KR101343744B1

KR101343744B1 - 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스 개발, 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101343744B1
Application number: KR1020110120120A
Authority: KR
Inventors: 엄숭호; 배선주
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-12-19
Also published as: WO2013073774A1; KR20130054625A; US20150050698A1

Abstract

본 발명은 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 지질 막 성분을 포함하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스는 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 및 지질 막 성분을 포함하는 다형의(예. 타원형, 구형 혹은 사각형)의 젤 매트릭스로서, 세포 핵 내부의 염색체의 물리적 모형을 모사한 구조(타원형)로 인하여 작은 공간 안에 DNA, 전사 및 번역 구성인자 등이 밀집되어 있어 단백질 생산량을 최대화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 젤 형태 안에서 DNA가 포함되어 있어 외부 인자로부터 보호할 수 있기 때문에 안정적으로 장기간 동안 고농도의 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.

Description

세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스 개발, 및 이의 제조 방법{Nucleus mimic, gene-networked gel matrix for in vitro protein production, and preparation method thereof}

본 발명은 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 및 지질 막 성분을 포함하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 매트릭스 개발, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근, 자연의 우수한 기능적 시스템을 복제하고자 하는 노력의 일원으로 생화학, 물리학, 공학, 수학 등의 다기능적 학문들이 총 집대성된 고난이도 집적 기술-생체모사공학(biomimetic engineering or bio-inspired engineering)이 활발히 연구되고 있다. 이는 의료 및 바이오관련공학, 심지어 섬유 및 식품공학 등을 아우르며 다양한 분야로 급속히 전파되고 있다. 예를 들어, 세포 내 외부 유전자 도입(endocytosis)에서 문제가 되어온 낮은 전달 효율을 증가시키는 연구가 천연 바이러스의 뛰어난 전달능력을 모사함으로써 한층 더 발전된 결과를 보여주고 있다.

이처럼 자연에 존재하는 모든 물질들은 생체모사공학의 연구 대상으로 주목받고 있다. 특히 생명의 최소 단위 구성체인 세포는 물질대사의 집약체로 생체 시스템을 통제하는 중요한 대상이기에 그 기능을 연구하고 복제하고자 하는 관심이 날로 증가하고 있다. 현재까지 진행되고 있는 대표적인 세포 모사 연구로는 다종 물질간의 선택적 교환을 위한 핵공 전달체 혹은 세포 외벽 지질 막 모사 연구, 면역 신호 체계를 통제하기 위한 인공 수지상 세포(artificial dendritic cell) 연구 등이 있다. 본 발명에서는 이러한 연구방향에 발맞추어 세포 핵 내부의 단백질 생산 주체인 염색체(chromosome)의 기능을 모사하고 기존의 상업적 단백질 생산능력을 초극대화 하는데 목적이 있다.

현재까지 알려진 상업적 단백질 생산 방법은 살아있는 세포의 세포질을 파괴하는 방법이나 화학적으로 아미노산을 중합하는 방법이 주로 이용되어 왔다. 그러나 이들 방법은 세포 파쇄 과정 및 정제/분리 과정에 있어서 매우 복잡한 생산 과정을 거치며, 제작된 단백질이 정상적으로 발현이 되지 않거나, 체내에서 잘 받아들여지지 못하고 면역반응을 일으키며, 긴 사슬의 단백질 중합에서 아미노산 서열의 정확성이 떨어지는 등의 단점들을 가지고 있었다. 따라서 최근에는 세포를 이용하지 않는 무세포 단백질 합성 시스템(cell-free 혹은 in vitro protein synthesis system)의 개발이 활발히 진행되고 있다.

무세포 단백질 합성 시스템은 세포 파쇄액(cell lysates)이나 추출액에 기질(substrate)이나 효소(enzyme)를 첨가하여 단백질 합성에 필요한 핵심 요소들(ATP(adenosine triphosphate), 아미노산 등)을 이용하여 시험관 내에서 단백질을 합성하는 방법이다. 이러한 무세포 단백질 합성 시스템은 기존의 세포를 이용한 단백질 생산 방법의 단점을 극복할 수 있기 때문에 어떠한 단백질이든 합성을 가능하게 할 것이라고 기대된다. 또한 단백질이 합성될 때의 pH, 온도, 이온 세기 등 다양한 외부 조건에 대해서 자유로울 수 있기 때문에 생산성을 증가시킬 수 있을 것으로도 기대된다. 그러나 이러한 장점들을 가지고 있음에도 불구하고 실질적으로 이용되고 있지 않는 이유는, 짧은 반응시간과 낮은 단백질 생산 속도로 인해 소비되는 시약의 비용이 높기 때문이다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 요오도아세트아미드(iodoacetamide), 글루타티온(glutathione) 등과 같은 다양한 화학물질을 첨가하거나, 연속 유동 시스템을 개발하여 생산성을 높이기 위한 다양한 시도들이 진행되고 있지만 여전히 산업적으로 이용되기에는 부족한 실정이다.

