JP5421241B2 - 無細胞蛋白質合成システムを用いる膜蛋白質を含むプロテオリポソームの形成 - Google Patents
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Description
‐ミニ細胞として直接使用可能である。
‐組み込まれた膜蛋白質の酵素活性の試験またはそれらの構造的分析のために使用可能である。
‐細胞膜または核膜、ミトコンドリアまたは一定のオルガネラに対する膜蛋白質の目標が定められた放出のためのベクターとして使用可能である。したがってこれらプロテオリポソームは(例えば抗腫瘍分子のような、薬剤としての治療上の膜蛋白質)膜蛋白質形質導入ベクターとして、またワクチン開発のため未変性のエピトープを含む抗原の提示のためのベクターとしても使用可能である。
‐関心ある膜蛋白質の遺伝子または遺伝子群が組み込まれている無細胞蛋白質合成システム;
‐上記のような脂質ベシクル。
1‐発現ベクターの作製:
関心ある膜蛋白質をコードする相補的DNAを含み、プロモーター配列、T7タイプターミネーター配列、および最初のメチオニンコドンから5から8塩基対の間に位置するRBS(リボソーム結合部位)を含むPCR生成物が蛋白質合成のためのマトリックスとして使用され得る。それにも関わらず、プロモーター領域、T7タイプターミネーター領域およびRBSを含む原核生物発現ベクターが一般的に好まれるであろう。例えば、ベクターはpET(Novagen)またはpIVEX(Roche Applied Science)でよい。
フォワードプライマー:
Gp91phox90のための5’GGAATTCCATATGGTTCGAAGACAACTGGACAGG3’(配列番号1)、Gp91phox195のための5’GGAATTCCATATGAAAACCATCCGGAGGTCTTAC3’(配列番号2)、Gp91phox221のための5’GGAATTCCATATGATCCATGGAGCTGAACGAA3’(配列番号3)、Gp91phox233のための5’GGAATTCCATATGGCAGAGAGTTTGGCTGTG3’(配列番号4)および5’側にNdeI認識部位を含むGp91phox285のための5’GGAATTCCATATGTTTTGGCGATCTCAACAGA3’(配列番号5)
リバースプライマー:
N末端部位で標識するための5’GCGTTACTCGAGTCATGGAAGAGACAAGTTAGAAG3’(配列番号6)またはC末端側に位置する標識のための5’GCGTTACTCGAGGAAGTTTTCCTTGTTGAAAATG3’(配列番号7)。これらプライマーはXhoI制限部位を含む。
A−無処置の葉緑体の調製
葉緑体はいくらか修正したDouceおよびJoyard(1982)により記述された方法に従い調製される。葉緑体はホウレンソウ(Spinacia loeracea L.)の葉から抽出される。葉は選別され葉脈が除去され、それから洗浄される。そのようにして得られる葉は、色素体中に存在する貯蔵澱粉を枯渇させるため、低温室で一晩置かれる。(2lの混合培地:スクロース0.33M、ソディウムピロフォスフェート30mM、BSA1g/l、pH7.8に対しておよそ2kgの)葉は4℃で2から3秒間、ブレンダー(Waring Blendorタイプ、4lボリューム)で微細に切断される。ホモジェネートは4重のガーゼおよび50μmのメッシュブロッティングで濾過される。濾液は4℃で10分間1200gで遠心分離される。沈殿は洗浄培地(スクロース0.33M、MOPS/NaOH20mM、pH7.8)で丁寧に希釈される。この葉緑体が豊富な懸濁液は50μmのメッシュブロッティング布で濾過される。葉緑体外の異物および破壊された葉緑体を排除するため、懸濁液はパーコールの非連続密度勾配(パーコール40%[(v/v)]、スクロース0.33M、MOPS/NaOH20mM、pH7.8およびパーコール80%[(v/v)]、スクロース0.33M、MOPS/NaOH20mM、pH7.8)上に置かれ、20分間3000gで遠心分離される。無処置の葉緑体はパーコール40%[(v/v)]と80%[(v/v)]の層の間の境界面に位置し、一方非葉緑体性の成分および破壊された葉緑体はパーコール40%[(v/v)]の層の上に残る。パーコールを排除するため、無処置の葉緑体は6から7倍量の洗浄培地で希釈され、5分間4000gで遠心分離される。沈殿は洗浄培地中で回収され、50μmのメッシュブロッティング布で濾過されてから5分間3000gで遠心分離される。
