JP2000175695A - 無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法 - Google Patents
無細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法Info
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Abstract
比べて、より短時間に、より高い合成量かつより低コス
トでポリペプチドを合成するための方法を提供するこ
と。 【解決手段】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成系
によるポリぺプチドの製造方法において、濃縮細胞抽出
液を含む無細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドを
コードする核酸の翻訳又は転写/翻訳を介して該ポリペ
プチドを生成し、該ポリペプチドを回収することを含む
方法。
Description
細胞タンパク質合成系によるポリペプチドの製造方法に
関する。
を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。細
胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網赤血
球由来のものが使用される。無細胞タンパク質合成系
は、系を容易に改変することができるため、目的のタン
パク質に適した発現系を構築しやすい。また、PCRを
用いて作成したリニアDNAを鋳型として用いることが
できる。これにより、生細胞による発現系にて必要とさ
れた、ベクターへのライゲーション、トランスフォーメ
ーション、培養、集菌、溶菌といった時間と手間のかか
る工程が一切不要となり、短時間で容易にタンパク質を
発現することができる。しかし、タンパク質合成量が少
ない欠点があり、応用が限られていた。
960年代に合成系が発表されてから今日まで続けられ
てきた。合成系が開発された当時の試験管内での反応法
(バッチ法)の無細胞タンパク質合成系はタンパク質合
成量が少なく、ラジオアイソトープ標識により発現が確
認できる程度のものであった。合成量改善の歴史で一大
転機となったのは1988年Spirinらによるフロ
ー法の開発である(Science 1988,24
2,1162−1164;特表平1−503119号公
報)。これは、タンパク質合成のための基質であるアミ
ノ酸、ATP、GTP等をポンプにより連続的に供給
し、同時に限外濾過膜を介して流出した反応液より反応
産物の回収を連続的に行うという方法である。フロー法
によりそれまで数時間で停止していた合成反応の継続時
間が数十時間に延長された。これに伴いタンパク質の合
成量は飛躍的に増大し、1mlの反応液あたり100μ
gのタンパク質の生産が可能となった。この結果を受け
て、無細胞タンパク質合成系はタンパク質の発現系とし
て注目を浴びることになる。その後、いくつかのグルー
プによりフロー法の報告がなされた(特開平4−200
390号公報)。しかし、フロー法にはタンパク質合成
量の割に大量の基質が必要である、膜が目詰まりして反
応が停止しやすい、特殊な装置が必要であるという問題
点があった。
供給しながら同時に合成を行うシステムが報告された。
Kim とChoi(Biotechnol. Pro
g.1996,12,645−649)は、透析膜を底
に張ったチャンバーを開発し、このチャンバーを基質溶
液に漬けてタンパク質合成を行った。Davisら(P
romega Notes Magazine Num
ber 56, 1996, p.14−18, Pr
omega Corporation)は、市販の透析
ユニットを利用しこれにより、フロー法と比較して簡便
な装置を用いて合成反応持続時間の延長が可能であるこ
とが示された。
の変更による合成量改善法も検討された。反応に用いる
細胞抽出液を限外濾過遠心により濃縮することにより、
合成速度の向上が報告されている(Nakanoら,B
iosci. Biotech. Biochem.,
58,631−634;Kimら,Eur.J.Bio
chem.239,881−886(1996))。ま
た、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系において、A
TP再生系として従来用いられていたホスホエノールピ
ルベート(PEP)とピルビン酸キナーゼ(PK)の組
合わせを、クレアチンホスフェート(CP)とクレアチ
ンキナーゼ(CK)の組み合わせに変更し、さらに、そ
の他の反応液組成の最適化によりバッチ法でも1mlの
反応液あたり数百μg(Yabukiら,Journa
l of Biomolecular NMR,11:
295−306,1998)の生産量である。ここで、
PEP、CPはいずれもATP再生のための基質であ
り、またPK、CKはいずれもADPをATPに再生す
る酵素である。PK、CKはそれぞれPEP、CPを基
質として必要とする。現在までに、無細胞タンパク質系
で得られた最大の合成量はKimとChoi(上掲)に
よる14時間で1.2mg/mlである。合成速度は1
時間あたり約80μg/mlで、使用した基質1mlあ
たりの合成量は約100μgであった。
胞タンパク質合成系において従来法よりも、より短時間
