JP2000175695A - 無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法 - Google Patents
無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法Info
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- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 無細胞タンパク質合成系において、従来法と
比べて、より短時間に、より高い合成量かつより低コス
トでポリペプチドを合成するための方法を提供するこ
と。 【解決手段】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成系
によるポリぺプチドの製造方法において、濃縮細胞抽出
液を含む無細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドを
コードする核酸の翻訳又は転写／翻訳を介して該ポリペ
プチドを生成し、該ポリペプチドを回収することを含む
方法。
比べて、より短時間に、より高い合成量かつより低コス
トでポリペプチドを合成するための方法を提供するこ
と。 【解決手段】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成系
によるポリぺプチドの製造方法において、濃縮細胞抽出
液を含む無細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドを
コードする核酸の翻訳又は転写／翻訳を介して該ポリペ
プチドを生成し、該ポリペプチドを回収することを含む
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、透析法を用いた無
細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法に
関する。
細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液
を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。細
胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網赤血
球由来のものが使用される。無細胞タンパク質合成系
は、系を容易に改変することができるため、目的のタン
パク質に適した発現系を構築しやすい。また、ＰＣＲを
用いて作成したリニアＤＮＡを鋳型として用いることが
できる。これにより、生細胞による発現系にて必要とさ
れた、ベクターへのライゲーション、トランスフォーメ
ーション、培養、集菌、溶菌といった時間と手間のかか
る工程が一切不要となり、短時間で容易にタンパク質を
発現することができる。しかし、タンパク質合成量が少
ない欠点があり、応用が限られていた。
を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。細
胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網赤血
球由来のものが使用される。無細胞タンパク質合成系
は、系を容易に改変することができるため、目的のタン
パク質に適した発現系を構築しやすい。また、ＰＣＲを
用いて作成したリニアＤＮＡを鋳型として用いることが
できる。これにより、生細胞による発現系にて必要とさ
れた、ベクターへのライゲーション、トランスフォーメ
ーション、培養、集菌、溶菌といった時間と手間のかか
る工程が一切不要となり、短時間で容易にタンパク質を
発現することができる。しかし、タンパク質合成量が少
ない欠点があり、応用が限られていた。
【０００３】無細胞タンパク質合成系の合成量改善は１
９６０年代に合成系が発表されてから今日まで続けられ
てきた。合成系が開発された当時の試験管内での反応法
（バッチ法）の無細胞タンパク質合成系はタンパク質合
成量が少なく、ラジオアイソトープ標識により発現が確
認できる程度のものであった。合成量改善の歴史で一大
転機となったのは１９８８年Ｓｐｉｒｉｎらによるフロ
ー法の開発である（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４
２，１１６２−１１６４；特表平１−５０３１１９号公
報）。これは、タンパク質合成のための基質であるアミ
ノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ等をポンプにより連続的に供給
し、同時に限外濾過膜を介して流出した反応液より反応
産物の回収を連続的に行うという方法である。フロー法
によりそれまで数時間で停止していた合成反応の継続時
間が数十時間に延長された。これに伴いタンパク質の合
成量は飛躍的に増大し、１ｍｌの反応液あたり１００μ
ｇのタンパク質の生産が可能となった。この結果を受け
て、無細胞タンパク質合成系はタンパク質の発現系とし
て注目を浴びることになる。その後、いくつかのグルー
プによりフロー法の報告がなされた（特開平４−２００
３９０号公報）。しかし、フロー法にはタンパク質合成
量の割に大量の基質が必要である、膜が目詰まりして反
応が停止しやすい、特殊な装置が必要であるという問題
点があった。
９６０年代に合成系が発表されてから今日まで続けられ
てきた。合成系が開発された当時の試験管内での反応法
（バッチ法）の無細胞タンパク質合成系はタンパク質合
成量が少なく、ラジオアイソトープ標識により発現が確
認できる程度のものであった。合成量改善の歴史で一大
転機となったのは１９８８年Ｓｐｉｒｉｎらによるフロ
ー法の開発である（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４
２，１１６２−１１６４；特表平１−５０３１１９号公
報）。これは、タンパク質合成のための基質であるアミ
ノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ等をポンプにより連続的に供給
し、同時に限外濾過膜を介して流出した反応液より反応
産物の回収を連続的に行うという方法である。フロー法
によりそれまで数時間で停止していた合成反応の継続時
間が数十時間に延長された。これに伴いタンパク質の合
成量は飛躍的に増大し、１ｍｌの反応液あたり１００μ
ｇのタンパク質の生産が可能となった。この結果を受け
て、無細胞タンパク質合成系はタンパク質の発現系とし
て注目を浴びることになる。その後、いくつかのグルー
プによりフロー法の報告がなされた（特開平４−２００
３９０号公報）。しかし、フロー法にはタンパク質合成
量の割に大量の基質が必要である、膜が目詰まりして反
応が停止しやすい、特殊な装置が必要であるという問題
点があった。
【０００４】近年、透析膜を介した拡散により、基質を
供給しながら同時に合成を行うシステムが報告された。
Ｋｉｍ とＣｈｏｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏ
ｇ．１９９６，１２，６４５−６４９）は、透析膜を底
に張ったチャンバーを開発し、このチャンバーを基質溶
液に漬けてタンパク質合成を行った。Ｄａｖｉｓら（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ Ｎｕｍ
ｂｅｒ ５６， １９９６， ｐ．１４−１８， Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、市販の透析
ユニットを利用しこれにより、フロー法と比較して簡便
な装置を用いて合成反応持続時間の延長が可能であるこ
とが示された。
供給しながら同時に合成を行うシステムが報告された。
Ｋｉｍ とＣｈｏｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏ
ｇ．１９９６，１２，６４５−６４９）は、透析膜を底
に張ったチャンバーを開発し、このチャンバーを基質溶
液に漬けてタンパク質合成を行った。Ｄａｖｉｓら（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ Ｎｕｍ
ｂｅｒ ５６， １９９６， ｐ．１４−１８， Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、市販の透析
ユニットを利用しこれにより、フロー法と比較して簡便
な装置を用いて合成反応持続時間の延長が可能であるこ
とが示された。
【０００５】装置の変更だけでなく、細胞抽出液や組成
の変更による合成量改善法も検討された。反応に用いる
細胞抽出液を限外濾過遠心により濃縮することにより、
合成速度の向上が報告されている（Ｎａｋａｎｏら，Ｂ
ｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
５８，６３１−６３４；Ｋｉｍら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６（１９９６））。ま
た、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系において、Ａ
ＴＰ再生系として従来用いられていたホスホエノールピ
ルベート（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の組
合わせを、クレアチンホスフェート（ＣＰ）とクレアチ
ンキナーゼ（ＣＫ）の組み合わせに変更し、さらに、そ
の他の反応液組成の最適化によりバッチ法でも１ｍｌの
反応液あたり数百μｇ（Ｙａｂｕｋｉら，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，１１：
２９５−３０６，１９９８）の生産量である。ここで、
ＰＥＰ、ＣＰはいずれもＡＴＰ再生のための基質であ
り、またＰＫ、ＣＫはいずれもＡＤＰをＡＴＰに再生す
る酵素である。ＰＫ、ＣＫはそれぞれＰＥＰ、ＣＰを基
質として必要とする。現在までに、無細胞タンパク質系
で得られた最大の合成量はＫｉｍとＣｈｏｉ（上掲）に
よる１４時間で１．２ｍｇ／ｍｌである。合成速度は１
時間あたり約８０μｇ／ｍｌで、使用した基質１ｍｌあ
たりの合成量は約１００μｇであった。
の変更による合成量改善法も検討された。反応に用いる
細胞抽出液を限外濾過遠心により濃縮することにより、
合成速度の向上が報告されている（Ｎａｋａｎｏら，Ｂ
ｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
５８，６３１−６３４；Ｋｉｍら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６（１９９６））。ま