チラコイドはいくらか修正したDouceら(非特許文献2)により記述されたプロトコールに従い精製される。無処置の葉緑体は低張培地(MgCl2 4mM、MOPS/NaOH 10mM、pH7.8)中に入れられる。低張培地の体積は葉緑体の体積よりおよそ10倍大きい。従って最終的なスクロース濃度は0.1Mより低くなるまで激しく減少する。破壊された葉緑体の懸濁液はスクロースの非連続密度勾配(MgCl2緩衝液 4mM、MOPS/NaOH 10mM、pH7.8におけるスクロース0.6Mおよび0.93M)上に置かれ、1時間72000gで遠心分離される。遠心分離後、3つの分画が得られる:葉緑体の可溶性酵素(ストロマ)を含む密度勾配の上層、本質的にチラコイドを含む緑の沈殿、および0.6Mおよび0.93Mのスクロース層の境界面に位置する葉緑体包膜。
葉緑体包膜およびチラコイド包膜の脂質組成物は類似しており、より多量に得られるため後者が使用されてきた。脂質全体はいくらか修正したBlighおよびDyer(1959)により記述された方法に従い抽出される。チラコイドは洗浄緩衝液または蒸留水中で可溶化され、それから懸濁液は4℃で10分間1000gで遠心分離される。沈殿は3分の1の体積のCHCl3および3分の1の体積の蒸留水が加えられたCHCl3/MeOH(1/2)で可溶化される。溶液は4℃で一晩置かれる。(濃緑色で脂質および色素を含む)有機相は回収され、それからアルゴン下で乾燥のため蒸発させられ、純粋なCHCl3中で可溶化される。この溶液は色素を排除するためにDorneら(1987)により記述されたようにシリカゲルカラム上に置かれる。カラムは先に大量のCHCl3を使用して洗浄され、石英ウールで栓をされる。(325メッシュより小さい)シリカは純粋なCHCl3で溶解される。CHCl3がゲルの頂点に到着した時に溶液は置かれる。透明な溶出液が得られるまで、カラムと同じ体積のCHCl3が(色素を排除するために)加えられる。それから全てのCHCl3が溶出され、CHCl3/アセトン(990/10)混合物がモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)を溶出させるために使用される。溶出液は回収され、アルゴン下で乾燥のために蒸発させられ、CHCl3/MeOH(1/2)混合液で可溶化される。それからメタノールが加えられる(ジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)、スルフォキノヴォシルジアシルグリセロール(SQDG)およびトリガラクトシルジアシルグリセロール(TGDG)の溶出)。溶出液は回収され、アルゴン下で乾燥のために蒸発させられ、CHCl3/MeOH(1/2)混合液で可溶化される。試料は再び蒸発させられ、3mlのCHCl3/MeOH(1/2)混合液で再可溶化され、-20℃でアルゴン下に保たれる。
脂質はアルゴン下で蒸発させられ、DEPC(ジエチルピオカルボネート)処理されたまたはヌクレアーゼフリーの水で再懸濁される。脂質はSUV(小単層ベシクル)を含む均一な懸濁液を形成するため、ソニファイ(Branson Sonifer 250、サイクル0.5および強度80)1分間を3回される。懸濁液は一様な大きさの脂質ベシクル(リポソーム)の懸濁液を得るために0.2μmの膜で濾過される。
膜蛋白質は無細胞発現システムで合成される。このシステムはSpirin(非特許文献11)またはLiguori(非特許文献7)により記述されるように大腸菌(Echerichia coli)溶解物に基づく。反応はバッチフォーマット(Eppendorff管またはマルチウェルプレート中)またはカップ中(Roche Applied ScienceからのRTS500HYシステム)のどちらかで実施される。