이와 같이 안정적으로 높은 생산성을 유지할 수 있는 효과적인 무세포 단백질 합성 시스템의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점들을 해결할 뿐 아니라 근원적으로 세포 내 핵의 유전자들의 물리적 배열을 모사하여 단백질 생산능력을 극대화하기 위해 안출된 것으로, 인공 세포핵을 제작하기 위하여 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 및 지질 막 성분 을 포함하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스 개발, 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 및 지질 막 성분을 포함하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스를 제공한다.

또한 본 발명은 사파이어 기판 위에 산화 아연(ZnO) 나노입자를 증착시키고, 상기 표면 위에 전자빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 진공 스퍼터링(sputtering) 방식으로 금을 증착시킨 후, 1 mM의 HDFT(heptadecafluoro-1-decanethiol) 용액을 실온에서 15분간 처리하여 초소수성 표면을 제작하는 단계; 염기서열의 상보적 결합을 통하여 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 단일가닥(single strand) 핵산을 결합시켜 X형 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계; pIVEX 플라스미드와 DNA 단편을 제한효소(restriction enzyme)와 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 재조합 플라스미드를 제조하는 단계; 상기 X형 핵산 나노 구조체, 재조합 플라스미드, 및 전사 및 번역 구성물질을 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 핵산 젤 전구체를 제조하는 단계; 초소수성 표면 위에 핵산 젤 전구체 용액을 올리고 PDMS 주형을 덮은 후 실온에서 최소 4시간 이상 반응시키는 단계; 및 상기 제작된 핵산 매트릭스를 지질 막 성분(DOPC, DOTAP, Texas-red DHPE)으로 제작된 리포좀과 실온에서 2시간 이상 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 X형 핵산 나노 구조체는 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 DNA 서열이 결합된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 DNA 단편은 AcGFP(Aequorea coerulescens green fluorescence protein) 유전자인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNA 단편은 암 사멸 또는 혈관 생성과 관련된 유전자인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 hShh(Human sonic hedgehog), hTRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), hGDNF(Human glail-derived neurotrophic factor), 및 mouse-SDF1α(Stromal cell-derived factor-1α) 유전자로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNA 단편은 홍합접착단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP) 생산과 관련된 유전자인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 fp-151 유전자이다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNA 단편은 암 줄기세포 마커인 CD44 생산과 관련된 유전자인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드는 맥아 또는 대장균 기반(wheat germ or E. coli based system)인 pIVEX(plasmid in vitro expression vector) 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 전사 및 번역 구성물질은 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase), ATP, NTP 혼합액, 세포 파쇄액, 및 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 지질 막 성분은 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), 및 Texas-red DHPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 핵산 젤 매트릭스는 가로, 세로, 및 높이의 크기가 최소 100nm 내지 최대 1,000μm, 또는 최대 직경이 100μm이하의 다형인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스는 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 및 지질 막 성분을 포함하는 다형의 구조체로서, 핵산 젤 매트릭스가 가지는 구조적 특성으로 인하여 작은 공간에 DNA, 전사 및 번역 구성인자 등이 밀집되어 있어 세포 내 자연형의 유전체 밀집구조 환경과 흡사하여 과량의 단백질 생산이 가능하다. 이는 현재 상업화된 무세포 단백질 합성 방법과 비교하여 월등한 단백질 생산 능력 향상을 제시한다. 또한 다양한 질병 치료에 상응하는 외부 유전체를 젤 내부에 포함하고 있는 구조로써 외부 인자로부터 이를 보호할 수 있도록 제작되었기 때문에, 체내에 주입하였을 때 안정적인 항암치료 및 염증치료 등 치료효능을 증대시킬 수 있는 원천기술로 기대된다. 또한 상기 개발된 핵산 매트릭스와 지질 막 성분과의 결합을 통한 세포 핵 모사 시스템은 독성반응 및 면역반응이 거의 없는 천연 구조 모사체로서 기존 세포에서의 핵 시스템을 대체할 수 있어 향후 유전자 치료를 위한 차세대 플랫폼으로 제안될 수 있을 것이다.