た、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系において、Ａ
ＴＰ再生系として従来用いられていたホスホエノールピ
ルベート（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の組
合わせを、クレアチンホスフェート（ＣＰ）とクレアチ
ンキナーゼ（ＣＫ）の組み合わせに変更し、さらに、そ
の他の反応液組成の最適化によりバッチ法でも１ｍｌの
反応液あたり数百μｇ（Ｙａｂｕｋｉら，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，１１：
２９５−３０６，１９９８）の生産量である。ここで、
ＰＥＰ、ＣＰはいずれもＡＴＰ再生のための基質であ
り、またＰＫ、ＣＫはいずれもＡＤＰをＡＴＰに再生す
る酵素である。ＰＫ、ＣＫはそれぞれＰＥＰ、ＣＰを基
質として必要とする。現在までに、無細胞タンパク質系
で得られた最大の合成量はＫｉｍとＣｈｏｉ（上掲）に
よる１４時間で１．２ｍｇ／ｍｌである。合成速度は１
時間あたり約８０μｇ／ｍｌで、使用した基質１ｍｌあ
たりの合成量は約１００μｇであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、無細
胞タンパク質合成系において従来法よりも、より短時間
に、より高い合成量でかつより低コストでポリペプチド
を製造するための方法を提供することである。
胞タンパク質合成系において従来法よりも、より短時間
に、より高い合成量でかつより低コストでポリペプチド
を製造するための方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、透析法を用い
た無細胞タンパク質合成系によるポリぺプチドの製造方
法において、濃縮細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合
成系中で該ポリペプチドをコードする核酸の翻訳または
転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成し、該ポリペ
プチドを回収することを含む方法を提供する。
た無細胞タンパク質合成系によるポリぺプチドの製造方
法において、濃縮細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合
成系中で該ポリペプチドをコードする核酸の翻訳または
転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成し、該ポリペ
プチドを回収することを含む方法を提供する。
【０００８】本発明において、上記方法は、濃縮細胞抽
出液を含有するポリペプチド合成反応液を透析内液とし
ポリペプチド合成基質溶液を透析外液として含み、かつ
該透析内液と該透析外液が物質移動を可能とする透析膜
によって隔離されている該無細胞タンパク質合成系を振
とうまたは攪拌することを含むことができる。本発明に
おいて、上記無細胞タンパク質合成系の透析外液は反応
速度が低下した時点で新鮮なものと交換することができ
る。本発明において、透析膜は１００００ダルトンを超
える分子量限界、好ましくは約５００００ダルトンおよ
びそれ以上の分子量限界をもつことができる。
出液を含有するポリペプチド合成反応液を透析内液とし
ポリペプチド合成基質溶液を透析外液として含み、かつ
該透析内液と該透析外液が物質移動を可能とする透析膜
によって隔離されている該無細胞タンパク質合成系を振
とうまたは攪拌することを含むことができる。本発明に
おいて、上記無細胞タンパク質合成系の透析外液は反応
速度が低下した時点で新鮮なものと交換することができ
る。本発明において、透析膜は１００００ダルトンを超
える分子量限界、好ましくは約５００００ダルトンおよ
びそれ以上の分子量限界をもつことができる。
【０００９】本発明において、濃縮細胞抽出液は大腸
菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エー
ルリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽
酵母などの真核、原核細胞の粗細胞抽出液を濃縮したも
のである。本発明の実施態様において、そのような濃縮
細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を濃縮したもので
ある。濃縮細胞抽出液は、上記の粗細胞抽出液を透析、
限外濾過、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿など
の濃縮法によって濃縮して得ることができる。例えば、
大腸菌Ｓ３０細胞抽出液の濃縮は、振とうまたは攪拌可
能な閉鎖系で、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）から
既知の方法（Ｚｕｂａｙら（１９７３）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−２８７）で得られた大腸
菌Ｓ３０抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社からも入手可能）を
透析内液とし、分子量限界１０００〜１４０００の透析
膜を介して透析外液に対して透析を行うことによって得
ることができる。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、
酢酸マグネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝
液と、ポリエチエレングリコール、もしくはショ糖／エ
ピクロルヒドリン水溶性合成共重合体（例えばＳＩＧＭ
Ａ社製のＦｉｃｏｌｌ）、とを含むことができる。
菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エー
ルリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽
酵母などの真核、原核細胞の粗細胞抽出液を濃縮したも
のである。本発明の実施態様において、そのような濃縮
細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液を濃縮したもので
ある。濃縮細胞抽出液は、上記の粗細胞抽出液を透析、
限外濾過、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿など
の濃縮法によって濃縮して得ることができる。例えば、
大腸菌Ｓ３０細胞抽出液の濃縮は、振とうまたは攪拌可
能な閉鎖系で、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）から
既知の方法（Ｚｕｂａｙら（１９７３）Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−２８７）で得られた大腸
菌Ｓ３０抽出液（Ｐｒｏｍｅｇａ社からも入手可能）を
透析内液とし、分子量限界１０００〜１４０００の透析
膜を介して透析外液に対して透析を行うことによって得
ることができる。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、
酢酸マグネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝
液と、ポリエチエレングリコール、もしくはショ糖／エ
ピクロルヒドリン水溶性合成共重合体（例えばＳＩＧＭ
Ａ社製のＦｉｃｏｌｌ）、とを含むことができる。
【００１０】本発明において、上記無細胞タンパク質合
成系はＡＴＰ再生系としてクレアチンキナーゼとクレア
チンホスフェートの組合わせを含むことができる。本発
明はさらに、透析法を用いた無細胞タンパク質合成系に
よるポリペプチドの製造方法において、大腸菌由来の細
胞抽出液ならびにＡＴＰ再生系としてのクレアチンキナ
ーゼとクレアチンホスフェートの組合わせを含む無細胞
タンパク質合成系中で該ポリペプチドをコードする核酸
の翻訳または転写／翻訳を介して該ポリペプチドを生成
し、該ポリペプチドを回収することを含む方法を提供す
る。大腸菌由来の細胞抽出液は濃縮されていてもよいし
あるいは未濃縮であってもよい。本発明の実施態様にお
いて、上記細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液であ
る。
成系はＡＴＰ再生系としてクレアチンキナーゼとクレア
チンホスフェートの組合わせを含むことができる。本発
明はさらに、透析法を用いた無細胞タンパク質合成系に
よるポリペプチドの製造方法において、大腸菌由来の細
胞抽出液ならびにＡＴＰ再生系としてのクレアチンキナ
ーゼとクレアチンホスフェートの組合わせを含む無細胞
タンパク質合成系中で該ポリペプチドをコードする核酸
の翻訳または転写／翻訳を介して該ポリペプチドを生成
し、該ポリペプチドを回収することを含む方法を提供す
る。大腸菌由来の細胞抽出液は濃縮されていてもよいし
あるいは未濃縮であってもよい。本発明の実施態様にお
いて、上記細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液であ
る。
【００１１】本明細書でいう「無細胞タンパク質合成
系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でポ
リペプチドを合成する無細胞翻訳系、ＤＮＡを鋳型とし
てＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者
を含むものを包含する。本明細書でいう「濃縮細胞抽出
液」は、リボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に
必要な成分を含む真核および原核生物細胞の粗抽出液を
透析、限外濾過、ＰＥＧ沈殿（Ｈ．Ｎａｋａｎｏら，Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４６
（１９９６）２７５−２８２）などの既知の濃縮法また
は新規に見出される濃縮法によって濃縮されたものを意
味し、該抽出液はタンパク質インビボ合成に関与する翻
訳系または転写系／翻訳系の成分を含む。「濃縮」は、
抽出液中の総タンパク質濃度を指標として、その濃度の
増加を意味する。
系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でポ
リペプチドを合成する無細胞翻訳系、ＤＮＡを鋳型とし
てＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者
を含むものを包含する。本明細書でいう「濃縮細胞抽出
液」は、リボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に
