WO2015025865A1 - 酵素の保存液およびそれを用いた再構成型無細胞翻訳システム用反応液 - Google Patents

酵素の保存液およびそれを用いた再構成型無細胞翻訳システム用反応液 Download PDF

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WO2015025865A1
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solution
free translation
aqueous solution
cell
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哲也 四方
友亮 松浦
恭章 數田
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独立行政法人科学技術振興機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)

Definitions

  • the present invention relates to a storage solution for an enzyme used in a reconstituted cell-free translation system that has been purified and recombined after purification of proteinaceous factors, ribosomes, RNA, and the like necessary for protein translation, and a reconstitution using the storage solution.
  • the present invention relates to a reaction solution for a constitutive cell-free translation system.
  • a cell-free translation system is known as a technique for synthesizing proteins by artificially translating DNA and RNA, and there are many commercially available products.
  • a cell-free translation system an extract-type cell-free translation system that uses a crude extract from cells and a protein factor, ribosome, RNA, etc. necessary for protein synthesis were purified and recombined to reconstitute.
  • a reconstructed cell-free translation system is known (see, for example, Shimizu et al., Nature Biotechnology (2001) 19, 751-755 (Non-patent Document 1)).
  • reconstituted cell-free translation system can grasp and control what kind of components are in the system, and mix There is an advantage that the reaction inhibitor can be kept as low as possible.
  • the reconstituted cell-free translation system so far has a much lower protein synthesis activity than the extract-type cell-free translation system.
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and the object of the present invention is to provide a reconfigurable cell-free translation system that can significantly improve the efficiency of protein synthesis as compared with the prior art. Providing a reaction solution.
  • the present invention is an enzyme preservation solution having a chloride salt concentration of 10 mM or less and a glycerol concentration of 5% or less.
  • the preservation solution of the present invention preferably contains no chloride salt, and the chloride salt is particularly preferably at least one of potassium chloride and magnesium chloride.
  • the preservation solution of the present invention preferably does not contain glycerol.
  • the preservation solution of the present invention preferably contains potassium glutamate, potassium acetate or potassium aspartate.
  • the preservation solution of the present invention preferably contains magnesium glutamate, magnesium acetate or magnesium aspartate.
  • the enzyme preservation solution of the present invention is preferably an enzyme preservation solution for use in a reconstituted cell-free translation system.
  • the present invention also provides a reaction solution for a reconstituted cell-free translation system containing the above-described preservation solution of the present invention.
  • the amount of protein synthesis can be remarkably increased as compared with a conventional reconstituted cell-free translation system.
  • the amount of protein synthesized can be significantly increased by protein synthesis using a dialysis system that could not be achieved by conventional reconstituted cell-free translation systems.
  • group reaction apparatus 1 which can utilize suitably the reaction liquid for reconfigurable cell-free translation systems of this invention. 10 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 4.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 5.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 6.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 7.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 8.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 8.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 8.
  • the present invention is an enzyme storage solution suitable for storing an enzyme for use in a reconstituted cell-free translation system, wherein the chloride salt concentration is 10 mM or less and the glycerol concentration is 5% or less. It is a certain enzyme preservation solution.
  • the present inventors can remarkably improve the efficiency of protein synthesis, which has been a problem in the conventional reconstitution type, by changing the composition of the enzyme preservation solution used in the reconstitution type cell-free translation system from the conventional one. I found out that I can do it.
  • chloride salts and glycerol that are conventionally included in enzyme preservation solutions for use in reconstituted cell-free translation systems actually act to inhibit reconstituted cell-free translation.
  • the enzyme preservation solution of the present invention is suitable for storing an enzyme for a reconstituted cell-free translation system as described above, but is used for storing an enzyme for a purpose other than that for a reconstituted cell-free translation system. Of course.
  • FIG. 1 shows reaction solution 1 (Example 1), reaction solution 2 (Comparative Example 1), reaction solution 3 (Example 2), and reaction solution 4 (Comparative Example 2), respectively, in Experimental Example 1 described later. It is a graph which shows the result of the reconstruction type
  • Reaction solutions 1 and 3 are cases in which a stock solution of an enzyme that does not contain chloride salt and glycerol is used
  • reaction solutions 2 and 4 are cases in which a conventional chloride salt and glycerol are included.
  • the composition of the conventional storage solution used for the reaction solutions 2 and 4 is as follows.
  • composition of the storage solution (in this case, dialysis buffer) used for the reaction solutions 1 and 3 is as follows.