도 1 은 X형 핵산 나노 구조체의 간략한 모식도(a)와 전기영동으로 확인한 결과(b)를 보여주는 도면이다.
도 2 는 재조합 플라스미드의 제조단계를 전기영동으로 확인한 결과((a) 및 (b))와 염기서열 분석결과(c)를 보여주는 도면이다. (d) 및 (e)는 암 사멸 및 혈관생성인자와 관련된 유전자에 대한 재조합 플라스미드의 제조단계를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 3 은 핵산 매트릭스의 간략한 모식도이다.
도 4 는 전사 및 번역에 필요한 구성성분들을 포함시켜 핵산 젤 매트릭스를 제작한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 초소수성 표면의 제작 방법을 보여주는 모식도이다.
도 6 은 HDFT 농도 및 제작 방법에 따른 표면의 소수성을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7 은 초소수성 표면의 제조 단계를 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8 은 제조된 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스(타원형)를 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 도면이다.
도 9 는 지질 막 성분과의 결합을 통한 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 매트릭스의 제작 모식도 및 제작된 핵산 매트릭스를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10 은 제조된 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스(타원형)의 단백질 발현 효율을 예측한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11 은 기존의 용액 기반 무세포 단백질 합성 시스템과 본 발명의 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스의 단백질 발현을 비교한 결과((a) 및 (d)), X형 핵산 나노 구조체와 재조합 플라스미드의 결합 비율에 따른 단백질 발현량(b), 및 배양 시간에 따른 단백질 발현량(c)을 보여주는 도면이다.
도 12 는 기존의 용액 기반 무세포 단백질 합성 시스템과 본 발명의 무세포 단백질 합성용 핵산 매트릭스로부터 생산된 단백질의 분자량을 단백질 전기영동법을 통해 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명자들은 안정적으로 높은 단백질 생산성을 유지할 수 있는 효과적인 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성 핵산 젤 매트릭스 시스템에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 전사 및 번역 구성물질, 및 지질 막 성분을 포함하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 매트릭스를 제공한다.

본 발명의 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스는 다형인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 다양한 형태의 젤 매트릭스를 제작하기 위해서 간단히 타원형, 원형, 사각형의 PDMS 틀(mold)을 사용하였다. 틀의 모양에 따라 젤의 형태를 변경시킬 수 있기 때문에, 변경 가능한 젤의 형태에는 제한이 없다. 바람직하게는 타원형, 원형, 사각형일 수 있다. 더욱 바람직하게는 표면적이 상대적으로 넓은 원형, 또는 타원형일 수 있다. 상기 핵산 젤 매트릭스의 크기에는 제한이 없으나, 바람직하게는 가로, 세로, 높이의 크기가 최소 100nm 내지 최대 1,000μm, 또는 최대 직경 100μm 이하의 다형 구조이다.

표면적이 상대적으로 넓은 타원형 또는 원형의 젤 매트릭스를 제작하기 위한 방법으로 초소수성 기판위에 틀을 넣는 방법을 시도하였다. 본 발명에서는 (a) 사파이어 기판 위에 산화 아연(ZnO) 나노입자를 증착시키고, 상기 표면 위에 전자빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 진공 증착(sputtering) 방식으로 금을 표면에 도포시킨 후, 1 mM의 HDFT(heptadecafluoro-1-decanethiol) 용액을 실온에서 15분간 처리하여 초소수성 표면을 제작하는 단계; (b) 염기서열의 상보적 결합을 통하여 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 단일가닥(single strand) 핵산을 결합시켜 X형 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계; (c) pIVEX 발현 플라스미드와 DNA 단편을 제한효소(restriction enzyme)와 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 재조합 플라스미드를 제조하는 단계; (d) 상기 X형 핵산 나노 구조체와 재조합 플라스미드 및 전사 및 번역 구성물질을 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 핵산 젤 전구체를 제조하는 단계; (e) 초소수성 표면 위에 핵산 젤 전구체 용액을 올리고 틀 PDMS 주형을 덮은 후 실온에서 최소 4시간 이상 반응시키는 단계; 및 (f) 상기 제작된 유전자 네트워크 수화젤을 지질 막 성분(DOPC, DOTAP, Texas-red DHPE)으로 제작된 리포좀과 실온에서 2시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 상기 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 매트릭스의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 DNA 서열이 결합된 X형 핵산 나노 구조체를 이용하여 핵산 매트릭스를 제조할 수 있다는 것과 상기 핵산 나노 구조체의 사이에 목적 단백질을 코딩(coding)하는 유전자를 결합시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 상기 X형 핵산 나노 구조체 사이에 결합시킬 수 있는 유전자의 종류에는 제한이 없다. 바람직하게는 암 사멸 또는 혈관 생성과 관련된 유전자(hShh(Human sonic hedgehog), hTRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), hGDNF(Human glail-derived neurotrophic factor), mouse-SDF1α(Stromal cell-derived factor-1α) 등)일 수 있다. 또한 상기 유전자는 암 줄기세포 마커인 CD44 생산과 관련된 유전자일 수 있고, 홍합접착단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP) 생산과 관련된 유전자(fp-151 유전자 등)일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다. 핵산 매트릭스의 개략적인 모식도는 도 3에 나타내었다.