必要な成分を含む真核および原核生物細胞の粗抽出液を
透析、限外濾過、ＰＥＧ沈殿（Ｈ．Ｎａｋａｎｏら，Ｊ
ｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４６
（１９９６）２７５−２８２）などの既知の濃縮法また
は新規に見出される濃縮法によって濃縮されたものを意
味し、該抽出液はタンパク質インビボ合成に関与する翻
訳系または転写系／翻訳系の成分を含む。「濃縮」は、
抽出液中の総タンパク質濃度を指標として、その濃度の
増加を意味する。
【００１２】本明細書でいう「ポリペプチド」は、複数
のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチ
ド、すなわち低分子量（小ペプチド）から高分子量（タ
ンパク質を含む大ペプチド）のいずれも包含するものと
する。本明細書でいう「核酸」とはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、
ＤＮＡ、ｃＤＮＡのいずれかを指す。
のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチ
ド、すなわち低分子量（小ペプチド）から高分子量（タ
ンパク質を含む大ペプチド）のいずれも包含するものと
する。本明細書でいう「核酸」とはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、
ＤＮＡ、ｃＤＮＡのいずれかを指す。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、透析を用いた無細胞タンパク質合成法に
おいて、透析内液中に粗細胞抽出液の濃縮液を用いると
きに、未濃縮の抽出液を用いたときと比べて著しくポリ
ペプチドの生産量が向上することを意外にも見出した。
また、同時に、分子量限界の大きな透析膜を用いること
により、および／または透析外液を反応速度が低下した
時点で新鮮なものと交換することにより、ポリペプチド
の合成量をさらに改善できることを見出した。
本発明者らは、透析を用いた無細胞タンパク質合成法に
おいて、透析内液中に粗細胞抽出液の濃縮液を用いると
きに、未濃縮の抽出液を用いたときと比べて著しくポリ
ペプチドの生産量が向上することを意外にも見出した。
また、同時に、分子量限界の大きな透析膜を用いること
により、および／または透析外液を反応速度が低下した
時点で新鮮なものと交換することにより、ポリペプチド
の合成量をさらに改善できることを見出した。
【００１４】粗細胞抽出液は、細菌（例えば大腸菌
等）、菌類（例えば出芽酵母等）、小麦胚芽、ウサギ網
赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、Ｈ
ｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等の、高いタンパク質合成活性
の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であるこ
とができる（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒ
ａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐ
ｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇ
ｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ）。上記定義のとおり、粗細胞抽出液はリボソーム、
ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に必要な成分を含む。粗
抽出液の調製は例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−
ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８
４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．と
Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ）に記載の方法を使用できる。具体的には、フ
レンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら，上掲）やグ
ラスビーズを用いた破砕（Ｋｉｍら，上掲）によって行
うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細
胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９株
（ｒｎａ，ｍｅｔ）から既知の方法、例えばＰｒａｔｔ
ら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒ
ｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを
使用してもよい。
等）、菌類（例えば出芽酵母等）、小麦胚芽、ウサギ網
赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、Ｈ
ｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等の、高いタンパク質合成活性
の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であるこ
とができる（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａｐｒ
ａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐ
ｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇ
ｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ）。上記定義のとおり、粗細胞抽出液はリボソーム、
ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に必要な成分を含む。粗
抽出液の調製は例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−
ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８
４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．と
Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ）に記載の方法を使用できる。具体的には、フ
レンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら，上掲）やグ
ラスビーズを用いた破砕（Ｋｉｍら，上掲）によって行
うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細
胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌Ａ１９株
（ｒｎａ，ｍｅｔ）から既知の方法、例えばＰｒａｔｔ
ら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒ
ｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを
使用してもよい。
【００１５】本発明では、上記細胞抽出液はその総タン
パク質濃度が増加するように濃縮する必要があるが、濃
縮は任意の手段例えば限外濾過（限外濾過遠心を含
む）、透析、ＰＥＧ沈殿などによって行うことができ
る。濃縮の度合いは、通常１．５倍以上、好ましくは２
倍以上である。大腸菌由来の細胞抽出液の場合、限外濾
過遠心で１．５〜７倍以上、ＰＥＧ沈殿で１．５〜５倍
以上まで濃縮可能であるが、4倍を超えるとハンドリン
グが難しくなる。また、小麦胚芽抽出液の場合、ＰＥＧ
沈殿で10倍の濃縮が可能である（Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．
ら，上掲）。ＰＥＧ沈殿による方法では、細胞抽出液に
ＰＥＧ水溶液を混ぜることによりタンパク質、核酸を沈
殿させて回収し、これを少量の緩衝液に溶かすことによ
り濃縮細胞抽出液を得ることができる。透析による濃縮
は、例えば後述の実施例１に記載の方法によって実施可
能である。すなわち、１つの方法では、振とうまたは攪
拌可能な閉鎖系で細胞抽出液を透析内液とし、透析膜
（例えば分子量限界１０００〜１４０００）を介して透
析外液に対して透析を行うことによって得ることができ
る。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、酢酸マグネシ
ウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、ＰＥＧ
（例えば＃８０００）、ショ糖／エピクロルヒドリン水
溶性合成共重合体（例えばＳＩＧＭＡ社製のＦｉｃｏｌ
ｌ）等の高分子吸収剤とを含むことができる。高分子吸
収剤は水分を吸い出すために必須である。
パク質濃度が増加するように濃縮する必要があるが、濃
縮は任意の手段例えば限外濾過（限外濾過遠心を含
む）、透析、ＰＥＧ沈殿などによって行うことができ
る。濃縮の度合いは、通常１．５倍以上、好ましくは２
倍以上である。大腸菌由来の細胞抽出液の場合、限外濾
過遠心で１．５〜７倍以上、ＰＥＧ沈殿で１．５〜５倍
以上まで濃縮可能であるが、4倍を超えるとハンドリン
グが難しくなる。また、小麦胚芽抽出液の場合、ＰＥＧ
沈殿で10倍の濃縮が可能である（Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．
ら，上掲）。ＰＥＧ沈殿による方法では、細胞抽出液に
ＰＥＧ水溶液を混ぜることによりタンパク質、核酸を沈
殿させて回収し、これを少量の緩衝液に溶かすことによ
り濃縮細胞抽出液を得ることができる。透析による濃縮
は、例えば後述の実施例１に記載の方法によって実施可
能である。すなわち、１つの方法では、振とうまたは攪
拌可能な閉鎖系で細胞抽出液を透析内液とし、透析膜
（例えば分子量限界１０００〜１４０００）を介して透
析外液に対して透析を行うことによって得ることができ
る。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、酢酸マグネシ
ウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、ＰＥＧ
（例えば＃８０００）、ショ糖／エピクロルヒドリン水
