子”在本文中应理解为“碳底物”,并意指可发酵的碳底物,通常是产生有机碳化合物的碳源,适合作为微生物的能源。C1碳源是非有机或有机化合物,每个分子或离子只含有一个碳原子。本文所述的用于生物质生产和其他发酵过程的典型底物C1碳分子包括天然气、二氧化碳(以气态或溶解形式)、一氧化碳、甲醇和合成气(一氧化碳和氢气的混合物)。碳源可以作为单一碳源使用,或可以作为不同碳源的混合物使用。
本文所用的术语“细胞系”是指已建立的特定细胞类型的克隆,其获得了在长时间内增殖的能力。术语“宿主细胞系”是指用于表达内源或重组基因或代谢通路基因以分别产生多肽和由这些多肽介导的细胞代谢物的细胞系。制备用于与一个或多个异源基因重组以将基因整合入细胞基因组的细胞系在此也称为“底盘”细胞系。“生产宿主细胞系”或“生产细胞系”通常理解为即时可用的用于在生物反应器中培养/培育以获得生产过程产物(例如POI或代谢物)的细胞系。本文所述的酵母宿主或酵母细胞系应特别理解为重组酵母生物体,其可被培养/培育以产生POI或宿主细胞代谢物。
关于宿主细胞系,术语“细胞培养”或“培养”(“培育”在本文同义),也称为“发酵”,意指在人工环境(例如,体外环境)中,在有利于生长、分化或持续生存的条件下,在细胞活化或休眠状态下,尤其是在受控生物反应器中根据工业上已知的方法,维持细胞的状态。培养时,在适宜于支持细胞培养物的培养的条件下,使细胞培养物与培养容器中的细胞培养基或底物接触。在某些实施例中,本文所述的培养基用于根据本领域已知的标准细胞培养技术培养细胞。在某些方面,提供了可用于酵母生长的培养基。
细胞培养基为细胞在受控的、人工的和体外的环境中维持和生长提供了必要的营养。细胞培养基的特性和组成取决于具体的细胞需求。重要参数包括渗透压、pH值和营养配方。根据本领域已知的方法,可以连续或不连续的方式进行营养物质的补给。本文所述方法中使用的培养基对于生产重组蛋白特别有用。
分批培养过程是一种培养模式,在该模式中,细胞培养所需的所有营养物质都包含在初始培养基中,在发酵过程中无需增加供给其他营养物质,而在补料分批培养过程中,在分批阶段后,进行补料阶段,其中通过补给将一种或多种营养物质供入培养基。营养补给的目的是增加生物量,以增加重组蛋白量。
在某些实施例中,本文所述的方法是补料分批培养过程。特别地,利用编码所需重组POI或代谢通路的核酸构建物转化宿主细胞,将该宿主细胞在生长期培养基中培养并转移到生产期培养基以产生所需的重组POI或细胞代谢物。
在另一实施例中,以连续培养模式(例如恒化器)培养本文所述的宿主细胞。连续发酵过程的特征是将新鲜培养基以规定的、固定的和连续的速率补入生物反应器,而同时以相同的规定的、恒定的和连续的排出速率从生物反应器中排出培养液。将培养基、补料速率和排出速率保持在同一水平,使生物反应器的培养参数和条件保持不变。
本文所述的稳定的细胞培养物应特别理解为指保持遗传特性的细胞培养物,所述遗传特性特别是保持POI或代谢物产生水平高,例如至少在μg水平,即使经过了约20代培养,优选至少30代,更优选至少40代,最优选至少50代。特别地,本发明提供了稳定的重组宿主细胞系,当用于工业规模生产时可认为是一个巨大的优势。
本文所述的细胞培养物对于工业制造规模的方法特别有利,例如在体积和技术系统方面,该方法结合基于补给营养物的培养模式,特别是补料分批培养或分批培养过程,或连续或半连续过程(如恒化器)。
术语“表达”或“表达系统”或“表达盒”应理解如下。包含目的编码序列和可操作连接的控制序列的核酸分子用于转化或转染宿主细胞以表达编码序列,从而产生编码的蛋白质或宿主细胞代谢物。为了实现转化,表达系统可包含在载体中,例如,包含编码POI的目的基因的载体。然而,相关DNA也可以整合到宿主染色体中。表达可涉及分泌或非分泌表达产物,包括例如POI或代谢物。
本文所用的术语“表达构建物”或“载体”或“质粒”定义为克隆重组核苷酸序列(即重组基因)的转录和其mRNA在合适宿主生物体中的翻译所需的DNA序列。表达载体或质粒通常包含在宿主细胞中自主复制的起点、可选择的标记(例如氨基酸合成基因或具有抗生素(例如博来霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)、多个限制性酶切位点、合适的启动子序列和转录终止子,这些元件可操作地连接在一起。本文所用的术语“质粒”和“载体”包含自主复制核苷酸序列和基因组整合核苷酸序列。典型的表达盒在核酸分子的5’端到3’端的方向上包含:启动子、一个或多个编码序列和终止子。
本文所用的术语“功能”,例如在酶活性的上下文中,应涉及功能性活化分子。功能性酶的特征在于催化中心识别酶底物并催化底物转化为转化产物。在标准测试系统中测定酶变体的酶活性时,例如,其中酶活性至少为亲本(未经修饰或野生型酶)活性的50%,或至少为60%、70%、80%、90%、100%或甚至超过100%中的任何一种,则可认为酶变体是功能性的。
本文所用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。启动子活性可通过其转录效率来评估。这可以通过测量来自启动子的mRNA转录量来直接确定,例如通过Northern杂交或通过测量来自启动子的基因产物表达量来间接确定。
“甲醇诱导启动子”在本文应理解为一种自然产生的或野生型启动子,其控制生物体特别是甲基营养型微生物的甲醇异化通路基因的表达。
根据甲基营养型酵母(例如巴斯德毕赤酵母)的甲醇异化通路,甲醇被动扩散到酵母过氧化物酶体。在那里,通过两种不同的醇氧化酶同工酶(Aox1、Aox2)中的一种转化为甲醛。甲醛可以通过甲醇异化通路在几个步骤中进一步氧化成CO2。或者,甲醛通过与5-磷酸木酮糖的缩合反应并入磷酸戊糖通路,该反应由称为二羟基丙酮合酶(Das)的特异转酮酶催化。该反应生成二羟基丙酮(DHA)分子和3-磷酸甘油醛分子。这些反应都发生在甲基营养型酵母的过氧化物酶体中。
作为天然或野生型启动子序列的替代,可以使用这种天然或野生型启动子序列(这里理解为亲本启动子)的功能变体,其具有至少90%的序列一致性,并且以基本相似的方式发挥控制基因表达的功能,例如以诱导型启动子或组成型启动子作为亲本启动子。
本文所用的关于核苷酸或氨基酸序列或蛋白质的术语“异源”是指对给定宿主细胞来说是外来的,即“外源的”化合物,例如在天然中没有发现的,或在天然中但在不同物种中发现的;或在给定(野生型)宿主细胞中自然发现的,例如是“内源的”,然而,处于异源构建物的情形中,例如使用异源核酸。内源发现的异源核苷酸序列也可以在细胞中产生非自然(例如,大于预期或大于自然发现的)的量,或在细胞的非自然腔室中产生。异源核苷酸序列或包含异源核苷酸序列的核酸在序列上可能与内源核苷酸序列不同,但编码与内源发现相同的蛋白质。特别是,异源核苷酸序列是那些在自然中与宿主细胞没有同一关系的核苷酸序列。任何重组或人工核苷酸序列都可认为是异源的。异源聚核苷酸的一个例子是与控制编码核苷酸序列表达的启动子并非天然相关的核苷酸序列。
如本文所述,合成卡尔文循环的酶可以是异源的,或者由异源核酸分子或基因编码。编码序列可操作地与酵母宿主细胞内源或异源的启动子连接。通常地,酵母改造成包含重组核苷酸序列,该重组核苷酸序列包含启动子和编码序列,所述启动子和编码序列并非天然相关或并非天然地可操作地相互连接。
作为异源化合物的另一个例子,是可操作地连接到转录控制元件的POI编码聚核苷酸,所述转录控制元件例如,控制聚核苷酸表达的启动子,或通常非可操作地连接到聚核苷酸的终止信号序列。
在特定微生物中表达的异源碳固定酶将根据在该微生物中天然表达的酶而变化,或者需要过表达以提升卡尔文循环的功能。引入酵母宿主细胞并由重组酵母表达的异源基因可以来自任何来源,例如真核生物或原核生物、其人工变体或合成生物体。
本文所述的示例性异源基因包括天然的基因或聚核苷酸,或那些对宿主细胞来说是内源的但人工连接到如本文所述PTS的基因。这些构建物是人工构建物,它们不存在于天然中,因此是合成的或人工的。
本文所述卡尔文循环的异源酶也指野生型酶的同系物和功能变体,其具有相应的酶活性功能,包括一个或多个氨基酸在序列中的插入、替换或缺失(例如,与酶的天然氨基酸序列具有至少60%,或至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%序列一致性的酶蛋白,如利用National Center of Biotechnology Information(国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的。
示例性RuBisCO可由编码天然RuBisCO酶的野生型RuBisCO基因编码,或由编码天然RuBisCO酶的密码子优化聚核苷酸编码。例如,RuBisCO可以是来源于细菌的,优选以下属的细菌:硫杆菌属(Thiobacillus)、铁氧化菌属(Sideroxydans)、纤毛菌属(Leptothrix)、甲基菌属(Methylobacillus)、Sulfuritalea、嘉利翁氏菌属(Gallionellales)、红育菌属(Rhodoferax)、红育菌属(Rhodoferax)、伯克氏菌(Burkholderiales)、硫单孢菌属(Thiomonas)、丝硫细菌属(Thiothrix)、嗜盐硫杆状菌属(Halothiobacillus)、Acidihalobacter、Limnohabitans、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、闪光囊硫菌属(Lamprocystis)、硫囊菌属(Thiocystis)、异着色菌属(Allochromatium)或硫红球菌属(Thiorhodococcus)。根据一具体实施例,RuBisCO由源于以下菌的RuBisCO基因编码:脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)、硫杆菌65-29(Thiobacillus sp.65-29)、硫杆菌65-1402(Thiobacillus sp.65-1402)、排硫硫杆菌(Thiobacillus thioparus)、硫杆菌GWE1_62_9(Thiobacillus sp.GWE1_62_9)、嗜硫硫杆菌(Thiobacillus thiophilus)、Thiobacillus sajanensis、硫杆菌65-1059(Thiobacillus sp.65-1059)、硫杆菌SCN63-374(Thiobacillus sp.SCN 63-374)、Sideroxydans lithotrophicus、Sulfuritaleahydrogenivorans、发酵红育菌(Rhodoferax fermentans)、中间硫单孢菌(Thiomonasintermedia)、那不勒斯嗜盐硫杆菌(Halothiobacillus neapolitanus)、Acidihalobacterprosperus、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、Lamprocystis purpurea、Allochromatium warmingii或德氏硫红球菌(Thiorhodococcus drewsii),例如,包含标识为SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其具有至少为90%或95%的序列一致性、表达功能性核酮糖二磷酸羧化酶的功能活性变体。
示例性PRK可由编码天然PRK酶的野生型PRK基因编码,或由编码天然PRK酶的密码子优化聚核苷酸编码。例如,PRK可以是来源于植物的,优选以下科的植物:苋科(Amaranthaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、豆科(Fabaceae)、杨柳科(Salicaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、大叶藻科(Zosteraceae)、水云科(Ectocarpaceae)或锦葵科(Malvaceae)。根据一具体实施例,PRK由源于以下植物的PRK基因编码:菠菜(Spinaciaoleracea)、甜菜(Beta vulgaris subsp.Vulgaris)、黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)、向日葵(Helianthus annuus)、黄胡萝卜(Daucus carotasubsp.sativus)、赤豆(Vigna angularis)、毛白杨(Populus tomentosa)、旋蒴苣苔(Dorcoceras hygrometricum)、小麦(Triticum aestivum)、天蓝遏蓝菜(Noccaeacaerulescens)、欧洲油菜(Brassica napus)、大叶藻(Zostera marina)、玉米(Zea mays)、长囊水云(Ectocarpus siliculosus)或黄麻(Corchorus capsularis),例如,包含标识为SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其具有至少为90%或95%的序列一致性、表达功能性核酮糖磷酸激酶的功能活性变体。
示例性PGK1可由编码天然PGK1酶的野生型PGK1基因编码,或由编码天然PGK1酶的密码子优化聚核苷酸编码。例如,PGK1可以是来源于酵母的,优选以下属的酵母:Ogataea、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、塞伯林德纳氏酵母属(Cyberlindnera)、Kuraishia、塞伯林德纳氏酵母属(Cyberlindnera)、管囊酵母属(Pachysolen)、Meyerozyma、酒香酵母属(Brettanomyces)、Babjeviella、Scheffersomyces、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、有孢汉生酵母(Hanseniaspora)、Lachancea、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、有孢汉生酵母属(Hanseniaspora)、哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、酵母属(Saccharomyces)、Komatagella、亚罗酵母属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)。根据一具体实施例,PGK1由源于以下酵母的PGK1基因编码:Ogataeapolymorpha、Ogataea parapolymorpha、异常威克汉姆酵母NRRL Y-366-8(Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366-8)、库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)、费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)、Kuraishiacapsulata CBS 1993、嗜鞣管囊酵母NRRL Y-2460(Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460)、季也蒙毕赤酵母ATCC 6260(Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260)、布鲁塞尔酒香酵母AWRI1499(Brettanomyces bruxellensis AWRI1499)、肌酸巴氏杆菌NRRL Y-12698(Babjeviella inositovora NRRL Y-12698)、斯氏舍弗氏菌CBS 6054(Scheffersomycesstipitis CBS 6054)、多形态雪旺菌(Schwanniomyces polymorphus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniaspora guilliermondii)、酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiaeS288C)、马克斯克鲁维酵母(Klyveromyces marxianus)、Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或白假丝酵母(Candida albicans),例如,包含标识为SEQ IDNO:3的核苷酸序列或与其具有至少为90%或95%的序列一致性、表达功能性磷酸甘油酸激酶的功能活性变体。