に、より高い合成量でかつより低コストでポリペプチド
を製造するための方法を提供することである。
た無細胞タンパク質合成系によるポリぺプチドの製造方
法において、濃縮細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合
成系中で該ポリペプチドをコードする核酸の翻訳または
転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成し、該ポリペ
プチドを回収することを含む方法を提供する。
出液を含有するポリペプチド合成反応液を透析内液とし
ポリペプチド合成基質溶液を透析外液として含み、かつ
該透析内液と該透析外液が物質移動を可能とする透析膜
によって隔離されている該無細胞タンパク質合成系を振
とうまたは攪拌することを含むことができる。本発明に
おいて、上記無細胞タンパク質合成系の透析外液は反応
速度が低下した時点で新鮮なものと交換することができ
る。本発明において、透析膜は10000ダルトンを超
える分子量限界、好ましくは約50000ダルトンおよ
びそれ以上の分子量限界をもつことができる。
菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エー
ルリッヒ腹水癌細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽
酵母などの真核、原核細胞の粗細胞抽出液を濃縮したも
のである。本発明の実施態様において、そのような濃縮
細胞抽出液は大腸菌S30細胞抽出液を濃縮したもので
ある。濃縮細胞抽出液は、上記の粗細胞抽出液を透析、
限外濾過、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿など
の濃縮法によって濃縮して得ることができる。例えば、
大腸菌S30細胞抽出液の濃縮は、振とうまたは攪拌可
能な閉鎖系で、大腸菌A19株(rna,met)から
既知の方法(Zubayら(1973)Ann.Re
v.Genet.7:267−287)で得られた大腸
菌S30抽出液(Promega社からも入手可能)を
透析内液とし、分子量限界1000〜14000の透析
膜を介して透析外液に対して透析を行うことによって得
ることができる。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、
酢酸マグネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝
液と、ポリエチエレングリコール、もしくはショ糖/エ
ピクロルヒドリン水溶性合成共重合体(例えばSIGM
A社製のFicoll)、とを含むことができる。
成系はATP再生系としてクレアチンキナーゼとクレア
チンホスフェートの組合わせを含むことができる。本発
明はさらに、透析法を用いた無細胞タンパク質合成系に
よるポリペプチドの製造方法において、大腸菌由来の細
胞抽出液ならびにATP再生系としてのクレアチンキナ
ーゼとクレアチンホスフェートの組合わせを含む無細胞
タンパク質合成系中で該ポリペプチドをコードする核酸
の翻訳または転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成
し、該ポリペプチドを回収することを含む方法を提供す
る。大腸菌由来の細胞抽出液は濃縮されていてもよいし
あるいは未濃縮であってもよい。本発明の実施態様にお
いて、上記細胞抽出液は大腸菌S30細胞抽出液であ
る。
系」は、mRNAの情報を読み取ってリボソーム上でポ
リペプチドを合成する無細胞翻訳系、DNAを鋳型とし
てRNAを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者
を含むものを包含する。本明細書でいう「濃縮細胞抽出
液」は、リボソーム、tRNAなどのタンパク質合成に
必要な成分を含む真核および原核生物細胞の粗抽出液を
透析、限外濾過、PEG沈殿(H.Nakanoら,J
ournalofBiotechnology,46
(1996)275−282)などの既知の濃縮法また
は新規に見出される濃縮法によって濃縮されたものを意
味し、該抽出液はタンパク質インビボ合成に関与する翻
訳系または転写系/翻訳系の成分を含む。「濃縮」は、
抽出液中の総タンパク質濃度を指標として、その濃度の
増加を意味する。
のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチ
ド、すなわち低分子量(小ペプチド)から高分子量(タ
ンパク質を含む大ペプチド)のいずれも包含するものと
する。本明細書でいう「核酸」とはRNA、mRNA、
DNA、cDNAのいずれかを指す。
本発明者らは、透析を用いた無細胞タンパク質合成法に
おいて、透析内液中に粗細胞抽出液の濃縮液を用いると
きに、未濃縮の抽出液を用いたときと比べて著しくポリ
ペプチドの生産量が向上することを意外にも見出した。
また、同時に、分子量限界の大きな透析膜を用いること
により、および/または透析外液を反応速度が低下した
時点で新鮮なものと交換することにより、ポリペプチド
の合成量をさらに改善できることを見出した。
等)、菌類(例えば出芽酵母等)、小麦胚芽、ウサギ網
赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、H
eLa細胞、CHO細胞等の、高いタンパク質合成活性
