JP6722951B2 - 膜タンパク質の製造方法およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、膜タンパク質の新規な製造方法、および当該製造方法によって製造された膜タンパク質を含む組成物等に関する。

各種ゲノムプロジェクトの成果に基づいて、様々な生物のゲノムにコードされているタンパク質の一次構造が明らかとなってきた。高等生物のタンパク質については、その約３０％が膜貫通ヘリックスをもつ内在性膜タンパク質であると推定されている。膜タンパク質は、細胞膜におけるシグナル伝達、物質輸送、エネルギー生産、細胞骨格形成などに関与し、創薬ターゲットとしても極めて重要である。実際、市販されている医薬品の約７０％が膜タンパク質、特にＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に作用することが知られている。膜タンパク質の創薬開発への利用や構造機能解析には高純度の大量試料が必要となるが、細胞膜に埋め込まれた状態である膜タンパク質は安定性が低く合成途中で変性しやすいなどの問題がある。

膜タンパク質の合成には、大別して、生細胞発現系を用いる方法と、無細胞の合成系を用いる方法とが存在する。生細胞発現系を用いて膜タンパク質を製造する場合、低発現、過剰発現による細胞死、または生体膜からの抽出が困難であるという問題が生ずる場合がある。例えば、大腸菌で膜タンパク質を発現させる場合は、通常、不溶性の膜タンパク質が誤って折りたたまれ凝集した封入体として得られる。このため、天然型に折りたたまれた膜タンパク質の収量が少ないといった問題がある。

他方、真核細胞で膜タンパク質を発現させる場合は、界面活性剤で可溶化した際、界面活性剤での溶解が困難な界面活性剤不溶性画分（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ-ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＤＲＭ）に膜タンパク質が脂質ラフトの構成分子と共に濃縮して回収されることが多い。ＤＲＭとは、動物細胞の細胞膜に存在する脂質ラフトのことで、スフィンゴ脂質およびコレステロールを主成分とする脂質マイクロドメインを指し、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、イオンチャンネル、クローディンファミリータンパク質等の重要な膜タンパク質が集積している。このように、界面活性剤での溶解が困難な領域に集積する膜タンパク質を可溶化する必要があるが、膜タンパク質の性質に影響の少ない（変性、立体構造不安定化などを起こしにくい）弱い界面活性剤では可溶化の効率が極めて低いことが多い。さらに、膜タンパク質の変性を引き起こすおそれのある強力な界面活性剤を使わざるを得ないことが多いゆえに、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を有する膜タンパク質の調製が困難となることが多い。

生細胞で発現させた膜タンパク質の不安定性を解消するため、特定の残基に一以上の変異を入れて膜タンパク質の立体構造の安定性を増加させる技術が報告されている（特許文献１）。しかし、そのような変異は膜タンパク質本来の立体構造を変化させ、機能に大きく影響を及ぼすことが報告されており、膜タンパク質の創薬への利用や構造機能解析において、人為的な変異は極力最小限にした方が望ましいと考えられる（非特許文献 Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＢ_２ ｉｎ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１２）。

そこで、膜タンパク質の合成において、合成条件を人為的に制御することが容易な無細胞の合成系を利用することが試みられている。無細胞の合成系を利用した膜タンパク質の合成方法として、例えば、界面活性剤の存在下において膜タンパク質を不溶化させることなく製造する方法がある（特許文献２）。この方法は、多くの膜タンパク質を可溶性画分として大量に合成できるものの、合成された膜タンパク質を再構成（リフォールディング）する必要があり、誤った折りたたみ（ミスフォールディング）の膜タンパク質が得られるなど、生体環境で適切に折りたたまれた膜タンパク質とは異なる品質である場合が多い（非特許文献 Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＢ_２ ｉｎ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ．Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１２）。

リポソームまたは脂質ベシクルを事前に調製して無細胞タンパク質合成系に添加した膜タンパク質の合成方法も報告されている（特許文献３、特許文献４、非特許文献１）。これらの方法では、一続きの閉じた脂質二重層構造をとる脂質膜を予め形成させている。このような脂質膜は、合成されたポリペプチド鎖が挿入されやすい辺縁を欠いており、全体として閉じていることから（安定的に形成している）、合成ポリペプチド鎖の脂質膜への挿入が著しく非効率であり、さらに、脂質二重層構造への挿入されやすさが個々の膜タンパク質の性質に大きく依存するため、収量および汎用性に大きな問題がある（非特許文献（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｄｒｉｖｅｓ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ５ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））。

無細胞タンパク質合成系で、アポリポタンパク質から形成させた多重螺旋タンパク質ベルト構造をとるナノディスクに、膜タンパク質を組み込ませて膜タンパク質を合成する方法も報告されている（特許文献５）。ナノディスクも、アポリポタンパク質が脂質ディスクに巻きついた構造をとる為に全体として閉じており、ポリペプチド鎖が挿入されやすい辺縁を欠いている。この方法においても、十分な収量が得られていない。また、通常、生細胞等で発現させた膜タンパク質を界面活性剤ＤＤＭ（ｎ-ｄｏｄｅｃｙｌ β-ｄ-ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）で可溶化した後にナノディスクへ再構成するが（非特許文献「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｂｉｌａｙｅｒ Ｎａｎｏｄｉｓｃｓ」、非特許文献「Ａｔｏｍｉｃ-ｌｅｖｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ-ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」）、この可溶化工程によってナノディスクに再構成された膜タンパク質に対するリガンド結合親和性が低くなることが報告されている（非特許文献「Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｎ Ａ_２Ａ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ： Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＨＡＰＳ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｓ」）。これに加え、結晶化等の用途によって膜タンパク質を囲んでいるナノディスクを界面活性剤等で取り除くことが必要であるため、構造解析等に不向きであり汎用性の点で問題がある。

脂質と界面活性剤を特定の濃度比率で混合することによって予め調製したバイセルを無細胞タンパク質合成系に添加し、膜タンパク質をバイセルに組み込ませて膜タンパク質を合成する方法（以下、「調製済みバイセル添加法」という）も報告されている（非特許文献２および３）。バイセルは、長鎖のリン脂質と短鎖のリン脂質（界面活性剤）から構成される脂質二重層構造をとるディスク状の脂質会合体である。バイセルは、長鎖リン脂質と界面活性剤とのモル比（ｑ値）または、ｑ値および長鎖リン脂質と界面活性剤の総脂質濃度（Ｃ_Ｌ値）によって大きさや形を調整し、膜タンパク質の合成を行う間、安定的に形成しているバイセルの形状が変化しないようｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値を一定に保つ必要がある。例えば、ｑ値を０．５で一定に保つ場合、Ｃ_Ｌ値は１３０ｍＭ以上でなければならない（非特許文献（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｂｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ-Ｓｔａｔｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ））。このため、反応溶液中のｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値を厳密に制御する必要がある。この理由から、非特許文献３ではバッチ法を使い、透析法を使った非特許文献２ではｑ値の変化を防ぐため外液中に内液中と等量の界面活性剤を添加している。また、用いる脂質の種類が限定されるため、種々の膜タンパク質の合成においては、汎用的でないといった問題がある（非特許文献４）。さらに、生物学的活性を有する膜タンパク質の収量が少ないといった問題も報告されている（非特許文献２）。

ステロイド系界面活性剤とリン脂質とを用いて、脂質ディスクまたはリポソーム内で折りたたまれた膜タンパク質を製造する方法（特許文献６）が報告されている。特許文献６に記載の方法では、脂質ディスクまたはリポソーム内で折りたたまれた膜タンパク質を可溶化する工程を必要とするため、膜タンパク質の収率に影響を与えうる。また、この方法は、膜タンパク質の合成反応の途中で、ステロイド系界面活性剤の濃度を低下させる必要があるため、実質的には、反応系からの除去が容易な界面活性剤、すなわち、ミセルサイズが小さく、かつ／または、臨界ミセル濃度が高い界面活性剤に実質的に限定される、という問題がある。

生体膜を構成している脂質組成は組織によって違いが見られ、脂質二重層の膜厚も組織によって異なることが報告されている（非特許文献（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ： ｔｈｅ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｍｏｄｅｌ））。このため、膜タンパク質の疎水性領域の長さと人工的に限定的な条件で調製された脂質二重層の膜厚が必ずしも一致しない場合があり、この疎水性ミスマッチの度合い等によって膜貫通ヘリックスが膜に挿入する際の配向、脂質二重膜内におけるコンフォメーション、脂質の構成、膜の曲率、膜タンパク質機能等に影響を及ぼす可能性がある（非特許文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、非特許文献（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｍｉｓｍａｔｃｈ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｌａｔｅｒａｌ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ））。非特許文献（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｄｒｉｖｅｓ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ５ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によれば、大腸菌で発現させたパピローマウイルス由来Ｅ５タンパク質（膜タンパク質）を、事前に調製したＤＭＰＣ等の脂質二重膜へ組み込ませたところ、疎水性ミスマッチによってＥ５タンパク質が凝集を起こしたことが報告されている。このことは、リポソーム、脂質ベシクル、バイセル、ナノディスク等を事前に調製して膜タンパク質を組み込ませる従来技術の適用限界を示している。

一方、膜タンパク質の折りたたみ、構造安定化、および機能は、複数種類の脂質が結合することによって調節されていることが報告されている（非特許文献５）。

日本国公表特許公報「特表２０１１−２２４０１８号公報」 日本国公開特許公報「特開２００３−１８９９９号公報」 日本国公開特許公報「特開２００５−２２５７９６号公報」 日本国公表特許公報「特表２０１０−５２４４８８号公報」 日本国公表特許公報「特表２００９−５２１２０９号公報」 国際公開番号ＷＯ２００９／０６０８５７（２００９年５月１４日国際公開）

Ｋａｌｍｂａｃｈ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ３７１， ６３９−６４８ （２００７） Ｌｙｕｋｍａｎｏｖａ Ｅ．Ｎ．ｅｔ．ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８１８， ３４９−３５８（２０１２） Ｅｖａ-Ｍａｒｉａ Ｅ．Ｕｈｌｅｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ． ２１， ２７９−２８８ （２０１２） Ｃｈｏ， Ｈ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．１１４， ９２３８−９２４５（２０１０） Ｌａｇａｎｏｗｓｋｙ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１０，１７２−１７５（２０１４） Ｈａｕｓｅｒ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５０８， １６４−１８１（２０００） Ｚｈａｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ１０３，ｎｏ．４７，１７７０７−１７７１２（２００６） Ｎａｇａｉ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７，１−７（２００７） Ａｇａｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｄｙｎａｍｉｃｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ９１４ （２０１２） Ｒａｍ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ａｃｔａ ９４０，２８９−２９４（１９８８） Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４， ４０３０−４０４０（１９９５） Ｆａｈａｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１６，１−６（２００２）

従来の無細胞タンパク質合成系における膜タンパク質の製造方法は、脂質膜（特に脂質二重膜）を人為的に成分調製して形成させておき、そこに膜タンパク質を組み込ませているが、生体環境での膜タンパク質を再現するための適切な脂質膜であるとは限らない。また、これらの脂質膜は、合成されたポリペプチド鎖が挿入されやすい辺縁を欠いており、全体として閉じていることから、合成ポリペプチド鎖の脂質膜への挿入が著しく非効率であった。この問題を解決する技術として特許文献６が報告されている。ステロイド系界面活性剤とリン脂質とを用いて、タンパク質合成と脂質二重膜形成とを同時に進行させ、脂質ディスクまたはリポソーム内で折りたたまれた膜タンパク質を製造する方法であり、収量は改善されたものの、従前の技術と同様、可溶化工程を必要とする。膜タンパク質を可溶化する際、ＤＲＭの形成に対処するため強力な界面活性剤を使わざるを得なくなる場合があり、膜タンパク質の変性を引き起こすといった問題が生じる可能性がある。このため、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を有する膜タンパク質の収量が減る原因ともなる。