상기 DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드는 맥아 또는 대장균 기반(wheat germ or E. coli based system)인 pIVEX(plasmid in vitro expression vector)인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 맥아 기반인 경우 pIVEX 1.3WG, pIVEX 1.4WG series, 대장균 기반의 경우 pIVEX 2.3E.coli, pIVEX 2.4E.coli 이다.

또한 본 발명자들은 상기 핵산만을 이용한 무세포 단백질 발현용 젤 매트릭스를 제조하기 위하여 전사 및 번역 구성물질을 포함하여 다형의(예. 타원형, 원형, 사각형) 젤(gel) 구조체를 제조하였으며 이를 핵산 매트릭스 기반 무세포 단백질 발현용으로 활용하였다.

본 발명의 일실시예에서는 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스의 단백질 생산 능력을 기존의 용액 기반 시스템에 비하여 20배 이상의 단백질을 생산할 수 있다는 것을 확인하였으며, 또한 안정적으로 재활용될 뿐 아니라 장시간동안 단백질이 발현된다는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

상기 결과로부터, 본 발명의 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스를 다양한 질병에 대한 유전자 치료에 적용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 마이크로 단위의 작은 크기 및 구조체 내부에 DNA가 포함되어 있어 외부 인자로부터 보호가능하다는 이점 때문에, 안정적으로 체내에서 단백질을 발현할 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 핵산 젤 매트릭스의 제조

1-1. X형 핵산 나노 구조체의 제조

핵산 매트릭스를 제조하기 위하여, 네 종류의 단일가닥(single strand) 핵산을 Integrated DNA Technology 에 의뢰하여 제조하였다. 제조된 단일가닥 핵산의 서열은 하기와 같다.

X01(5'-ACGTCGACCGATGAATAGCGGTCAGATCCGTACCTACTCG-3', 서열번호 1)

X02(5'-ACGTCGAGTAGGTACGGATCTGCGTATTGCGAACGACTCC-3', 서열번호 2)

XO3(5'-ACGTCGAGTCGTTCGCAATACGGCTGTACGTATGGTCTCC-3', 서열번호 3)

X04(5'-ACGTCGAGACCATACGTACAGCACCGCTATTCATCGGTCG-3', 서열번호 4)

염기서열의 상보적 결합을 유도하여 X형 핵산 나노 구조체를 제조하였다(열교환기(Thermocycler)를 이용하여 가열 냉각시킴(annealing), 95 ℃에서 2분 → 65 ℃에서 2분 → 60 ℃에서 5분 30초 → 60 ℃에서 30초당 -1 ℃씩 온도를 낮춤 → 20 ℃에서 30초 → 20 ℃에서 4 ℃까지 온도를 낮춤). X형 핵산 나노 구조체의 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었다. 그리고 각각의 결합된 핵산 나노 구조체는 전기영동(electrophoresis)을 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 1(b)에 나타내었다.

도 1(b)에 나타난 바와 같이, 1번 라인은 X01 단일가닥, 2번 라인은 X01과 X02가 결합된 구조체, 3번 라인은 X01, X02, 및 X03이 결합된 구조체, 4번 라인은 X01 내지 X04가 결합된 X형 핵산 나노 구조체가 형성된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 각각의 단일가닥 핵산이 결합할수록 크기가 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 네 종류의 단일가닥 핵산이 결합하여 X형 핵산 나노 구조체가 제조되었음을 확인하였다.