の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であるこ
とができる(Clemens,M.J.,Transc
riptionandtranslation−apr
acticalapproach,(1984),p
p.231−270,Henes,B.D.とHigg
ins,S.J.編,IRLPress,Oxfor
d)。上記定義のとおり、粗細胞抽出液はリボソーム、
tRNAなどのタンパク質合成に必要な成分を含む。粗
抽出液の調製は例えばPratt,J.M.ら,Tra
nscriptionandtranslation−
apracticalapproach,(198
4),pp.179−209,Henes,B.D.と
Higgins,S.J.編,IRLPress,Ox
ford)に記載の方法を使用できる。具体的には、フ
レンチプレッスによる破砕(Prattら,上掲)やグ
ラスビーズを用いた破砕(Kimら,上掲)によって行
うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌S30細
胞抽出液である。S30細胞抽出液は、大腸菌A19株
(rna,met)から既知の方法、例えばPratt
ら(上掲)の方法に従って調製できるし、あるいはPr
omega社やNovagen社から市販されるものを
使用してもよい。
パク質濃度が増加するように濃縮する必要があるが、濃
縮は任意の手段例えば限外濾過(限外濾過遠心を含
む)、透析、PEG沈殿などによって行うことができ
る。濃縮の度合いは、通常1.5倍以上、好ましくは2
倍以上である。大腸菌由来の細胞抽出液の場合、限外濾
過遠心で1.5〜7倍以上、PEG沈殿で1.5〜5倍
以上まで濃縮可能であるが、4倍を超えるとハンドリン
グが難しくなる。また、小麦胚芽抽出液の場合、PEG
沈殿で10倍の濃縮が可能である(Nakano,H.
ら,上掲)。PEG沈殿による方法では、細胞抽出液に
PEG水溶液を混ぜることによりタンパク質、核酸を沈
殿させて回収し、これを少量の緩衝液に溶かすことによ
り濃縮細胞抽出液を得ることができる。透析による濃縮
は、例えば後述の実施例1に記載の方法によって実施可
能である。すなわち、1つの方法では、振とうまたは攪
拌可能な閉鎖系で細胞抽出液を透析内液とし、透析膜
(例えば分子量限界1000〜14000)を介して透
析外液に対して透析を行うことによって得ることができ
る。ここで、透析外液は、酢酸カリウム、酢酸マグネシ
ウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、PEG
(例えば#8000)、ショ糖/エピクロルヒドリン水
溶性合成共重合体(例えばSIGMA社製のFicol
l)等の高分子吸収剤とを含むことができる。高分子吸
収剤は水分を吸い出すために必須である。
2年にBecklerら(ASMposterpres
entation,1992)が初めて報告し、その後
Davisら(上掲)が同じ系を利用した大スケール透
析反応を記載しているが、そのいずれにおいてもS30
抽出液は未濃縮のものが用いられてきた。また、Dav
isら(上掲)のFig.4Cには、透析膜の分子量限
界の違いが合成量に与える影響について示されている
が、たとえ分子量限界の大きなものを用いてもポリペプ
チド合成量の向上量は小さい。
抽出液を濃縮し、その濃縮液を透析内液に用いることに
よって、および/または分子量限界のより大きい透析膜
を使用することによって、および/または反応速度の低
下が認められる時点で透析外液を新鮮なものと交換する
ことによって、従来法によるものをはるかに凌ぐポリペ
プチドの高い生産量を達成することができる。このよう
に優れた効果は、例えば無細胞系でのクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)またはRa
sタンパク質の生産量の経時変化に関する図2、図3に
示されている(実施例3および4参照)。CATの合成
量をみると、12時間での反応で5mg/ml、21時
間の反応で6mg/mlまで向上した。無細胞系でのC
ATの合成で従来最も高い生産量は14時間で1.2m
g/ml(KimとChoi、上掲)であるが、本発明
では約4倍以上高い生産量が得られる。
外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装
置を用いることができる。小スケール反応用装置として
は、例えばDispoDialyzer(登録商標)
(Spectrum社製)やSlidealyzer
(登録商標)(Pierce社製)が挙げられる。ま
た、大スケール反応用装置としては、Spectra/
Por(登録商標)透析用チューブ(Spectrum
社製)を例示できる。
(すなわち、ポリペプチド合成反応液)には、大腸菌S
30等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のポリペプチドを
コードするDNAもしくはRNA(mRNA等)、AT
P(アデノシン5’−三リン酸)、GTP(グアノシン
5’−三リン酸)、CTP(シチジン5’−三リン
酸)、UTP(ウリジン5’−三リン酸)、緩衝液、塩
類、アミノ酸、RNアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要により