示例性TDH3可由编码天然TDH3酶的野生型TDH3基因编码,或由编码天然TDH3酶的密码子优化聚核苷酸编码。例如,TDH3可以是来源于酵母的,优选以下属的酵母:Ogataea、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、塞伯林德纳氏酵母属(Cyberlindnera)、Kuraishia、塞伯林德纳氏酵母属(Cyberlindnera)、管囊酵母属(Pachysolen)、Meyerozyma、酒香酵母属(Brettanomyces)、Babjeviella、Scheffersomyces、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、有孢汉生酵母(Hanseniaspora)、Lachancea、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、有孢汉生酵母属(Hanseniaspora)、哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、酵母属(Saccharomyces)、Komatagella、亚罗酵母属(Yarrowia)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)。根据一具体实施例,TDH3由源于以下酵母的TDH3基因编码:Ogataeapolymorpha、Ogataea parapolymorpha、异常威克汉姆酵母NRRL Y-366-8(Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366-8)、库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)、费比恩塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)、Kuraishiacapsulata CBS 1993、嗜鞣管囊酵母NRRL Y-2460(Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460)、季也蒙毕赤酵母ATCC 6260(Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260)、布鲁塞尔酒香酵母AWRI1499(Brettanomyces bruxellensis AWRI1499)、肌酸巴氏杆菌NRRL Y-12698(Babjeviella inositovora NRRL Y-12698)、斯氏舍弗氏菌CBS 6054(Scheffersomycesstipitis CBS 6054)、多形态雪旺菌(Schwanniomyces polymorphus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniaspora guilliermondii)、酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiaeS288C)、马克斯克鲁维酵母(Klyveromyces marxianus)、Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或白假丝酵母(Candida albicans),例如,包含标识为SEQ IDNO:4的核苷酸序列或与其具有至少为90%或95%的序列一致性、表达功能性甘油醛-3-磷酸脱氢酶的功能活性变体。
示例性TPI1可由编码天然TPI1酶的野生型TPI1基因编码,或由编码天然TPI1酶的密码子优化聚核苷酸编码。例如,TPI1可以是来源于酵母的,优选以下属的酵母:Ogataea、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、塞伯林德纳氏酵母属、Kuraishia、塞伯林德纳氏酵母属、管囊酵母属、Meyerozyma、酒香酵母属、Babjeviella、Scheffersomyces、生丝毕赤酵母属、许旺酵母属、克鲁维酵母属、有孢汉生酵母、Lachancea、接合酵母属、假囊酵母属、接合酵母属、有孢汉生酵母属、哈萨克斯坦酵母属、酵母属、Komatagella、亚罗酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属。根据一具体实施例,TPI1由源于以下酵母的TPI1基因编码:Ogataeaparapolymorpha、Ogataea polymorpha、异常威克汉姆酵母NRRL Y-366-8、库德里阿兹威氏毕赤酵母、费比恩塞伯林德纳氏酵母、Kuraishia capsulata CBS 1993、嗜鞣管囊酵母NRRLY-2460、季也蒙毕赤酵母ATCC 6260、布鲁塞尔酒香酵母AWRI1499、肌酸巴氏杆菌NRRL Y-12698、斯氏舍弗氏菌CBS 6054、多形态雪旺菌、乳酸克鲁维酵母、葡萄有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、酿酒酵母S288C、马克斯克鲁维酵母、Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母、解脂耶罗威亚酵母、博伊丁假丝酵母或白假丝酵母,例如,包含标识为SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其具有至少为90%或95%的序列一致性、表达功能性磷酸丙糖异构酶的功能活性变体。
示例性TKL1可由编码天然TKL1酶的野生型TKL1基因编码,或由编码天然TKL1酶的密码子优化聚核苷酸编码。例如,TKL1可以是来源于酵母的,优选以下属的酵母:Ogataea、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、塞伯林德纳氏酵母属、Kuraishia、塞伯林德纳氏酵母属、管囊酵母属、Meyerozyma、酒香酵母属、Babjeviella、Scheffersomyces、生丝毕赤酵母属、许旺酵母属、克鲁维酵母属、有孢汉生酵母、Lachancea、接合酵母属、假囊酵母属、接合酵母属、有孢汉生酵母属、哈萨克斯坦酵母属、酵母属、Komatagella、亚罗酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属。根据一具体实施例,TKL1由源于以下酵母的TKL1基因编码:Ogataeaparapolymorpha、Ogataea polymorpha、异常威克汉姆酵母NRRL Y-366-8、库德里阿兹威氏毕赤酵母、费比恩塞伯林德纳氏酵母、Kuraishia capsulata CBS 1993、嗜鞣管囊酵母NRRLY-2460、季也蒙毕赤酵母ATCC 6260、布鲁塞尔酒香酵母AWRI1499、肌酸巴氏杆菌NRRL Y-12698、斯氏舍弗氏菌CBS 6054、多形态雪旺菌、乳酸克鲁维酵母、葡萄有孢汉逊酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、酿酒酵母S288C、马克斯克鲁维酵母、Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母、解脂耶罗威亚酵母、博伊丁假丝酵母或白假丝酵母,例如,包含标识为SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与其具有至少为90%或95%的序列一致性、表达功能性转酮酶的功能活性变体。
示例性分子伴侣可由本文所述的酵母宿主细胞的异源或内源的基因编码。这种分子伴侣尤其发挥了作为支持由RuBisCO基因编码的功能性RuBisCO酶的折叠的分子伴侣功能。
例如GroEL可由编码天然GroEL分子伴侣的野生型GroEL基因编码或由编码天然GroEL分子伴侣的密码子优化聚核苷酸编码。例如,GroEL可以是来源于细菌的,优选以下属的细菌:埃希氏菌属(Escherichia)、硫杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、亚特兰大杆菌属(Atlantibacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、果胶杆菌属(Pectcobacterium)、西姆惠菌属(Shimwellia)、弗朗科杆菌属(Franconibacter)、泛菌属(Pantoea)、红树杆菌属(Mangrovibacter)、Nissabacter、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、Rouxiella、邻单胞菌属(Plesiomonas)、摩根氏菌属(Morganella)或耶尔森菌属(Yersinia)。根据一具体实施例,GroEL由源于以下细菌的GroEL基因编码:大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、赫尔曼亚特兰大杆菌(Atlantibacter hermannii)、产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenes)、Shimwellia blattae、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、Pantoea alhagi、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、威斯康星米勒氏菌(Moellerella wisconsensis)、脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),例如,包含标识为SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与其具有至少90%或95%序列一致性的表达功能性分子伴侣的功能活性变体。
GroES可例如由编码天然GroES分子伴侣的野生型GroES基因编码或由编码天然GroES分子伴侣的密码子优化聚核苷酸编码。例如,GroES可以是来源于细菌的,优选以下属的细菌:埃希氏菌属、硫杆菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属、亚特兰大杆菌属、克雷伯菌属、果胶杆菌属、西姆惠菌属、弗朗科杆菌属、泛菌属、红树杆菌属、Nissabacter、克罗诺杆菌属、Rouxiella、邻单胞菌属、摩根氏菌属或耶尔森菌属。根据一具体实施例,GroES由源于以下细菌的GroES基因编码:大肠杆菌、福氏志贺氏菌、赫尔曼亚特兰大杆菌、产气克雷伯菌、Shimwellia blattae、阴沟肠杆菌、Pantoea alhagi、斯氏普罗威登斯菌、威斯康星米勒氏菌、脱氮硫杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌或恶臭假单胞菌,例如,包含标识为SEQ IDNO:8的核苷酸序列或与其具有至少90%或95%序列一致性的表达功能性分子伴侣的功能活性变体。
与亲本序列相比的变体的术语“序列一致性”表示两个或多个核苷酸序列在相应位点具有相同或保守的碱基对的一致性(或同源性)程度,达到一定程度,直至高至接近100%。同源序列通常具有至少约50%的核苷酸序列一致性,优选地至少约60%的一致性,更优选地至少约70%的一致性,更优选地至少约80%的一致性,更优选地至少约90%的一致性,更优选地至少约95%的一致性。
与多肽或蛋白质序列相关的“氨基酸序列一致性百分比”(%)定义为候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比(在对齐该序列并引入间隙(如有必要)后,以达到最大百分比序列一致性,不考虑任何保守替换作为序列一致性的一部分)。本领域技术人员可以确定合适的参数来测量对齐,包括在所比较的序列全长上实现最大对齐所需的任何算法。
对于例如启动子或基因的核苷酸序列的“百分比(%)一致性”,定义为候选DNA序列中与DNA序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比(在对齐该序列并引入间隙(如有必要)后,以达到最大百分比序列一致性,不考虑任何保守替换作为序列一致性的一部分)。为了测定核苷酸序列一致性百分比的目的,可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现对齐,例如,使用公开可用的计算机软件。本领域的技术人员可以确定合适的参数来测量对齐,包括在所比较的序列全长上实现最大对齐所需的任何算法。
为了本文中所述的目的,使用NCBI BLAST程序2.2.29版本(Jan-06-2014)来确定两个序列间的序列一致性,其中blastn或blastp设置如下示例性参数:字体大小:11;期望值:10;空位罚分:存在=5,扩展=2;过滤器=低复杂度激活;匹配/不匹配分数:2,-3;过滤器字符串:L;m。
本文所用的术语“代谢物”是指由一条或多条细胞代谢通路的酶催化的代谢反应的产物,包括反应物、产物和所述酶的辅因子分子。代谢物可能出现在与编码酶的一条或多条细胞代谢通路相同的通路(所述酶催化细胞生长和/或生产抑制剂或其中间体的合成),或可在分支通路中进行合成。
本文所用的术语“可操作地连接”是指核苷酸序列在单个核酸分子上的关联,方式是使得一个或多个核苷酸序列的功能受到存在于所述核酸分子上的至少一个其他核苷酸序列的影响。例如,当启动子能够影响编码序列的表达时,启动子与重组基因的编码序列可操作地连接。作为另一例子,当编码信号肽的核酸能够以分泌形式表达蛋白质(例如成熟蛋白质的前体或成熟蛋白质)时,其与编码POI的核酸序列可操作地连接。特别地,这种可操作地相互连接的核酸可立即连接,即在编码信号肽的核酸和编码POI的核酸序列之间没有进一步的元件或核酸序列。
如果启动子控制编码序列的转录,则通常理解为启动子序列与编码序列可操作地连接。如果一个启动子序列与编码序列并非天然相关,那么它的转录要么在天然(野生型)细胞中不受该启动子控制,要么这些序列重新组合,具有不同的连续序列。
本文所用的术语“过氧化物酶体靶向信号”(PTS)是指短核酸序列,当其连接到编码序列或置于编码序列内(例如作为编码C-端三肽或N-端5-9氨基酸肽的核苷酸序列)时,这种短核酸序列将表达产物的表达引导至宿主细胞的过氧化物酶体。通过这种功能性PTS,可以将酶重新定位到过氧化物酶体。包括巴斯德毕赤酵母在内的大多数生物体都有两种不同的靶向系统。第一种(PTS1)使用受体Pex5实现靶向过氧化物酶体。第二种(PTS2)用Pex7为受体。功能性PTS是为受体Pex5(PTS1)或Pex7(PTS2)中任一种特异识别的氨基酸序列,从而活化受体并引导融合了这种PTS的基因表达到宿主细胞过氧化物酶体。
编码PTS1的核苷酸序列通常与3’端的基因相连,使得PTS融合于相应基因表达产物的羧基端。从而,基因表达产物氨基酸序列的C-端直接连接到PTS的N-端。
编码PTS2的核苷酸序列通常与5’端的基因相连,或整合到5’端附近,使得PTS融合于氨基端或接近于相应基因表达产物的氨基端。从而,基因表达产物的氨基酸序列的N-端直接连接到PTS2的C-端。
以下工具可用于确定给定蛋白质序列中的靶向信号:PTS1预测器((Neuberger G,Maurer-Stroh S,Eisenhaber B,Hartig A,Eisenhaber F.Motif refinement of theperoxisomal targeting signal 1and evaluation of taxon-specific differences.JMol Biol.2003 May 2;328(3):567-79.),或PTS预测工具WoLF PSORT(Horton P,Park K-J,Obayashi T et al.WoLF PSORT:protein localization predictor.Nucleic AcidsRes 2007;35:W585-7.)。
本文所用的术语“目的蛋白质”(POI)是指通过重组技术在宿主细胞中产生的多肽或蛋白质。更特别地,该蛋白质可以是并非在宿主细胞中自然产生的多肽,即异源蛋白质,或者也可以是原生于宿主细胞的,即宿主细胞的同源蛋白质,但是通过例如用包含编码POI核酸序列的自复制载体转化而产生,或者通过重组技术将编码POI的核酸序列的一个或多个拷贝整合到宿主细胞的基因组中,或者通过重组修饰控制编码POI基因表达的一个或多个调控序列,例如启动子序列。
POI可以是任何真核、原核或合成多肽。特别地,它可以是哺乳动物蛋白质,包括人或动物蛋白质。它可以是分泌蛋白,也可以是胞内蛋白。POI可以是天然蛋白质,也可以是人工蛋白质。本发明方法和酵母宿主细胞也可用于天然蛋白质的功能变体、衍生物或生物活性片段的重组生产。