‐大腸菌(E. coli)溶解物(RTSシステム[Roche Applied Science]、RiNAシステム[Quiagen]、またはExpresswayシステム[Invitrogen])
‐エネルギー性培地
‐メチオニンを除く全てのアミノ酸
‐メチオニン
‐非イオン性または両性の界面活性剤
‐GroEまたはDnaKシャペロン
‐炭化水素ポリマー(NV10[Novexin])
‐プロテアーゼインヒビター(例えばProtease Inhibitor Tablet[Roche Applied Science])。
バッチまたはカップ中の無細胞合成の間に生成されるプロテオリポソームは非連続スクロース密度勾配上で精製される。反応混合物は最初に4℃で20分間13,000rpmで遠心分離され、それから上清が除去されプロテオリポソームを含む沈殿(緑の沈殿)は反応体積と等しい体積のTris-HCl50mM、pH7.2で再懸濁される。最懸濁された試料は60%スクロース(1から6mlのスクロース)および25%スクロース(1から6mlのスクロース)層の間に置かれる。それからシステム全体は10%スクロース(0.4から2mlのスクロース)層で注意深く覆われる。4℃で1時間200,000gで遠心分離した後に、密度勾配の最上部から0.1から1mlの分画が収集され、リポソームに組み込まれた膜蛋白質の最終蛋白質濃度および純度を決定するためにウェスタンブロッティング、銀および/またはクーマジーブルー染色により分析される。各分画に含まれる膜蛋白質の活性は酵素反応(gp91-phoxの切断形態の場合)または哺乳動物細胞に形質導入された後の蛋白質の機能分析(BakおよびVDAC蛋白質の場合)のどちらかにより試験される。高い純度のプロテオリポソームを含む分画はまとめられ、哺乳動物細胞における形質導入実験で試験される。
精製されたプロテオリポソームは組換え膜蛋白質を哺乳動物細胞中に形質導入する能力について試験された。精製されたプロテオリポソームは1x106の細胞中に0.6μMから1.5μMの濃度で直接加えられ、分析前に37℃、5%CO2で6、12または24時間インキュベートされる。外因性組換え膜蛋白質の細胞上の位置は膜蛋白質に特異的な抗体または抗ヒスチジン抗体を使用する免疫蛍光法により検出される。組換え膜蛋白質の活性は、特にBakおよびVDACは、インキュベーション後にアポトーシスに関与する蛋白質(カスパーゼ3、7、9、8、PARP、p53等)を活性化することにより、細胞の生存力を決定することにより(MTT、アネキシンV試験等)試験された。
1-チラコイド脂質存在下での膜蛋白質発現
チラコイド脂質の膜蛋白質合成に与える影響について決定するために、チラコイド脂質ベシクル存在下または不在下でin vitro発現反応が実施される(図1Aおよび1B)。最終体積が25、50または100μlでのバッチ反応が開始時の濃度10mg/mlの脂質ベシクル(リポソーム)存在下で実施される。加えられるリポソームの体積は合成反応体積(vol/vol)と少なくとも等しい。合成反応におけるリポソームの最終濃度は0.6mg/mlから5mg/mlに変動し得る。リポソームは一度反応混合液が作製されると、反応培地に加えられる。興味深いことに、脂質の存在はin vitro発現システムの転写および翻訳機構に干渉しない(図1)。大腸菌(E. coli)溶解物に基づくin vitro発現システムは、ウイルスエンベロープ蛋白質(Env蛋白質、図1A)、植物蛋白質(ポリンOEP24、図1B)、バクテリア(結果は示されない)または哺乳動物膜蛋白質(ポリンVDACおよびミトコンドリアプロアポトーシス蛋白質BAK、図2C)のような様々な起源の蛋白質を合成し得る。それ以上に、例えばそれらは新たに合成された膜蛋白質の崩壊に対する保護を提供し(Env蛋白質、図1A)、多量体の形成(ポリンOEP24、図1Bおよびミトコンドリア蛋白質VDACおよびBAK、図2C)、膜蛋白質の共発現(図2C)、またはシャペロンおよび界面活性剤のような添加物の不在下でさえ行う蛋白質の機能の保持(ミトコンドリア蛋白質VDACおよびBAK、図6および7およびgp91-phox、図4)を可能にするため、脂質ベシクルの付加は特定の膜蛋白質の合成およびそれらの構造にポジティブな効果をもたらす。