このため、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を有する高純度の膜タンパク質を高収率且つ汎用性に優れた方法で合成する技術が求められている。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、界面活性剤と脂質とを共存させた無細胞タンパク質合成系において、界面活性剤濃度を初期濃度から人為的に下げることなく、膜タンパク質の翻訳開始後、該膜タンパク質のポリペプチド鎖の疎水性領域に界面活性剤および／もしくは脂質または脂質・界面活性剤混合ミセルが結合し始め、ポリペプチド鎖の疎水性領域が保護されつつ翻訳過程が進むにつれて、伸長している該ポリペプチド鎖の疎水性領域に沿い脂質と界面活性剤が疎水性相互作用、近距離相互作用、水素結合相互作用、静電相互作用等によって選択的に会合、置換または再配置を繰り返し、適切な部位に適切な脂質が選択的に結合することにより該ポリペプチド鎖の折りたたみを正しいフォームに修正しながら脂質−界面活性剤−ポリペプチド鎖の集合体を徐々に形成していき、最終産物として生体環境と同様の正しい機能構造を取った膜タンパク質に脂質および界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルとして効率良く製造できることを初めて見出した。また、従来技術で行われてきた膜タンパク質を可溶化する工程および再構成する工程を省略することに成功し、優れた品質の膜タンパク質を高収率で得ることができる技術を確立し本発明を完成した。

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る無細胞タンパク質合成系による膜タンパク質の製造方法は、（ａ）無細胞タンパク質合成反応液に、膜タンパク質をコードする鋳型核酸と、脂質と、界面活性剤と、を添加する工程、および（ｂ）上記無細胞タンパク質合成反応液における上記界面活性剤濃度を臨界ミセル濃度以上の濃度に維持した状態で上記膜タンパク質を合成する工程、を含み、上記界面活性剤と上記脂質とは、予め調製して上記界面活性剤および／もしくは上記脂質からなる脂質膜を安定的に形成させることなく、上記無細胞タンパク質合成反応液に添加することを特徴とする。

本発明の一態様に係る製造方法は、（ｃ）遠心分離後の上清から、または精製溶出液から、上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを回収する工程、をさらに含んでいてもよい。

本発明は、また、上記製造方法によって製造された、上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを提供する。

本発明によれば、膜タンパク質を可溶化する工程を不要とし、かつ、優れた品質の膜タンパク質を汎用的で且つ高収率で得ることができる、膜タンパク質の製造方法を提供することができる。

従来技術（リポソーム法）と本発明との工程の違いを示す図である。 無細胞合成条件における脂質の探索による、ヒトＧｌｃＴの発現レベルおよび比活性の改良を示す図である。ＰＣはホスファチジルコリン；ＰＥはホスファチジルエタノールアミン；ＰＩはホスファチジルイノシトール；ＰＡはホスファチジン酸：ＳＭはスフィンゴミエリン；ｌｙｓｏ−ＰＣはリゾホスファチジルコリン；ｌｙｓｏ−ＰＥはリゾホスファチジルエタノールアミン；ｌｙｓｏ−ＰＳはリゾホスファチジルセリン；Ｃｈｏｌはコレステロール；ＧａｌＣｅｒはガラクトシルセラミド；ＧｌｃＣｅｒはグルコシルセラミドである。 本発明における脂質濃度の検討を示す図である。 本発明によって製造したヒトクローディンの特性を示す図である。（ａ）本発明によって製造したヒトクローディンのＳＥＣ溶出プロファイル。ピークのＳＥＣ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＢＢ染色によって分析した。（ｂ）リポソーム法によって製造したクローディン−４と本発明によって製造したクローディン−４との特性の比較（それぞれ、レーン１〜８およびレーン９〜１４）。精製ステップにおける画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＢＢ染色によって分析した。（ｃ）センサーチップに固定化したＧＳＴタグ付加Ｃ−ＣＰＥに対する、無細胞合成したクローディン−４の表面プラズモン共鳴法による結合解析。（ｄ）１Ｍのグアニジン−ＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）の非存在下および存在下における膜タンパク質のＣＰＭアッセイを示す。（ｅ）ＣＰＭアッセイによる、ＧｎＨＣｌの非存在下（線）または存在下（点線）における、クローディン−４（灰色）およびクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体（黒色）の４０℃における熱安定性の解析。（ｆ）精製したクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体サンプルにおけるクローディン−４に結合した脂質の検出のためのＴＬＣ分析。（ｇ）クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体に対するＰＣの熱安定性効果を評価するためのＣＰＭアッセイ。（ｈ）クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体に対するＣＨＳの熱安定性効果を評価するためのＣＰＭアッセイ。１ＭのＧｎＨＣｌの非存在下（白丸）および存在下（黒三角）における各濃度でのｔ１／２値を、グラフにプロットした。 本発明によるヒトγ−セクレターゼ構成要素の製造を示す図である。（ａ）様々な種類の界面活性剤の存在下で製造したＴ４Ｌ−ＰＳ１ＮＴＦ・ＰＳ１ＣＴＦ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。Ｔ４Ｌ−ＰＳ１ＮＴＦタンパク質およびＰＳ１ＣＴＦタンパク質は、ＰＳ１ＣＴＦのＣ末端の（に付加した）ＦＬＡＧタグを用いたタグアフィニティークロマトグラフィー（０．０５％のβＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中）によって共精製した。（ｂ）Ｂｒｉｊ-７８またはジギトニンの存在下において本発明によって製造し、（ａ）と同様の方法でＦＬＡＧタグ付加ＰＳ１ＣＴＦを用いて精製した、Ｔ４Ｌ−ＰＳ１ＮＴＦ・ＰＳ１ＣＴＦ複合体およびＴ４Ｌ−ＰＳ１ＮＴＦ・ＰＳ１ＣＴＦ・Ｐｅｎ−２複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。Ｃ_１０Ｅ_５，ペンタエチレングリコールデシルエーテル；Ｃ_１０Ｅ_８，オクタエチレングリコールデシルエーテル；Ｃ_１２Ｅ_６，ヘキサエチレングリコールドデシルエーテル；Ｃ_１２Ｅ_８，オクタエチレングリコールドデシルエーテル；ＯＧ，ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ＮＧ，ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ＤＭ，ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ＵＤＭ，ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ＤＤＭ，ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ＴＤＭ，ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ＯＧ−ＮＧ，オクチルグルコースネオペンチルグリコール；ＤＭ−ＮＧ，デシルマルトースネオペンチルグリコール；ＤＤＭ−ＮＧ，ドデシルマルトースネオペンチルグリコール；ＣｙＧｌｕ−４，４−シクロヘキシル−１−ブチル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ＣｙＭａｌ−６，６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ＤＭＨＭ，２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン。 本発明によるヒトクローディン−４の界面活性剤濃度条件探索を示す図である。 調製済みバイセル添加法で一般的に用いられているＤＭＰＣ（２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とＤＨＰＣ（２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）の組み合わせが本発明にも適用できることを示す。（ａ）１０ｍｇ／ｍＬのジギトニンおよび６．７ｍｇ／ｍＬの卵黄ＰＣ、または９．５ｍｇ／ｍＬのＤＨＰＣおよび６．７ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣの存在下で製造したヒトクローディン−４のＩＭＡＣ溶出のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。（ｂ）（ａ）のデンシトメトリー解析から見積もったヒトクローディン−４の濃度。 ヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体のＸ線結晶学を示す図である。（ａ）ヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体のＳＥＣ溶出プロファイル。（ｂ）ヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の結晶。（ｃ）ＳＰｒｉｎｇ-８のＢＬ３２ＸＵを用いてヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の結晶から収集した回折画像。（ｄ）４．５Åの分解能におけるヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の初期位相の電子密度マップ。この電子密度マップはＣＯＯＴプログラム（参考文献１４）を用いて作製した。 本発明によるヒトクローディン−４の製造を示す図である。（ａ）様々な種類の非イオン性界面活性剤の存在下で本発明によって製造したヒトクローディン−４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。ヒトクローディン−４のＮ末端に付加したネイティブヒスチジンタグを利用したアフィニティークロマトグラフィー（０．０５％のβＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中）によって精製した。（ｂ）（ａ）におけるヒトクローディン−４のバンドの強度を非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値に対してプロットした図である。バンドの強度はＩｍａｇｅ Ｊ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて測定し、タンパク質の量はＢＳＡをスタンダードとして用いた検量線から見積もった。非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値はグリフィン法により算出した（ＨＬＢ値＝２０×親水部の式量の総和／分子量）。なお、ＨＬＢはＨｙｄｒｏｐｈｉｌｅ-Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅの略である。 本発明を利用したヒトＧｌｃＴの精製を示す図である。（ａ）本発明を利用し、１％ジギトニンとブタ脳ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ抽出物条件で調製したヒトＧｌｃＴの精製。各精製ステップの標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色にて分析した。（ｂ）本発明を利用して調製したヒトＧｌｃＴ最終精製標品の、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ （ＧＥ））上での溶出プロファイル。 従来技術（界面活性剤法）と本発明によるヒトクローディン−４の合成比較を示す図である。 本発明の他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。 本発明のさらに他の実施例を示す図である。

〔膜タンパク質の製造方法〕
本発明に係る膜タンパク質の製造方法は、（ａ）無細胞タンパク質合成反応液に、膜タンパク質をコードする鋳型核酸と、脂質と、界面活性剤と、を添加する工程、および（ｂ）上記無細胞タンパク質合成反応液における上記界面活性剤濃度を臨界ミセル濃度以上の濃度に維持した状態で上記膜タンパク質を合成する工程、を含んでいる。

本発明に係る膜タンパク質の製造方法において、上記界面活性剤と上記脂質とは、予め調製して上記界面活性剤および／もしくは上記脂質からなる脂質膜を安定的に形成させることなく、上記無細胞タンパク質合成反応液に添加する。

本発明の一態様において、工程（ｂ）では、膜タンパク質の翻訳開始後、ポリペプチド鎖の疎水性領域に界面活性剤および／もしくは脂質または脂質・界面活性剤混合ミセルが選択的に結合し始め、ポリペプチド鎖の疎水性領域が保護されつつ翻訳過程が進むにつれて、伸長している当該ポリペプチド鎖の疎水性領域に沿い脂質と界面活性剤が選択的に会合、置換および／または再配置を繰り返してもよい。

本発明に係る膜タンパク質の製造方法は、上記無細胞タンパク質合成反応液から上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを回収する工程、を含んでいてもよい。

本発明に係る膜タンパク質の製造方法の一態様は、（ｃ）遠心分離後の上清から、または精製溶出液から、上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを回収する工程、を含んでいてもよい。

本発明に係る膜タンパク質の製造方法の一態様は、工程（ｂ）より後に、遠心分離を行う工程を含んでいてもよい。

本発明に係る膜タンパク質の製造方法の一態様は、工程（ｂ）より後に、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ等による精製を行う工程を含んでいてもよい。

＜工程（ａ）＞
（膜タンパク質）
本明細書において「膜タンパク質」とは、脂質膜（特には脂質二重膜）と相互作用し得るタンパク質を指す。「膜タンパク質」には、膜貫通ヘリックスまたはバレル構造をもつ膜内在性タンパク質の他、パルミトイル化、ゲラニル化、またはミリストイル化等されて修飾部分が膜脂質に埋め込まれているもの、あるいは膜脂質や膜タンパク質と相互作用しているものも含まれる。例えば、膜タンパク質としては、受容体タンパク質、チャネルタンパク質、トランスポーター（輸送体タンパク質）、膜結合酵素、および細胞接着に関与するタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの膜タンパク質は細胞内へのシグナル伝達や増殖制御など生体内で重要な働きを有するものが多く、創薬のターゲットとして極めて重要である。特に膜貫通部位をもつ膜内在性タンパク質は、膜脂質に埋め込まれやすいように配列された疎水的アミノ酸配列を有するため、極めて水に溶けにくい性質を示す。組換えＤＮＡ技術を用いてこれらの膜タンパク質を異種宿主で発現させると、すぐに凝集して不溶性の沈殿を生ずるので、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を有するタンパク質を調製することが困難である。

シグナル伝達経路とは、Ｇタンパク質やｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーによって調節される医学的に重要な生物学的経路である。このシグナル伝達経路に関与するタンパク質としては、ペプチド性ホルモン、神経伝達物質、などのリガンドと結合するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質自身、ホスポリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼなどのエフェクタータンパク質、およびプロテインキナーゼＡやプロテインキナーゼＣなどがある。