RNAポリメラーゼ(DNAを鋳型として用いる場合)
およびtRNA、などを含むことができる。その他、A
TP再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン
酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートと
クレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコー
ル(例えば#8000)、3’,5’−cAMP、葉酸
類、RNアーゼ阻害剤、還元剤(例えばジチオトレイト
ール)、などを含むことができる。一方、透析外液(す
なわち、ポリペプチド合成基質溶液)は、透析内液組成
から細胞抽出液、RNアーゼ阻害剤、DNAもしくはR
NA、RNAポリメラーゼを除いたものが使用できる。
例えば、緩衝液、ATP、GTP、CTP、UTP,塩
類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成
分の濃度は任意に選択することができる。
H、Tris−OAcのような緩衝剤を使用できる。塩
類の例は、酢酸塩(例えばアンモニウム塩、マグネシウ
ム塩など)、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例は
アジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸
はタンパク質を構成する20種のアミノ酸である。ま
た、DNAを鋳型として用いる場合にはRNAポリメラ
ーゼを反応系に添加するが、例えばT7RNAポリメラ
ーゼなどの市販の酵素を使用できる。
タンパク質合成系において、大腸菌由来の細胞抽出液な
らびにATP再生系としてのクレアチンキナーゼとクレ
アチンホスフェートの組合わせを含む無細胞タンパク質
合成系中で該ポリペプチドをコードする核酸の翻訳また
は転写/翻訳を介して該ポリペプチドを生成し、該ポリ
ペプチドを回収することによっても、従来の方法による
合成効率を超えるという利点が得られる。このことは図
1に結果から明らかであり、この場合細胞抽出液は濃縮
されていても未濃縮であってもよいが濃縮細胞抽出液の
方がより好ましい。本発明の実施態様において細胞抽出
液は大腸菌S30細胞抽出液であるが、これに限定され
ない。無細胞タンパク質合成系のその他の成分等の条件
は上述したものを適用できる。
とおり小ペプチドから大ペプチドに至る任意のものを対
象とし、公知のものまたは新規のものを含む。目的のポ
リペプチドをコードするDNAまたはRNAは、真核ま
たは原核生物の細胞もしくは組織からゲノムDNA、m
RNAとして周知の方法(フェノール/クロロホルム処
理、エタノール沈殿、塩化セシウム密度勾配遠心など)
で得るか、あるいは、cDNAクローニングで合成・単
離することができる。あるいは、ポリペプチドのアミノ
酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列が判明
している場合には、DNA合成機を用いて化学的に合成
することもできる。
装置を使用し、透析膜の内部に上記透析内液を、一方そ
の外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物
質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪
拌(回転攪拌など)し、生成した目的ポリペプチドを、
透析内液または外液から回収することができる。温度お
よび攪拌速度などの反応条件は、ポリペプチドの種類に
応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場
合、温度は通常約25〜約50℃、好ましくは37℃で
あるが、高度高熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タ
ンパク質合成系では50℃を超える温度でもよい。ま
た、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば100
〜200rpmを使用できる。目的のポリペプチドの生
成を監視しながら、反応時間を適当に選択することがで
きる。
合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮な
ものと交換する場合、および/または、透析膜の分子量
限界が10000ダルトンを超えるもの、好ましくは約
50000ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場
合には、ポリペプチドの生産量をさらに高めることがで
きる。
分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に
少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法
は、ポリペプチドの性質に応じて従来公知のものを単独
にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモ
ニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしく
はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー、HPLC、電気泳