溶性合成共重合体（例えばＳＩＧＭＡ社製のＦｉｃｏｌ
ｌ）等の高分子吸収剤とを含むことができる。高分子吸
収剤は水分を吸い出すために必須である。
【００１６】大腸菌Ｓ３０抽出液透析無細胞系は１９９
２年にＢｅｃｋｌｅｒら（ＡＳＭｐｏｓｔｅｒｐｒｅｓ
ｅｎｔａｔｉｏｎ，１９９２）が初めて報告し、その後
Ｄａｖｉｓら（上掲）が同じ系を利用した大スケール透
析反応を記載しているが、そのいずれにおいてもＳ３０
抽出液は未濃縮のものが用いられてきた。また、Ｄａｖ
ｉｓら（上掲）のＦｉｇ．４Ｃには、透析膜の分子量限
界の違いが合成量に与える影響について示されている
が、たとえ分子量限界の大きなものを用いてもポリペプ
チド合成量の向上量は小さい。
２年にＢｅｃｋｌｅｒら（ＡＳＭｐｏｓｔｅｒｐｒｅｓ
ｅｎｔａｔｉｏｎ，１９９２）が初めて報告し、その後
Ｄａｖｉｓら（上掲）が同じ系を利用した大スケール透
析反応を記載しているが、そのいずれにおいてもＳ３０
抽出液は未濃縮のものが用いられてきた。また、Ｄａｖ
ｉｓら（上掲）のＦｉｇ．４Ｃには、透析膜の分子量限
界の違いが合成量に与える影響について示されている
が、たとえ分子量限界の大きなものを用いてもポリペプ
チド合成量の向上量は小さい。
【００１７】これに対して、本発明の方法では、Ｓ３０
抽出液を濃縮し、その濃縮液を透析内液に用いることに
よって、および／または分子量限界のより大きい透析膜
を使用することによって、および／または反応速度の低
下が認められる時点で透析外液を新鮮なものと交換する
ことによって、従来法によるものをはるかに凌ぐポリペ
プチドの高い生産量を達成することができる。このよう
に優れた効果は、例えば無細胞系でのクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはＲａ
ｓタンパク質の生産量の経時変化に関する図２、図３に
示されている（実施例３および４参照）。ＣＡＴの合成
量をみると、１２時間での反応で５ｍｇ／ｍｌ、２１時
間の反応で６ｍｇ／ｍｌまで向上した。無細胞系でのＣ
ＡＴの合成で従来最も高い生産量は１４時間で１．２ｍ
ｇ／ｍｌ（ＫｉｍとＣｈｏｉ、上掲）であるが、本発明
では約４倍以上高い生産量が得られる。
抽出液を濃縮し、その濃縮液を透析内液に用いることに
よって、および／または分子量限界のより大きい透析膜
を使用することによって、および／または反応速度の低
下が認められる時点で透析外液を新鮮なものと交換する
ことによって、従来法によるものをはるかに凌ぐポリペ
プチドの高い生産量を達成することができる。このよう
に優れた効果は、例えば無細胞系でのクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはＲａ
ｓタンパク質の生産量の経時変化に関する図２、図３に
示されている（実施例３および４参照）。ＣＡＴの合成
量をみると、１２時間での反応で５ｍｇ／ｍｌ、２１時
間の反応で６ｍｇ／ｍｌまで向上した。無細胞系でのＣ
ＡＴの合成で従来最も高い生産量は１４時間で１．２ｍ
ｇ／ｍｌ（ＫｉｍとＣｈｏｉ、上掲）であるが、本発明
では約４倍以上高い生産量が得られる。
【００１８】本発明の方法では、透析膜を介して内液と
外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装
置を用いることができる。小スケール反応用装置として
は、例えばＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）
（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）やＳｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ
（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）が挙げられる。ま
た、大スケール反応用装置としては、Ｓｐｅｃｔｒａ／
Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ
社製）を例示できる。
外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装
置を用いることができる。小スケール反応用装置として
は、例えばＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）
（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）やＳｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ
（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）が挙げられる。ま
た、大スケール反応用装置としては、Ｓｐｅｃｔｒａ／
Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ
社製）を例示できる。
【００１９】無細胞タンパク質合成系における透析内液
（すなわち、ポリペプチド合成反応液）には、大腸菌Ｓ
３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のポリペプチドを
コードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、ＡＴ
Ｐ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン
５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン
酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩
類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要により
ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）
およびｔＲＮＡ、などを含むことができる。その他、Ａ
ＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン
酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートと
クレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコー
ル（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸
類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイト
ール）、などを含むことができる。一方、透析外液（す
なわち、ポリペプチド合成基質溶液）は、透析内液組成
から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。
例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ，塩
類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成
分の濃度は任意に選択することができる。
（すなわち、ポリペプチド合成反応液）には、大腸菌Ｓ
３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のポリペプチドを
コードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、ＡＴ
Ｐ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン
５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン
酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩
類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要により
ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）
およびｔＲＮＡ、などを含むことができる。その他、Ａ
ＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン
酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートと
クレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコー
ル（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸
類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイト
ール）、などを含むことができる。一方、透析外液（す
なわち、ポリペプチド合成基質溶液）は、透析内液組成
から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。
例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ，塩
類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成
分の濃度は任意に選択することができる。
【００２０】緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯ
Ｈ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩
類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウ
ム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例は
アジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸
はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。ま
た、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラ
ーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼなどの市販の酵素を使用できる。
Ｈ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩
類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウ
ム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例は
アジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸
はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。ま
た、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラ
ーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼなどの市販の酵素を使用できる。
【００２１】本発明においては、透析法を用いた無細胞
タンパク質合成系において、大腸菌由来の細胞抽出液な
らびにＡＴＰ再生系としてのクレアチンキナーゼとクレ
アチンホスフェートの組合わせを含む無細胞タンパク質
合成系中で該ポリペプチドをコードする核酸の翻訳また
は転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成し、該ポリ
ペプチドを回収することによっても、従来の方法による
合成効率を超えるという利点が得られる。このことは図
1に結果から明らかであり、この場合細胞抽出液は濃縮
されていても未濃縮であってもよいが濃縮細胞抽出液の
方がより好ましい。本発明の実施態様において細胞抽出
液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液であるが、これに限定され
ない。無細胞タンパク質合成系のその他の成分等の条件
は上述したものを適用できる。
タンパク質合成系において、大腸菌由来の細胞抽出液な
らびにＡＴＰ再生系としてのクレアチンキナーゼとクレ
アチンホスフェートの組合わせを含む無細胞タンパク質
合成系中で該ポリペプチドをコードする核酸の翻訳また
は転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成し、該ポリ
ペプチドを回収することによっても、従来の方法による
合成効率を超えるという利点が得られる。このことは図
1に結果から明らかであり、この場合細胞抽出液は濃縮
されていても未濃縮であってもよいが濃縮細胞抽出液の
方がより好ましい。本発明の実施態様において細胞抽出
液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液であるが、これに限定され
ない。無細胞タンパク質合成系のその他の成分等の条件
は上述したものを適用できる。
【００２２】本発明では、ポリペプチドは、上記定義の
とおり小ペプチドから大ペプチドに至る任意のものを対
象とし、公知のものまたは新規のものを含む。目的のポ
リペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、真核ま
たは原核生物の細胞もしくは組織からゲノムＤＮＡ、ｍ
ＲＮＡとして周知の方法（フェノール／クロロホルム処
理、エタノール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心など）
で得るか、あるいは、ｃＤＮＡクローニングで合成・単
離することができる。あるいは、ポリペプチドのアミノ
酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列が判明
している場合には、ＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成
することもできる。
とおり小ペプチドから大ペプチドに至る任意のものを対
象とし、公知のものまたは新規のものを含む。目的のポ
リペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、真核ま
たは原核生物の細胞もしくは組織からゲノムＤＮＡ、ｍ
ＲＮＡとして周知の方法（フェノール／クロロホルム処
理、エタノール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心など）
で得るか、あるいは、ｃＤＮＡクローニングで合成・単
離することができる。あるいは、ポリペプチドのアミノ
酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列が判明
している場合には、ＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成
することもできる。
【００２３】本発明方法の実施においては、上述の透析
装置を使用し、透析膜の内部に上記透析内液を、一方そ
の外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物
質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪
拌（回転攪拌など）し、生成した目的ポリペプチドを、
透析内液または外液から回収することができる。温度お
よび攪拌速度などの反応条件は、ポリペプチドの種類に
応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場
合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは３７℃で
あるが、高度高熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タ
ンパク質合成系では５０℃を超える温度でもよい。ま
た、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００
〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のポリペプチドの生
成を監視しながら、反応時間を適当に選択することがで
きる。
装置を使用し、透析膜の内部に上記透析内液を、一方そ
の外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物
質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪
拌（回転攪拌など）し、生成した目的ポリペプチドを、
透析内液または外液から回収することができる。温度お
よび攪拌速度などの反応条件は、ポリペプチドの種類に
応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場
合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは３７℃で
あるが、高度高熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タ
ンパク質合成系では５０℃を超える温度でもよい。ま
た、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００
〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のポリペプチドの生
成を監視しながら、反応時間を適当に選択することがで
きる。
【００２４】本発明の方法では、上記無細胞タンパク質
合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮な
ものと交換する場合、および／または、透析膜の分子量
限界が１００００ダルトンを超えるもの、好ましくは約
５００００ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場
合には、ポリペプチドの生産量をさらに高めることがで
きる。
合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮な
ものと交換する場合、および／または、透析膜の分子量
限界が１００００ダルトンを超えるもの、好ましくは約
５００００ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場
合には、ポリペプチドの生産量をさらに高めることがで
きる。
【００２５】生成ポリペプチドの精製は、生細胞からの
分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に
少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法
は、ポリペプチドの性質に応じて従来公知のものを単独
にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモ
ニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしく
はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳
動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げる
ことができる。生成ポリペプチドの同定および定量は、
活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析
などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しなが
ら行うことができる。本発明を実施例でさらに詳しく説
明するが、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲は以下
の実施例によって制限されないものとする。
分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に
少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法
は、ポリペプチドの性質に応じて従来公知のものを単独
にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモ
ニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしく
はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳
動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げる
ことができる。生成ポリペプチドの同定および定量は、
活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析
などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しなが
ら行うことができる。本発明を実施例でさらに詳しく説
明するが、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲は以下
の実施例によって制限されないものとする。