1-2. 재조합 플라스미드의 제조

세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스에서 발현될 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)를 제조하기 위하여, 개념증명모델로 사용하는 녹색형광단백질(GFP, green fluorescent protein)를 발현하는 AcGFP 유전자 서열을 포함하는 플라스미드와 pIVEX 발현 플라스미드를 각각 제한효소(restriction enzyme)(AcGFP 플라스미드 / pIVEX 발현 플라스미드에 대하여 각각 Nco I, Stu I / Nco I, Sma I)를 처리하여 자른 후, T4 DNA 연결효소(ligase)를 사용하여 18~22 ℃에서 16시간 동안 AcGFP 유전자와 pIVEX 발현 플라스미드를 결합시켰다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, AcGFP 유전자를 포함하고 있는 플라스미드가 제한효소에 의해서 잘려진 것(800 bp)을 확인할 수 있었다(도 2(a) 참조). 또한 잘려진 AcGFP 유전자와 pIVEX 발현 플라스미드가 결합되어 3994 bp의 밴드(재조합 플라스미드)가 형성된 것을 확인할 수 있었다(도 2(b) 참조).

도 2(c)에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 플라스미드는 유전자 염기서열 분석(DNA sequencing)을 통하여 정상적으로 AcGFP 유전자가 pIVEX 발현 플라스미드에 삽입되어 제조된 것을 확인하였다.

AcGFP 유전자 외에도, 암 사멸 및 혈관 생성인자와 관련된 hShh(Human sonic hedgehog), hTRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), hGDNF(Human glail-derived neurotrophic factor), 또는 mouse-SDF1α(Stromal cell-derived factor-1α) 유전자를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 재조합 플라스미드를 제조하였다(도 2(d),(e) 참조).

도 2(d)에 나타난 바와 같이, hShh 유전자가 포함된 플라스미드(2번 라인)가 제한효소 Hind III와 Not I 에 의해 잘려져 선형의 hShh(3번 라인)유전자 서열이 생성된 것을 확인할 수 있었다. hTRAIL 유전자가 포함된 플라스미드(5번 라인)는 제한효소 Nco I, Hpa I에 의해 잘려져 선형의 hTRAIL(6번 라인)유전자 서열이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한 각각의 유전자에 대하여 재조합 가능한 형태로 pIVEX 발현 플라스미드가 4번 라인과 7번 라인과 같이 해당하는 제한효소에 맞게 잘려진 것을 확인 할 수 있었다.

도 2(e)도 마찬가지로, hGDNF 유전자를 포함하는 플라스미드(1번 라인)가 제한효소 Hind III, Hpa I 에 의해 잘려져 선형의 hGDNF(2번 라인) 유전자 서열이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한 mouse-SDF1α 유전자를 포함하는 플라스미드(5번 라인)는 제한효소 Not I, Sal I에 의해 잘려져 mouse-SDF1α(6번 라인)유전자 서열이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한 각각의 유전자에 대하여 재조합 가능한 형태로 pIVEX 발현 플라스미드가 3번 라인, 7번 라인과 같이 해당하는 제한효소에 맞게 잘려진 것을 확인할 수 있었다.

1-3. 핵산 젤 매트릭스의 제조

핵산 젤 매트릭스를 제조하기 위하여, 실시예 1-1의 X형 핵산 나노 구조체와 실시예 1-2의 재조합 플라스미드를 T4 DNA 연결효소(ligase)를 사용하여 실온에서 최소 4시간 이상 반응시켜 결합시켰다. 핵산 매트릭스의 개략적인 모식도는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, X형 핵산 나노 구조체를 기반으로 하여 매트릭스를 형성시키고, X형 핵산 나노 구조체 사이에 목적하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 결합시켜 핵산 젤 매트릭스를 제조하였다.

또한 핵산 젤 매트릭스를 제작하는 과정에서 전사 및 번역에 필요한 구성성분들을 포함시켜 핵산 젤 매트릭스를 제조하였다. 핵산 염색제인 SYBR green I 으로 염색하여 전사 및 번역에 필요한 구성성분들이 포함되어 있는 핵산 젤 매트릭스를 관찰하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4의 결과로부터, 1번의 아무 성분도 포함되어 있지 않은 핵산 젤 매트릭스(대조군), 2번의 T7 RNA 중합효소와 전사 완충용액이 포함된 핵산 젤 매트릭스, 3번의 T7 RNA 중합효소와 전사 완충용액 및 NTP 혼합액이 포함된 핵산 젤 매트릭스, 4번의 NTP 혼합액만이 포함된 핵산 젤 매트릭스, 5번의 T7 RNA 중합효소만이 포함된 핵산 젤 매트릭스의 다섯 가지 유형이 모두 잘 형성됨을 확인하였고 도 4의 B 와 같이 핵산 젤 매트릭스가 형성된 것을 육안으로 쉽게 확인할 수 있었다.