膜タンパク質であるＧＰＣＲスーパーファミリーは、αヘリックスによる膜貫通部位を７ヶ所もっているので７回膜貫通型受容体とも呼ばれる。共役するＧタンパク質は通常三量体であり、α、β、γのサブユニットからなる。非常に多くのリガンドがＧＰＣＲに結合することが知られており、例えばドーパミン、アドレナリン、エンドセリン、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、味覚成分や嗅覚成分が含まれる。この受容体の活動をコントロールすることは、神経、免疫、血圧、代謝に関係する疾患の治療に有効である。真核生物のゲノム解析によって数多くの受容体が同定されており、包括的な研究手段が必要とされているが、ＧＰＣＲは７ヶ所の膜貫通領域を有するという構造上、極めて疎水性が高く従来の技術では大量発現で凝集が起こりやすいという問題がある。

その他の細胞膜受容体としては、イオンチャネル内蔵受容体（脳内のグルタミン酸受容体等）があり、トランスポーターとしては、グルコースやアミノ酸等の比較的低分子物質から、タンパク質やＤＮＡ等の比較的大きな分子を輸送するためのもの等がある。

膜結合酵素としては、上述したＧタンパク質等の細胞内へのシグナル伝達に関与する多くのタンパク質が存在し、細胞増殖の調節や細胞のガン化等に関し重要な働きをしている。

細胞接着に関与するタンパク質としては、例えばクローディンファミリータンパク質が挙げられる。クローディンファミリー４回膜貫通型タンパク質は、タイトジャンクションストランドの主要な構成要素であり、傍細胞浸透性およびバリア機能に寄与する。細胞において、クローディンは上述したＤＲＭに局在している。したがって、可溶化工程を必要とする従来の方法では、タンパク質の変性を回避するため弱い界面活性剤の選択を余儀なくされ、その結果として可溶化が不完全な状態となるため、クローディンタンパク質のファミリーを広く網羅する良質なサンプルを大量に製造することは困難である。

さらに、このような従来から公知の膜タンパク質のみならず、ゲノム情報からその存在が推測されるものの未だその機能が明らかでない新規な膜タンパク質も含まれる。

さらに、これらの部分配列、相同配列、改変配列および誘導配列であっても基本的に脂質膜と相互作用するものは、本発明の膜タンパク質に含まれる。

さらに、膜タンパク質同士の複合体および、膜タンパク質を含む膜タンパク質以外のタンパク質などからなる複合体は、本発明の膜タンパク質に含まれる。

（鋳型核酸）
無細胞タンパク質合成反応液には、目的の膜タンパク質をコードする鋳型核酸が添加されている。膜タンパク質をコードする鋳型核酸は、例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの何れかからなる任意の長さの核酸重合物である。また、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。さらに、従来から公知の任意の修飾を施されていてもよく、例えば、蛍光物質などによる標識、メチル化、キャップ構造の付加、ヌクレオチドアナログなどにより置換されていてもよい。

ＤＮＡの場合には通常二本鎖であるが、環状二本鎖でも直鎖状二本鎖でもいずれでもよく、これらは無細胞タンパク質合成系で転写および翻訳される。これらは当業者に周知であって大腸菌等を宿主とする従来の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。あるいは、宿主細胞を形質転換することなくＰＣＲ等の試験管内でのＤＮＡ増幅技術によって調製することもできる。ＲＮＡの場合には、通常一本鎖のｍＲＮＡとして用いられ、無細胞タンパク質合成系で翻訳される。これらの技術は、例えば、文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９、および、文献：Ｄ． Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ （ｅｄ．）， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， １９８５； Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ （ｅｄ．）， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９８４に記載されている。

無細胞タンパク質合成系での転写および／または翻訳に必要な配列として、例えばＴ７プロモーター等の強力なプロモーター、リボソーム結合部位、Ｔ７ターミネーター等の配列を付加することができる。また、発現した融合タンパク質の精製を効率的に行うためヒスチジン、ＳＵＭＯ、ＳｔｒｅｐＩＩ、ＧＳＴ、ＦＬＡＧなどのタグ配列を付加することもできる。また、タグ配列を切断するためのプロテアーゼ認識部位をタグ配列とタンパク質コード部位との間に挿入することもできる。

（臨界ミセル濃度）
「臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）」とは、界面活性剤の分子が集合してミセルを形成し始める濃度であり、界面活性剤固有の数値である。本明細書においては純水中におけるＣＭＣを指す。

（界面活性剤）
本明細書において「界面活性剤」とは、溶液中で界面に吸着されて、その界面の状態を著しく変える性質を示す化合物をいう。また、例えば、短鎖のリン脂質（非特許文献６）など、界面活性剤としての作用を持つものも含まれる。本発明に用いられる界面活性剤は、特に限定されない。本発明に係る製造方法では、広範な種類の界面活性剤を使用し得る。本発明に用いられる界面活性剤は、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤に大別される。

イオン性界面活性剤としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ）、２，８−ジメチル−５−ノニルホスホコリン（Ｆｏｓ ｃｈｏｌｉｎｅ ｉｓｏ-１１）、ジヘプタノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）等が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、ジギトニン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系）、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ系）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ-４０）、オクタエチレングリコールデシルエーテル（Ｃ_１０Ｅ_８）、オクタエチレングリコールドデシルエーテル（Ｃ_１２Ｅ_８）、ペンタエチレングリコールデシルエーテル（Ｃ_１０Ｅ_５）、ヘキサエチレングリコールドデシルエーテル（Ｃ_１２Ｅ_６）、オクチルテトラオキシエチレン、オクチルペンタオキシエチレン等のポリオキシエチレン系界面活性剤；オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧ−ＮＧ）、デシルマルトースネオペンチルグリコール（ＤＭ−ＮＧ）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧ）、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＵＤＭ）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ）、ドデシルマルトースネオペンチルグリコール（ＤＤＭ−ＮＧ）、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＴＤＭ）、４−シクロヘキシル−１−ブチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＣｙＧｌｕ−４）、６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＣｙＭａｌ−６）、２，６−ジメチル−４−ヘプチル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭＨＭ）、β−ヘプチルチオグルコシド（ＨＴＧ）、β−オクチルチオグルコシド（ＯＴＧ）等のグルコシド／マルトシド系界面活性剤；スクロースモノデカノエート、スクロースモノドデカノエート等が挙げられる。

界面活性剤として好ましくは、ジギトニン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系）、オクタエチレングリコールデシルエーテル（Ｃ_１０Ｅ_８）、オクタエチレングリコールドデシルエーテル（Ｃ_１２Ｅ_８）、オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧ−ＮＧ）、デシルマルトースネオペンチルグリコール（ＤＭ−ＮＧ）、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＵＤＭ）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ）、ドデシルマルトースネオペンチルグリコール（ＤＤＭ−ＮＧ）、６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＣｙＭａｌ−６）、ジヘプタノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）であり、より好ましくは、ジギトニン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系）、オクタエチレングリコールデシルエーテル（Ｃ_１０Ｅ_８）、オクチルグルコースネオペンチルグリコール（ＯＧ−ＮＧ）、デシルマルトースネオペンチルグリコール（ＤＭ−ＮＧ）、ジヘプタノイルホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）である。

界面活性剤は、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。工程（ａ）における無細胞タンパク質合成反応液において、界面活性剤の濃度は、目的の膜タンパク質の種類、界面活性剤の種類等に応じて適宜設定すればよいが、少なくとも臨界ミセル濃度以上とする。合成反応を阻害する可能性のある界面活性剤は、低い濃度、例えば臨界ミセル濃度とすることで、本発明に適用可能である。工程（ａ）における無細胞タンパク質合成反応液において、界面活性剤の濃度は、例えば、その界面活性剤の臨界ミセル濃度以上であることが好ましく、臨界ミセル濃度の１．０〜３０００倍であることがより好ましい。例えば、界面活性剤としてジギトニンを用いる場合、０．４〜３．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．８〜１．２％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。界面活性剤としてＢｒｉｊ-７８を用いる場合、０．４〜３．０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．６〜１．０％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。

「界面活性剤の濃度を臨界ミセル濃度以上の濃度に維持した状態」とは、界面活性剤の濃度が臨界ミセル濃度以上の濃度であって、ミセルまたは脂質・界面活性剤混合ミセルが互いに融合し、成長して脂質膜が安定的に形成しない濃度範囲を保った状態をいう。「脂質・界面活性剤混合ミセルが互いに融合し、成長して脂質膜が安定的に形成しない濃度範囲」とは、脂質・界面活性剤混合ミセルが成長してポリペプチド鎖が挿入されやすい辺縁の形成を妨げる、あるいは脂質と界面活性剤が選択的に会合、置換または再配置を繰り返す運動を妨げることのないように保つ濃度範囲であり、界面活性剤および脂質の種類によって異なるが、後述の実施例１で示すように数点の濃度条件を試すだけで、当業者にとって過度の負担なく見つけることも可能である。ここで、「ミセル」とは、両親媒性分子が疎水性相互作用により会合して形成される集合体を指す。「脂質・界面活性剤混合ミセル」とは、少なくとも一種類のミセル構造を形成しうる両親媒性分子を含む二種類以上の混合物によって形成され、具体的には界面活性剤と脂質との混合物によって形成される脂質−界面活性剤集合体を指す。

（脂質）
本明細書において「脂質」とは、親水性部分が外側（水相）に向かって配向し、疎水性部分が内側に向かって配向して二重層を形成しうる任意の脂肪酸誘導体を指す。また、例えば、ペプチド界面活性剤（非特許文献７および非特許文献８）など、脂質としての作用を持つもの（「脂質様物質」ともいう）も含まれる。親水性部分には、例えば、リン酸基、カルボキシル基、硫酸基、アミノ基、ニトロ基などが含まれ、疎水性部分には、例えば、長鎖（飽和／不飽和）炭化水素基、１つ以上の芳香族基、脂環式基または複素環基で置換された長鎖（飽和／不飽和）炭化水素基などが含まれる。「脂質」には、天然の脂質だけでなく、人工脂質も包含される。本発明に用いられる脂質は、特に限定されない。脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、コレステロール、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤｐＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏ−ＰＥ）、リゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏ−ＰＳ）、ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）、カルジオリピン、卵黄レシチン、大豆レシチン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、これらの水素添加物や蛍光物質や精製タグなどを標識した脂質等が挙げられる。また、ブタ脳由来脂質抽出物など、様々な脂質の混合物も適用可能である。

脂質は、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。このため、生体機能を担持した膜タンパク質合成に重要である、膜タンパク質毎に適切な脂質を複数種類選択・組み合わせることが可能である。これら脂質の使用量は、目的のタンパク質の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、重量比で工程（ａ）における界面活性剤の０．０２５〜２．０倍であることが好ましい。また、本発明によれば、後述の実施例に示すとおり、複数種類の脂質から選択した適切な脂質を用いるだけでなく、多種多様の脂質が含まれている脂質混合物を反応液に加えて膜タンパク質に脂質を（場合によっては複数種類の脂質を）選択させる、あるいは膜タンパク質に選択させて結合している脂質混合物由来の未知の脂質を分析することによって同定した脂質を用いる、あるいは文献などによって明らかになっている既知の脂質を用いることなどの対応により、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を有する高収率・高純度の膜タンパク質を得ることが可能である点で従来技術と大きく異なる。

本発明の脂質・界面活性剤混合ミセルは、バイセル（非特許文献９〜１２）と異なり、脂質と界面活性剤とを組み合わせる際に脂質−界面活性剤の鎖長の長さやｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値を考慮する必要はない。また、脂質と界面活性剤とを均一に混合するために行う加熱−冷却−ボルテックスミキサーのサイクルを繰り返す工程（非特許文献９）も不要である。このように、本発明の脂質・界面活性剤混合ミセルとバイセルとは大きく異なるが、本発明において、バイセル調製に用いられる脂質と界面活性剤との組み合わせを用いることもできる。このような組み合わせの具体例としては、長鎖リン脂質（ＤＭＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１−ミリストイル−２−［４−（４−ビフェニル）ブタノイル］−ｓｎグリセロ−３−ホスホコリン（ＴＢＢＰＣ）など）と、界面活性剤としての短鎖リン脂質（ＤＨＰＣ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなど）との組み合わせが挙げられる。

なお、当然のことながら、バイセル調製に用いられる脂質と界面活性剤との組み合わせを本発明に用いる場合、予めバイセルを調製する必要や、予めｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値を設定する必要はない。また、組み合わせの濃度は後述の実施例１で示す濃度毎の探索を行うことにより選択すればよい。