動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げる
ことができる。生成ポリペプチドの同定および定量は、
活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析
などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しなが
ら行うことができる。本発明を実施例でさらに詳しく説
明するが、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲は以下
の実施例によって制限されないものとする。
ev. Genet.7:267−187, 197
3)の方法に従って、大腸菌A19株(rna,me
t)から調製した。
ーブSpectra/Pro2(分子量限界,1200
0〜14000,Spectrum社製)に入れ透析チ
ューブクランプで封をした後、50mlの溶液B[25
gのポリエチレングリコール8000(PEG800
0)に溶液A(10mM Tris−HCl (pH
8.2),60mM CH3COOK,14mM Mg
(CH3COO)2,1mMジチオトレトール(DT
T))を加え、容量を50mlとしたもの]と共にヒー
トシールバッグ(Heat Seal Bag, Ya
mamoto社製)に入れてヒートシーラーで密封し
た。これをローテーターに取り付けて4℃で45分間、
毎分約10回転で回転攪拌した。
を取り出し、溶液の減少に応じて透析チューブクランプ
の位置を調節した後、4℃で15分間500mlの溶液
Aに対し透析した。上記の方法により、タンパク質濃度
で約2倍に濃縮された大腸菌S30抽出液を得た。
合成法によるCAT(クロラムフェ ニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ)の合成 タンパク質合成反応液(透析内液)の組成は、55mM
Hepes−KOH(pH7.5),5mM DT
T,1.2mM ATP,各々0.8mM のCTP,
GTPおよびUTP,80mMクレアチンホスフェー
ト,250μg/mlクレアチンキナーゼ,4.0%
(w/v)PEG8000,0.64mM3’,5’−
cAMP,68μM L−(−)−5−フォルミル−
5,6,7,8−テトラヒドロ葉酸,175μg/ml
E. coli tRNA (Boehringer
−Mannheim社製),210mM グルタミン酸
カリウム,27.5mM NH4OAc,10.7mM
Mg(CH3COO)2,各々1mMの20種のタンパ
ク質構成アミノ酸,0.05% NaN3,6.7μg
/ml pK7−CAT DNA(CAT発現ベクタ
ー;Kimら(1996)Eur.J.Bioche
m.,239:881−886),93μg/mlT7
RNAポリメラーゼ,0.5ユニット/μl RNアー
ゼ阻害剤(Toyobo社製),0.3容積の実施例1
からの大腸菌S30抽出液もしくは濃縮した大腸菌S3
0抽出液であった。
成は、透析内液から大腸菌S30抽出液,RNアーゼ阻
害剤,DNA,T7 RNA ポリメラーゼを除き、
4.2mMMg(CH3COO)2を追加したものであっ
た。300μlの透析内液を入れたDispo/Dia
lyzer CE(分子量限界10000もしくは50
000,Spectrum社製)を、3000μlの透
析外液の入った15mlチューブに入れ、試験管用振と
う培養器で37℃、160rpmで振とうすることによ
りタンパク質合成を行った。
量は、Shaw(1975)MethodsEnzym
ol,p.735−755に従い以下の方法で行った。
すなわち、アセチルコエンザイムAとクロラムフェニコ
ールを基質としてCATによるクロラムフェニコールの
アセチル化反応を行い、その結果生じた還元型コエンザ
イムAを5,5’−ジチオビス−2−ニトロ安息香酸
(DTNB)を用いて発色定量した。37℃、412n
mにおける吸光度の単位時間あたりの増加量よりCAT
の活性を定量し、これを指標としてCATタンパク質量
を決定した。合成反応開始後、6時間におけるCATの
量を図1に示す。濃縮していない大腸菌S30抽出液を
使用した場合は2mg/ml、濃縮したS30抽出液を
使用した場合は3mg/mlの収量を得た。
合成法(反応途中で透析外液を交換) によるCATの合
成 実施例1の方法で濃縮した大腸菌S30抽出液を使用し
て実施例2に記載の反応試験を行った場合の、合成開始
後各時間におけるCATの量を図2に示す。反応開始後
6時間でCATの合成速度は低下した。同等の反応試験
において、反応速度が低下する時刻(ここでは6時間)
に透析外液を新たなものに交換したところ、合成反応は
長時間継続し、反応開始後12時間で5mg/ml、21時
間では6mg/mlのCATを合成することができた
(図2)。
合成法によるRasの合成 濃縮した大腸菌S30抽出液を使用し、pK7−CAT
の代わりにpK7−Ras(Rasタンパク質の発現ベ
クター;Kigawaら(1995)J.Biomo
l.NMR,6:129−134)を用い、1mMロイ
シンの代わりに1mM[14C]−ロイシン(18.5M
Bq/mmol,Amersham社製)を用いた他は
実施例2と同等の方法にてタンパク質の合成反応を行っ
た。Rasタンパク質の合成量を、フィルター上での5