本文所指的POI可以是与真核宿主细胞同源(或同种异基因)的产物,也可以是异源产物,并优选制备用于治疗、预防、诊断、分析或工业用途。
POI优选为在酵母细胞中产生的异源重组多肽或蛋白质,优选为分泌蛋白质。优选产生的蛋白质的例子为免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、抑酶肽、组织因子通路抑制剂或其他蛋白酶抑制剂、胰岛素或胰岛素前体、胰岛素类似物、生长激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、转化生长因子a或b、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)、GRPP、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板衍生生长因子1、血清白蛋白、酶例如脂肪酶或蛋白酶,或是由水解酶、转移酶、氧化还原酶、裂解酶、异构酶或连接酶组成的组中的任一种,或是与天然蛋白功能相似的功能同系物、功能相当变体、衍生物和生物活性片段。POI在结构上可类似于天然蛋白质,并且可衍生于天然蛋白质,这可通过向天然蛋白质的C-和/或N-末端或侧链中添加一个或多个氨基酸、在天然氨基酸序列中的一个或多个不同位点替换一个或多个氨基酸、在天然蛋白质的一端或两端或在氨基酸序列中的一个或多个位点处删除一个或多个氨基酸,或在天然氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸。这些修饰对于上述蛋白质中的几种蛋白质是为人熟知的。
POI也可以选自提供宿主细胞内生化反应的底物、酶、抑制剂或辅因子,以获得所述生化反应或数个反应级联的产物,例如获得宿主细胞的代谢物。示例性产物可以是维生素,例如核黄素、有机酸和醇,其可在表达本文所述重组蛋白或POI后获得且产量增加。
本文所用的术语“重组”是指“由基因工程制备或致使”。因此,“重组微生物”包括至少一种“重组核酸”。本文所述酵母理解为重组酵母。重组微生物可包含表达载体或克隆载体,或其经基因改造以包含重组核酸序列。
“重组蛋白”是通过在宿主中表达相应重组核酸而产生的。“重组启动子”是一种经基因改造的非编码核苷酸序列,其适合于用作本文所述的功能活性启动子。
一般而言,本文所述的重组核酸或生物体可通过本领域技术人员已知的重组技术产生。根据本发明,可采用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中已得到充分解释。参见,例如,Maniatis,Fritsch&Sambrook,"MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,(1982)。
根据本文所述的一具体实施例,通过将启动子和编码POI的相关基因连接到载体或表达构建物中制备重组构建物。通过使用这种载体或表达构建物转化宿主细胞,基因可以稳定地整合到宿主细胞基因组中。
表达载体可包括但不限于克隆载体、改良克隆载体和特定设计的质粒。适用于在宿主细胞中表达重组基因的任何表达载体都可以使用。这种载体的选择通常取决于宿主生物体。
适当的表达载体通常包含适用于在酵母宿主细胞中表达编码POI的DNA的进一步调控序列。调控序列的例子包括操纵子、增强子、核糖体结合位点以及控制转录和翻译起始和终止的序列。调控序列可以可操作地连接于要表达的DNA序列。
为了在宿主细胞中能够表达重组核苷酸序列,表达载体可提供接近编码序列5’端的启动子,例如,目的基因或能够分泌POI的信号肽基因的上游。由此,转录由这个启动子序列调控和启动。
本文所用的术语“信号肽”应特指天然信号肽、异源信号肽或天然与异源信号肽的混合物,并且特别地与产生POI的宿主生物体是异源或同源的。信号肽的作用是使POI分泌进入内质网。它通常是短(3-60个氨基酸长)肽链,引导蛋白质运输到质膜外,从而使分离和纯化异源蛋白更为容易。在运输蛋白质后,一些信号肽被信号肽酶从蛋白质中切除。
示例性的信号肽是来自酿酒酵母α交配因子前体肽原(prepro peptide)的信号序列和来自巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶基因(PHO1)和细胞外蛋白X(EPX1)的信号肽(WO2014067926A1)。
本文所述的转化子可通过将表达载体DNA(例如质粒DNA)引入宿主并筛选高产率表达POI或宿主细胞代谢物的转化子来获得。宿主细胞经处理以使其能够通过常规用于真核细胞转化的方法来纳入外源DNA,例如电脉冲法、原生质体法、乙酸锂法及它们的改良方法。巴斯德毕赤酵母优选通过电穿孔法转化。微生物摄入重组DNA片段的优选转化方法包括化学转化、电穿孔法或通过原生质体转化。本文所述的转化子可以通过将这样的载体DNA(例如质粒DNA)引入宿主并筛选高产率表达相关蛋白或宿主细胞代谢物的转化子来获得。
细胞培养产物的产生可以通过:将重组宿主细胞系培养在适当的培养基中,从培养物中分离表达的POI或代谢物,并可选地用适当的方法纯化。
用于产生本文所述POI的几种不同方法是优选的。可通过以下来表达、加工并可选地分泌物质:使用含有编码相关蛋白质的重组DNA和本文所述至少一种调控元件的表达载体转化酵母宿主细胞,制备转化细胞的培养物,培育培养物,诱导转录和产生POI,并回收发酵过程中的产物。
本文所述的宿主细胞特别通过以下试验对其表达能力或产量进行测试:ELISA、活性测定、HPLC或其他适当的试验。
本发明特别允许以中试或工业规模进行发酵处理。工业处理规模优选采用至少10L的体积,特别地至少50L,优选地至少1m3,优选地至少10m3,最优选地至少100m3。
在工业规模中的生产条件是优选的,这是指例如采用典型的数天处理时间在100L至10m3或更大体积的反应器中进行补料分批培养,或以稀释率约为0.02-0.15h-1在体积约50-1000L或更大的发酵罐中进行连续培育过程。
合适的培养技术可包括在生物反应器中,先以分批培养阶段开始培养,然后是高比生长率的短指数补料分批培养阶段,接着是低比生长率的补料分批培养阶段。另一种合适的培养技术可以包括分批培养阶段,然后是低稀释率的连续培养阶段。
本文所述的用调控元件和/或POI编码基因转化的转化酵母可优选地先在使用碳固定的条件下培养以有效地生长到大量的细胞数。接着,当细胞系培养用于高产率POI生产时,选择生产表达产物的培养技术。
一个优选的实施例包括提供生物质的分批培养,然后是用于高产率POI生产的补料分批培养。
优选在生长条件下在生物反应器中培养本文所述的宿主细胞系以获得至少1g/L细胞干重,更优选地至少10g/L细胞干重,优选地至少20g/L细胞干重的细胞密度。这样有利于提供中试或工业规模的生物质生产的这种产率。
能够积累本文所述生物质的生长培养基,尤其是基础生长培养基,通常没有或包含限定量(limited amount)的碳源、氮源、硫源和磷酸盐源。通常,这种培养基还包含微量元素(traceelement)和维生素,并且还可以包含氨基酸、蛋白胨或酵母提取物。
优选的氮源包括NH4H2PO4、NH3或(NH4)2SO4;
优选的硫源包括MgSO4或(NH4)2SO4或K2SO4;
优选的磷酸盐源包括NH4H2PO4或H3PO4或NaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4或K2HPO4;
进一步的通常的培养基组分包括KCl、CaCl2和微量元素,如:Fe、Co、Cu、Ni、Zn、Mo、Mn、I、B;
优选地,所述培养基中添加维生素B7。
酵母,尤其是表达本文所述功能性卡尔文循环的巴斯德毕赤酵母的经典生长培养基,仅含有限定量的碳源,如二氧化碳、碳酸盐、甲醇、甘油、山梨糖醇或葡萄糖。所述限定量优选为至少10mg/L,优选为至少100mg/L,最优选为至少1g/L。
在生产阶段,生产培养基仅与限定量的补充碳源一起使用。所述限定量优选为至少10mg/L,优选为至少100mg/L,最优选为至少1g/L。酵母,尤其是表达本文所述的功能性卡尔文循环的巴斯德毕赤酵母的经典生产培养基,包括可利用的碳源(例如C1碳源,但也包括葡萄糖、甘油、山梨醇或甲醇)。
发酵优选在3至7.5的pH值范围内进行。
通常发酵时间约为24至120小时,温度范围为20℃至35℃,优选为22-30℃。
特别地,细胞在适合于实现所需POI或代谢物表达的条件下进行培养,所述POI或代谢物可从细胞或培养基中纯化,这取决于表达系统的性质和表达的蛋白质的性质,例如,蛋白质是否与信号肽融合,以及蛋白质是否可溶或膜结合。如本领域技术人员所理解,培养条件将根据包括所使用的宿主细胞类型和具体表达载体等因素而变化。
优选地,使用产生以下产量的条件来表达POI:至少1mg/L,优选为至少10mg/L,优选为至少100mg/L,最优选为至少1g/L。
优选地,使用产生以下产量的条件来表达代谢物:至少1mg/L,优选为至少10mg/L,优选为至少100mg/L,最优选为至少1g/L。
应理解,本发明的方法还可包括在允许POI表达(以分泌形式或作为胞内产物)的条件下培养所述重组宿主细胞。然后可以从细胞培养基中分离重组POI或宿主细胞代谢物,并通过本领域技术人员熟知的技术进一步纯化。
根据本文所述方法产生的POI通常可以使用现有技术来分离和纯化,包括增加所需POI的浓度和/或降低至少一种杂质的浓度。
从宿主细胞分泌重组表达产物通常是有利的,其原因包括易于纯化处理,因为这些产物回收自培养上清液,而不是回收自破碎酵母细胞以释放胞内蛋白质时产生的复杂蛋白质混合物。
培养的转化细胞也可以通过超声波或机械、酶或化学方法破裂,以获得含有所需POI的细胞提取物,并从中分离和纯化POI。
获得重组多肽或蛋白质产物的分离纯化方法可以使用例如利用溶解度差异的方法,例如盐析和溶剂沉淀,利用分子量差异的方法,例如超滤和凝胶电泳,利用电荷差异的方法,例如离子交换色谱法;利用特异亲和性的方法,例如亲和色谱法;利用疏水性差异的方法,例如反相高效液相色谱法;利用等电点差异的方法,例如等电聚焦法。
高纯度产物基本上不含污染蛋白质,并优选纯度至少为90%,更优选地至少为95%,甚至少为98%,高至100%。纯化产物可以通过纯化细胞培养上清或从细胞碎片中获得。
作为分离和纯化方法,优选以下标准方法:细胞破碎(如果从细胞内获得POI)、通过微滤或切向流过滤器(TFF)或离心来分离和洗涤细胞(碎片),通过沉淀或热处理纯化POI,通过酶消化激活POI,通过离子交换(IEX)、疏水层析(HIC)、亲和层析、尺寸排阻(SEC)或高效液相色谱(HPLC)等色谱法纯化POI,通过超滤进行POI的浓缩沉淀和洗涤。
分离纯化的POI或代谢物可通过Western blot、HPLC、活性测定或ELISA等常规方法进行鉴定。
优选的酵母宿主细胞来源于甲基营养型酵母,例如来源于毕赤酵母(Pichia)或Komagataella,例如巴斯德毕赤酵母或Komagataella pastoris,或法夫驹形氏酵母或K.pseudopastoris。宿主的例子包括酵母,例如巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的例子包括CBS 704(=NRRL Y-1603=DSMZ 70382)、CBS 2612(=NRRL Y-7556)、CBS 7435(=NRRL Y-11430)、CBS 9173-9189(CBS strains:CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre,Centraalbureau voor Schimmel-cultures,Utrecht,The Netherlands),和DSMZ 70877(German Collection of Micro-organisms and Cell Cultures(德国微生物和细胞培养物保藏库)),但也包括来自Invitrogen的菌株,如X-33、GS115、KM71和SMD1168。酿酒酵母菌株的例子包括W303、CEN.PK和BY系列(EUROSCARF collection)。上述所有菌株均已成功用于产生转化子和表达异源基因。
本文所述优选的酵母宿主细胞,例如巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母宿主细胞,包含异源或重组启动子序列,这些序列可来源于与生产宿主不同的巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母菌株。在另一具体实施例中,本文所述宿主细胞包含本文所述的重组表达构建物,所述重组表达构建物包含源于与宿主细胞相同属、种或株的启动子。
如果POI是与宿主细胞同源的蛋白质,即在宿主细胞中自然产生的蛋白质,则POI在宿主细胞中的表达可通过用异源启动子序列替换其天然启动子序列来调节。
根据一具体实施例,POI产生方法采用了提供于质粒上的编码POI的重组核苷酸序列,该质粒适于以单拷贝或多拷贝每细胞(per cell)的方式整合到宿主细胞的基因组中。编码POI的重组核苷酸序列也可以提供于单拷贝或多拷贝每细胞的自主复制质粒上。
本文所述的优选方法采用质粒,该质粒为真核表达载体,优选为酵母表达载体。表达载体可包括但不限于克隆载体、改良克隆载体和特定设计的质粒。在本文所述方法中所使用的优选表达载体可以是适合于在宿主细胞中表达重组基因的任何表达载体,并且根据宿主生物体进行选择。重组表达载体可以是任何载体,所述载体能够在宿主生物体基因组中复制或整合到宿主生物体基因组中,也称为宿主载体,例如携带本文所述DNA构建物的酵母载体。优选的酵母表达载体用于在酵母中进行表达,所述酵母选自以Ogataea属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母属为代表组成的甲基营养酵母组。
特别地,使用衍生于pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis或pPUZZLE的质粒作为载体。
根据一优选的实施例,通过将相关基因连接到载体中得到重组构建物。利用这些载体转化宿主细胞,可以将这些基因稳定地整合到宿主细胞基因组中。利用重组宿主细胞系可以通过以下步骤产生基因编码的多肽:在合适的培养基中培养从而得到转化子,从培养物中分离表达的POI,并通过适合表达产物的方法将其纯化,尤其是从污染蛋白质中分离POI。
表达载体可包含一个或多个表型选择标记,例如编码产生抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因。酵母载体通常包含源于酵母质粒的复制起点、自主复制序列(ARS),或可替代地,包含用于整合到宿主基因组的序列、启动子区域、用于多腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列和选择标记。
本领域技术人员熟知分别用于连接DNA序列、调控元件和编码POI的基因、启动子和终止子,以及将它们插入包含整合或宿主复制所需信息的合适载体的步骤,例如由J.Sambrook等人所述的(A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1989)。
也可以使用多克隆载体,其是具有多克隆位点的载体,其中所需异源基因可以在多克隆位点并入以提供表达载体。在表达载体中,启动子位于POI基因的上游并调控基因的表达。在多克隆载体的情况下,由于POI的基因引入于多克隆位点,所以启动子位于多克隆位点的上游。
为获得重组宿主细胞而提供的DNA构建物可通过已有的标准方法(例如亚磷酰胺法)合成制备。DNA构建物也可以源于基因组或cDNA,例如,通过制备基因组或cDNA文库和根据标准技术使用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列而获得(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,1989)。最后,DNA构建物可以源于合成与基因组的混合来源、合成与cDNA的混合来源,或基因组和cDNA的混合来源,DNA构建物通过将合成来源、基因组来源或cDNA来源的片段退火制备,采用标准技术,视情况而定,这些片段对应于整个DNA构建物的各个部分。
在另一优选实施例中,酵母表达载体能够稳定地整合在酵母基因组中,例如通过同源重组。
上述的描述将参照以下实施例得到更充分地理解。然而,这些实施例仅代表实践本发明一个或多个实施例的方法,而不应理解为限制本发明的范围。
实施例
在以下实施例中,显示了如何构建巴斯德毕赤酵母菌株,该菌株含有靶向过氧化物酶体或在胞质溶胶中表达的功能性卡尔文循环。在实施例2中,对DNA构建部分进行了说明,以及在实施例3中描述了巴斯德毕赤酵母菌株的构建和筛选。用于培养和增殖细胞的培养基组成在实施例1中进行描述。包含靶向过氧化物酶体的全功能卡尔文循环的主要菌株具有标识符“GaT_pp_10”,并具有以下基因型:Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3。