（無細胞タンパク質合成系）
本発明の方法に使用する無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液および／または合成に必要な試薬を含む無細胞タンパク質合成反応液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系であり、このような合成系としては、例えば、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系でもよい。ＤＮＡを鋳型として用いる場合には、ＰＣＲ等の試験管内での増幅反応により、従来必要とされたクローニングという煩雑な操作を経ることなく、多数の鋳型ＤＮＡを同時並行的に迅速に調製することができる。

上記細胞抽出液としては、リボソーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に必要な成分を含む真核細胞または原核細胞の抽出液が使用可能である。前記真核細胞および原核細胞としては従来公知のものが何れも使用可能であり、具体的に例示すれば、大腸菌、好熱性細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞および出芽酵母などが挙げられ、特に大腸菌由来のもの（例えば大腸菌Ｓ３０細胞抽出液）または高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものが高い合成量を得る点において好ましい。該大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９（ｒｎａ、ｍｅｔ）、ＢＬ２１、ＢＬ２１ｓｔａｒ、ＢＬ２１コドンプラス株等から公知の方法（文献：Ｐｒａｔｔ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ - ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， （１９８４）， ｐｐ．１７９-２０９， Ｈｅｎｅｓ， Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ， Ｓ．Ｊ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ参照）に従って調製できるし、あるいはプロメガ社やノバジェン社他から市販されているものを使用してもよい。

大腸菌Ｓ３０抽出液の具体的な調製方法としては、最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素またはマイナス８０℃にて保存する。

本発明における無細胞タンパク質合成反応液には、大腸菌Ｓ３０等の細胞抽出液の他に、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の鋳型、膜タンパク質をコードする鋳型核酸（ｍＲＮＡ等）、界面活性剤、脂質、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、緩衝液、塩類、アミノ酸、核酸分解酵素の阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型とする場合）および／またはｔＲＮＡ等を含むことができる。その他、ＡＴＰ再生系、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ＃８０００）、３’、５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、酸化／還元調整剤、酵素、小胞、タンパク質シャペロン、シグナル識別粒子等および／または他の試薬を含むことができる。これらの合成反応系は当業者に周知であり、文献で報告されている。

緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類としては、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩等）、グルタミン酸塩等が使用でき、抗菌剤としてはアジ化ナトリウム、アンピシリン等が使用可能である。またＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等の市販の酵素を使用してもよい。

本発明において、ＡＴＰ再生系としては好ましくは０．０２〜５μｇ／μＬのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と１０〜１００ｍＭのクレアチンホスフェート（ＣＰ）との組合せが挙げられるが、これに限定されるものではなく、従来公知の材料が何れも使用可能であり、上記以外に例えば１〜２０ｍＭのホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）と０．０１〜１μｇ／μＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）との組合せ等が使用可能である。これらＰＫおよびＣＫは何れもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれＰＥＰおよびＣＰを基質として必要とする。

＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、上述の無細胞タンパク質合成系において膜タンパク質を合成する。このとき、無細胞タンパク質合成反応液における界面活性剤の濃度を、臨界ミセル濃度以上の濃度に維持した状態にする。これにより、脂質・界面活性剤混合ミセルが形成されるが、ミセルまたは脂質・界面活性剤混合ミセルが互いに融合しないため安定的に形成した脂質膜へと成長しないと考えられる。安定的に形成した脂質膜には脂質ベシクル、リポソーム、ナノディスク、バイセルなどが含まれる。ここで、「安定的に形成した」とは、一続きの脂質二重膜で形成されており、全体として閉じている構造状態をいう。このような脂質膜は合成されたポリペプチド鎖が挿入されやすい辺縁を欠いており、翻訳されたポリペプチド鎖が挿入しにくくなり、脂質・界面活性剤混合プロテオミセルの形成が極めて非効率であると考えられる。例えば、バイセルは、平面部に長鎖リン脂質が存在して二重層構造を形成し、リム部辺縁は界面活性剤によって安定化されている。脂質と界面活性剤との組み合わせ並びにｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値によってバイセルを安定的に形成させるため、性質が多様な膜タンパク質毎に適切な脂質等を選択する上で制約がある。さらに、辺縁が安定化されているため翻訳されたポリペプチド鎖が挿入しにくくなる可能性がある。ナノディスクは、アポリポタンパク質が脂質ディスクに巻きついた構造をとり、全体として閉じている。このため、翻訳されたポリペプチドが挿入しにくくなる。脂質・界面活性剤混合ミセルが互いに融合し、成長して大きな脂質膜（リポソーム）が安定的に形成される場合は、夾雑物が脂質膜中に封入された状態で沈殿する確率が高くなるといった問題が生じる。また、沈殿したプロテオリポソームを可溶化する工程が精製工程の前に必要となるため、膜タンパク質の形成に、その結合が重要な脂質が引きはがされることにより膜タンパク質の品質が損なわれる、膜タンパク質の機能や構造が破壊される、あるいはＤＲＭの形成に対処するため強力な界面活性剤を使わざるを得なくなり膜タンパク質の変性を引き起こすといった問題が生じる可能性があり、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を有する膜タンパク質の収量が減る原因ともなる。なお、リポソームは、例えば、脂質共存下において界面活性剤濃度を徐々に低下させることにより、脂質膜が成長していき安定的に形成される。本発明では、界面活性剤濃度を臨界ミセル濃度以上で維持しており、膜タンパク質に適切な脂質を選択（結合）させながら脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを形成させていることから、人為的にリポソームへと成長させている方法とは異なる。また、事前に調製した脂質ベシクル、リポソーム、バイセルなどとも異なることは言うまでもない。

本発明では、無細胞タンパク質合成反応液における界面活性剤濃度を、ミセルまたは脂質・界面活性剤混合ミセルが互いに融合して脂質膜が安定的に形成しない濃度範囲で維持することにより、膜タンパク質の翻訳開始後、該膜タンパク質を構成するポリペプチド鎖の疎水性領域に界面活性剤および／もしくは脂質または脂質・界面活性剤混合ミセルが結合し始め、ポリペプチド鎖の疎水性領域が保護されつつ翻訳過程が進むにつれて、伸長している該ポリペプチド鎖の疎水性領域に沿い脂質と界面活性剤が疎水性相互作用、近距離相互作用、水素結合相互作用、静電相互作用等によって選択的に会合、置換および／または再配置を繰り返し、適切な部位に適切な脂質が結合することにより該ポリペプチド鎖の折りたたみを正しいフォームに修正しながら脂質−界面活性剤−ポリペプチド鎖の集合体を徐々に形成していき、膜タンパク質が正しいフォームを形成するために必要最小限の脂質−界面活性剤集合体に包み込まれた脂質・界面活性剤混合プロテオミセルの状態で最終産物が効率良く得られると考えられる。工程（ｂ）における合成反応前の界面活性剤濃度および合成反応終了後の界面活性剤濃度は、臨界ミセル濃度以上の濃度であれば特に限定されない。「脂質と界面活性剤が選択的に会合、置換および／または再配置を繰り返す」とは、膜タンパク質の疎水性領域に界面活性剤または脂質分子が会合（結合）し、結合している界面活性剤に脂質分子が会合し、該膜タンパク質の構造安定性または機能調節に重要な部位に結合する脂質が界面活性剤と置き換わる、および／または結合した脂質がより適切な部位に結合している界面活性剤と置き換わり再配置される運動を繰り返すことを指す。これによって、膜タンパク質の正しいコンフォメーション形成に関わっている脂質や機能調節に関わっている脂質が、それぞれ該膜タンパク質の特異的な位置へ選択的に結合すると考えられる。

「脂質・界面活性剤混合プロテオミセル」とは、脂質および界面活性剤が膜タンパク質の周りを包み込んだ脂質−界面活性剤集合体を指す。ここで、「包み込む」とは、翻訳が進むにつれて伸長している膜タンパク質のポリペプチド鎖の疎水性領域に沿い脂質と界面活性剤が選択的に会合、置換および／または再配置を繰り返しながら脂質・界面活性剤・膜タンパク質の集合体が徐々に形成されることをいう。一方、「組み込む」とは、予め安定的に形成されている脂質膜または人為的により安定的に形成させた脂質膜に膜タンパク質が挿入されることをいう。したがって、本発明は、予め調製して形成させたリポソーム（非特許文献１）、バイセル（非特許文献２、非特許文献３）、脂質ベシクル（特許文献４）およびナノディスク（特許文献５、非特許文献８）に膜タンパク質を組み込む従来技術とは大きく異なる。従来技術は、バイセルなどの脂質膜環境の安定性向上に向けた技術開発が行われてきたが、本発明ではミセルまたは脂質・界面活性剤混合ミセルが互いに融合し、成長して脂質膜が安定的に形成しない臨界ミセル濃度以上の濃度を維持する点で全く異なる。

膜タンパク質、脂質分子、界面活性剤分子が自発的に集合体を形成し自己組織化する過程において、膜タンパク質の構造安定性または機能調節に重要な部位に結合している界面活性剤と脂質とが置き換わる現象は驚くべき発見であった。

工程（ｂ）における無細胞タンパク質合成反応液において、界面活性剤の濃度は、例えば、その界面活性剤の臨界ミセル濃度以上であることが好ましく、臨界ミセル濃度の１．０〜３０００倍であることがより好ましい。工程（ａ）および工程（ｂ）における界面活性剤の濃度は、臨界ミセル濃度以上の濃度である限り、特に限定されない。

無細胞タンパク質合成系は、バッチ法、フロー法、透析法、その他公知の技術（例えば、文献：Ｓｐｉｒｉｎ， Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２１７， １２３-１４２， １９９３参照）のいずれもが適用可能である。透析法を用いる場合には、透析膜（限外濾過膜）を介して内液と外液とを隔離して含む振とうまたは攪拌可能な透析法が好ましい。透析装置としては、例えば、ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）、Ｓｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、またはＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）等を用いることができる。本発明者により改良された透析法を用いる無細胞タンパク質合成系の詳細は文献：特開２０００−１７５６９５号公報に開示されており、その内容は参照により本出願に組み込まれる。透析法で行う場合には、例えば、透析膜を通過しない界面活性剤を選択する、あるいは透析膜のポアサイズを調整して界面活性剤が通過しないようにする、あるいは内液中へ界面活性剤を補充する（例えば、滴定による）、あるいは外液へ界面活性剤を添加する等によって、内液中の界面活性剤濃度を臨界ミセル濃度以上の濃度に維持することができる。

＜工程（ｃ）＞
本発明に係る膜タンパク質の製造方法では、上記無細胞タンパク質合成反応液から、工程（ｂ）において製造された、脂質−界面活性剤集合体内に包み込まれた状態の上記膜タンパク質を回収することができる。一例では、遠心分離および／または精製（例えば、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ等による）等を行うことによる。

本発明に係る製造方法の一態様では、工程（ｂ）において製造された、上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを直接精製することによって、脂質・界面活性剤混合プロテオミセルの状態で該膜タンパク質を分離することができる。なお、精製工程の前に遠心分離工程を含めてもよい。

遠心分離を行う際の遠心力は特に限定されないが、脂質−界面活性剤集合体に包み込まれなかった膜タンパク質の凝集物等の不要な成分をより多く分離する観点から、５，０００ｇ以上であることが好ましい。

遠心分離を行う際の温度は特に限定されないが、膜タンパク質の品質の観点から、４〜３０℃であることが好ましく、４〜１０℃であることがより好ましい。また、遠心分離を行う時間は特に限定されないが、微粒子除去と作業効率の兼ね合いから、１分〜１６時間であることが好ましい。

本発明に係る製造方法では、脂質−界面活性剤集合体内に包み込まれた状態の膜タンパク質が脂質・界面活性剤混合プロテオミセルとして得られ、遠心分離の上清に分離される。そのため、本発明に係る製造方法では、遠心分離の上清から上記膜タンパク質を回収することができる。