%トリクロロ酢酸を利用しての沈降法を用いて定量し
た。その結果、Rasタンパク質の合成量は反応開始後
6時間で3mg/mlであった。
来法と比較すると、以下の利点が提供される。 (1)タンパク質合成量 本発明の方法によるタンパク質のCAT合成量6mg/
ml(実施例3)は従来法(KimとChoi;上掲)
の値1.2mg/mlを大きく上回り、工業的なタンパ
ク質生産を行ううえで有利である。本発明で使用した大
腸菌抽出液1mlあたりのタンパク質の合成量は約8m
gであり、従来法での値約3mgを上回る。したがっ
て、本発明の方法による反応液からは純度の高いタンパ
ク質をより簡便に精製することができる。
g/mlであり、従来法の約80μg/mlを大幅に上
回る。より短時間に同量のタンパク質を合成できること
は、分解を受け易いタンパク質、変性し易いタンパク質
を合成する上で有利である。
合成量は約500μgであり、従来法での値100μg
/mlを大幅に上回る。このため、本発明の方法では、
従来法よりはるかに低いコストでタンパク質を生産する
ことができる。
系における、透析膜の分子量限界と使用する大腸菌S3
0抽出液の濃縮の有無に対する反応開始6時間後のCA
Tの合成量を示す。
系における、透析外液交換の有無と合成時間に対するC
ATの合成量の関係を示す。
系における、合成時間に対するRasの合成量を示す。
Claims (12)
- 【請求項1】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成系
によるポリぺプチドの製造方法において、濃縮細胞抽出
液を含む無細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドを
コードする核酸の翻訳または転写/翻訳を介して該ポリ
ペプチドを生成し、該ポリペプチドを回収することを含
む前記方法。 - 【請求項2】 濃縮細胞抽出液を含有するポリペプチド
合成反応液を透析内液とし、ポリペプチド合成基質溶液
を透析外液として含み、かつ該透析内液と該透析外液が
物質移動を可能とする透析膜によって隔離されている該
無細胞タンパク質合成系を振とうまたは攪拌することを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記透析外液を反応速度が低下した時点
で新鮮なものと交換することをさらに含むことを特徴と
する請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記透析膜が10000ダルトンを超え
る分子量限界をもつことを特徴とする請求項1〜3のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 前記濃縮細胞抽出液が大腸菌、小麦胚
芽、ウサギ網赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹
水癌細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母などの
真核または原核細胞の濃縮細胞抽出液であることを特徴
とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 前記濃縮細胞抽出液が濃縮大腸菌S30
細胞抽出液であることを特徴とする請求項5に記載の方
法。 - 【請求項7】 前記濃縮細胞抽出液が、前記真核または
原核細胞の粗細胞抽出液を透析、限外濾過、PEG沈殿
などの濃縮法によって濃縮して得られることを特徴とす
る請求項5または6に記載の方法。 - 【請求項8】 前記濃縮細胞抽出液が、振とうまたは攪
拌可能な閉鎖系で、大腸菌A19株(rna,met)
から既知の方法で得られた大腸菌S30抽出液を透析内
液とし、分子量限界1000〜14000の透析膜を介
して透析外液に対して透析を行うことによって得られる
ものであることを特徴とする請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 前記透析外液が、酢酸カリウム、酢酸マ
グネシウム、ジチオトレイトールを含有する緩衝液と、
ポリエチエレングリコール、もしくはショ糖/エピクロ
ルヒドリン水溶性合成共重合体、とを含むものであるこ
とを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記無細胞タンパク質合成系が、AT
P再生系としてクレアチンキナーゼとクレアチンホスフ
ェートの組合わせを含むことを特徴とする請求項1〜9
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項11】 透析法を用いた無細胞タンパク質合成
系によるポリペプチドの製造方法において、大腸菌由来
の細胞抽出液ならびにATP再生系としてのクレアチン
キナーゼとクレアチンホスフェートの組合わせを含む無
細胞タンパク質合成系中で該ポリペプチドをコードする
核酸の翻訳または転写/翻訳を介して該ポリペプチドを
生成し、該ポリペプチドを回収することを含む前記方
法。 - 【請求項12】 前記細胞抽出液が大腸菌S30細胞抽
出液であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
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