실시예 2. 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스

2-1. 표면의 제작

세포 핵 모사를 통한 자연의 기능적 단백질 생산능력을 보다 효과적으로 모사하기 위해서는 세포핵의 형태적인 모사가 앞서 이루어져야 한다. 구형 혹은 타원형의 모형을 가진 핵 내부로 파악하였을 때 이는 같은 부피 체에서 상대적인 표면적이 증가됨을 알 수 있었다. 넓은 표면적을 가진 핵산 젤 매트릭스 내부의 유전자는 외부에서 공급되는 단백질 전사-번역 인자들과 긴밀히 반응할 수 있는 확률이 증가되기 때문에, 결국 더욱 효율적인 단백질 생산을 가능하게 한다.

이러한 핵산 젤 매트릭스를 제작하기 위해서 본 연구에서는 초소수성 표면에서 표면장력을 최소화하려는 친수성 물의 특성을 이용하였다. 친수성인 핵산 젤 전구체가 초소수성 표면 위에서 구형의 형태를 자유롭게 형성하므로 제작과정의 간결성이 기대된다. 아울러, 비교대상으로 사각형의 젤 패드도 제작되는데 이는 단순히 양전하 표면을 유도한 유리기판을 사용하였다.

초소수성 표면을 제작하기 위하여, 사파이어 기판 위에 산화 아연(zinc oxide, ZnO) 입자를 증착시켜 거친 표면(rough surface)을 제작하고, 거친 표면에 전자빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 진공 증착(sputtering) 방식으로 금 을 코팅하여 5 nm의 금 박막을 형성하였다. 그리고 마지막으로 다양한 농도의 HDFT(heptadecafluoro-1-decanethiol) 용액을 실온에서 15분 동안 처리한 후 다이클로로메테인(dichloromethane)으로 2분간 세척하여 초소수성 표면을 제작하였다. 제작 방법의 개략적인 모식도는 도 5에 나타내었다. HDFT 농도에 따른 소수성은 접촉각(contact angle)을 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, HDFT를 처리하지 않았을 때는 접촉각이 약 80도, 0.1 mM과 0.5 mM의 HDFT를 처리했을 경우에는 약 120도, HDFT 1 mM을 처리했을 경우에는 약 150도가 되는 것을 확인하였다. 또한 1 mM의 HDFT를 처리한 경우, 진공증착방식을 이용하여 금을 표면코팅하였을 때 접촉각이 높아진 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여 진공증착 방식을 이용하여 금을 코팅한 후에 1 mM의 HDFT를 처리하여 초소수성 표면을 제작할 수 있음을 확인하였다.

1 mM의 HDFT를 처리하여 제작된 초소수성 표면은 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 산화 아연 입자를 증착시킨 후에는 위에서 관찰한 결과(도 7(a) 참조)와 45도 기울여서 관찰한 결과(도 7(d) 참조) 모두 사파이어 기판 위에 거친 표면이 제작된 것을 확인할 수 있었고, 그 위에 금을 증착시킨 경우에는 거친 표면 위에 금 막(gold membrane)이 덮여진 것을 확인할 수 있었다(도 7(b) 및 (e) 참조). 그리고 HDFT를 이용하여 초소수성 표면을 제작한 결과는 도 7(c) 와 (f)로부터 확인할 수 있었다.

2-2. 핵산 젤 매트릭스의 제조

도 3에 나타난 바와 같이, X형 핵산 나노 구조체를 기반으로 하여, X형 핵산 나노 구조체 사이에 목적하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 결합시켜 핵산 매트릭스를 제조하였다.

실시예 1-1의 X형 핵산 나노 구조체와 실시예 1-2의 재조합 플라스미드를 T4 DNA 연결효소(ligase)를 사용하여 실시예 2-1에서 제조된 초소수성 표면 위에 올리고 100μm 원형 지름에 30μm 의 홈이 파여있는 PDMS(polydimethylsiloxane) 주형 틀(mold)로 덮어준 후 실온에서 최소 4시간 이상 젤(gel)화를 유도한 후 PDMS 주형을 제거하여 핵산 젤 매트릭스를 제조하였다. 제조된 타원형의 핵산 젤 매트릭스 내의 핵산을 핵산 염색제인 SYBR green I으로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 타원형(직경 100μm)의 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스가 3차원의 젤 매트릭스 형태로 제조된 것을 확인하였다.