特許文献６に記載の技術では、膜タンパク質が含まれるプロテオリポソームは、遠心分離の沈殿に分離される。プロテオリポソームから膜タンパク質を回収するためには、遠心分離後に可溶化を行う必要がある。また、可溶化の前に密度勾配分画による純化を行う場合もある。一方で、本発明の製造方法では、膜タンパク質は上清から回収されるため、可溶化が不要である。また、カラム精製、磁気ビーズ等による精製が容易である為、密度勾配分画による純化工程も不要である。したがって、本発明では、このような工程が不要である分、収率が高くなる上、時間を短縮することができる。可溶化は脂質膜に組み込まれた膜タンパク質の一部を脂質膜から露出させることによって行われるため、均質性が低下する虞がある。しかしながら、本発明に係る製造方法では、可溶化を行わないため、均質な膜タンパク質を得ることができる。また、弱い結合力で膜タンパク質に結合している脂質を解離させることなく正しいフォールディングを維持したままにすることができ、本来の機能を正しく発揮し得る。したがって、本発明は、優れた品質（より正しいフォールディング、より正しい機能、高純度、高均質性など）の膜タンパク質を大量に必要とする、膜タンパク質の結晶構造解析、膜タンパク質をターゲットとする薬剤のスクリーニング、膜タンパク質の工業的生産、抗体医薬の開発（抗原としての利用）等において特に有用であり得る。

回収した膜タンパク質は、精製工程に供してもよい。これにより遠心分離の上清に含まれている不要な成分を取り除くことができるため、より純度を高くすることができる。精製は、例えば、タグアフィニティーカラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、等のカラムクロマトグラフィーによって行うことができる。また、磁気ビーズ等の磁性微粒子技術を用いてもよい。

膜タンパク質に精製タグを付加している場合には、精製タグを切除する工程を含んでいてもよい。精製タグを切除することによって、膜タンパク質はより正しい立体構造をとり得る。

〔膜タンパク質の利用および応用〕
本発明に係る製造方法によって製造された膜タンパク質は、上述のように優れた品質を有し得る。本発明に係る製造方法により製造された膜タンパク質は、脂質−界面活性剤集合体に包み込まれた状態で活性を有し得る。したがって、本発明では、脂質−界面活性剤集合体内に包み込まれた状態の膜タンパク質を含む組成物が提供される。

本発明に係る製造方法は、生体内で機能する構造・活性が反映され、かつ安定化された膜タンパク質を大量に調製するために有用である。合成された膜タンパク質は、そのままの状態で機能解析研究や構造解析研究に使用することができる。機能解析研究としては、脂質二重膜を介した物質移動やリガンドとの結合を検出することによって膜タンパク質の活性を測定することができる。この機能解析技術は、受容体タンパク質の酵素活性やリガンドとの結合性を指標とするハイスループットスクリーニングに用いることができる。例えば、ぺプチド、タンパク質、または化合物のコンビナトリアルライブラリーを用いて受容体タンパク質に作用する物質を同定する。ＧＰＣＲに結合する特定のリガンドの結合を実証し、またはその阻害剤、競合剤を同定するために種々のリガンド分子を放射性同位元素、蛍光物質または発光化合物等で標識し受容体タンパク質との結合を解析することができる。

膜タンパク質の構造解析研究としては、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析、小角Ｘ線分散（ＳＡＸＳ）、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＴ）等により行うことができるがこれらに限定されない。Ｘ線回折を行うための結晶化は、脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを用いても、さらに精製を行なうことによっても可能である。リン脂質二重膜に受容体タンパク質を存在させた状態で当該タンパク質を結晶化させるための種々の方法も報告されている（例えば、文献：特開２００６−２１９４０１号公報参照）。このようにして得られた膜タンパク質の構造の情報は、例えば、ドラッグデザインに利用することができる。

本発明に係る製造方法によって製造された膜タンパク質は、抗体医薬の製造における抗原として利用することもできる。膜タンパク質を脂質膜に組み込んだ状態で抗原として利用すれば、より正確にフォールディングしているため、生体に適用した場合により効果の高い抗体を得ることができる。また、本発明に係る製造方法によって製造された膜タンパク質は、そのような抗体のスクリーニングに利用することもできる。

また、本発明に係る製造方法によって製造された膜タンパク質は、純度が高く、不純物が少ないため、ライブラリーを用いた薬剤探索において信頼性の高い結果を得ることができる。

また、本発明の他の実施形態において、膜タンパク質としてウイルスタンパク質や癌抗原を発現させることができ、これらを含む免疫原性組成物はワクチン成分として使用することができる。ウイルスタンパク質としては、ヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０、単純ヘルペスウイルスのエンベロープグリコプロテイン、ＳＡＲＳウイルスのスパイクタンパク質、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン等が挙げられる。免疫応答が助けになる抗原には細菌等の病原体や腫瘍細胞表面の膜タンパク質も含まれる。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

なお、実施例において使用した試薬の入手先は以下のとおりである。ジギトニンは和光純薬工業（株）から購入した。コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＳ）およびほとんどの界面活性剤はＡｎａｔｒａｃｅ社から購入した。Ｂｒｉｊ-３５、Ｂｒｉｊ-５８、Ｂｒｉｊ-７８、コレステロール、３−ｓｎ−ホスファチジン酸（ＰＡ）、Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）および７−ジエチルアミノ−３−（４−マレイミドフェニル）−４−メチルクマリン（ＣＰＭ）は、シグマアルドリッチ社から購入した。Ｌ−α−リゾホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏ−ＰＥ）、Ｌ−α−リゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏ−ＰＳ）およびＬ−α−リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）は、Ｏｌｂｒａｃｈｔ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）および天然脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社から購入した。ペンタエチレングリコールデシルエーテル（Ｃ_１０Ｅ_５）、オクタエチレングリコールデシルエーテル（Ｃ_１０Ｅ_８）、ヘキサエチレングリコールドデシルエーテル（Ｃ_１２Ｅ_６）およびオクタエチレングリコールドデシルエーテル（Ｃ_１２Ｅ_８）は、日光ケミカルズ（株）から購入した。分子内消光蛍光ペプチドプローブＮｍａ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｖａｌ-Ｖａｌ-Ｉｌｅ-Ａｌａ-Ｔｈｒ-Ｖａｌ-Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）-Ｄ-Ａｒｇ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｄ-Ａｒｇ-ＮＨ_２、およびＧＸＧＤプロテアーゼ阻害剤（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）_２ケトンは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入した。Ｘ線結晶学のための試薬およびツールは、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社から購入した。グラジェントポリアクリルアミドゲルＸＶＰＡＮＴＥＲＡ Ｇｅｌ １０-２０％は、ＤＲＣ社から購入した。他の全ての化学物質は、ナカライテスク（株）から購入した。

〔実施例１〕
１．界面活性剤の種類および濃度の選択
本実施例では、界面活性剤の種類および濃度の選択方法を示す。なお、本選択方法によって得られた好ましい界面活性剤濃度は、脂質・界面活性剤混合ミセルが成長して脂質膜が安定的に形成しない濃度範囲を指す。

（ヒトγ−セクレターゼ複合体の例）
ヒトγ−セクレターゼ複合体は、アルツハイマー病に関連するアミロイド−βペプチドを生成する膜内プロテアーゼである（参考文献６）。この巨大な膜タンパク質複合体（約１７０ｋＤａ）は４つのサブユニットからなる。９回膜貫通型プレセニリン−１（ＰＳ１）触媒サブユニットは、２回膜貫通型プレセニリン促進タンパク質２（Ｐｅｎ−２）と相互作用すると考えられている（参考文献７）。本発明により、様々な界面活性剤条件についてＰＳ１ＮＴＦおよびＰＳ１ＣＴＦを共発現させ、ＰＳ１ＮＴＦ・ＰＳ１ＣＴＦ複合体を形成させて試験した結果、いくつかの好ましい界面活性剤条件を同定した（図５の（ａ））。さらに、これら界面活性剤条件において、本発明によるＰＳ１ＮＴＦ、ＰＳ１ＣＴＦおよびｈＰｅｎ−２の共発現により、ＰＳ１ＮＴＦ・ＰＳ１ＣＴＦ・Ｐｅｎ−２複合体が形成された（図５の（ｂ））。

（ヒトクローディンファミリータンパク質の例）
ヒトクローディンファミリー４回膜貫通型タンパク質は、タイトジャンクションストランドの主要な構成要素であり、傍細胞浸透性およびバリア機能に寄与する。本実施例では、本発明によりヒトクローディンファミリー４回膜貫通型タンパク質を発現させ、様々な界面活性剤の探索を行った（図９）。その結果に基づき、収量の多かったジギトニン（図６の（ａ））およびＢｒｉｊ-７８（図６の（ｂ））の存在下で本発明の方法を用いてヒトクローディン−４タンパク質を製造した。そして、タグアフィニティークロマトグラフィー（０．０５％のβＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中）によって精製し、合成に好ましい界面活性剤濃度を選択した（図６の（ｃ））。

（トランスポーターＡの例）
本実施例では、イオン性界面活性剤を使用した場合でも膜タンパク質の合成が可能であることを示す。イオン性界面活性剤１％ＣＨＡＰＳと卵黄ＰＣ６．７ｍｇ／ｍＬの混合物を添加した条件下で４時間、本発明の方法によって、トランスポーターＡを製造した。反応前後の合成液を、１００，０００ｇ遠心で分画しＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｎ末端にＮ１１タグを持つトランスポーターＡを、ＨｉｓＰｒｏｂｅを用いたウエスタンブロッティングにより分析した。図１２の矢印は、合成したトランスポーターＡのバンド（約１５ｋＤａ）を示している。

（界面活性剤組み合わせによる膜タンパク質合成の例）
卵黄ＰＣ６．７ｍｇ／ｍＬと界面活性剤０．５％のＢｒｉｊ-７８と０．５％のジギトニンあるいは０．５％ＣＨＡＰＳとの混合物を添加した条件下で４時間、本発明の方法によって、トランスポーターＡを製造した。反応液を、遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画した。上清画分と沈殿画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１３の矢印は、合成したトランスポーターＡのバンドを示している。

なお、限られた脂質の種類から選択した脂質と界面活性剤との割合（ｑ値）または、ｑ値および長鎖リン脂質と界面活性剤の総脂質濃度（Ｃ_Ｌ値）で形成させるバイセルの場合、本実施例で示すような、適切な界面活性剤の探索、および以下の実施例で示す適切な脂質の探索を行って、目的の膜タンパク質に適した脂質と界面活性剤との組み合わせを絞り込むことは不可能である。

２．適切な脂質条件の選択
膜タンパク質の種類によっては、構造安定性および正しい機能のために、特定の脂質を場合によっては複数種類必要とするものが知られている（非特許文献５、参考文献１および参考文献２）。本実施例では、適切な脂質条件の選択方法を示す。

（脂質濃度探索方法：ヒトクローディンファミリータンパク質の例）
実施例１−１．の界面活性剤探索結果に基づき、収量の高かった１％ ジギトニンおよび１％ Ｂｒｉｊ-７８、ならびにその比較対象として収量が無かった０．２％ ジギトニンおよび０．２％ Ｂｒｉｊ-７８を用いて、本発明でのヒトクローディン−４合成における、各界面活性剤条件の卵黄ＰＣ濃度の検討を行った（図３）。合成反応５時間後の反応液を、１００，０００ｇ遠心で分画した。遠心分画前の反応液（Ｔ）および１００，０００ｇ上清画分（Ｓ）について、Ｎ末端にＮ１１タグを持つヒトクローディン−４をＨｉｓＰｒｏｂｅにてウエスタンブロッティングにより分析した。図３の（ｅ）は、ジギトニン条件（ａ）および（ｂ）の１００，０００ｇ上清画分に含まれるヒトクローディン−４をＮｉ-ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （ＧＥ）にて精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色にて分析したゲル画像を示す。黒い矢頭はヒトクローディン−４のバンドを示している。また、合成反応液中の界面活性剤と脂質との割合（重量比）も記載されている。図３の（ｆ）は、（ｅ）と同様に、Ｂｒｉｊ-７８条件（ｃ）および（ｄ）の１００，０００ｇ上清画分に含まれるヒトクローディン−４の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像を示す。

（脂質濃度探索方法：トランスポーターＡの例）
反応液中に、１−２０ｍｇ／ｍＬ卵黄ＰＣ、大腸菌脂質またはモノオレインと界面活性剤（１％のＢｒｉｊ-７８）を加え、３時間合成反応を行った。反応液を、遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画した。上清画分と沈殿画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１４の矢印は、合成したトランスポーターＡのバンドを示している。