在实施例4中,显示了该菌株(GaT_pp_10)可以在甲醇和二氧化碳存在下生长,而缺少部分卡尔文循环的对照菌株(GaT_pp_12、GaT_pp_13)不能生长。这表明该菌株表达功能性卡尔文循环。
在实施例5中,进一步显示了GaT_pp_10的生长依赖于碳源CO2。在只有甲醇作为能源的情况下,没有观察到生长。这个例子也显示了,在没有分子伴侣GroEL和GroES共表达的情况下,工程菌株的生长也是可能的。
在进一步的实施例中,概述了如何使用含有卡尔文循环的巴斯德毕赤酵母菌株生产有价值的产物,例如代谢物(乳酸,实施例6)或蛋白质(羧肽酶B或人血清白蛋白,实施例7)。实施例8致力于显示天然巴斯德毕赤酵母Aox1、Das1和Das2对菌株表达功能性卡尔文循环的影响。最后,在实施例9中,显示了13C标记策略,以进一步提供GaT_pp_10菌株固定二氧化碳能力的证据。
在实施例10中,解释了如何构建在胞质溶胶中表达卡尔文循环的菌株。该菌株具有唯一标识符GaT_pp_22,并且具有以下基因型:Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(cTDH3,cPRK,cPGK1)1(cRuBisCO,GroEL,GroES)2(cTKL1,cTPI1)3。
在实施例11中,显示了该菌株(GaT_pp_22)可以在甲醇和二氧化碳存在下生长,这表明胞质表达合成卡尔文循环的功能。在实施例12和13中,显示了GaT_pp_22菌株如何以CO2和甲醇生产增值化学品(乳酸,实施例12和衣康酸,实施例13)。此外,还概述了在表达胞质溶胶卡尔文循环的菌株中如何产生蛋白质(羧肽酶B或人血清白蛋白,实施例14)。
实施例1制备培养基
LB培养基用于大肠杆菌DH 10B的培养,操作步骤如下。
制备LB培养基(10.0g*L-1大豆蛋白胨(Quest)、5.0g*L-1酵母提取物(MERCK)和5.0g*L-1NaCl,并用4N NaOH调节pH值至7.4-7.6),并分装在500mL肖特瓶中。灭菌方法是在121℃高压灭菌20分钟。
酵母蛋白胨(YP)培养基用于在摇瓶中培养巴斯德毕赤酵母CBS7435 wt,操作步骤如下。
添加碳源之前,对YP-培养基(20.0g*L-1大豆蛋白胨(Quest)、10.0g*L-1酵母提取物(MERCK),用4N NaOH调节pH值至7.4-7.6)进行高压灭菌。制备10倍葡萄糖原液(220g*L-1D(+)-葡萄糖一水合物)并通过高压灭菌。将10倍葡萄糖原液按1/10的比例添加到YP培养基中,得到YPD培养基。
生物反应器培养用的含甘油分批培养培养基(BatchGly)制备如下。
按表1制备BatchGly。用盐酸(25%)调节含甘油分批培养培养基的pH值(4.9-5.1),通过过滤(0.22μm过滤单元)除菌加入经高压灭菌的玻璃瓶。用d-生物素(RO-H2O中0.2g*L-1)制备生物素溶液,并在加热至55-60℃下搅拌以确保完全溶解,然后过滤除菌(0.22μm过滤单元)。按表3制备微量元素溶液。
按表2制备标记培养基(LM)。制备后,对培养基进行无菌过滤(0.22μm过滤单元)。在生物反应器中用25%NH3调节pH值。
表1:作为碳源的含甘油分批培养培养基(BatchGly)的组成及供应商信息。按表2自制(sp)微量元素溶液
表2:微量元素溶液的组成
表3:微量元素溶液的组成
为了测试作为生产宿主的工程菌株(engineered strain),制备酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base(YNB))培养基(终浓度见表4)。
表4:酵母氮源基础(YNB)培养基的组成
实施例2构建质粒与线性DNA片段
所有表达盒(启动子、CDS、终止子)均通过金门克隆法构建(Engler et al.PloSOne 4(5):e5553.doi:10.1371/journal.pone.0005553)并在其侧翼有相应的整合位点,以取代上述三个基因,即aox1、das1和das2。遵循发表在(Sarkari,et al.2017BioresourceTechnology.doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004)的质粒DNA构建物操作流程,实现用于构建所有线性DNA片段和向导RNA(gRNA)/hCas9质粒的操作流程。
将表5中所述基因的编码序列(CDS)与巴斯德毕赤酵母CBS7435 wt的甲醇诱导启动子和终止子序列结合(表6)。
表5:根据酶命名法和EC编号,在巴斯德毕赤酵母(Centraalbureau voorSchimmelcultures,NL,基因组测序是通过(Küberl et al.,2011;Valli et al.,2016))中创建合成卡尔文循环所需的基因,以及基因来源。通过在每个编码三肽SKL的CDS的3’端添加9个核苷酸,将C-端蛋白序列改造为包含过氧化物酶体靶向信号(PTS)。利用维也纳分子病理研究所(Research Institute of Molecular Pathology)(IMP)提供的PTS预测工具在电脑中评估靶向性(Neuberger et al.2003,Journal of Molecular Biology;doi.org/10.1016/S0022-2836(03)00319-X)。*Uniprot:通用蛋白资源(Universal ProteinResource)
表6:提出的合成卡尔文循环中的基因调控元件(启动子PXXX和终止子TXXX)。所有所需基因(也参见表7)均受巴斯德毕赤酵母CBS7435(Centraalbureau voorSchimmelcultures,NL,基因组测序是通过(Küberl et al.,2011,Valli et al.2016))的强甲醇诱导启动子控制。GroEL和GroES由中等强度的组成型启动子调控。
在本研究中,巴斯德毕赤酵母的三个天然基因(AOX1(ORF ID:PP7435_Chr4-0130)、DAS1(ORF ID:PP7435_Chr3-0352)和DAS2(ORF ID:PP7435_Chr3-0350))由表5所列的基因所取代,通过同源重组由依赖于DNA损伤修复机制的CRISPR/Cas9介导的系统促进整合事件。通过在引入DSB时提供DNA模板片段(其由侧翼有将要整合的基因的同源区域组成),基因替换可以在巴斯德毕赤酵母中以高精度非常高效地进行。使用的CRISPR/Cas9系统的研发设计是根据(Gao et al.2014 Journal of Integrative Plant Biology 56(4):343-49.doi:10.1111/jipb.12152.;Weninger et al.2016.Journal of Biotechnology235:139-49.doi:10.1016/j.jbiotec.2016.03.027)。使用的质粒的构建方法如下所述。
用PCR(NEB,高保真DNA聚合酶)从CBS7435wt细胞的基因组DNA(gDNA)提取物中扩增用于替换酶Aox1、Das1和Das2天然序列所需的侧翼区域。从2mL在YPD培养基中生长的过夜培养物中提取基因组DNA。gDNA是根据供应商的规程(Promega,基因组DNA纯化试剂盒)制备的。简单来说,用相应引物通过PCR从基因组中扩增启动子和终止子序列。扩增后用琼脂糖凝胶电泳(用或Midori Green进行DNA染色)检查和纯化序列,并根据供应商的规程(Gel和PCR Clean-Up System)切取和制备相应的条带。
接下来,将这些序列克隆到具有融合位点的相应骨架(BB)1载体中,所述融合位点使得随后能够与编码序列结合。在一锅法反应中组装金门质粒。每次反应使用组合的40fmol质粒或PCR片段。在dH2O稀释的CutSmart缓冲液(New England Biolabs Ipswich,MA)中,反应混合物含有100U的T4连接酶(New England Biolabs Ipswich,MA)和20U的BsaI(New England Biolabs Ipswich,MA)(用于BB1或BB3反应)或BpiI(BbsI)(ThermoFisherScientific,US)(用于BB2反应),添加20mM的ATP(New England Biolabs Ipswich,MA)。每个反应混合物在PCR管中用热循环仪孵育(37℃,1min和16℃,2.5min,重复45次,然后50℃/5min和80℃/10min)。然后反应混合物直接用于转化大肠杆菌DH10B菌株。所有金门法操作均按照(Sarkari,et al.2017 Bioresource Technology.doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004)进行。
将100μL等份的化学感受态细胞与金门法反应混合物轻轻混合,在冰上孵育10min,然后在42℃下热休克90s。热处理后,细胞在冰上再冷藏5-10min。添加1mL LB培养基后,转化细胞在37℃下复苏30min(用于针对BB1和BB3中的卡那霉素的筛选)和60min(用于针对BB2中的氨苄青霉素的筛选)。细胞复苏后以3个不同稀释度涂布在选择性LB-琼脂平板(20μL,200μL,以及旋转下来(spin down)剩余细胞和在小体积LB培养基中重悬)。平板培养约16h/37℃,单菌落接种于2mL含相应抗生素的LB培养基并再次孵育12-16h。根据供应商的规程(Plasmid Mini Kit,SLG,Gauting,Ger)从这些培养物中进行小量制备,并通过用适当的酶进行消化,然后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序来检查。相应制备其他CBS7435 wt衍生启动子(PALD4、PFDH1、PSHB17、PPDC1和PRPP1B)和终止子(TIDP1、TRPB1t、TRPS2t、TRPS3t和TRPBS17Bt)(表4中列出了CBS7435 wt基因座ID)并克隆到相应的BB1质粒中。根据上述规程,从Ogataea polymporpha(CBS 4732)的gDNA中扩增出Tdh3和Pgk1的编码序列,以及从Ogataeaparapolymorpha(CBS 11895)的gDNA中扩增出TkI1的Tpi1的编码序列。编码分子伴侣GroEL和GroES(大肠杆菌)、PRK(菠菜)和cbbM(脱氮硫杆菌)的序列经密码子优化,以及从GeneArt购买。在克隆BB1的所有侧翼区域/启动子、编码序列(CDS)和终止子后,在BB2水平上组合了相应的启动子-CDS-终止子片段(组合如表6所示)。按上述方法进行金门法反应和转化,用限制性消化和琼脂糖凝胶电泳检查质粒的完整性。结合BB3中相应表达盒的最后一步是在改良版BB3载体中进行的,该改良版本带有第一个启动子5’端和最后一个终止子3’端的额外外部BpiI位点,它允许在常规的BsaI介导的组装后切除片段(也参见表7中的“用于线性片段的质粒”列)。这些质粒的完整性最后通过BpiI(BbsI)(ThermoFischer Scientific,US)限制性消化,然后琼脂糖凝胶电泳以及部分地通过Sanger测序来检查。分配到正确组装质粒的克隆进行扩增并用10%甘油冻存于-80℃冷库。从这些冷库中取出,接种于含有LB培养基的100mL烧瓶,并在37℃/250rpm下培养12-16h。然后根据供应商的规程(HiSpeed MidiKit,Qiagen)收获细胞并用于质粒的中量制备。然后用BpiI(BbsI)(ThermoFischerScientific,US)消化中量制备得到的整个质粒材料,并在制备性琼脂糖凝胶电泳中纯化样品。根据供应商的规程,稍加修改,对用于替换三个天然基因座的相应条带进行纯化。所有来自同一条带的凝胶切片溶解在15mL的Falcon管中,然后通过多次重复的加载步骤加载到一个或两个柱上。用50μL进行洗脱步骤,并重复3次。通过凝胶电泳再次检查最终溶液,再储存于-20℃。
利用如(Sarkari,et al.2017Bioresource Technology.doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004.)所述金门克隆技术构建了质粒,该质粒含有向导RNA(gRNA)、hCas9、用于游离型复制(episomal replication)的ARS/CEN序列和用于转化后在G418上筛选巴斯德毕赤酵母的抗性盒。
用于CRSIRP/Cas9靶向不同基因座的基因组识别位点为:
CTAGGATATCAAACTCTTCG(AOX1,SEQ ID NO:9),
TGGAGAATAATCGAACAAAA(DAS1,SEQ ID NO:10)和
CGACAAACTATAAGTAGATT(DAS2,SEQ ID NO:11)。
用琼脂糖凝胶电泳检测融合PCR,并纯化相应条带以进一步用于金门法组装。将gRNA片段组装入BB3质粒,该质粒能够在巴斯德毕赤酵母中游离型表达(ARS/CEN)hCas9和用于筛选的G418的抗性盒。这些质粒在gRNA启动子(PGAP)和含有BpiI限制性位点的终止子(Ttef1)之间显示一连接序列。纯化的质粒先在常规BsaI BB1反应中进行克隆,然后利用BpiI反应进一步克隆到hCas9 BB3质粒中。用适当的酶进行限制性消化来鉴定正确组装的质粒,并通过Sanger测序进行验证。随后进行中量制备,并通过NanoDrop测量确定DNA浓度(来自gRNA质粒和线性替换片段)。
实施例3构建表达靶向过氧化物酶体的功能性卡尔文循环的巴斯德毕赤酵母菌株
为了创建GaT_pp_10和对照巴斯德毕赤酵母菌株,删除了巴斯德毕赤酵母基因组中3个基因,即AOX1(ORF ID:PP7435_Chr4-0130)、DAS1(ORF ID:PP7435_Chr3-0352)和DAS2(ORF ID:PP7435_Chr3-0350),并将8个基因PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES和RuBisCO(表5和表6)整合到基因组中。
3.1巴斯德毕赤酵母的转化
利用电穿孔法对化学感受态细胞进行巴斯德毕赤酵母转化,如下所述。将巴斯德毕赤酵母(CBS7435 wt或相应克隆)的单个菌落接种于10mL YPD预培养物,并培养过夜(overnight)(o/n;~16h)(摇床;180rpm;28℃)。第二天,接种100mL主培养物。如下所述计算预培养物的接种体积,使得主培养物在孵育(摇床;180rpm;28℃)大约16小时后达到介于1.2和3.0间的终点OD。
ODm时间t后主培养物的OD600(用OD600 1.5来计算)
Vm主培养物的体积[mL]
tm主培养基的培养时间[h](至少15h)
μ在28℃下YPD中的巴斯德毕赤酵母野生型为0.3h-1
ODpre预培养物的OD600
接种主培养物后,测量OD并通过离心(5min;1500g及4℃)在50mL Falcon管中收集细胞,然后重悬于10mL预处理溶液(0.6M山梨醇、10mM Tris-HCl、10mM DTT、100mMLiCl)中。将该混合物孵育30分钟(摇床;180rpm;28℃),并用冰冻山梨醇(1M)填充至50mL然后离心(5min;1500×g;4℃)。然后将细胞颗粒结合到45mL冰冻山梨醇(1M)中,并通过离心(5min;1500×g;4℃)采集。重复该洗涤步骤,然后将细胞重悬于500μL冰冻山梨醇中,并将其等份(80μL)加入冰上预冷的Eppendorf管(-20℃)中。等份样品保存于-80℃,直到用于转化。
将80μL等份的电感受态巴斯德毕赤酵母细胞与1μg相应的gRNA-Cas9质粒和1500-2000nmol的线性替换片段轻轻混合(转化混合物的总体积不超过110μL)。用等体积的无菌dH2O转化细胞作为阴性对照。然后将混合物在2mm电穿孔比色皿中冰上冷却5分钟。在电穿孔仪(2000V、25μF和186Ω)上进行电穿孔。电穿孔后,立即用1mL YPD培养基冲洗比色皿,然后将全部内容物转移到Eppendorf管中。细胞在Eppendorf管中用加热块在28℃下复苏1.5到2h。然后将这些细胞涂布接种在添加500μg/mL G418的选择性YPD平板上,在28℃下培养48-72h直到出现单菌落。从这些平板中挑选单菌落,并在选择性G418平板上重复划线两次。经菌落PCR鉴定阳性菌落,并进一步在YPD平板上重复划线,直至游离型gRNA/hCas9质粒发生丢失。这是通过每次在YPD划线后在选择性平板上重复划线来检查的。从无质粒菌落中得到的阳性菌落用于接种10mL YPD,并且1mL等份样品在10%甘油(v/v)存在下保存于-80℃。