  • the preservation solution of the present invention 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6) 100 mM potassium glutamate (KGlu) 10 mM magnesium acetate (Mg (OAc) 2 ) 7mM 2-mercaptoethanol
  • the preservation solution of the present invention does not contain potassium chloride or magnesium chloride as the chloride salt, but instead contains potassium glutamate as the potassium salt and magnesium acetate as the magnesium salt. It is out.
  • the preservation solution of the present invention does not contain glycerol. From the results shown in FIG. 1, it can be understood that the efficiency of cell-free translation is remarkably different due to the difference in the composition of the used preservation solution.
  • Patent Document 1 discloses that magnesium is added to a reaction composition in order to increase efficiency, but Cl 2 ⁇ inhibits protein synthesis in a cell-free translation system. Therefore, it is described that it is preferable to supply magnesium as Mg (CH 3 COO) 2 instead of MgCl 2 .
  • Mg CH 3 COO
  • glycerol has the effect of stabilizing the protein in an aqueous solution, and is said to stabilize the protein in the process of freezing and thawing, and has been included in conventional storage solutions.
  • the usage guide http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj27
  • the crude cell-free translation system S30 T7 High-Yield Protein Expression System sold by Promega. /PJ_No27-3.pdf
  • Non-Patent Document 2 describes that a high concentration of glycerol or salt should not be added to the template DNA in order to increase the protein yield.
  • this non-patent document 2 also relates to extract-type cell-free translation, and does not suggest any teaching regarding glycerol in an enzyme preservation solution used in a reconstituted cell-free translation system. Moreover, there is no teaching or suggestion of simultaneously changing the chloride salt and glycerol in the stock solution.
  • the preservation solution of the present invention has a chloride salt concentration of 10 mM or less and a glycerol concentration of 5% or less, but preferably does not contain a chloride salt.
  • the chloride salt include potassium chloride and It is more preferable that it is at least one of magnesium chloride, and it is particularly preferable that both potassium chloride and magnesium chloride are not included. Moreover, it is preferable that the preservation solution of the present invention does not contain glycerol.
  • the preservation solution of the present invention preferably contains potassium glutamate, potassium acetate or potassium aspartate as a potassium salt instead of potassium chloride. If any of these potassium salts is used, the effect of efficient cell-free translation according to the present invention is exhibited.
  • the preservation solution of the present invention preferably contains magnesium glutamate, magnesium acetate or magnesium aspartate as a magnesium salt instead of magnesium chloride.
  • Enzymes to be preserved by the preservation solution of the present invention include enzymes used in reconstituted cell-free translation systems (for example, enzymes that improve the three types of translation reactions of HrpA, Tig, and Pth and ribosomes that are RNA protein complexes) ).
  • the present invention also provides a reaction solution for a reconstituted cell-free translation system comprising the preservation solution of the present invention.
  • the reaction solution for the reconstituted cell-free translation system of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described preservation solution of the present invention, and the composition thereof is a conventionally known appropriate reconstituted cell-free translation. It may be a reaction solution for the system.
  • the present inventor prepared a reaction solution containing the preservation solution of the present invention and having an optimized composition, and the results are shown in FIG. Even so, it can be understood that the efficiency of cell-free translation is significantly improved.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing an example of a dialysis reaction apparatus 1 that can be suitably applied to reconstituted cell-free translation using the reaction solution of the present invention.
  • Cell-free translation using dialysis in a dialysis system
  • the reason for reconfigurable cell-free translation is unknown.
  • Cell-free translation using a dialysis system was difficult.
  • the reaction solution of the present invention containing the preservation solution of the present invention cell-free translation using a dialysis system is possible even in the reconstitution type as shown in FIG.
  • the dialysis reaction apparatus 1 shown in FIG. 3 includes, for example, a dialysis membrane 2 that partitions the internal space of the tube-like material in the depth direction, and is cell-free on the dialysis membrane 2 (opening side of the tube-like material).
  • the component 5 necessary for cell-free translation passes through the dialysis membrane 2 over time and enters the microdialyzer from the external dialysis solution 4 and is used for the reaction.
  • the dialysis membrane 2 is additionally added and discharged from the microdialyzer to the external dialysis fluid 4.
  • Example 1 (1) Purification of enzyme added to reconstituted cell-free translation system with His-tag added to reconstituted cell-free translation system with His-tag that has been cultured overnight using a jar fermenter In E. coli having a large expression plasmid of enzyme (protein synthesis factor), 2 vol. And glass beads having the same weight as the total weight of the bacterial cells and the A buffer were added, and the bacterial cells were crushed using a multi-bead shocker. The glass beads were removed by centrifuging at 8000 rpm for 15 minutes, and further centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes.