또한 세포 핵 모사를 위하여 지질 막 성분(DOPC, DOTAP, Texas-red DHPE)으로 제작된 리포좀과 실온에서 2시간 동안 반응시켜 도 9와 같이 지질 막 성분이 포함된 세포 핵 모사 핵산 매트릭스 기반 단백질 합성용 구조체를 제작하였다.

2-3. 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스의 단백질 생산 효율 예측

타원형의 무세포 단백질 합성용 핵산 젤 매트릭스와 사각형 패드형의 핵산 젤 매트릭스의 단백질 생산 효율을 비교 예측하였다. 한 개의 패드형 젤 매트릭스가 127개의 타원형 젤 매트릭스와 동일한 부피를 가지는 것을 전제로 하여 타원형 젤 매트릭스의 AcGFP 단백질 발현량을 측정하였다. 측정값으로부터 얻어진 y=0.2887e⁰ ^.0076x수식으로부터 단백질 발현량을 예측하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 50,800개의 타원형 젤 매트릭스가 동일한 부피에 해당하는 400개의 패드형 젤 매트릭스에 비해 약 20배의 효과가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는 타원형의 구조로 인하여 표면적이 증가함에 따라 내부 DNA 등의 인자들이 젤 매트릭스의 표면에 존재하게 되어 외부의 단백질 생산 인자들과의 반응확률이 증가하기 때문에 단백질 생산량을 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 3. 용액 기반( solution phase ) 무세포 단백질 합성 시스템과의 비교

기존의 상업적으로 판매되고 있는 용액 기반(solution phase) 무세포 단백질 합성 시스템과의 단백질 합성량을 비교하기 위하여, AcGFP 유전자(각 unit에 대해 0.78, 1.56, 2.25, 3 ng 에 해당하는 양. 예: 100 unit에 해당하는 AcGFP 유전자의 양이 0.78 ng)가 첨가된 용액과 핵산 젤 매트릭스를 각각 100, 200, 400, 및 800 unit(단위)을 처리하고 24 ℃ 에서 24시간 동안 반응시킨 후 발현된 단백질의 양을 형광을 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 11(a)에 나타내었다.

도 11(a)에 나타난 바와 같이, 용액 기반 시스템(□)은 800 unit을 처리한 경우에 단백질 발현량이 약 0.23 ㎍/mL이지만, 핵산 매트릭스 기반 구조체(◆)는 100 unit을 처리한 경우에 약 2.6 ㎍/mL로 20배 이상 단백질 발현량이 증가된 것을 확인하였다. 또한 핵산 매트릭스 기반 구조체를 800 unit 처리한 경우에는 단백질 발현량이 3.0 ㎍/mL으로 단백질 발현량이 용액 기반 시스템에 비하여 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다.

도 11(b)는 핵산 매트릭스 기반 구조체 내에 포함되어 있는 X형 핵산 나노 구조체와 재조합 플라스미드의 비율에 따른 단백질 발현량을 비교한 결과로, 4,000:1의 비율일 때 단백질 발현량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

X형 핵산 나노 구조체와 재조합 플라스미드의 비율을 4,000:1로 하여 구조체를 제조한 후, 800 unit을 처리하고 연속 배양 시스템에서 시간에 따른 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과는 도 11(c)에 나타내었다.

도 11(c)에 나타난 바와 같이, 50시간 까지 시간에 따라 발현량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

제조된 핵산 매트릭스 기반 무세포 단백질 발현용 구조체의 효율을 확인하기 위하여, 대조군으로 GUS(beta-glucuronidase) 유전자를 사용하여 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과는 도 11(d)에 나타내었다.

도 11(d)에 나타난 바와 같이, 핵산 매트릭스 기반 구조체의 경우 용액 기반 시스템에 비하여 20배 이상 높은 단백질 발현량을 보여주었다.