3.2菌落PCR法验证转化子
在添加G418的YPD平板上进行两轮筛选后,用菌落PCR检测工程基因座的完整性。为此,用无菌尖端接触单菌落,并在PCR管中将细胞材料重悬于10μL NaOH(0.02M)。将试管在99℃下孵育10min,然后冷却至室温。从这些细胞裂解物中直接取3μL作PCR模板。用适当的引物检测AOX1、DAS1和DAS2基因座的正确替换事件。通过Sanger测序验证正确克隆的基因座序列。
3.3工程操作流程
表7:菌株构建物概述,显示了每个转化子的名称和亲本,以及所得基因型,其始于巴斯德毕赤酵母(Centraalbureau voor Schimmelcultures,NL,基因组测序是通过(Küberl et al.,2011;Valli et al.,2016))作为野生型(wt)菌株。含有CO2同化所必需全部基因的菌株命名为GaT_pp_10。GaT_pp_12和GaT_pp_13为对照菌株,其缺乏关键酶RuBisCO和PRK。
根据表7中概述的操作流程,上述规程适用于所有菌株的构建(对于启动子、CDS和终止子的结合参见表5和表6)。第一步是用编码用于TDH3、PRK和PGK1的表达盒替换巴斯德毕赤酵母CBS7435 wt的AOX1,得到GaT_pp_04菌株,以及用编码用于TDH3和PGK1的表达盒替换得到GaT_pp_05菌株。整合事件通过共转化gRNA/hCas9质粒GaT_B3_003来促进,其在AOX1的5’端(5’prime end)产生双链断裂(DSB)。改造继续在DAS1基因座进行,利用gRNA/hCas9质粒GaT_B3_012,并与相应的线性片段进行共转化。为了创建GaT_pp_06,用RuBisCO、GroEL和GroES(源于GaT_B3_016的线性片段)替换GaT_pp_04的DAS1基因座。在相同亲本菌株中用表达盒(GaT_B3_17)替换DAS1和用敲除盒(GaT_B3_018)替换DAS1,该表达盒用于在没有分子伴侣GroEL和GroES下表达RuBisCO,该敲除盒没有CDS;所得菌株分别命名为GaT_pp_07和GaT_pp_08。在GaT_pp_05菌株中,用相同敲除盒替换DAS1,转化后的菌株命名为GaT_pp_09。最后一个改造步骤中,通过共转化GaT_B3_014用编码用于TkI1和Tpi1的表达盒(源于GaT_B3_027)替换DAS1的CDS,从而在DAS2的3’端创建DSB。所得菌株为GaT_pp_10、GaT_pp_11、GaT_pp_12和GaT_pp_13。所有三个菌株的最终改造基因型可从表7得到,表6显示了其中所用的调控元件。
实施例4含有功能性卡尔文循环的DAS1/DAS2缺失菌株在二氧化碳和甲醇存在下生长
用于生物反应器中培养的预培养物如下所述进行制备。
取GaT_pp_10、GaT_pp_12、GaT_pp_13和CBS7435 wt的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种100mL YPD培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到50mL Falcon管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中,从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mL BatchGly(起始OD=1.0或0.19g*L-1CDW)培养基所需体积。
在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,最大工作体积为1.0L。培养温度控制在28℃,通过加入12.5%的氢氧化铵控制pH值为5.0,通过控制搅拌速度介于400至1200rpm和气流介于6至45SL*h-1,将溶解氧浓度保持在20%以上饱和度。
从上述预培养物中取细胞用于将0.5L起始体积接种于生物反应器中以达到1.0的起始光密度(600nm)或0.19g*L-1。甘油分批培养在大约16h(CBS7435 wt)、36h(GaT_pp_12、GaT_pp_13)和40h(GaT_pp_10)后完成。所有菌株积累的生物质约为10g*L-1CDW。
在发酵起始点取样,测定初始OD,重复三遍。使用便携式光谱光度计(C8000 CellDensity Meter,WPA,Biowave)进行OD测量,吸光度介于0.2至0.5间。同时从起始点取样进行HPLC分析。HPLC分析的操作如下所述。
为了进行HPLC分析,离心2mL细胞悬液(13000rpm,3min),并将上清液移到洁净Eppendorf管中。将900μL上清液与100μL 40mM H2SO4混合并使用2mL注射器上的0.22μm过滤单元进行过滤,然后将样品转移至适用于自动取样装置的玻璃管中。
如前所描述,甘油、葡萄糖、甲醇和柠檬酸盐通过HPLC测定,使用纯标准品进行鉴定和定量(Blumhoff,et al.2013 Metabolic Engineering 19.26-32.doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003)。HPLC配有Aminex HPX-87H(300×7.8mm,BioRad,Hercules,CA)色谱柱。用折光指数检测器(RID-10A,Shimadzu)检测甘油、葡萄糖、甲醇和柠檬酸盐。色谱柱在60℃下以0.004M H2SO4为流动相在0.6mL/min流速下操作。
在甘油分批培养阶段后和整个培养过程中,每天至少取样一次。如上所述制备HPLC样品。如下所述,细胞密度通过OD测量和测定细胞干质量(CDW)来确定。
为了测定细胞干重,将2mL细胞悬浮液中的细胞颗粒用水洗涤一次并离心(13000rpm,3min)。洗涤步骤结束后,将细胞颗粒转移到预先称重的玻璃管中,并在110℃下干燥24小时。干燥后,再次称重玻璃管,并使用以下公式计算细胞干重:
CDW[g/L]=(玻璃管(满)[g]-玻璃管(空)[g])*500
对于每种培养物,进行CDW测定,重复两次。
分批培养后,使用连接0.22μm过滤单元的5mL注射器添加0.5%甲醇(v/v)来诱导所有生物反应器,该过滤单元通过无菌方式连接注入接口。
在诱导阶段设置进气中的CO2为1%。
在诱导阶段后,细胞脉冲加入0.5%甲醇(v/v)并按上述方法取样。每次添加甲醇后,重复取样进行如前所述的HPLC和OD分析。
诱导后的第二次脉冲通过加入甲醇至浓度为0.75%(v/v)进行,并将进气中的CO2浓度设置为5%。如上所述进行取样。
从第三次脉冲开始,每天一次将甲醇添加量增加到1%(v/v),直到发酵1结束。如前所述规范继续采样。
在培养最后一天,如后面部分所述测定生物反应器中的甲醇摄入率。
将1%甲醇补入细胞中,并按上述方法取样。从这开始,在全天培养期间每隔大约1h的时间以及在24小时后进行取样,进行HPLC测量和OD测定。
实施例4结果
工程化GaT_pp_10菌株在甲醇为能源、CO2为单一碳源的条件下生长。
图1显示,工程GaT_pp_10菌株(GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)能够在甲醇为能源和CO2为单一碳源的条件下生长良好。缺少RuBisCO的菌株(GaT_pp_12和GaT_pp_13)在分批培养结束后仅补给甲醇和CO2时,没有明显生长。RuBisCO阴性菌株的失能(diability)清楚表明了甲醇不能再并入(incorporate)生物质中。从实验中进一步推导出,GaT_pp_10菌株的生长是由于摄取和并入CO2。
RuBisCO阳性GaT_pp_10菌株在第一次甲醇脉冲后(见图1中的实心三角形和正方形)表现出明显的生长,并且只要添加甲醇用产生于能量,就可以继续生长。
表8显示了甘油分批培养结束后,在整个甲醇补料阶段观察到的生物质形成率。在本实施例中培养的两个RuBisCO阳性菌株生物复制体在整个观察培养期内的生物质形成率为0.029g*L-1*h-1(GaT_pp_10a)和0.016g*L-1*h-1(GaT_pp_10b)。正如所料,在这些条件下,CBS7435 wt细胞生物质的形成(0.076g*L-1*h-1)更为明显。CBS7435wt细胞仍然具有功能性DAS1和DAS2以及AOX1,使它们能够同化和异化甲醇。
对照菌株GaT_pp_12和GaT_pp_13在培养过程中未显示形成任何生物质,表明甲醇只能在甲醇利用通路的异化支路中利用。这是由于DAS1和DAS2被敲除了。
观察到的RuBisCO阳性菌株(GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)的生物质形成清楚表明CO2的合成同化通路是功能性的。
表8:整个共补料(甲醇+CO2)阶段计算的生物质形成率。显示了GaT_pp_10(GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)的所有生物复制体、对照菌株GaT_pp_12和GaT_pp_13以及CBS7435wt的形成率。
在本实施例所述生物反应器中,在培养第6天测定甲醇的摄取情况。
图2显示了甲醇摄取研究中所有生物反应器的生长情况。
只有工程化GaT_pp_10菌株(图2中GaT_pp_10a和GaT_pp_10b)和CBS7435 wt细胞能够生长。wt细胞的生长是符合预期的,因为这些细胞具有甲醇利用的全基因库。GaT_pp_10a和GaT_pp_10b的显著增长清楚地表明了所提出的CO2合成同化通路的功能性。引入合成的划分的(compartmentalized)卡尔文循环补偿了Das1和Das2活性的损失,使得菌株能够从CO2形成生物质。
RuBisCO阴性菌株GaT_pp_12和GaT_pp_13在观察条件下无法生长。这是由于无法纳入碳,无论是来自甲醇还是来自CO2的碳。
GaT_pp_10菌株和CBS7435 wt中生物质的形成也与观察到的甲醇摄取相关(图3)。wt细胞能够迅速消耗甲醇,起始的8.0g*L-1甲醇在约3h内被完全利用。类似于GaT_pp_10菌株生物质形成的减少,甲醇摄取速率滞后(与观察的wt的情况相比)。在RuBisCO阳性菌株中,起始的8.0g*L-1甲醇在7h内降至~5g*L-1,培养24小时后完全消耗。
尽管RuBisCO阴性菌株(GaT_pp_12和GaT_pp_13)没有观察到生长,但甲醇仍被消耗。
表9显示了能源甲醇下的生物质产量YX/S和比甲醇消耗率。YX/S[g(CDW)*g(MetOH)-1]值将每份消耗甲醇获得的生物质增加描述为[g]CDW每[g]甲醇的能量当量,其计算仅适用于显示出生长的菌株。GaT_pp_10a和GaT_pp_10b的甲醇下的生物质产量约为CBS735 wt细胞观察值的一半。
为了表示甲醇消耗率,计算了比甲醇消耗率qS(MetOH)[g*g(CDW)-1*h-1]。图3显示了不同菌株的甲醇吸收情况。甲醇浓度的降低显示出以下时间范围的近似线性行为:GaT_pp_10a和b、GaT_pp_12和GaT_pp_13直到T1~7.2h,而CBS7435 wt为T1~3.1h。甲醇消耗率由上述时间范围内的线性回归斜率确定。比甲醇消耗率(qS)是通过将甲醇消耗率除以T1/2时的生物质浓度来确定的。甲醇仍为RuBisCO阴性菌株所利用的观察反映在这些数字中,这表明底物仍可以被氧化(qs(GaT_pp_12)=0.027,qs(GaT_pp_13)=0.024[g*g-1*h-1]),但仅为GaT_pp_10菌株中观察到的约50%的速率和CBS7435 wt菌株约25%的速率。
表9:比甲醇消耗率qs和甲醇下的生物质产量YX/S。在发酵1第6天期间测定的值(实施例4,图3)。
实施例5 GaT_pp_10的生长依赖于以甲醇为电子供体的碳源CO2
用于生物反应器中培养的YPD预培养物按如下所述进行制备。
取GaT_pp_10、GaT_pp_11和GaT_pp_12的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种100mL YPD培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到50mL Falcon管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mLBatchGly培养基(起始OD=1.0或0.19g*L-1CDW)所需体积。
在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,最大工作体积为1.0L。培养温度控制在28℃,通过加入12.5%的氢氧化铵控制pH值为5.0,通过控制搅拌速度介于400至1200rpm和气流介于6至45SL*H-1,将溶解氧浓度保持在20%以上饱和度。进气由N2、O2和CO2的混合气体合成,以确保二氧化碳的准确浓度。
从上述预培养物中取细胞用于将0.5L起始体积接种于生物反应器中以达到1.0的起始光密度(600nm)或0.19g*L-1。甘油分批培养在大约36h(GaT_pp_12用于技术复制体a和b两者)和40h(GaT_pp_10用于技术复制体a和b两者)后完成。所有菌株积累的生物质约为10g*L-1CDW。
在发酵2起始点取样,测定初始OD,重复三遍。使用便携式光谱光度计(C8000 CellDensity Meter,WPA,Biowave)进行OD测量,吸光度介于0.2至0.5间。同时从起始点取样进行HPLC分析。HPLC分析的操作如实施例4所述。
在甘油分批培养阶段后和整个培养过程中,每天至少取样一次。如上所述制备HPLC样品。如下所述,细胞密度通过OD测量和测定细胞干质量(CDW)来确定。
为了测定细胞干重,将2mL细胞悬浮液中的细胞颗粒用水洗涤一次并离心(13000rpm,3min)。洗涤步骤结束后,将细胞颗粒转移到预先称重的玻璃管中,并在110℃下干燥24小时。干燥后,再次称重玻璃管,并使用以下公式计算细胞干重:
CDW[g/L]=(满玻璃管重量[g]-空玻璃管重量[g])*500
对于每种培养物,CDW测定重复三遍。
分批培养后,使用连接0.22μm过滤单元的5mL注射器添加0.5%甲醇(v/v)来诱导所有生物反应器,该过滤单元通过无菌方式连接注入接口。
在诱导阶段设置进气中的CO2为1%。
在上述工艺控制条件下诱导细胞后,增加搅拌速度N和进气流量F的工艺控制值,以吹出由甲醇氧化形成的CO2。搅拌器转速保持恒定在1000rpm,进气混合物的气体流量设置为35sL*h-1。所有生物反应器进气的CO2设置为0%。该策略要求立即吹出甲醇氧化必然形成的所有CO2。
切换高速搅拌和进气条件后,观察到输出流量中的CO2浓度,一旦达到接近0%,就开始甲醇进料。
诱导后的第一补料步骤是在所有生物反应器中加入1%甲醇(v/v)。
第二补料步骤是将生物反应器中CO2增加至5%,其中分别培养GaT_pp_10b和GaT_pp_12b的一个技术复制体。
在另两个生物反应器中,培养了GaT_pp_10a和GaT_pp_12a,进气中的CO2含量保持在0%。
每天至少如上所述进行一次生物反应器的取样。
每天一次通过在线HPLC测量,将甲醇浓度调节至1%(v/v)。
诱导后第三天,切换CO2。将GaT_pp_10a和GaT_pp_12a的进气CO2含量从0%调节到5%,在含有GaT_pp_10b和GaT_pp_12b的反应器中CO2供应改为0%。
切换CO2供应后,相应进行取样和补料,直到发酵2结束。采用上述相同操作方法,以5%CO2为碳源,对无分子伴侣菌株GaT_pp_11进行测试,并与GaT_pp_10进行比较(表10-用*标记的值)
实施例5结果
在后面部分中,将描述上述实施例的结果,并将表明工程化GaT_pp_10菌株能够以CO2作为单一碳源生长。
本实施例的主要目的是证明,GaT_pp_10菌株的生长是由于发酵2期间外部供应的CO2。实施例3中显示了所提出的CO2同化通路的可行性和功能性。无论如何,在甲醇利用通路的异化支路的第一步中,甲醇氧化也会在胞内产生CO2。在本实施例中,工艺参数设置为确保产生的二氧化碳立即从细胞中消耗的条件。这是通过将搅拌速度设置为1000rpm和进气的气体流量设置为35sL*h-1来实现的。在这些条件下,确保所有产生的CO2都吹出生物反应器。
很明显,就在诱导之后,与供应0%CO2(图4中时间点t2和t3间的圆)相比,工程化GaT_pp_10菌株在供应5%CO2(图4中时间点t2和t3之间的尖)时的生长要明显得多。这种效应也表明是可逆的,在切换GaT_pp_10b中的CO2供应后(图4中t3后的尖),细胞迅速停止生长。反之亦然,当CO2由0%设置为5%时,GaT_pp_10a细胞恢复生长(图4中t3后的圆点)
正如预料,在缺乏RuBisCO的对照菌株的技术复制体(GaT_pp_12a和b)中没有观察到生长。