（適切な脂質の探索方法：ヒトグルコシルセラミドシンターゼ（ＧｌｃＴ）の例）
グルコシルセラミドシンターゼ（ＧｌｃＴ）は、糖脂質の生合成における最初の酵素として機能する推定３回膜貫通型タンパク質である（参考文献４）本試料を用いて、様々な脂質について、ＧｌｃＴ生成レベルおよび酵素活性（参考文献５）に対する影響を指標として探索を行った（図２の（ａ））。卵黄ＰＣは一般的に無細胞タンパク質合成系で脂質として用いられている。グルコシルセラミドは、スフィンゴ糖脂質の一種であり、スフィンゴ糖脂質は脳組織に豊富に含まれていることが知られている。また、多くのスフィンゴ糖脂質は、グルコシルセラミドを出発物質として合成されることから、本実施例では、ブタ脳由来の脂質混合物からＧｌｃＴに適した脂質の探索を行った。卵黄ＰＣ（図２の（ａ）および（ｂ）のレーン「ＰＣ」）と比較して、ブタ脳由来の脂質混合物ではＧｌｃＴの比活性が顕著に増加した。また、卵黄ＰＣ（９５％）にＰＡまたはコレステロール（５％）を加えた場合でも比活性の増加の程度は低かった。それに対して、ブタ肝臓脂質混合物またはリゾＰＣ（５％）と卵黄ＰＣ（９５％）との存在下で合成した場合、合成は認められなかった。次に、ブタ脳脂質混合物を用いて合成されたＧｌｃＴの精製サンプルにおける結合脂質をＭＳ／ＭＳ分析することによって、比活性の増加に貢献する脂質の種類の同定を試みた。その結果、主要な脂質であるＰＣ（３４：１）およびＰＣ（３６：１）に加えて、ヘキソシルセラミドが検出された（図２の（ｃ））。このヘキソシルセラミドは、脳脂質混合物における主要なヘキソシルセラミドであるガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）であると推定された。実施例６で、ＧａｌＣｅｒを用いたＧｌｃＴの製造結果を示す。また、予め脂質候補を予測するのが困難な場合、実施例６で示すように様々な種類の脂質が含まれる脂質混合物を使って、適切な脂質類を目的の膜タンパク質に選択（結合）させることが可能である。このように、生物学的な活性を有し、かつ正確な立体構造を形成するのに必要な脂質を膜タンパク質に選択させながら合成する方法はこれまで報告されていない。

（適切な脂質の探索方法：ヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の例）
タンパク質複合体形成に不可欠な脂質の選択も重要である。本実施例では、クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体に結合し安定性を高める脂質の同定方法を示す。

卵黄ＰＣとコレステロール、ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）と卵黄ＰＣ、ブタ肝臓と卵黄ＰＣを用いて合成したクローディン−４のＮ末端のＮ１１タグを、透析バッファーＡ（０．０５％のβＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０））に対して透析しながら、４℃で一晩、Ｈｉｓタグ付加ＴＥＶプロテアーゼを用いた消化によって切断した。Ｎ１１タグフラグメントおよびＨｉｓタグ付加ＴＥＶプロテアーゼをリバースＩＭＡＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ＩＭＡＣ）によって除去し、タグの付いていないクローディン−４をフロースルー画分および洗浄画分から回収した。得られたクローディン−４を精製した過剰量のＣ−ＣＰＥと混合し、４℃で１時間インキュベートして、クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体を形成させた。この複合体をＣ−ＣＰＥのＮ１１タグによりＮｉ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅレジンに吸着させ、洗浄バッファーＢ（０．０２５％のＣ_１２Ｅ_８、０．００２％のＣＨＳおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、溶出バッファーＢ（０．０２５％のＣ_１２Ｅ_８、０．００２％のＣＨＳ、５００ｍＭのイミダゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で溶出させた。複合体の精製後、透析バッファーＢ（０．０２５％のＣ_１２Ｅ_８、０．００２％のＣＨＳおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））に対して透析しながら、Ｃ−ＣＰＥのＮ１１タグを、４℃で一晩、ＴＥＶプロテアーゼを用いた消化によって切断した。Ｎ１１タグフラグメントを上述と同様に除去した。最後に、ランニングバッファー（０．０２５％のＣ_１２Ｅ_８および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））中、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００）を用いてサンプルを分画し、タンパク質複合体の単分散ピーク中に分離した。なお、Ｃ−ＣＰＥは、Ｎ末端にＮ１１タグおよびＦＬＡＧタグ、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位およびＧＳＳＧＳＳＧリンカー配列を融合し、界面活性剤および脂質の非存在下で、無細胞タンパク質合成系で合成したものを用いた。３０μｇの精製したクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体から、クロロホルム／メタノール（２：１（ｖ／ｖ））を用いて脂質を抽出し、これらの脂質抽出物をＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社）上にスポットした。クロロホルム、メタノール、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸、および水（７５：４５：８０：２０：１３：６（ｖ／ｖ））を含む移動相で脂質を分離し、リンモリブデン酸試薬（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて検出した。

ＴＬＣ分析の結果、クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体精製標品から、結合脂質としてＰＣが検出された（図４の（ｇ））。また、クローディン−４が局在する膜ドメインに多く含まれるコレステロールについても、ＰＣと同様にＣＰＭアッセイを用いて、クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体に対する安定化効果を調べたところ、添加量に依存した効果が示された（図４の（ｈ）白丸）。このことから、クローディン−４の無細胞合成および精製では、本実施例で特定された適切なＰＣまたはコレステロール／ＣＨＳを系に添加している。

〔実施例２〕
本実施例では、界面活性剤の濃度条件が臨界ミセル濃度以上の濃度であれば特に限定されず、膜タンパク質を合成できることを示す。

（界面活性剤濃度：臨界ミセル濃度の１−３倍の例）
膜タンパク質であるチャネルＡを用いて、５時間合成反応を行った。反応液中には、終濃度４．３ｍｇ／ｍｌ ブタ脳脂質と界面活性剤であるＤＤＭ（１ｘＣＭＣ： ０．００８７％、１．５ｘＣＭＣ： ０．０１３％、２ｘＣＭＣ： ０．０１７％、２．５ｘＣＭＣ： ０．０２２％、３ｘＣＭＣ： ０．０２６％）が含まれている。反応液を、遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。図１５の矢印は、製造したチャネルＡのバンド（約２２ｋＤａ）を示している。

（界面活性剤濃度：臨界ミセル濃度の３０００倍の例）
合成反応を４時間の条件で行った。反応液中には、終濃度４．３ｍｇ／ｍｌ ブタ脳脂質と界面活性剤（３％ ＬＭＮＧ）が含まれている。反応液を、遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。図１６の矢印は、製造した膜タンパク質（トランスポーターＡ（ＴＡ）、チャネルＡ（ＣＡ））のバンドを示している（ＭはＭｏｃｋ）。

〔実施例３〕
本実施例では、遠心分離を行う際の遠心力条件は特に限定されず、膜タンパク質を製造できることを示す。

卵黄ＰＣ６．７ｍｇ／ｍＬと１％のＢｒｉｊ-７８の混合物を添加した条件下で４時間、本発明の方法によって、トランスポーターＡを製造した。反応液を、５，０００ｇあるいは２００，０００ｇ、１５分で分画した。上清画分と沈殿画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１７の矢印は、発現したトランスポーターＡのバンドを示している。

〔実施例４〕
本実施例では、遠心分離を行わず精製工程のみで膜タンパク質を製造できることを示す。

（アフィニティークロマトグラフィーによる精製工程の例）
卵黄ＰＣ６．７ｍｇ／ｍＬと１％のＢｒｉｊ-７８の混合物を添加した条件下で４時間、本発明の方法によって、トランスポーターＡを製造した。遠心未分離反応液のＮｉ-ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （ＧＥ）にて精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色にて分析したゲル画像を示す。図１８の矢印は、発現したトランスポーターＡのバンドを示している。

（磁性微粒子技術による精製工程の例）
卵黄ＰＣ６．７ｍｇ／ｍＬと１％のＢｒｉｊ-７８の混合物を添加した条件下で４時間、本発明の方法によって、トランスポーターＡを製造した。遠心未分離反応液のＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ （ＧＥ）にて精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色にて分析したゲル画像を示す。図１９の矢印は、発現したトランスポーターＡのバンドを示している。

〔実施例５〕
本実施例では、遠心分離温度および遠心分離時間条件は特に限定されず、膜タンパク質を製造できることを示す。卵黄ＰＣ６．７ｍｇ／ｍＬと１％のＢｒｉｊ-７８の混合物を添加した条件下で４時間、本発明の方法によって、トランスポーターＡを製造した。反応液を、１、１５分、１６時間（１００，０００ｇ、４℃）、または１５分（１００，０００ｇ、３０℃）で分画した。上清画分と沈殿画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図２０の矢印は、発現したトランスポーターＡのバンドを示している。

〔実施例６〕
（ヒトクローディン−４の合成）
本発明によるヒトクローディン−４の合成を行った。ＴＥＶプロテアーゼ認識部位およびＦＬＡＧタグをコードする配列を３’末端に付加したことを除き、ヒトクローディン−４（残基１〜１８３）をコードする遺伝子をサブクローニングした。Ｔ４ファージリゾチーム−クローディン−４融合タンパク質（Ｔ４Ｌ−クローディン−４）を公知の方法（参考文献８）に従って作製し、更にＴＥＶ部位およびＦＬＡＧタグをＣ末端側に付加した。コレステロール（５％（ｗ／ｗ））と卵黄ＰＣ（９５％（ｗ／ｗ））から構成される脂質混合物６．７ｍｇ／ｍＬとジギトニン１０．０ｍｇ／ｍＬとの混合物を添加した条件下で３０℃において５時間、本発明の方法によって、クローディン−４およびＴ４Ｌ−クローディン−４を製造した。セレンで標識したサンプルを、反応液および供給溶液中のメチオニンをセレノメチオニンに置き換えた以外、ネイティブなタンパク質と同様に製造した。この反応液中で合成したクローディン−４を１００，０００ｇ上清において回収し、Ｎｉ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーレジンに吸着させ、洗浄バッファーＡ（０．０５％のβＤＤＭ、０．００２％のＣＨＳ、２０ｍＭのイミダゾールおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、次いで、同じ緩衝液に５００ｍＭのイミダゾールを含む溶出バッファーで溶出させた。

（５種類のクローディンタンパク質合成及び精製の結果）
上記方法で合成した５種類のクローディンタンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。その結果、５つ全てのクローディンサンプルにおいて高い合成レベルを示し、ＳＥＣ解析により、ほとんど凝集することなく単分散していることがわかった（図４の（ａ））。したがって、本実施例では、本発明の方法が、大量調製が困難であるクローディンファミリーメンバーの多くに適用可能であることを示している。

〔実施例７〕
（ヒトクローディン−４とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシン（ＣＰＥ）との相互作用）
食中毒性のバクテリアＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓはエンテロトキシン（ＣＰＥ）を分泌するが、ＣＰＥは非常に高い親和性でヒトクローディン−４をターゲットとする（参考文献９）。本実施例では、推定クローディン−４結合部位を含むＣＰＥの残基１８５〜３１９からなるＣ末端フラグメント（Ｃ−ＣＰＥ）に対するヒトクローディン−４の親和性を、表面プラズモン共鳴によって測定した。測定されたＫ_Ｄ値は３．４ｎＭであった（図４の（ｃ））。この値は細胞ベースのアッセイによって得られた値とほとんど同じである。

〔実施例８〕
（ＣＰＭアッセイによるクローディン−４の熱安定性の分析）
精製された膜タンパク質の構造完全性および安定性は、ＣＰＭアッセイによって評価することが望ましい。このアッセイにおいて、４０℃における分析物の熱変性は、７−ジエチルアミノ−３−（４−マレイミドフェニル）−４−メチルクマリン（ＣＰＭ）色素（露出したシステイン残基（存在する場合に）と反応する）の蛍光によってモニターする。４０℃における熱変性のｔ_１／２値が１７分以上である場合、膜タンパク質は十分に安定しているとみなされる（参考文献３）。理論上、安定な膜タンパク質ほどｔ_１／２値が長い。しかしながら、発明者らは、ミスフォールディングに起因する膜タンパク質の強固な凝集によってもｔ_１／２値が長くなることも見出した。したがって、所望の安定性と望ましくない凝集とを区別するために、１Ｍのグアニジン−ＨＣｌ（ＧｎＨＣｌ）の非存在下および存在下における膜タンパク質のＣＰＭアッセイを比較した。正しく折りたたまれたタンパク質は、１ＭのＧｎＨＣｌ存在下でより短いｔ_１／２値を示す（図４の（ｄ）、ケース１）一方で、強固な凝集はそのような違いを示さない（図４の（ｄ）、ケース２）。したがって、ＣＰＭアッセイによって精製したサンプルの状態および安定化因子の効果を最終的に評価することが可能である。