【００２６】
【実施例】実施例１ 大腸菌Ｓ３０抽出液の調製と濃縮 大腸菌Ｓ３０抽出液は、Ｚｕｂａｙら（Ａｎｎｕ． Ｒ
ｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−１８７， １９７
３）の方法に従って、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅ
ｔ）から調製した。
ｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．７：２６７−１８７， １９７
３）の方法に従って、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅ
ｔ）から調製した。
【００２７】１５ｍｌの大腸菌Ｓ３０抽出液を透析チュ
ーブＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ２（分子量限界，１２００
０〜１４０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）に入れ透析チ
ューブクランプで封をした後、５０ｍｌの溶液Ｂ［２５
ｇのポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８００
０）に溶液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ
８．２），６０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＫ，１４ｍＭ Ｍｇ
（ＣＨ3ＣＯＯ）2，１ｍＭジチオトレトール（ＤＴ
Ｔ））を加え、容量を５０ｍｌとしたもの］と共にヒー
トシールバッグ（Ｈｅａｔ Ｓｅａｌ Ｂａｇ， Ｙａ
ｍａｍｏｔｏ社製）に入れてヒートシーラーで密封し
た。これをローテーターに取り付けて４℃で４５分間、
毎分約１０回転で回転攪拌した。
ーブＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ２（分子量限界，１２００
０〜１４０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）に入れ透析チ
ューブクランプで封をした後、５０ｍｌの溶液Ｂ［２５
ｇのポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８００
０）に溶液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ
８．２），６０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＫ，１４ｍＭ Ｍｇ
（ＣＨ3ＣＯＯ）2，１ｍＭジチオトレトール（ＤＴ
Ｔ））を加え、容量を５０ｍｌとしたもの］と共にヒー
トシールバッグ（Ｈｅａｔ Ｓｅａｌ Ｂａｇ， Ｙａ
ｍａｍｏｔｏ社製）に入れてヒートシーラーで密封し
た。これをローテーターに取り付けて４℃で４５分間、
毎分約１０回転で回転攪拌した。
【００２８】大腸菌Ｓ３０抽出液の入った透析チューブ
を取り出し、溶液の減少に応じて透析チューブクランプ
の位置を調節した後、４℃で１５分間５００ｍｌの溶液
Ａに対し透析した。上記の方法により、タンパク質濃度
で約２倍に濃縮された大腸菌Ｓ３０抽出液を得た。
を取り出し、溶液の減少に応じて透析チューブクランプ
の位置を調節した後、４℃で１５分間５００ｍｌの溶液
Ａに対し透析した。上記の方法により、タンパク質濃度
で約２倍に濃縮された大腸菌Ｓ３０抽出液を得た。
【００２９】実施例２ 透析を用いた無細胞タンパク質
合成法によるCAT（クロラムフェ ニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ）の合成 タンパク質合成反応液（透析内液）の組成は、５５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＤＴ
Ｔ，１．２ｍＭ ＡＴＰ，各々０．８ｍＭ のＣＴＰ，
ＧＴＰおよびＵＴＰ，８０ｍＭクレアチンホスフェー
ト，２５０μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ，４．０％
（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００，０．６４ｍＭ３’，５’−
ｃＡＭＰ，６８μＭ Ｌ−（−）−５−フォルミル−
５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸，１７５μｇ／ｍｌ
Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製），２１０ｍＭ グルタミン酸
カリウム，２７．５ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ，１０．７ｍＭ
Ｍｇ（ＣＨ3ＣＯＯ）2，各々１ｍＭの２０種のタンパ
ク質構成アミノ酸，０．０５％ ＮａＮ3，６．７μｇ
／ｍｌ ｐＫ７−ＣＡＴ ＤＮＡ（ＣＡＴ発現ベクタ
ー；Ｋｉｍら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２３９：８８１−８８６），９３μｇ／ｍｌＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ，０．５ユニット／μｌ ＲＮアー
ゼ阻害剤（Ｔｏｙｏｂｏ社製），０．３容積の実施例１
からの大腸菌Ｓ３０抽出液もしくは濃縮した大腸菌Ｓ３
０抽出液であった。
合成法によるCAT（クロラムフェ ニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ）の合成 タンパク質合成反応液（透析内液）の組成は、５５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＤＴ
Ｔ，１．２ｍＭ ＡＴＰ，各々０．８ｍＭ のＣＴＰ，
ＧＴＰおよびＵＴＰ，８０ｍＭクレアチンホスフェー
ト，２５０μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ，４．０％
（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００，０．６４ｍＭ３’，５’−
ｃＡＭＰ，６８μＭ Ｌ−（−）−５−フォルミル−
５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸，１７５μｇ／ｍｌ
Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製），２１０ｍＭ グルタミン酸
カリウム，２７．５ｍＭ ＮＨ4ＯＡｃ，１０．７ｍＭ
Ｍｇ（ＣＨ3ＣＯＯ）2，各々１ｍＭの２０種のタンパ
ク質構成アミノ酸，０．０５％ ＮａＮ3，６．７μｇ
／ｍｌ ｐＫ７−ＣＡＴ ＤＮＡ（ＣＡＴ発現ベクタ
ー；Ｋｉｍら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２３９：８８１−８８６），９３μｇ／ｍｌＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ，０．５ユニット／μｌ ＲＮアー
ゼ阻害剤（Ｔｏｙｏｂｏ社製），０．３容積の実施例１
からの大腸菌Ｓ３０抽出液もしくは濃縮した大腸菌Ｓ３
０抽出液であった。
【００３０】タンパク質合成基質溶液（透析外液）の組
成は、透析内液から大腸菌Ｓ３０抽出液，ＲＮアーゼ阻
害剤，ＤＮＡ，Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを除き、
４．２ｍＭＭｇ（ＣＨ3ＣＯＯ）2を追加したものであっ
た。３００μｌの透析内液を入れたＤｉｓｐｏ／Ｄｉａ
ｌｙｚｅｒ ＣＥ（分子量限界１００００もしくは５０
０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を、３０００μｌの透
析外液の入った１５ｍｌチューブに入れ、試験管用振と
う培養器で３７℃、１６０ｒｐｍで振とうすることによ
りタンパク質合成を行った。
成は、透析内液から大腸菌Ｓ３０抽出液，ＲＮアーゼ阻
害剤，ＤＮＡ，Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを除き、
４．２ｍＭＭｇ（ＣＨ3ＣＯＯ）2を追加したものであっ
た。３００μｌの透析内液を入れたＤｉｓｐｏ／Ｄｉａ
ｌｙｚｅｒ ＣＥ（分子量限界１００００もしくは５０
０００，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を、３０００μｌの透
析外液の入った１５ｍｌチューブに入れ、試験管用振と
う培養器で３７℃、１６０ｒｐｍで振とうすることによ
りタンパク質合成を行った。
【００３１】反応液中に含まれるＣＡＴタンパク質の定
量は、Ｓｈａｗ（１９７５）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍ
ｏｌ，ｐ．７３５−７５５に従い以下の方法で行った。
すなわち、アセチルコエンザイムＡとクロラムフェニコ
ールを基質としてＣＡＴによるクロラムフェニコールの
アセチル化反応を行い、その結果生じた還元型コエンザ
イムＡを５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸
（ＤＴＮＢ）を用いて発色定量した。３７℃、４１２ｎ
ｍにおける吸光度の単位時間あたりの増加量よりＣＡＴ
の活性を定量し、これを指標としてＣＡＴタンパク質量
を決定した。合成反応開始後、6時間におけるＣＡＴの
量を図１に示す。濃縮していない大腸菌Ｓ３０抽出液を
使用した場合は２ｍｇ／ｍｌ、濃縮したＳ３０抽出液を
使用した場合は３ｍｇ／ｍｌの収量を得た。
量は、Ｓｈａｗ（１９７５）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍ
ｏｌ，ｐ．７３５−７５５に従い以下の方法で行った。
すなわち、アセチルコエンザイムＡとクロラムフェニコ
ールを基質としてＣＡＴによるクロラムフェニコールの
アセチル化反応を行い、その結果生じた還元型コエンザ
イムＡを５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸
（ＤＴＮＢ）を用いて発色定量した。３７℃、４１２ｎ
ｍにおける吸光度の単位時間あたりの増加量よりＣＡＴ
の活性を定量し、これを指標としてＣＡＴタンパク質量
を決定した。合成反応開始後、6時間におけるＣＡＴの
量を図１に示す。濃縮していない大腸菌Ｓ３０抽出液を
使用した場合は２ｍｇ／ｍｌ、濃縮したＳ３０抽出液を
使用した場合は３ｍｇ／ｍｌの収量を得た。
【００３２】実施例３ 透析を用いた無細胞タンパク質
合成法（反応途中で透析外液を交換） によるＣＡＴの合