表10总结了在CO2供应切换发酵2期间观察到的生物质形成率,表示补料培养阶段第一部分的数值(图4中的t2到t3;即在GaT_pp_10a和GaT_pp_12a中为0%CO2;在GaT_pp_10b和GaT_12b中为5%CO2),标记了得自于第二阶段的数值(图4中的t3至培养结束;即在GaT_pp_10b和GaT_pp_12b中为0%CO2;在GaT_pp_10a和GaT_pp_12a中为5%CO2)。
生物质形成值清楚地表明,生物值的形成与外部供应CO2直接相关。GaT_pp_10a在没有CO2供应时几乎没有任何(0.002g*L-1(CDW)*h-1)的增长,但当进气中的CO2组分设置为5%诱导时,GaT_pp_10a迅速开始增长(0.029g*L-1(CDW)*h-1)。
反之亦然,GaT_pp_10b在开始时显著增长(0.036g*L-1(CDW)*h-1),当CO2供应量设定为0%时,停止增长(0.000g*L-1(CDW)*h-1)。
这个实施例中也显示,表达过氧化物酶体版合成卡尔文循环的菌株在非共表达GroEL和GroES情况下也能生长。相应地培养了这些菌株(见表10中标记*的值),在5%CO2时观察到的生物质形成率(GaT_pp_11a为0.008g*L-1(CDW)和GaT_pp_11b为0.004g*L-1(CDW))表明,该通路可以在不使用异源分子伴侣的情况下运作。
表10:进气流中的CO2为0%和5%时的生物质形成率。在发酵第一阶段生物复制体GaT_pp_10a和GaT_pp_12a中的CO2供应量为0%,然后在发酵第二阶段设置为5%。反之亦然,发酵第一阶段在GaT_pp_10b和GaT_pp_12b II中使用5%CO2,然后在第二阶段关闭相应生物反应器中的CO2。GaT_pp_10菌株的生长依赖于外部供应CO2。在5%CO2(*)的独立复制发酵阶段中,测试GaT_pp_11(a和b)的生长情况。
本实施例(表10)所示的生长数据证明了,GaT_pp_10菌株的生长取决于CO2的外部供应。当供应CO2和甲醇时只有工程化GaT_pp_10菌株观察到生长,该菌株在过氧化物酶体中表达功能性卡尔文循环,这表明存在功能性摄取和并入CO2。
实施例6利用定位于过氧化物酶体的功能性合成卡尔文循环的菌株制备乳酸
进行以下实施例以证明工程化GaT_pp_10菌株作为宿主菌株具有利用CO2作为碳源生产大宗化学品方面的潜力。化学品生产的一系列途径均可能使用本公开的GaT_pp_10菌株,并以生产乳酸(LA)作为工业相关实例来展现。
巴斯德毕赤酵母CBS7435变体和RuBisCO阳性菌株(表示为GaT_pp_10菌株)用作宿主菌株。表达载体pPM2d_pGAP衍生于pPuzzle_ZeoR载体骨架(详述见WO2008/128701A2),以及BB3rN_14(GoldenPiCS:a Golden Gate-derived modular cloning system forapplied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris.Prielhofer R,BarreroJJ,Steuer S,Gassler T,Zahrl R,Baumann K,Sauer M,Mattanovich D,Gasser B,MarxH.BMC Syst Biol.2017 Dec 8;11(1):123.doi:10.1186/s12918-017-0492-3.10.1186/s12918-017-0492-3PubMed 29221460)由pUC19细菌复制起点和博来霉素(Zeocin)或诺尔斯菌素(NTC)抗生素抗性盒构成。由巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子或醇氧化酶(AOX)启动子和酿酒酵母CYC1转录终止子介导细菌乳酸脱氢酶(LDH)基因的表达。LDH基因进行亚克隆并分别连接到载体pPM2d_pGAP和BB3rN_14中,然后如实施例3所述,通过电穿孔进入相应的巴斯德毕赤酵母菌株。在含有50μg*mL-1博来霉素或100μg*mL-1NTC的YPD平板(每升:10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂)上进行阳性转化子的筛选。用菌落PCR法来确保转化质粒的存在。因此,如实施例3所述得到基因组DNA,并使用适当的引物进行PCR。
最后将所得菌株命名为GaT_pp_28(Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3PGAPLDH)(其具有PGAP下的LDH基因),和GaT_pp_39(Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3PAOX1LDH)(其具有AOX 1启动子(PAOX1)控制下的LDH基因)。
然后对产LDH菌株进行乳酸生产摇瓶试验(GaT_pp_28)和生物反应器培养(GaT_pp_28和GaT_pp_39)。根据实施例4和5设计发酵试验。通过HPLC分析监测这些培养期间产生的乳酸(Blumhoff,et al.2013.Metabolic Engineering 19.26-32.doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.;Steiger,et al.2016.Metabolic Engineering 35.95-104.doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003),样品制备与实施例3所述类似。
对于摇瓶培养菌株过表达LDH,如下制备YP预培养物。
取GaT_pp_28或GaT_pp_39的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种100mL YPG培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到50mL Falcon管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于5mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于20mL补充有0.5%甲醇的BatchGly培养基(起始OD=15.0或2.85g*L-1CDW)所需的体积。
然后将主培养物在CO2培养箱(使用5%CO2)中在摇荡装置(180rpm)上培养。接种后每天取样一次,并从培养第1天起将甲醇浓度调节至1%(v/v)。如实施例4和5所述监测细胞生长(OD测量)和代谢物图谱(HPLC分析)。
对于GaT_pp_28或GaT_pp_39菌株的生物反应器培养,如下制备YP预培养物。
取GaT_pp_28或GaT_pp_39的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种400mL YPG培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到500mL无菌离心管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mL补充有0.5%甲醇YNB培养基(起始OD=15.0或2.85g*L-1CDW)所需的体积。
接种后,如实施例4所述在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,但修改为使用5M NaOH调节pH值。取样操作和反应器中甲醇浓度的维持也根据实施例4进行。
实施例6结果
培养了三个生物复制体,其中每个生物复制体有两个技术复制体。接种后,在5%的高CO2气体下进行摇瓶培养。在培养期间,含有LDH的构建菌株分泌了乳酸(LA)(表11)。
表11:在摇瓶中用CO2培养GaT_pp_28期间测得的乳酸滴度(titer)。显示了每个生物复制体(GaT_pp_28_C1-C3)的两个技术复制体(I和II)和亲本菌株(GaT_pp_10)在不同时间点的LA滴度,在时间点0,细胞接种于含有0.5%甲醇(v/v)的BatchGly培养基。工程化GaT_pp_28菌株以CO2为碳源产生乳酸(LA)。
以CO2为单一碳源培养GaT_pp_28细胞产生的乳酸,其滴度(titer)可高达(up to)36mg/L。这些结果表明,具有定位于过氧化物酶体的合成卡尔文循环的工程化酵母细胞可以作为LA的生产平台。
表12:在生物反应器中用CO2培养GaT_pp_28和GaT_pp_39期间测得的乳酸滴度。工程化GaT_pp_39和GaT_pp_28菌株以CO2作单一碳源产生乳酸(LA);显示了不同时间点的LA滴度与相应的细胞干重(CDW)值。
在实施例6过程中,对含有过氧化物酶体版合成卡尔文循环的工程化酵母细胞在两种不同启动子控制下的LA生产进行测试。在GaT_pp_39菌株中,LDH基因由PAOX1控制,而在GaT_pp_28菌株中,LDH基因由PGAP控制。在生物反应器培养期间,两种菌株都得到了可检测水平的LA(参见表12)。
通过实施例6,提供了表达过氧化物酶体版合成卡尔文循环的工程化细胞可以用作LA的生产平台的证据。这说明了GaT_pp_10菌株作为广泛化学品生产平台的可能性。
实施例7利用表达定位于过氧化物酶体内的功能性合成卡尔文循环的菌株生产猪羧肽酶B(CpB)或人血清白蛋白(HSA)
基于具有过氧化物酶体版合成卡尔文循环的菌株(GaT_pp_10),构建过表达CpB(GaT_pp_31)和(GaT_pp_35)的菌株。用CO2作单一碳源在生物反应器中培养表达CpB和HSA的转化子。根据实施例4和5所述的设置设计这些研究的设置。
菌株构建
巴斯德毕赤酵母CBS7435变体和RuBisCO阳性菌株(表示为GaT_pp_10菌株)用作宿主菌株。pPM2d_pGAP表达载体衍生于WO2008/128701A2所述pPuzzle ZeoR载体骨架(详述见),其由pUC19细菌复制起点和博来霉素抗生素抗性盒组成。分别地由巴斯德毕赤酵母醇氧化酶(AOX1)启动子(PAOX1)和酿酒酵母CYC1转录终止子介导异源基因的表达。对编码猪羧肽酶(GeneBank CAB46991.1第16-416位氨基酸,45.7kDa)的基因进行了用于巴斯德毕赤酵母的密码子优化,并合成了N-端酿酒酵母α交配因子信号肽序列。对编码人血清白蛋白及其天然分泌信号肽(GenBank NP_000468第1-609位氨基酸,66.4kDa)的基因进行了用于巴斯德毕赤酵母的密码子优化和合成。使用Expasy在线工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)计算分子量。用SbfI和SfiI消化携带N-端分泌前导序列的目的基因的载体,并将每个基因分别连接到经SbfI和SfiI消化的pPM2d_pAOX载体中。将质粒线性化,然后如实施例3所述通过电穿孔进入相应的巴斯德毕赤酵母菌株(GaT_pp_10)。在含有50μg*mL-1博来霉素的YPD平板(每升:10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂)上进行阳性转化子的筛选。用菌落PCR法确保转化质粒的存在。因此,如实施例3所述得到基因组DNA,并使用适当的引物进行PCR。
最后,将工程化菌株(具有基因型Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3PAOX1CpB)命名为GaT_pp_31,将工程化菌株(具有基因型Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3PAOX1HSA)命名为GaT_pp_35。在两个菌株中,模式蛋白(model protein)(GaT_pp_31中的CpB;GaT_pp_35中的HSA)均受PAOX1控制。
对于GaT_pp_31或GaT_pp_35菌株的生物反应器培养,如下制备预培养物。
取GaT_pp_31或GaT_pp_35的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种400mL YPG培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到500mL无菌离心管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mL补充有0.5%甲醇的YNB培养基(起始OD=18.0或3.45g*L-1CDW)所需的体积。
接种后,如实施例4所述在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,但修改为使用5M NaOH调节pH值。还根据实施例4进行了取样操作和维持反应器中的甲醇浓度。
采用SDS-PAGE分析检测培养上清液中的HSA和CpB,然后进行银离子染色。简言之,将15μL上清液与5μL 4×样品缓冲液(NuPAGE LDS Sample Buffer(4×)(ThermoFischerScientific,US))混合,并在70℃下加热10min,然后在MOPS电泳缓冲液中加载到10%Bis-Tris蛋白凝胶(ThermoFisher Scientific,US)上。将电源设置为30mA的恒定电流进行分离。凝胶电泳约3h,然后在固定液(乙醇50%(v/v)、乙酸10%(v/v))中在4℃下固定过夜。固定步骤后,在孵育液(乙醇30%(v/v)、0.89M醋酸钠、13mM硫代硫酸钠、0.25%戊二醛)中在室温下将凝胶孵育30min,并在RO-H2O中洗涤3次,每次10min。然后将凝胶在硝酸银溶液(6mM硝酸银、0.02%甲醛)中孵育,简单洗涤,然后在显影液(0.25M碳酸钠、0.01%甲醛)中显影,直至出现条带。使用50mM EDTA钠溶液停止反应1h。
实施例7结果
菌株GaT_pp_31在上述生物反应器培养中进行培养,并在添加0.5%甲醇的YNB培养基中进行培养。从第1天开始,每天一次将甲醇调节至1%甲醇(v/v),并在进气流中供应CO2(5%),这是工程细胞的唯一碳源。在培养期间,细胞以生物质形成率为0.019g CDW L- 1h-1生长。此外,通过SDS-PAGE和银离子染色对上清液样品进行分析,表明GaT_pp_31菌株表达了CpB(图7)。在生物反应器培养接种(0小时)后,没有可见条带(图7中的泳道1),而在72小时后可以检测到对应大小约45kDa的条带(图7中的泳道2)。这表明CpB是在只有CO2作为碳源的条件下生产的。
参照菌株GaT_pp_31,对过表达HSA的菌株(GaT_pp_35)进行了相应的培养。在第二次发酵(生物质形成率为0.013g CDW L-1h-1)中,产生了可检测水平的HSA,表明了该操作的再现性。图8显示HSA在生物反应器培养过程中累积,从第0天(d0)的不可测水平到第1天至第3天(d1-3)的可检测水平。由于HSA呈致密球状,银染检测到的表观分子量(这里约为55kDa)小于66.4kDa的实际分子量(与之前未发表的数据相符)。
通过这个实施例,证明了具有过氧化物酶体版合成卡尔文循环的细胞作为蛋白质生产平台的可用性。在可检测水平上表达CpB(作为模式技术酶)和HSA(作为药物相关产物的模式蛋白),这支持了在RuBisCO阳性(GaT_pp_10)背景下可以生产各种产物类别。
实施例8 Aox1、Das1和Das2对表达功能性卡尔文循环的巴斯德毕赤酵母菌株的影响
AOX1的CDS重新整合到GaT_pp_10中,如下所示:
从巴斯德毕赤酵母CBS7435的基因组中扩增AOX1的CDS,并根据实施例2所述的规程克隆到相应BB1质粒中。如实施例2所述,通过金门克隆在BB2水平上构建包含天然PAOX1、AOX1的CDS和合适终止子的表达盒。使用与实施例2和3所述类似的操作流程,使用金门克隆和CRISPR/Cas9,将功能性AOX1盒整合到GaT_pp_10菌株中。
与上述用于重建Aox1活性的操作流程类似,DAS1和DAS2的CDS被重新整合到工程化菌株的相应终止子区域。
如实施例4、5和6所述,测试菌株在CO2和甲醇情况下的生长情况。
实施例9 13C标记以验证CO2并入表达功能性卡尔文循环的巴斯德毕赤酵母菌株中
基于13C标记的研究分析了无机碳通过气态CO2的摄取并入生物质。实验设置(根据实施例4进行调整)包括13C标记甘油的分批培养阶段,然后是12C标记CO2和未标记的13C甲醇的补料培养阶段(方案I)。在第二设置中,也用13C标记甘油进行分批培养,用12C未标记甲醇和未标记(12C)CO2进行进补料培养(方案II)。
根据实施例5中所述操作流程,用菌株GaT_pp_10和GaT_pp_12在生物反应器中进行培养。与实施例5相反,使用含有全标记的13C甘油作为碳源的标记培养基(LM)。共接种了4个生物反应器。其中三个生物反应器应用方案I(两次用GaT_pp_10和一个反应器用GaT_pp_12),将方案II应用于接种GaT_pp_10的反应器。从两种实验中采集生物质,并使用元素分析仪耦合同位素比质谱仪(EA-IRMS)测定生物质中12C对13C的同位素比。该分析流程由第三方(IMPRINT ANALYTICS,Neutal,Austria)作为商业服务进行。