そこで、精製したヒトクローディン−４の構造完全性および安定性をＣＰＭアッセイによって試験した。ＧｎＨＣｌの非存在下および存在下におけるクローディン−４のｔ_１／２値は、４０℃で、それぞれ２７分および１５分であった（図４の（ｅ）灰色点線）。これは、本発明によって合成されたこのサンプルが十分に安定で完全な構造を有していることを示す。クローディン−４とＣ−ＣＰＥとの複合体のｔ_１／２値は、ＧｎＨＣｌの非存在下および存在下において、それぞれ、７０分および２３分であった（図４の（ｅ）黒色点線）。さらに、実施例１で同定した適切な脂質であるＰＣをサンプルに添加したところ、ＣＰＭアッセイにおけるｔ_１／２値が１．７倍に向上した（図４の（ｇ）黒色点線）。具体的な方法を以下に示す。

Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ（参考文献２）の手順を改良してＣＰＭアッセイを行った。反応開始前に、１００μＬの反応バッファー（０．０５％のβＤＤＭ、０．０２％のＣＨＳおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、変性剤として０．２Ｍのグアニジン−ＨＣｌ（ＧｎＨＣｌ）含有または非含有の、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０または８．０））を９６ウェルの黒プレート（Ｎｕｎｃ社）に１００μＬずつ入れ、測定開始まで２５℃に維持した。精製したタンパク質サンプルを反応バッファーで０．０５ｍｇ／ｍＬに希釈し、氷上で別の９６ウェルプレートに２４０μＬずつ入れた。ブランクのウェルには、同量の反応バッファーを入れた。反応バッファー中の０．４ｍｇ／ｍＬのＣＰＭを全てのウェルに２４μＬずつ添加し、１０回ピペッティングして混合し、氷上で１５分間インキュベートした。混合物の一部（１００μＬ）を黒プレートのウェルに移し、１０回ピペッティングして混合し、すぐに測定を開始した。３５５ｎｍにおいて励起し４６０ｎｍにおいて発光する蛍光を、ＡｒｖｏＸ３ 蛍光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、４０℃において４〜６時間、１分毎に測定した。ＣＰＭ蛍光強度が最大値の半分になる時間と定義されるｔ_１／２値を、各蛍光強度曲線においてｔ_１／２値に近い直線領域から算出した。

〔実施例９〕
（ヒトクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の結晶化および構造決定）
本実施例では、本発明によって合成した膜タンパク質が高品質であることを、クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体が約４Åの分解能で回折する結晶を得ることに成功した例によって示す（図８の（ａ）〜（ｃ））。具体的な方法を以下に示す。

精製した複合体を、タンパク質１ｍｇあたり０．０５ｍｇの卵黄ＰＣと共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで、タンパク質溶液１ｍＬあたり２５μＬのＢｉｏｂｅａｄｓ ＳＭ２（Ｂｉｏ-Ｒａｄ社）と共に、４℃で１時間インキュベートした。０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過してＢｉｏｂｅａｄｓを除去した。このサンプルを、１０，０００-Ｄａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ-ｏｆｆ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）がセットされたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ-４フィルターを用いて約２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。また、Ｔ４Ｌ−クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体を、実施例１に示すクローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体と同様の方法で製造したものを結晶化に用いた。

クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体およびＴ４Ｌ−クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体を、それぞれ同じ方法で結晶化した。６〜８ｍｇ／ｍＬの処理前のタンパク質サンプルおよび濃縮したタンパク質サンプルを、０．７５％のＣ_１２Ｅ_８および１０ｍＭの還元型グルタチオンを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の３．６〜１０．０ｍｇ／ｍＬの脂質懸濁物中でインキュベートした。この際、クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体にはコレステロール／スフィンゴミエリン／卵黄ＰＣ（７．５：２．５：９０（ｗ／ｗ））を用い、Ｔ４Ｌ−クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体には卵黄ＰＣを用いた。氷上で１時間インキュベートした後、サンプルを等量のリザーバー溶液と混合した。クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体のリザーバー溶液は、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０、５〜７％（ｖ／ｖ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール、０．００２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ_３、０．０００５％（ｗ／ｖ）の２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む７５ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５〜６．０）である。Ｔ４Ｌ−クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体のリザーバー溶液は、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０、７〜１０％（ｖ／ｖ）の１，６−ヘキサンジオール、０．００２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ_３、０．０００５％（ｗ／ｖ）の２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを含む７５ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．０〜５．５）である。結晶化のスクリーニングを、１５℃において、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって行った。約２週間後に結晶が出現し、約１〜２ヶ月で５０×５０×５０μｍ^３以上まで成長した。結晶を１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを添加したリザーバー溶液に１時間ソーキングし、クライオループに載せて、冷却窒素ガス中で急速冷却した。ＭＸ２２５ＨＥ ＣＣＤ検出器を備えるＳＰｒｉｎｇ-８のＢＬ３２ＸＵ（参考文献１０、参考文献１１）またはＢＬ４１ＸＵを用いて、１００Ｋのクライオストリーム中で、結晶のＸ線回折データを収集した。結晶のＳＡＤデータは、波長０．９７９３Åで収集した。約２４０の回折画像を各結晶から収集し、画像データをＨＫＬ-２０００（参考文献１２）またはＸＤＳ（参考文献１３）で処理した。クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の結晶は、空間群：Ｃ２、格子定数：ａ＝１２６．９Å、ｂ＝４６．５Å、ｃ＝１６０．４Å、β＝１１１．４°であった。Ｔ４Ｌ−クローディン−４・Ｃ−ＣＰＥ複合体の結晶は、空間群：Ｐ４_３、格子定数：ａ＝ｂ＝１０５．９Å、ｃ＝２２４．３Åであった。

〔実施例１０〕
本実施例では、上記で示した膜タンパク質以外の膜タンパク質種にも適用可能であることを示す（図２１）。反応液中には、終濃度４．３ｍｇ／ｍｌ ブタ脳脂質と界面活性剤（１％ Ｂｒｉｊ−７８）が含まれている。反応液を遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。図２１の矢印は、膜貫通受容体であるＧＰＣＲ１＿１（５４．５ｋＤａ）、ＧＰＣＲ１＿２（４７．７ｋＤａ）、ＧＰＣＲ１＿３（６４．７ｋＤａ）、ＧＰＣＲ１＿４（４５．５ｋＤａ）のバンドを示している。

〔実施例１１〕
（従来技術との比較１）
本実施例では、特許文献６に記載の方法（以下、「リポソーム法」という）および特許文献２に記載の方法（以下「界面活性剤法」という）との比較実験を示す。

改変したネイティブポリヒスチジンタグ（Ｎ１１、ＭＫＤＨＬＩＨＮＨＨＫＨＥＨＡＨＡＥＨ）アフィニティータグをＮ末端に融合したクローディン−４を、リポソーム法および本発明によって合成する比較実験を行った。リポソーム法では、本発明と同様に、無細胞タンパク質合成反応液に脂質および界面活性剤を添加するが、膜タンパク質を合成と同時に、透析法等によって界面活性剤濃度を低下させることにより脂質・界面活性剤混合ミセルを脂質膜（リポソーム）へと安定的に形成させ、合成しながら膜タンパク質をリポソームの脂質二重膜環境に挿入し、遠心分離等により沈殿物として回収した後、密度勾配遠心によって分画する工程および可溶化工程を経て精製する。一方、本発明では、合成された膜タンパク質が、脂質・界面活性剤混合ミセルに包み込まれ、遠心分離を行う場合は上清として回収した後、精製するため、密度勾配分画工程および可溶化工程における膜タンパク質のロスを防ぐことが可能である。リポソーム法と本発明の工程の違いを図１に示す。

リポソーム法では、クローディン−４を含むリポソームを、グリセロール密度勾配分画法によって精製し（図４の（ｂ）のレーン４およびレーン５）、βＤＤＭによって可溶化した後、合成産物をタグ（金属）アフィニティー法によって精製した。本発明では、クローディン−４を含む脂質・界面活性剤混合ミセルを、直接タグ精製した。図４の（ｂ）に示すとおり、リポソーム法による生産レベルは、本発明と同程度であったが（図４の（ｂ）のレーン２およびレーン１０）、βＤＤＭによる可溶化効率は低く、製造されたクローディン−４のほとんどが密度勾配分画工程および可溶化工程で失われた（図４の（ｂ）のレーン６）。それに対して、本発明では密度勾配分画工程および可溶化工程が必要ないため（図４の（ｂ）のレーン１１）、無細胞合成液１ｍＬあたりの、タグアフィニティーで精製したクローディン−４の最終的な収率において、リポソーム法では０．１１ｍｇ、本発明では０．３８ｍｇの顕著な差が見られた（図４の（ｂ）、レーン８およびレーン１４）。さらに、本発明によって製造したクローディン−４サンプルを用いて、クローディン−４の三次構造を認識するモノクローナル抗体を効率よく得ることができた。

（従来技術との比較２）
実施例１で同定したＧａｌＣｅｒなどの脂質を用いて、リポソーム法でＧｌｃＴを製造した。ＧａｌＣｅｒ（５％）、コレステロール（５％）および卵黄ＰＣ（９０％）の存在下で製造したサンプルが他の脂質と比較して、劇的に増加した生産レベルおよび顕著に高まった比活性を観察した（図２の（ｄ）および（ｅ））。ＧａｌＣｅｒはリポソーム法の可溶化工程後にも強く結合していることから、ＧａｌＣｅｒはＧｌｃＴに特異的に結合する脂質の一つであることが分かった。一方、ブタ脳脂質混合物を用いた場合、約２．７倍高い特異的活性観察された。この結果から、ＧａｌＣｅｒ以外にもＧｌｃＴに結合する未知の脂質が一つまたは複数存在すると考えられるが、ＧａｌＣｅｒに比べて結合が弱いことから可溶化工程で解離したと考えられる。また、ブタ脳脂質混合物を用いてリポソーム法で製造したＧｌｃＴは、ＤＤＭのような緩和な界面活性剤での可溶化効率が著しく悪かった（図２の（ｆ））。これは、ブタ脳脂質混合物に含まれる、ＧａｌＣｅｒなどのスフィンゴ脂質やコレステロールにより形成された脂質マイクロドメイン（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ-ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ，ＤＲＭ）内にＧｌｃＴが埋め込まれている為である。ＤＲＭは緩和な界面活性剤では溶かし難く、ＤＲＭ内に埋め込まれた状態で発現させる膜タンパク質の生産には不向きであるといえる。なお、ＤＲＭは、リポソーム法に限られる問題ではなく、従来技術に代表される可溶化工程を必要とする膜タンパク質合成方法全てに共通する課題だと考えられる。

そこで、本発明によりブタ脳脂質混合物を用いてＧｌｃＴを製造した。本発明では、図１０の（ａ）に示すようにリポソーム法と比較して高い収量のＧｌｃＴが得られ、数回のクロマトグラフィー工程後に均質なＧｌｃＴを精製することができた（図１０の（ｂ））。このことは、密度勾配分画工程および可溶化工程を必要としない本発明が、密度勾配分画工程および可溶化工程における収量ロスを防ぎＤＲＭの問題も生じさせることなく製造できる優位性を示す。また、未知の脂質を含む脂質混合物を用いて膜タンパク質に適切な脂質を選択（結合）させることができ、さらに、目的の膜タンパク質合成後に直接精製しても、弱い結合力で膜タンパク質に結合している脂質を解離させることなく製造できる優位性を示す。

（従来技術との比較３）
界面活性剤法において、大腸菌無細胞合成反応液には界面活性剤が含まれているが、脂質は含まれていない。合成された膜タンパク質は、遠心分離により上清においてプロテオミセルとして回収される。この界面活性剤法を用いた場合、タンパク質合成収率は見かけ上高いが、リポソーム法および本発明と比較して、合成されたタンパク質の構造的な均一性および安定性が劣る場合がほとんどである。