成 実施例１の方法で濃縮した大腸菌Ｓ３０抽出液を使用し
て実施例２に記載の反応試験を行った場合の、合成開始
後各時間におけるＣＡＴの量を図２に示す。反応開始後
6時間でＣＡＴの合成速度は低下した。同等の反応試験
において、反応速度が低下する時刻（ここでは６時間）
に透析外液を新たなものに交換したところ、合成反応は
長時間継続し、反応開始後12時間で５ｍｇ／ｍｌ、21時
間では６ｍｇ／ｍｌのＣＡＴを合成することができた
（図２）。
合成法（反応途中で透析外液を交換） によるＣＡＴの合
成 実施例１の方法で濃縮した大腸菌Ｓ３０抽出液を使用し
て実施例２に記載の反応試験を行った場合の、合成開始
後各時間におけるＣＡＴの量を図２に示す。反応開始後
6時間でＣＡＴの合成速度は低下した。同等の反応試験
において、反応速度が低下する時刻（ここでは６時間）
に透析外液を新たなものに交換したところ、合成反応は
長時間継続し、反応開始後12時間で５ｍｇ／ｍｌ、21時
間では６ｍｇ／ｍｌのＣＡＴを合成することができた
（図２）。
【００３３】実施例４ 透析を用いた無細胞タンパク質
合成法によるＲａｓの合成 濃縮した大腸菌Ｓ３０抽出液を使用し、ｐＫ７−ＣＡＴ
の代わりにｐＫ７−Ｒａｓ（Ｒａｓタンパク質の発現ベ
クター；Ｋｉｇａｗａら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｍｏ
ｌ．ＮＭＲ，６：１２９−１３４）を用い、１ｍＭロイ
シンの代わりに１ｍＭ［14Ｃ］−ロイシン（１８．５Ｍ
Ｂｑ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた他は
実施例２と同等の方法にてタンパク質の合成反応を行っ
た。Ｒａｓタンパク質の合成量を、フィルター上での５
％トリクロロ酢酸を利用しての沈降法を用いて定量し
た。その結果、Ｒａｓタンパク質の合成量は反応開始後
６時間で３ｍｇ／ｍｌであった。
合成法によるＲａｓの合成 濃縮した大腸菌Ｓ３０抽出液を使用し、ｐＫ７−ＣＡＴ
の代わりにｐＫ７−Ｒａｓ（Ｒａｓタンパク質の発現ベ
クター；Ｋｉｇａｗａら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｍｏ
ｌ．ＮＭＲ，６：１２９−１３４）を用い、１ｍＭロイ
シンの代わりに１ｍＭ［14Ｃ］−ロイシン（１８．５Ｍ
Ｂｑ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた他は
実施例２と同等の方法にてタンパク質の合成反応を行っ
た。Ｒａｓタンパク質の合成量を、フィルター上での５
％トリクロロ酢酸を利用しての沈降法を用いて定量し
た。その結果、Ｒａｓタンパク質の合成量は反応開始後
６時間で３ｍｇ／ｍｌであった。
【００３４】
【発明の効果】上記の実施例の結果に基づき本発明を従
来法と比較すると、以下の利点が提供される。 （１）タンパク質合成量 本発明の方法によるタンパク質のＣＡＴ合成量６ｍｇ／
ｍｌ（実施例３）は従来法（ＫｉｍとＣｈｏｉ；上掲）
の値１．２ｍｇ／ｍｌを大きく上回り、工業的なタンパ
ク質生産を行ううえで有利である。本発明で使用した大
腸菌抽出液１ｍｌあたりのタンパク質の合成量は約８ｍ
ｇであり、従来法での値約３ｍｇを上回る。したがっ
て、本発明の方法による反応液からは純度の高いタンパ
ク質をより簡便に精製することができる。
来法と比較すると、以下の利点が提供される。 （１）タンパク質合成量 本発明の方法によるタンパク質のＣＡＴ合成量６ｍｇ／
ｍｌ（実施例３）は従来法（ＫｉｍとＣｈｏｉ；上掲）
の値１．２ｍｇ／ｍｌを大きく上回り、工業的なタンパ
ク質生産を行ううえで有利である。本発明で使用した大
腸菌抽出液１ｍｌあたりのタンパク質の合成量は約８ｍ
ｇであり、従来法での値約３ｍｇを上回る。したがっ
て、本発明の方法による反応液からは純度の高いタンパ
ク質をより簡便に精製することができる。
【００３５】（２）タンパク質合成速度 本発明の方法による合成速度は1時間あたり約４００μ
ｇ／ｍｌであり、従来法の約８０μｇ／ｍｌを大幅に上
回る。より短時間に同量のタンパク質を合成できること
は、分解を受け易いタンパク質、変性し易いタンパク質
を合成する上で有利である。
ｇ／ｍｌであり、従来法の約８０μｇ／ｍｌを大幅に上
回る。より短時間に同量のタンパク質を合成できること
は、分解を受け易いタンパク質、変性し易いタンパク質
を合成する上で有利である。
【００３６】（３）タンパク質合成に要するコスト 本発明の方法において使用した基質溶液１ｍｌあたりの
合成量は約５００μｇであり、従来法での値１００μｇ
／ｍｌを大幅に上回る。このため、本発明の方法では、
従来法よりはるかに低いコストでタンパク質を生産する
ことができる。
合成量は約５００μｇであり、従来法での値１００μｇ
／ｍｌを大幅に上回る。このため、本発明の方法では、
従来法よりはるかに低いコストでタンパク質を生産する
ことができる。
【図１】この図は、透析を用いた無細胞タンパク質合成
系における、透析膜の分子量限界と使用する大腸菌Ｓ３
０抽出液の濃縮の有無に対する反応開始6時間後のＣＡ
Ｔの合成量を示す。
系における、透析膜の分子量限界と使用する大腸菌Ｓ３
０抽出液の濃縮の有無に対する反応開始6時間後のＣＡ
Ｔの合成量を示す。
【図２】この図は、透析を用いた無細胞タンパク質合成
系における、透析外液交換の有無と合成時間に対するＣ
ＡＴの合成量の関係を示す。
系における、透析外液交換の有無と合成時間に対するＣ
ＡＴの合成量の関係を示す。
【図３】この図は、透析を用いた無細胞タンパク質合成
系における、合成時間に対するＲａｓの合成量を示す。
系における、合成時間に対するＲａｓの合成量を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 矢吹 孝 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 BA80 CA04 HA01 4B050 CC03 EE02 EE05 4B064 AG01 CA21 CC22 CD21 DA16 4B065 BB23 BB25 BB26 BB28 BB29 BC20 BC50 CA24 CA29 CA60 4H045 AA20 BA10 DA89 EA60 FA70 GA10 HA05
Claims (12)
- 【請求項１】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成系
によるポリぺプチドの製造方法において、濃縮細胞抽出
液を含む無細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドを
コードする核酸の翻訳または転写／翻訳を介して該ポリ
ペプチドを生成し、該ポリペプチドを回収することを含
む前記方法。 - 【請求項２】 濃縮細胞抽出液を含有するポリペプチド
合成反応液を透析内液とし、ポリペプチド合成基質溶液
を透析外液として含み、かつ該透析内液と該透析外液が
物質移動を可能とする透析膜によって隔離されている該
無細胞タンパク質合成系を振とうまたは攪拌することを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記透析外液を反応速度が低下した時点
で新鮮なものと交換することをさらに含むことを特徴と
する請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記透析膜が１００００ダルトンを超え
る分子量限界をもつことを特徴とする請求項１〜３のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 前記濃縮細胞抽出液が大腸菌、小麦胚
芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹
水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母などの
真核または原核細胞の濃縮細胞抽出液であることを特徴
とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 前記濃縮細胞抽出液が濃縮大腸菌Ｓ３０
細胞抽出液であることを特徴とする請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 前記濃縮細胞抽出液が、前記真核または
原核細胞の粗細胞抽出液を透析、限外濾過、ＰＥＧ沈殿
などの濃縮法によって濃縮して得られることを特徴とす
る請求項５または６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記濃縮細胞抽出液が、振とうまたは攪
拌可能な閉鎖系で、大腸菌Ａ１９株（ｒｎａ，ｍｅｔ）
から既知の方法で得られた大腸菌Ｓ３０抽出液を透析内
液とし、分子量限界１０００〜１４０００の透析膜を介
して透析外液に対して透析を行うことによって得られる
ものであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記透析外液が、酢酸カリウム、酢酸マ
グネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、
ポリエチエレングリコール、もしくはショ糖／エピクロ
ルヒドリン水溶性合成共重合体、とを含むものであるこ
とを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記無細胞タンパク質合成系が、ＡＴ
Ｐ再生系としてクレアチンキナーゼとクレアチンホスフ
ェートの組合わせを含むことを特徴とする請求項１〜９
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成
系によるポリペプチドの製造方法において、大腸菌由来
の細胞抽出液ならびにＡＴＰ再生系としてのクレアチン
キナーゼとクレアチンホスフェートの組合わせを含む無
細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドをコードする
核酸の翻訳または転写/翻訳を介して該ポリペプチドを
生成し、該ポリペプチドを回収することを含む前記方
法。 - 【請求項１２】 前記細胞抽出液が大腸菌Ｓ３０細胞抽
出液であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP35466598A JP2000175695A (ja) | 1998-12-14 | 1998-12-14 | 無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法 |
| EP99961297A EP1143009A4 (en) | 1998-12-14 | 1999-12-14 | PROCESS FOR PRODUCING POLYPEPTIDE IN A CELLULAR PROTEIN SYNTHESIS SYSTEM |