발현된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에서 나타난 바와 같이, 대조군인 GUS 유전자가 정상적으로 발현된 것을 확인할 수 있었으며(2번 라인), 용액 기반 시스템(3번 라인)과 핵산 매트릭스 기반 구조체(4번 라인) 모두 AcGFP(26 kDa)를 생성한 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통해, 핵산 매트릭스 기반 구조체를 이용하여 기존의 무세포 단백질 발현 시스템에 비하여 20배 이상 높은 발현량을 가지는 무세포 단백질 발현 시스템을 개발할 수 있으며, 상기 시스템을 이용하면 안정적으로 장시간동안 고농도의 단백질을 생산할 수 있다는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

지질막 성분으로 코팅된 핵산 젤 전구체를 함유하는 핵산 젤 매트릭스로서,
상기 핵산 젤 전구체는, X형 핵산 나노 구조체, DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드, 및 전사 및 번역 구성물질을 포함하여 이루어지고,
상기 핵산 젤 전구체는, 사파이어 기판상에 산화아연(ZnO) 나노입자와 금과 HDFT(heptadecafluoro-1-decanethiol)가 차례로 처리된 초소수성 표면에서 PDMS 주형을 덮어 형성된 구형이고,
상기 X형 핵산 나노 구조체는 서열번호 1, 2, 3 및 4의 DNA 서열이 결합된 것을 특징으로 하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 구형 핵산 젤 매트릭스.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 AcGFP(Aequorea coerulescens green fluorescence protein) 유전자인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 암 사멸 또는 혈관 생성과 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 4 항에 있어서,
상기 유전자는 hShh(Human sonic hedgehog), hTRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), hGDNF(Human glail-derived neurotrophic factor), 및 mouse-SDF1α(Stromal cell-derived factor-1α) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 홍합접착단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP) 생산과 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 6 항에 있어서,
상기 유전자는 fp-151 유전자인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 암 줄기세포 마커인 CD44 생산과 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드는 맥아 또는 대장균 기반(wheat germ or E. coli based system)인 pIVEX(plasmid in vitro expression vector)인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 전사 및 번역 구성물질은 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase), ATP, NTP 혼합액, 세포 파쇄액, 및 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 지질 막 성분은 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), 및 Texas-red DHPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
제 1 항에 있어서,
상기 핵산 젤 매트릭스는 최대 직경 100μm 이하의 구형인 것을 특징으로 하는, 매트릭스.
(a) 사파이어 기판 위에 증착된 산화 아연(ZnO) 나노입자에 전자빔 리소그래피(e-beam lithography) 또는 진공 스퍼터링(sputtering) 방식으로 금을 더 증착시킨 후, 1 mM의 HDFT(heptadecafluoro-1-decanethiol) 용액을 실온에서 15분간 처리하여 초소수성 표면을 제작하는 단계;
(b) 염기서열의 상보적 결합을 통하여 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 단일가닥(single strand) 핵산을 결합시켜 X형 핵산 나노 구조체를 제조하는 단계;
(c) pIVEX 플라스미드와 DNA 단편을 제한효소(restriction enzyme)와 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 재조합 플라스미드를 제조하는 단계;
(d) 상기 X형 핵산 나노 구조체, 재조합 플라스미드, 및 전사 및 번역 구성물질을 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 핵산 젤 전구체를 제조하는 단계;
(e) 초소수성 표면 위에 핵산 젤 전구체 용액을 올리고 PDMS 주형을 덮은 후 실온에서 최소 4시간 이상 반응시켜 구형으로 형성하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)에서 얻어진 구형 물질을 지질 막 성분(DOPC, DOTAP, Texas-red DHPE)으로 제작된 리포좀으로 실온에서 2시간 이상 코팅시키는 단계를 포함하는, 세포 핵 모사 무세포 단백질 합성용 구형 핵산 젤 매트릭스의 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 AcGFP 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 암 사멸 또는 혈관 생성과 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 15 항에 있어서,
상기 유전자는 hShh(Human sonic hedgehog), hTRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), hGDNF(Human glail-derived neurotrophic factor), 및 mouse-SDF1α(Stromal cell-derived factor-1α) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 홍합접착단백질(Mussel Adhesive Protein, MAP) 생산과 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 17 항에 있어서,
상기 유전자는 fp-151 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 DNA 단편은 암 줄기세포 마커인 CD44 생산과 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 DNA 단편을 포함하는 발현 플라스미드는 맥아 또는 대장균 기반(wheat germ or E. coli based system)인 pIVEX(plasmid in vitro expression vector) 인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 전사 및 번역 구성물질은 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase), ATP, NTP 혼합액, 세포 파쇄액, 및 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 지질 막 성분은 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), 및 Texas-red DHPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 인 것을 특징으로 하는, 제조방법.