界面活性剤法では１％のＢｒｉｊ-７８を、本発明では１％のＢｒｉｊ-７８および０．６７％の卵黄ＰＣを用いてヒトクローディン−４の比較合成実験を行った（図１１の（ａ）〜（ｃ））。図１１の（ａ）の点線および実線は、界面活性剤法および本発明によって合成されたタンパク質のＳＥＣ溶出プロファイルを示す。図１１の（ｂ）は、ＣＢＢ染色したＳＥＣ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。図１１の（ｃ）は、ＳＥＣピーク画分を用いたプルダウンアッセイによるＧＳＴタグ付加Ｃ−ＣＰＥとのＣ−ＣＰＥ結合分析を示す。これらの結果から、本発明が界面活性剤法と比較して、正しい構造を持ったヒトクローディン−４をより多く合成できることを示した。

〔実施例１２〕
本実施例では、調製済みバイセル添加法で一般的に用いられているＤＭＰＣ（２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とＤＨＰＣ（２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）との組み合わせをも本発明にも適用できることを示す（図７）。図７の（ａ）は、１０ｍｇ／ｍＬのジギトニンおよび６．７ｍｇ／ｍＬの卵黄ＰＣ、または９．５ｍｇ／ｍＬのＤＨＰＣおよび６．７ｍｇ／ｍＬのＤＭＰＣの存在下でヒトクローディン−４を製造し、ＩＭＡＣ溶出したＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。図７の（ｂ）は、（ａ）の濃度解析から見積もったヒトクローディン−４の濃度を示す。この結果から、本発明でもＤＭＰＣとＤＨＰＣの組み合わせが本発明に適用可能であることが示されたが、卵黄ＰＣとジギトニンの組み合わせに比べて合成量が落ちている。これは、ＤＭＰＣがヒトクローディン−４の合成に最適な脂質で無いことに起因していると考えられる。またこの結果は、選択可能な脂質の種類が限られ、さらにｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値で規定する必要がある調製済みバイセル添加法の膜タンパク質合成における技術的な限界を示すものである。

〔実施例１３〕
本実施例では、ＤＭＰＣ（２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）とＤＨＰＣ（２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）との組み合わせを用いて、非特許文献２および非特許文献３で用いられているｑ値＝０．５の条件で、予め形成させたバイセルを大腸菌無細胞合成反応液に添加して膜タンパク質を合成する調製済みバイセル添加法と、同じＤＭＰＣ／ＤＨＰＣ濃度条件下で膜タンパク質を合成する本発明との比較を行った。図２２の（ａ）では、通常用いられる方法によって予め調製したバイセルを反応液に添加し、４時間合成反応を行ってチャネルＡを合成した。合成後の反応液を、遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画し、上清画分と沈殿画分を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。図２２の（ｂ）では、本発明の方法によって、予めバイセルを形成させることなくＤＭＰＣおよびＤＨＰＣを反応液に添加し、４時間合成反応を行ってチャネルＡを合成した。合成後の反応液を、遠心（１００，０００ｇ、１５分）で分画し、上清画分と沈殿画分を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。検出された上清画分のチャネルＡバンドの割合をそれぞれ定量化した結果、調製済みバイセル添加法（図２２の（ａ））と比較して本発明（図２２の（ｂ））の収量が約２０％多かった。

ところで、様々なｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値で調製したバイセルに関する報告は沢山あるが、バイセルを無細胞タンパク質合成系に添加する膜タンパク質合成方法は非特許文献２および非特許文献３のみであり、いずれもｑ値＝０．５でバイセルを調製している。非特許文献（「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆａｓｔ-Ｔｕｍｂｌｉｎｇ Ｂｉｃｅｌｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」）によれば、ｑ値＝０．５の場合、バイセルの形状は温度および総脂質濃度に対して非依存的に安定であることが報告されている。

一方、本発明の方法は、脂質と界面活性剤とを組み合わせる際に脂質−界面活性剤の鎖長やｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値を考慮する必要はないが、非特許文献２および非特許文献３との対比を明確にするため、広範囲な濃度をカバーするＤＭＰＣとＤＨＰＣを添加し（４時間合成反応、遠心（１００，０００ｇ、１５分））、得られたＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２２の（ｃ））と（図２２の（ｂ））の膜タンパク質収量を比較した。その結果、大幅に膜タンパク質の収量が増加するＤＭＰＣ／ＤＨＰＣ濃度条件が存在することが確認された（図２２の（ｃ）左から４番目のレーン：６２％増）。この結果は、調製済みバイセル添加法がｑ値または、ｑ値およびＣ_Ｌ値の制約によって、必ずしも最適でない条件下（ｑ値＝０．５）で膜タンパク質合成を強いられている可能性があることを示す。対照的に本発明では調製済みバイセル添加法のような制約が無いことから、幅広い脂質と界面活性剤の条件から最適な条件を見つけ出して膜タンパク質合成が可能である点で優位性がある。

〔実施例１４〕
サイズの小さいバイセルは磁場に対して等方的（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ）になる性質があり、溶液ＮＭＲで高分解能測定が可能となることから、小型バイセル（以下、「ｉｓｏｔｒｏｐｉｃバイセル」という）はＮＭＲによる膜タンパク質構造解析に適することが報告されている（非特許文献「Ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｂｉｃｅｌｌｅｓ： Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｆｏｒ ｈｉｇｈ-ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」）、（非特許文献「Ｄｅｔａｉｌｅｄ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ-Ｂｏｕｎｄ Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ａ Ｕｓｉｎｇ Ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ Ｂｉｃｅｌｌｅｓ」）。ｉｓｏｔｒｏｐｉｃバイセルの定義は文献によってまちまちであるが、ｑ値が０．０５から０．５の範囲で形成することが報告されており（非特許文献（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｂｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ-Ｓｔａｔｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ｑ値が０．２５から０．５のｉｓｏｔｒｏｐｉｃバイセルが溶液ＮＭＲ解析用に最も多く利用されている（非特許文献「Ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ＮＭＲ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、非特許文献「Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ Ｍｕｌｔｉ-Ｓｐａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、非特許文献「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｌａｙｅｒ ｍｉｍｉｃｓ- ｓｍａｌｌ ｉｓ ｂｅａｕｔｉｆｕｌ， ｂｕｔ ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｂｉｇｇｅｒ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ」）。

一方、ｑ値が０．５であるｉｓｏｔｒｏｐｉｃバイセルであって、Ｃ_Ｌ値が１％以下の場合、全ての短鎖リン脂質が解離してバイセルが崩壊し、長鎖リン脂質のみから構成される脂質ベシクルが形成されることが報告されている（特許文献「Ｂｉｃｅｌｌｅｓ ｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」）。そこで、本実施例では、ＤＭＰＣとＤＨＰＣとのモル比（バイセルではｑ値と呼ぶ）を、０．５よりも更に低い０．３以下、Ｃ_Ｌ値が１％であるバイセルが形成されない条件下において、本発明によって膜タンパク質の製造が可能であることを示す。ｑ値＝０．０５、０．１、０．２、０．２５、０．３およびＣ_Ｌ値＝１％の条件で、実施例１３記載の実験方法でチャネルＡを合成した。その結果、全てのＤＭＰＣ／ＤＨＰＣ条件で、チャネルＡを製造できることが確認された（図２３）。この結果は、本発明が調製済みバイセル添加法とは異なることを示す。

〔実施例１５〕
さらに、本実施例では、ｉｓｏｔｒｏｐｉｃバイセルが形成する下限値（ｑ値＝０．０５）よりも低いＤＭＰＣ／ＤＨＰＣモル比条件下において、本発明によって膜タンパク質の製造が可能であることを示す。実施例１３記載の実験方法で、チャネルＡを合成した。その結果、全てのＤＭＰＣ／ＤＨＰＣ条件で、チャネルＡを製造できることが確認された（図２４）。

〔まとめ〕
なお、実施例の記載は、本発明の膜タンパク質を合成することができるいくつかの方法の例にすぎず、これらの反応に用いる脂質および界面活性剤の種類ならびに添加量を様々に変更することは可能であり、それらの変更は本出願に含まれる開示を参照すれば、当業者が連想できるものである。

したがって、特許請求の範囲の記載に加えて、他の側面における本発明の１つの実施形態は、「膜タンパク質をコードするポリペプチドと、脂質と、界面活性剤と、を含む無細胞タンパク質合成系で膜タンパク質が可溶性画分に回収されうる反応条件を選択する工程、ここで、当該膜タンパク質は、リポソームよりも小さな脂質・界面活性剤混合ミセルに包み込まれることにより可溶性の状態にあり、前記選択された反応条件を用いて膜タンパク質を合成する工程、及び前記可溶性画分から回収された膜タンパク質を精製する工程を含むことを特徴とする。」
本実施形態では、目的とする膜タンパク質に適した脂質および界面活性剤の種類を選択することができ、また、その添加濃度も最適化することが可能である。これにより、可溶性画分に回収された膜タンパク質は、脂質・界面活性混合プロテオミセルに包み込まれた状態で正しい立体構造を形成した均質な分子として得ることができる。これを用いて公知の方法により容易に、高純度、高品質な免疫原として抗体取得への応用が可能となり、また、高品質の膜タンパク質結晶を取得することができる。さらに、精製した後の膜タンパク質をリポソームなどの大きな脂質二重層に再構成することも可能であり、生細胞と同様の環境で当該膜タンパク質の機能を解析することもでき、新規医薬化合物のスクリーニングや生体機能の分析又は診断装置の開発等の産業分野で有用である。

〔参考文献〕
１ ：Ｏｐｅｋａｒｏｖａ， Ｍ． ＆ Ｔａｎｎｅｒ， Ｗ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐｉｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ--ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １６１０， １１-２２ （２００３）．
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９：Ｓｏｎｏｄａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｒｅｍｏｖｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｕｄｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｎｄｓ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌａｕｄｉｎｓ ｉｎ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｂａｒｒｉｅｒ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７， １９５-２０４ （１９９９）．
１０ ：Ｈｉｒａｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ ｍｉｃｒｏ-ｂｅａｍ ｂｅａｍｌｉｎｅ ａｔ ＳＰｒｉｎｇ-８， ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏ-ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ． ＡＩＰ Ｃｏｎｆ． Ｐｒｏｃ． １２３４， ９０１-９０４ （２０１０）．
１１ ：Ｈｉｒａｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏ-ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｔ ＳＰｒｉｎｇ-８ ｂｅａｍｌｉｎｅ ＢＬ３２ＸＵ． Ｊ． Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｆ． Ｓｅｒ． ４２５， ０１２００２ （２０１３）．
１２ ：Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ， Ｚ． ＆ Ｍｉｎｏｒ， Ｗ． Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｘ-ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ３０７-３２６ （１９９７）．
１３ ：Ｋａｂｓｃｈ， Ｗ． ＸＤＳ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６６， １２５-１３２ （２０１０）．
１４ ：Ｅｍｓｌｅｙ， Ｐ．， Ｌｏｈｋａｍｐ， Ｂ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｗ．Ｇ． ＆ Ｃｏｗｔａｎ， Ｋ． Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６６， ４８６-５０１ （２０１０）．

本発明によれば、優れた品質の膜タンパク質を高収率で得ることができるため、ドラッグデザイン、抗体医薬、および薬剤探索等の医薬分野等に利用することができる。

Claims (3)

1. 無細胞タンパク質合成反応液に、膜タンパク質をコードする鋳型核酸と、脂質と、界面活性剤と、を添加する工程（ａ）、および、
   上記無細胞タンパク質合成反応液における上記界面活性剤濃度を臨界ミセル濃度以上の濃度に維持した状態で上記膜タンパク質を合成する工程（ｂ）を含み、
   ここで、上記界面活性剤と上記脂質とは、予め調製して上記界面活性剤および／もしくは上記脂質からなる脂質膜を安定的に形成させることなく、上記合成反応液に添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系による膜タンパク質の製造方法。
2. 下記の更なる工程を含んでなる、請求項１に記載の製造方法：
   （ｃ）遠心分離後の上清から、または精製溶出液から、上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセルを回収する工程。
3. 請求項１または２に記載の製造方法によって製造された、上記膜タンパク質に上記脂質および上記界面活性剤が結合した脂質・界面活性剤混合プロテオミセル。