一定の膜蛋白質の構造的な複雑さにより、(アルファヘリックス領域のような)種々の膜貫通領域を含む膜蛋白質の可溶性および活性な形態での合成は、天然のコンフォメーションの維持およびリポソームの脂質二重層内への一方向または二方向性の組み込みを可能とする更なる化学成分を必要とする。膜蛋白質についての様々な研究は、イオン性、非イオン性、または両性の界面活性剤が膜蛋白質を抽出および/または再可溶化するために必要であることを示してきた。それからこれら界面活性剤はプロテオリポソーム形成の最終段階の間に透析、除去クロマトグラフィー、希釈またはポリスチレンビーズの付加により排除される。
非イオン性(n-ドデシル ベータ-D-マルトシド[DDM]、n-オクチル ベータ-D-グルコピラノシド[β-OG]、n-チオオクチル ベータ-D-グルコピラノシド[β-thioOG]、ノニルフェニル‐ポリエチレン‐グリコール[NP40]、ポリオキシエチレン‐(23)‐ラウリル‐エーテル[Brij-35]、ポリオキシエチレン‐(8)‐ラウリル‐エーテル[C12E8]、ポリオキシエチレン‐ソルビタン‐モノラウレート20[Tween20]、n‐デシル‐β‐D‐マルトシド[DM])および両性(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンサルフォネート[CHAPS]、Zwittergent 3-14、ラウリルジメチルアミンオキシド[LDAO])界面活性剤の効果は、チラコイドリポソームにおいて膜蛋白質の発現、可溶化および組み込みに関して試験されてきた。それゆえ様々な連続した実験は界面活性剤のみの存在下および/またはシャペロン(DNAK、GroE)、酸化還元対(GSH/GSSG)、炭化水素ポリマー(NV10、Novexin)およびプロテアーゼインヒビター(図3)存在下でヒト蛋白質gp91-phoxの各種切断形態について実施されてきた。臨界ミセル濃度に近い濃度(0.12mMの理論的臨界ミセル濃度に対して0.2mM)で使用されるn-ドデシル ベータ-D-マルトサイド[DDM]を除き、全ての界面活性剤はそれらの臨界ミセル濃度(CMC)より高い濃度で反応培地に加えられる。図3で示されるように、これら界面活性剤は膜蛋白質の発現について様々な効果を有する。例えば、CHAPSおよびβ‐OGは、β‐OG についてはコンストラクトgp91phox221-C、CHAPSについてはgp91phox221-C、gp91phox233-Nおよび233-C、gp91phox285-Nを除き、gp91-phoxの切断形態の発現に関してネガティブな効果をもたらす。対照的に、界面活性剤のNP40、Thio-OGおよびDDMは、蛋白質のN末端でヘクサ‐ヒスチジン標識を含むコンストラクトに関して、殆どのgp91-phoxの切断形態の発現を刺激する(図3)。これらの結果は、非イオン性界面活性剤の付加が1つまたは複数のアルファヘリックス膜貫通領域を有する膜蛋白質の合成に適合すること、およびこれらはプロテオリポソーム形成のための合成反応において加えられ得ることを示唆する。