简言之,取GaT_pp_10和GaT_pp_12的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种100mL YPD培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到50mL Falcon管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mL LM(起始OD=1.0或0.19g*L-1CDW)所需的体积。
在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,最大工作体积为1.0L。培养温度控制在28℃,通过加入12.5%的氢氧化铵控制pH值为5.0,通过在分批培养阶段期间控制搅拌速度介于400至1200rpm和气流介于6至45SL*h-1,将溶解氧浓度保持在20%以上饱和度。进气由N2、O2和CO2的混合气体合成,以确保二氧化碳的准确浓度。
从上述预培养物中取细胞用于将0.5L起始体积接种于生物反应器中以达到1.0的起始光密度(600nm)或0.19g*L-1。甘油分批培养在大约36h(GaT_pp_12)和40h(GaT_pp_10的全部三个技术复制体I至III)后完成。所有菌株积累的生物质约为5.0g*L-1CDW。
在标记发酵起始点取样,测定初始OD,重复三遍。使用便携式光谱光度计(C8000CellDensity Meter,WPA,Biowave)进行OD测量,吸光度介于0.2至0.5间。同时从起始点取样进行HPLC分析。HPLC分析的操作如实施例4所述。此外,取样,采用EA-IRMS测定总13C含量。为此,首先用0.1M HCl洗涤对应约0.5mg干生物质的细胞悬浮液,再用RO-H2O洗涤两次。13C生物质样品储存于-20℃,直到分析。
在甘油分批培养阶段后和整个培养过程中,每天至少取样一次。如上所述进行OD测量、HPLC和制备含13C样品。
分批培养后,使用连接0.22μm过滤单元的5mL注射器添加0.5%甲醇(v/v)来诱导所有生物反应器,该过滤单元通过无菌方式连接注入接口。
在诱导阶段设置进气中的CO2为1%。
在上述工艺控制条件下诱导细胞后,增加搅拌速度N和进气流量F的工艺控制值,以吹出由甲醇氧化形成的CO2。搅拌器转速保持恒定在1000rpm,进气混合物的气体流量设置为35sL*h-1。
诱导后,在所有生物反应器中将CO2增加至5%和加入1%甲醇(v/v),开始补料培养阶段。
每天至少如上所述进行一次生物反应器的取样。
每天一次通过在线HPLC测量,将甲醇浓度调节至1%(v/v)。在有对照菌株GaT_pp_12的反应器和含有菌株GaT_pp_10(I和II)的两个反应器中,使用13C标记的甲醇(方案I),而在有菌株GaT_pp_10(III)的第三个反应器中,使用未标记的12C甲醇(方案II)。
实施例9结果
在以下部分中,概述了上述实施例的结果,并表明工程化GaT_pp_10菌株能够以CO2作为单一碳源生长,并且生物质的形成是由于摄取了气态CO2。
在标记培养基上进行标记实验期间,使用CO2为单一碳源、甲醇作为用于还原当量生成的供体底物,生长表现与使用BatchGly培养基的实施例4和5相似。这反映在用CO2和甲醇生长过程中相似的生物质形成率(对比表10和13)。此外,使用13C标记的甲醇(GaT_pp_I和II)或未标记的甲醇(III)不会明显改变生长表现。
表13:在13C标记发酵期间菌株GaT_pp_10和GaT_pp_12的生物质形成率。在12C CO2存在下在13C甲醇中培养(GaT_pp_12和GaT_pp_10I-II),或在12C CO2存在下在12C甲醇中培养(GaT_pp_10III)(在13C甘油分批培养阶段后)。
表14:通过同位素比质谱(EA-IRMS)分析菌株GaT_pp_12和GaT_pp_10的生物质样品的总13C含量。所有菌株在13C甘油(分批培养)中生长,然后用12CO2/13CH3OH共补料(方案I-GaT_pp_12、GaT_pp_10I-II)或用12CO2/12CH3OH共补料(方案II-GaT_pp_10III)。用EA-IRMS法测定了所得生物质样品中的13C含量,单位为%(13Cm)。13Cm的标准偏差显示了同一样品三次技术重复测量的误差。使用测得的生物质形成计算预期的理论13C含量,单位为%(13Ccal)。
实施例9通过利用EA-IRMS测量在12CO2中生长时总13C含量,验证了CO2直接并入生物质。生物质中的13C含量在13C甘油分批培养阶段富集到95%(参见表14分批培养45h时的终值),然后用12CO2作为碳源进行洗涤(wash out)。GaT_pp_12菌株为对照菌株,其不含功能性卡尔文循环,因此不能通过并入12C CO2来改变其13C含量。在共补料阶段所有生长菌株(GaT_pp_10I-III)的13C含量有所降低(参见表14中85-158h后的13Cm值),这与根据累积的生物质计算所得的值相当(各时间点的13Ccal值)。对于以13C甲醇为能源的两个菌株(GaT_pp_10I和II),根据理论值其13C含量有所降低。这表明没有显著量的源于甲醇氧化本身的碳被并入。在方案II(GaT_pp_10III)中,12C甲醇用作能源供应。在这种方法中,最终生物质中总13C含量降低的程度与方案I(GaT_pp_10I和II)没有显著差异。这表明同化的碳来自进气流中提供的12CO2,而不是来自甲醇氧化本身。
实施例10:构建在巴斯德毕赤酵母胞质溶胶中表达卡尔文循环的质粒和菌株
在本实施例中,公开了一种菌株构建物,其包含定位到胞质溶胶的功能性卡尔文循环。如实施例2所述进行利用金门克隆将DNA扩增并亚克隆到质粒中的所有步骤。将表15所述基因的编码序列(CDS)与巴斯德毕赤酵母CBS7435 wt的甲醇诱导型启动子和终止子序列结合(表16)。
表15:根据酶命名法和EC编号,在巴斯德毕赤酵母中创建定位于胞质溶胶的合成卡尔文循环所需的基因,以及基因来源。
表16:提出的合成卡尔文循环中的基因调控元件(启动子PXXX和终止子TXXX)。所有基因(也参见表9)均受源于巴斯德毕赤酵母CBS7435的强甲醇诱导启动子控制。GroEL和GroES由中等强度的组成型启动子调控。
表16所列的表达盒用金门克隆法进行组装,并用于转化巴斯德毕赤酵母CBS7435(根据实施例3中所描述的操作方法)。
根据表17所示方案构建GaT_pp_22菌株。该菌株包含所有能够在巴斯德毕赤酵母中形成胞质溶胶卡尔文循环所必要的基因。
表17:菌株构建物概述,显示了每个转化子的名称和亲本,以及所得到的基因型,其是从巴斯德毕赤酵母(Centraalbureau voor Schimmelcultures,NL,基因测序是通过(Küberl et al.,2011;Valli et al.,2016))开始的。含有用胞质溶胶版卡尔文循环同化CO2所必需全部基因的菌株命名为GaT_pp_22。
实施例11含有定位于胞质溶胶的功能性卡尔文循环的菌株能够在二氧化碳和甲醇存在下生长
如实施例4所述进行生物反应器培养。用15g/L甘油进行分批培养阶段。如实施例4所述用二氧化碳和甲醇进行补料。
工程化GaT_pp_22菌株在甲醇/CO2补料培养阶段中能够在甲醇为能源、CO2为单一碳源的存在下生长。
图6:显示了工程化GaT_pp_22菌株能够在甲醇(作为能源)和二氧化碳(作为单一碳源)的存在下生长。从该实验可以得出结论,GaT_pp_22菌株的生长是由于摄取和并入CO2。表18显示了,在甘油分批培养结束后在整个甲醇补料培养阶段中,观察到的菌株GaT_pp_22(I和II)的生物质形成率,与具有定位于过氧化物酶体的通路的菌株(GaT_pp_10I和II)进行了比较。
在RuBisCO阳性菌株(GaT_pp_22I和GaT_pp_22II)中观察到的生物质形成证明了,合成的CO2同化通路是功能性的(表18)。
表18:整个共补料(甲醇+CO2)阶段计算的生物质形成率。显示了GaT_pp_22的两个生物复制体(I和II)的形成率,并与表达胞质溶胶通路版的GaT_pp_10的两个生物复制体(I和II)进行了比较。
实施例12利用表达定位于胞质溶胶的功能性合成卡尔文循环的菌株(GaT_pp_22)生产乳酸
进行以下实施例以证明工程化GaT_pp_22菌株作为宿主菌株具有利用CO2作为碳源生产大宗化学品的潜力。化学品生产的一系列途径均可能使用本公开的GaT_pp_22菌株,并以生产乳酸(LA)作为工业相关实例来展现。
将实施例6中构建的含LDH(受PAOX1控制)的质粒转入菌株GaT_pp_22以产生GaT_pp_41,其全基因型为Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(cTDH3,cPRK,cPGK1)1(cRuBisCO,GroEL,GroES)2(cTKL1,cTPI1)3PAOX1LDH。
然后在发酵试验中对产LDH菌株进行乳酸(LA)生产测试,根据实施例4、5和6设计发酵试验。通过HPLC分析监测这些培养期间产生的乳酸(Blumhoff,et al.2013.MetabolicEngineering 19.26-32.doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.;Steiger,etal.2016.Metabolic Engineering 35.95-104.doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003),样品制备与实施例3所述类似。
简言之,过表达LDH的菌株GaT_pp_41的生物反应器培养如下进行。
取GaT_pp_41的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种400mL YPG培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到500mL无菌离心管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mL含0.5%甲醇的YNB培养基(起始OD=15.0或2.85g*L-1CDW)所需的体积。
接种后,如实施例4所述在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,但修改为使用5M NaOH调节pH值。还根据实施例4进行了取样操作和维持反应器中的甲醇浓度。
实施例12结果
在实施例6中显示了GaT_pp_10菌株(过氧化物酶体版通路)可以用作LA的生产平台。在本实施例12中,提供的数据显示在胞质溶胶中表达合成卡尔文循环的菌株也可用于LA的生产。
在生物反应器培养中,工程化GaT_pp_41细胞能够生长并将乳酸分泌到上清液中(表19)。培养42小时后检测到高达35mg/L的乳酸。
表19:工程化GaT_pp_41菌株以CO2作单一碳源生产乳酸(LA);显示了不同时间点的LA滴度与相应的细胞干重(CDW)值
这里提供的数据证明了使用CO2作为单一碳源来积累乳酸的可能性,而能量由GaT_pp_22背景中的甲醇氧化提供。
实施例13利用表达定位于胞质溶胶(GaT_pp_22)和过氧化物酶体(GaT_pp_10)的功能性合成卡尔文循环的菌株生产衣康酸
进行以下实施例以证明工程化菌株GaT_pp_22和GaT_pp_10作为宿主菌株具有利用CO2作为碳源生产衣康酸的潜力。
用前述菌株GaT_pp_22和GaT_pp_10作受体菌株,并用含有功能性表达盒的质粒进行转化,该功能性表达盒在pAOX或pGAP启动子控制下转录编码顺式乌头酸脱羧酶(UniprotID:B3IUN8)的cadA编码序列(Steiger,et al.2016.Metabolic Engineering 35.95-104.doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003)。(例如,使用实施例6中所述的质粒pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX作为受体质粒)。根据实施例6,将含有包含cadA的功能性表达盒的质粒转化入菌株GaT_pp_22和GaT_pp_10,从而得到GaT_pp_22+pGAP::CAD和GaT_pp_10+CAD。
然后在发酵试验中对产CAD菌株(GaT_pp_22+CAD和GaT_pp_10+CAD)进行衣康酸生产测试,根据实施例4和5设计发酵试验。通过HPLC分析监测这些培养期间产生的衣康酸(Blumhoff,et al.2013.Metabolic Engineering 19.26-32.doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.;Steiger,et al.2016.Metabolic Engineering 35.95-104.doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003),样品制备与实施例3所述类似。
实施例14构建分泌猪羧肽酶B(CpB)或人血清白蛋白(HSA)的GaT_pp_22衍生物
巴斯德毕赤酵母CBS7435变体和RuBisCO阳性菌株(命名为GaT_pp_22菌株)用作受体菌株。如实施例7所述参照构建GaT_pp_10菌株的操作流程,在GaT_pp_22背景下构建表达CpB和HSA的菌株。
将最后所得菌株分别命名为GaT_pp_37(CpB)(基因型为Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3PAOX1CpB),和GaT_pp_38(HSA)(基因型为Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3,PRK,PGK1)1(RuBisCO,GroEL,GroES)2(TKL1,TPI1)3PAOX1HSA)。
为了测试仅由CO2提供生物质形成所需的碳时,过表达HSA的工程化GaT_pp_38菌株是否能够产生异源蛋白,进行了生物反应器培养。根据实施例4、5和6所述的设置设计这些试验的设置。
对于GaT_pp_38菌株的生物反应器培养,如下制备预培养物。
取GaT_pp_31或GaT_pp_35的冻存液在YPD-平板上划线,并在28℃下培养48h。挑选单菌落并用于接种400mL YPG培养基。预培养物在28℃和180rpm下过夜培养。测定光密度,然后将细胞悬液转移到500mL无菌离心管并离心(1500g,6min)。用无菌dH2O洗涤颗粒两遍,再重悬于20mL无菌dH2O中。从该悬浮液中取样并测定OD。计算接种于500mL补充有0.5%甲醇的YNB培养基(起始OD=18.0或3.45g*L-1CDW)所需的体积。
接种后,如实施例4所述在1.4L DASGIP反应器(Eppendorf,Germany)中进行生物反应器培养,但修改为使用5M NaOH调节pH值。还根据实施例4进行了取样操作和维持反应器中的甲醇浓度。
通过SDS-PAGE和银离子染色检测HSA的分析操作在实施例7中进行了描述,并相应地应用于此处。
实施例14结果
如上所述对过表达HSA的胞质菌株(GaT_pp_38)以两个生物复制体进行培养。在这些培养中,细胞仍分别以0.012和0.008g CDW L-1h-1的生物质形成率生长。在这两种情况下,都产生了可检测水平的HSA。图8(第6-13泳道)显示,HAS在GaT_pp_38的两个生物复制体的生物反应器培养过程中累积,从第0天(d0)的不可检测水平到第1天至第3天(d1-3)的良好可检测水平。由于HSA呈致密球状,银染检测到的表观分子量(这里约为55kDa)小于66.4kDa的实际分子量(与之前未发表的数据相符)。
通过这个实施例证明了,菌株GaT_pp_38可以产生HAS(代表一模式药物蛋白),该菌株具有胞质溶胶版的合成卡尔文循环。
实施例部分引用的参考文献
Blumhoff,Marzena L.,Matthias G.Steiger,Diethard Mattanovich,andMichael Sauer.2013.“Targeting Enzymes to the Right Compartment:MetabolicEngineering for ltaconic Acid Production by Aspergillus Niger.”MetabolicEngineering 19(September).Elsevier:26-32.doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.