| CA002354534A CA2354534A1 (en) | 1998-12-14 | 1999-12-14 | Process for producing polypeptide in cell-free protein synthesis system |
| PCT/JP1999/007016 WO2000036133A1 (fr) | 1998-12-14 | 1999-12-14 | Procede de production d'un polypeptide dans un systeme de synthese proteique acellulaire |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35466598A JP2000175695A (ja) | 1998-12-14 | 1998-12-14 | 無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000175695A true JP2000175695A (ja) | 2000-06-27 |
Family
ID=18439091
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP35466598A Pending JP2000175695A (ja) | 1998-12-14 | 1998-12-14 | 無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法 |
Country Status (4)
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|---|---|
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| JP (1) | JP2000175695A (ja) |
| CA (1) | CA2354534A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002262867A (ja) * | 2001-03-08 | 2002-09-17 | Inst Of Physical & Chemical Res | 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 |
| WO2002090537A1 (en) * | 2001-05-02 | 2002-11-14 | Riken | Process for synthesizing protein using cell-free protein synthesis system |
| WO2002099437A1 (fr) * | 2001-05-31 | 2002-12-12 | Riken | Methode d'analyse de structure de proteines par spectroscopie de masse |
| WO2005047518A1 (ja) * | 2003-11-13 | 2005-05-26 | Shimadzu Corporation | 無細胞系タンパク質合成におけるミクロソーム膜添加による翻訳後修飾方法 |
| US6916623B2 (en) | 2001-03-06 | 2005-07-12 | Riken | Methods for producing protein domains and analyzing three dimensional structures of proteins by using said domains |
| WO2006051908A1 (ja) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | 無細胞タンパク質合成方法 |
| WO2009060857A1 (ja) | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Riken | 膜タンパク質の製造方法 |
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| US8603774B2 (en) | 2002-11-28 | 2013-12-10 | National Food Research Institute | Extract of E. coli cells having mutation in ribosomal protein S12, and method for producing protein in cell-free system using the extract |
| US8664355B2 (en) | 2004-11-19 | 2014-03-04 | Riken | Cell-free protein synthesis method with the use of linear template DNA and cell extract therefor |
| WO2015025865A1 (ja) * | 2013-08-21 | 2015-02-26 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 酵素の保存液およびそれを用いた再構成型無細胞翻訳システム用反応液 |
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| EP1995324A1 (en) * | 2007-05-22 | 2008-11-26 | ETH Zurich | Cell-free protein synthesis of deuterated proteins for structural and functional studies by NMR spectroscopy |
| JP6159808B2 (ja) * | 2012-11-30 | 2017-07-05 | バイオニア コーポレーション | 全自動無細胞タンパク質製造装備及びこれを利用したタンパク質の製造方法 |
| WO2017004504A1 (en) * | 2015-07-02 | 2017-01-05 | The University Of Massachusetts | Membrane and droplet-interface bilayer systems and methods |
| WO2017022696A1 (ja) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 膜タンパク質の製造方法およびその利用 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2895220B2 (ja) * | 1990-05-29 | 1999-05-24 | インスティテュト、ベルカ、ロシイスコイ、アカデミイ、ナウク | 無細胞翻訳系におけるポリペプチドの製造方法 |
| JPH06225783A (ja) * | 1992-12-07 | 1994-08-16 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 無細胞タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法 |
| KR960701892A (ko) * | 1993-04-08 | 1996-03-28 | 제임스 에프. 와일러 | 단백질 합성을 위한 세포 비함유 시스템 및 이러한 시스템내에서의 카페론 단백질의 용도(Cell free system for protein synthesis and use of chaperone proteins therein) |
| JP3434319B2 (ja) * | 1993-06-15 | 2003-08-04 | 日本製粉株式会社 | 無細胞タンパク合成系によるタンパクの製造方法 |
| KR0131166B1 (ko) * | 1994-05-04 | 1998-04-11 | 최차용 | 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법 |
| JPH09291A (ja) * | 1995-06-15 | 1997-01-07 | Hitachi Ltd | 無細胞蛋白質合成系における活性型蛋白質の合成方法 |
| JPH1080295A (ja) * | 1996-07-15 | 1998-03-31 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置 |
-
1998
- 1998-12-14 JP JP35466598A patent/JP2000175695A/ja active Pending
-
1999
- 1999-12-14 WO PCT/JP1999/007016 patent/WO2000036133A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1999-12-14 CA CA002354534A patent/CA2354534A1/en not_active Abandoned
- 1999-12-14 EP EP99961297A patent/EP1143009A4/en not_active Withdrawn
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6916623B2 (en) | 2001-03-06 | 2005-07-12 | Riken | Methods for producing protein domains and analyzing three dimensional structures of proteins by using said domains |
| US6951734B2 (en) * | 2001-03-08 | 2005-10-04 | Riken | Methods for producing proteins by using cell-free protein synthesis systems |
| JP2002262867A (ja) * | 2001-03-08 | 2002-09-17 | Inst Of Physical & Chemical Res | 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 |
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Also Published As
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