gp91-phox蛋白質の各種切断形態を含むプロテオリポソームの酵素活性は、電子受容体としての2つの基質存在下で決定された:ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)およびインドニトロテトラゾリウム(INT)。可溶性であるgp91-phox蛋白質の切断形態とは異なり、プロテオリポソームは細胞質因子およびアラキドン酸無しではNADPHおよびFAD依存性酵素活性を有する(図4)。例えば、2つの補因子存在下におけるgp91phox-221C蛋白質を含むプロテオリポソームのジアホラーゼ活性は、NBT還元については7.8mol/min/molおよびINTについては5.5mol/min/molの基礎活性を有する(図4Aおよび4B)。これらの値は可溶性蛋白質のそれに近く、プロテオリポソームが十分に機能的であることを示す。gp91phox-221Cを含む組換えプロテオリポソーム10ナノモルを細胞質抽出液およびアラキドン酸と共にインキュベーションすることは、NBTについては7倍、INTについては10倍蛋白質の還元活性を増加させる(図4Aおよび4B)。それゆえにこれらの結果は脂質ベシクルに含まれる組換え膜蛋白質が細胞質因子およびアラキドン酸の付加により刺激可能である基本的な酵素活性を有することを示す。
応用の実施例は図6B、6C、6D、7および8にて示される。脂質ベシクルに挿入されたBakおよびVDAC蛋白質のin vivoでのプロアポトーシス活性を測定するために、ヒト大腸癌細胞(HCT116)が組換えプロテオリポソーム存在下で24および48時間インキュベートされる。外因性膜蛋白質の位置は免疫蛍光法(図8)により確認され、プロアポトーシス活性はカスパーゼ経路の刺激(図6B、6Cおよび6D)または細胞生存力の測定(図7)のどちらかにより測定される。これらの結果は、組換えプロテオリポソームはミトコンドリア外膜に対する治療上関心のある膜蛋白質の特異的な放出および標的細胞におけるアポトーシス誘導が可能であることを示す。同一の方法で、プロテオリポソームは切断形態のgp91-phoxの細胞質膜への放出が可能である(結果は示されない)。
Claims (15)
- 膜蛋白質の合成が反応培地において脂質ベシクル存在下で蛋白質合成の無細胞システムを使用して行われることを特徴とする膜蛋白質を含むプロテオリポソームを得るための方法。
- 脂質ベシクルがポリエチレングリコール(PEG)分子またはその誘導体を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ポリエチレングリコール(PEG)分子またはその誘導体が合成脂質に接合していることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 脂質ベシクルが植物起源の脂質を含むことを特徴とする請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 脂質がホウレンソウの葉緑体由来であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 請求項1から5の何れか一項に記載の方法を使用して得られる、脂質二重層内に組み込まれた天然のコンフォメーションの膜蛋白質を含むプロテオリポソーム。
- ポリエチレングリコール(PEG)分子またはその誘導体を有することを特徴とする請求項6に記載のプロテオリポソーム。
- ポリエチレングリコール(PEG)分子またはその誘導体が合成脂質に接合していることを特徴とする請求項7に記載のプロテオリポソーム。
- 脂質が植物起源の脂質二重層を形成することを特徴とする請求項6から8の何れか一項に記載のプロテオリポソーム。
- 脂質二重層がホウレンソウの葉緑体由来であることを特徴とする請求項9に記載のプロテオリポソーム。
- 膜蛋白質が哺乳動物の蛋白質であることを特徴とする請求項6から10の何れか一項に記載のプロテオリポソーム。
- 膜蛋白質がヒト起源であることを特徴とする請求項11に記載のプロテオリポソーム。
- 医薬品またはワクチンとしての使用のための請求項6から12の何れか一項に記載のプロテオリポソーム。
- ミニ細胞としての請求項6から12の何れか一項に記載のプロテオリポソームのin vitroでの使用。
- 請求項1から4の何れか一項に記載の方法を実施するため、または無細胞蛋白質および脂質ベシクル合成システムを含む請求項6から12の何れか一項に記載のプロテオリポソームを合成するためのキット。
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