Engler,Carola,Ramona Gruetzner,Romy Kandzia,and SylvestreMarillonnet.2009.“Golden Gate Shuffling:A One-Pot DNA Shuffling Method Basedon Type Ils Restriction Enzymes.”PloS One 4(5):e5553.doi:10.1371/journal.pone.0005553.
FOLK,J E,K A PIEZ,W R CARROLL,and J A GLADNER.1960.“Carboxy-PeptidaseB.4.PurifiCation and Characterization of the Porcine Enzyme.”The Journal ofBiological Chemistry 235(August):2272-77.
Gao,Yangbin,and Yunde Zhao.2014.“Self-Processing of Ribozyme-FlankedRNAs into Guide RNAs in Vitro and in Vivo for CRISPR-Mediated GenomeEditing.”Journal of Integrative Plant Biology 56(4):343-49.doi:10.1111/jipb.12152.
Tadas,Michael K.Jensen,and Jay D.Keasling.2015.“CRISPR/Cas9Advances Engineering of Microbial Cell Factories.”Metabolic Engineering 34:44-59.doi:10.1016/j.ymben.2015.12.003.
Küberl,Andreas,Jessica Schneider,Gerhard G.Thallinger,Ingund Anderl,Daniel Wibberg,Tanja Hajek,Sebastian Jaenicke,et al.2011.“High-Quality GenomeSequence of Pichia Pastoris CBS7435.”Journal of Biotechnology 154(4):312-20.doi:10.1016/j.jbiotec.2011.04.014.
Sarkari,Parveen,and Michael Sauer.n.d.“An Efficient Tool forMetabolic Pathway Construction and Gene Integration for Aspergillus Niger.”Bioresource Technology.Elsevier Science.doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004.
Steiger,Matthias G.,Peter J.Punt,Arthur F.J.Ram,Diethard Mattanovich,and Michael Sauer.2016.“Characterizing MttA as a Mitochondrial Cis-AconiticAcid Transporter by Metabolic Engineering.”Metabolic Engineering35(May).Elsevier:95-104.doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003.
Valli,Minoska,Nadine E.Tatto,Armin Peymann,Clemens Gruber,NilsLandes,Heinz Ekker,Gerhard G.Thallinger,Diethard Mattanovich,Brigitte Gasser,and Alexandra B.Graf.2016.“Curation of the Genome Annotation of PichiaPastoris(Komagataella Phaffii)CBS7435 from Gene Level to Protein Function.”FEMS Yeast Research 16(6):1-12.doi:10.1093/femsyr/fow051.
Weninger,Astrid,Anna-Maria Hatzl,Christian Schmid,Thomas Vogl,andAnton Glieder.2016.“Combinatorial Optimization of CRISPR/Cas9 ExpressionEnables Precision Genome Engineering in the Methylotrophic Yeast PichiaPastorls.”Journal of Biotechnology 235:139-49.doi:10.1016/j.jbiotec.2016.03.027.
Claims (16)
1.一种酵母,所述酵母包含表达合成卡尔文循环的核苷酸序列表达系统,所述核苷酸序列表达系统包含合成卡尔文循环的异源基因,所述异源基因至少包括:
a)编码核酮糖二磷酸羧化酶(EC编号4.1.1.39)类的酶的基因(RuBisCO基因);和
b)编码核酮糖磷酸激酶(EC编号2.7.1.19)类的酶的基因(PRK基因);
其中所述RuBisCO基因和所述PRK基因中的每一个,与编码过氧化物酶体靶向信号(PTS)的核苷酸序列融合,
可选地,其中所述酵母进一步包含表达目的基因(GOI)的异源表达构建物。
2.一种酵母,所述酵母包含表达合成卡尔文循环的核苷酸序列表达系统,所述核苷酸序列表达系统包含合成卡尔文循环的异源基因,并且所述酵母进一步包含表达目的基因(GOI)的异源表达构建物,其中所述合成卡尔文循环至少包含以下异源基因:
a)编码核酮糖二磷酸羧化酶(EC编号:4.1.1.39)类的酶的基因(RuBisCO基因);和
b)编码核酮糖磷酸激酶(EC编号:2.7.1.19)类的酶的基因(PRK基因)。
3.根据权利要求1或2所述的酵母,其中所述RuBisCO基因和所述PRK基因中的每一个,与编码过氧化物酶体靶向信号(PTS)的核苷酸序列融合,以在酵母过氧化物酶体中表达合成卡尔文循环。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的酵母,其包含一个或多个内源基因以完成合成卡尔文循环。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的酵母,其中所述合成卡尔文循环包含一个或多个进一步的异源基因,所述异源基因是以下的任何基因:
a)编码磷酸甘油酸激酶(EC编号:2.7.2.3)类的酶的基因(PGK1基因),和/或
b)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC编号1.2.1.12)类的酶的基因(TDH3基因);和/或
c)编码磷酸丙糖异构酶(EC编号5.3.1.1)类的酶的基因(TPI1基因);和/或
d)编码转酮酶(EC编号2.2.1.1)类的酶的基因(TKL1基因),
可选地,其中所述PGK1、TDH3、TPI1和TKL1基因中的一个或多个,或每一个,与编码PTS的核苷酸序列融合。
6.根据权利要求5所述的酵母,其中所述合成卡尔文循环包含以下异源基因:所述RuBisCO基因、所述PRK基因、所述PGK1基因、所述TDH3基因、所述TPI1基因和所述TKL1基因。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的酵母,其中:
a)所述RuBisCO基因源于脱氮硫杆菌,优选地包含标识为SEQ ID NO:37的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达核酮糖二磷酸羧化酶的功能活性变体;和/或
b)所述PRK基因源于菠菜,优选地包含标识为SEQ ID NO:38的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达核酮糖磷酸激酶的功能活性变体;和/或
c)所述PGK1基因源于Ogataea polymorpha,优选地包含标识为SEQ ID NO:39的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达磷酸甘油酸激酶的功能活性变体;和/或
d)所述TDH3基因源于Ogataea polymorpha,优选地包含标识为SEQ ID NO:40的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶的功能活性变体;和/或
e)所述TPI1基因源于Ogataea parapolymorpha,优选地包含标识为SEQ ID NO:41的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达磷酸丙糖异构酶的功能活性变体;和/或;和/或
f)所述TKL1基因源于Ogataea parapolymorpha,优选地包含标识为SEQ ID NO:42的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达转酮酶的功能活性变体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的酵母,其包含在所述酵母胞质溶胶中表达一种或多种分子伴侣的进一步的异源基因,所述分子伴侣协助至少一种所述酶的共价折叠和/或组装。
9.根据权利要求8所述的酵母,其中所述分子伴侣至少为:
a)源于大肠杆菌的GroEL,优选标识为SEQ ID NO:43的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达分子伴侣的功能活性变体;和
b)源于大肠杆菌的GroES,优选标识为SEQ ID NO:8的核苷酸序列,或与其具有至少90%序列一致性的表达分子伴侣的功能活性变体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的酵母,其中合成卡尔文循环的一个或多个所述异源基因经密码子优化,用于在所述酵母中表达。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的酵母,所述酵母选自由以下属组成的组:毕赤酵母属、Komagataella、汉逊酵母属、Ogataea、假丝酵母属和球拟酵母属,优选地所述酵母选自由以下组成的组:巴斯德毕赤酵母、Komagataella pastoris、法夫驹形氏酵母和K.pseudopastoris。
12.一种在细胞培养物中培养权利要求1至11中任一项所述的酵母的方法,包括在生长阶段使用气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物作为碳源培养酵母,从而在细胞培养物中获得积累的酵母生物质。
13.根据权利要求12所述的方法,其中酵母纳入了与启动子可操作地连接的所述异源基因,其中所述启动子由甲醇诱导,并且其中所述生长阶段在将甲醇添加到培养基后开始。
14.根据权利要求13或14所述的方法,其还包括在生产阶段使用碳源培养所述积累的酵母生物质以分别产生所述POI和代谢物。
15.一种在包含合成卡尔文循环的酵母中生产有机产物的方法,其中至少20%的产物总有机碳的碳源为气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物。
16.权利要求1至11中任一项所述的酵母的用途,所述酵母用于使用气态二氧化碳和/或溶解的CO3 2-和/或HCO3 -化合物为碳源来生产POI和/或代谢物。
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---|---|---|---|---|
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CN111808777B (zh) * | 2020-07-28 | 2022-02-11 | 南京工业大学 | 一种骆驼刺泛菌及其应用 |
CN114317325A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-04-12 | 安徽师范大学 | 红树林杆菌及其应用和秸秆纤维素降解方法 |
CN114410489B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-06-23 | 云南大学 | 一株异常威克汉姆酵母cap5菌株及其应用 |
CN114395492B (zh) * | 2022-01-12 | 2023-09-05 | 安徽农业大学 | 一种酵母菌与红曲霉的共培养促进红曲霉产孢的方法 |
AT526405A1 (de) | 2022-08-08 | 2024-02-15 | Univ Wien Tech | Synthetischer Formolaseweg |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101965401A (zh) * | 2008-03-07 | 2011-02-02 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 发酵戊糖的细胞 |
CN106103694A (zh) * | 2014-01-16 | 2016-11-09 | 法国农业科学研究院 | 被修饰成利用二氧化碳的酵母 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA017803B1 (ru) | 2007-04-20 | 2013-03-29 | Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх | Система экспрессии |
CA2886460C (en) | 2012-10-29 | 2023-11-14 | Lonza Ltd | Leader peptides for expressing a protein of interest in an eukaryotic host cell |
WO2014129898A2 (en) * | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Technische Universiteit Delft | Recombinant micro-organism for use in method with increased product yield |
US9365720B2 (en) | 2014-01-14 | 2016-06-14 | Sabic Global Technologies B.V. | Interior train components having low smoke and low heat release, and methods of their manufacture |
US10294482B2 (en) | 2014-05-22 | 2019-05-21 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Recombinant microorganisms capable of carbon fixation |
-
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101965401A (zh) * | 2008-03-07 | 2011-02-02 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 发酵戊糖的细胞 |
CN106103694A (zh) * | 2014-01-16 | 2016-11-09 | 法国农业科学研究院 | 被修饰成利用二氧化碳的酵母 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
RAPHAEL FREY等: "Bottom-up Construction of a Primordial Carboxysome Mimic", 《JACS》 * |
XIA PENG-FEI等: "Recycling Carbon Dioxide during Xylose Fermentation by Engineered Saccharomyces cerevisiae", 《ACS SYNTHETIC BIOLOGY》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109536398A (zh) * | 2013-02-22 | 2019-03-29 | 代尔夫特理工大学 | 用于产量增加的方法中的重组体微生物 |
CN109536398B (zh) * | 2013-02-22 | 2023-08-04 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用于产量增加的方法中的重组体微生物 |
CN112391331A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-23 | 江南大学 | 一种过表达GatA基因的重组大肠杆菌及其应用 |
CN112391331B (zh) * | 2020-11-12 | 2022-09-27 | 江南大学 | 一种过表达GatA基因的重组大肠杆菌及其应用 |
CN115369049A (zh) * | 2021-05-17 | 2022-11-22 | 北京化工大学 | 一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用 |
CN115369049B (zh) * | 2021-05-17 | 2023-12-15 | 北京化工大学 | 一种分泌葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用 |
CN114181879A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-15 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用 |
CN114214219A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-03-22 | 北京化工大学 | 一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌 |
CN114214219B (zh) * | 2021-12-31 | 2023-12-15 | 北京化工大学 | 一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌 |
Also Published As
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