  • enzyme protein synthesis factor
  • compositions of the A buffer and B buffer were as follows.
  • the concentrated sample was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and then applied to a HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column equilibrated with a gel filtration buffer, followed by gel filtration.
  • the buffer composition used for gel filtration is shown below.
  • the concentrated sample was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and then applied to a HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column equilibrated with an EF-Tu gel filtration buffer, followed by gel filtration.
  • the buffer composition used for gel filtration is shown below.
  • HrpA disruption of the following composition was carried out on Escherichia coli having a His-tag-attached HrpA expression plasmid cultured overnight using a jar fermenter. Buffer for 2 vol. Then, the same amount of glass beads as the total weight of the cells and the HrpA disruption buffer was added, the cells were disrupted with a multi-bead shocker, and then centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes to remove the supernatant. 2 vol. Of A buffer having the following composition was added to the mixture of crushed cells and glass beads.
  • the concentrated sample was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and then applied to a HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column equilibrated with a gel filtration buffer, followed by gel filtration.
  • the buffer composition used for gel filtration is shown below.
  • HrpA gel filtration buffer 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6) 100 mM KCl 10 mM MgCl 2
  • the fraction was concentrated by a centrifugal concentrator with a molecular weight of 10000 cut to obtain HrpA with His-tag.
  • ribosome disruption buffer having the following composition was added to E. coli A19 strain cultured to OD4 by a jar fermenter. After adding the same amount of glass beads as the total weight of the cells and the ribosome disruption buffer, the cells were disrupted with a multi-bead shocker, and then centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes to remove the precipitate.
  • Centrifugation was performed at 14,000 rpm for 30 minutes to remove the precipitate, and after filtration with a 0.45 ⁇ m filter, it was applied to 5 mL ⁇ 4 HiTrap butyl column FF equilibrated with A buffer having the following composition. After the application was completed, the column was washed with A buffer containing 20% B buffer having the following composition and eluted with 50% B buffer.
  • sucrose buffer (pH 7.6, after filtration) 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6) 10 mM Mg (OAc) 2 30 mM NH 4 Cl 30% sucrose 7 mM 2-mercaptoethanol
  • 70S buffer having the following composition is added to the pellet to dissolve the pellet, and the resulting ribosome solution is concentrated by a centrifugal concentrator with a molecular weight of 3000 to obtain ribosomes. It was.
  • Enzyme, EF-Tu, and ribosome buffer (preservation solution) exchange to reconstituted cell-free translation system with His-tag Reconstituted cell-free translation with His-tag Enzyme, EF-Tu, and ribosome to be added to the system are placed in a microdialyzer with a molecular weight of 3000 cut, and 50 to 100 ⁇ L is placed at 4 ° C. for 17 hours.
  • the dialysis was carried out against the stock solution.
  • the dialyzed solution was concentrated with a centrifugal concentrator having a molecular weight of 3000 or 10,000 cut and stored at ⁇ 80 ° C.
  • reaction solution 1 (Dialysis buffer (pH 7.6, after filtration)) 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6) 100 mM KGlu 10 mM Mg (OAc) 2 7 mM 2-mercaptoethanol (6)
  • reaction solution 1 GFP synthesis reaction and confirmation of synthetic GFP 3M potassium glutamate aqueous solution 83.5 ⁇ L, 50 mM tyrosine aqueous solution 100 ⁇ L, 200 mM cysteine aqueous solution 25 ⁇ L, 1M HEPES solution 50 mM
  • As in alanine asparagine, aspartic acid, arginine, glycine, glutamine, glutamic acid, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, valine, 250 ⁇ L, 1M spermidine aqueous solution 5 ⁇ L 34.5 ⁇ L of 1 M
  • Solution A 15.2 ⁇ L, Solution B 2.0 ⁇ L, 50 ⁇ M Ribosome 1.2 ⁇ L (final concentration: 1.2 ⁇ M), 10 ⁇ M Alexa647 aqueous solution 2 ⁇ L, RNase inhibitor RNasin 0.5 ⁇ L, 7.75 ⁇ M GFPRNA 1.3 ⁇ L was added, 28.8 ⁇ L of water was added to make the total volume 50 ⁇ L, and reaction solution 1 (Example 1) was obtained.
  • reaction solution 1 20 ⁇ L of reaction solution 1 was measured with Agilent quantitative PCR device Mx3005P at 37 ° C., GFP fluorescence with excitation wavelength 492 nm, fluorescence wavelength 516 nm, and Alexa647 fluorescence with excitation wavelength 635 nm and fluorescence wavelength 665 nm up to 240 minutes every minute. And GFP synthesis was confirmed. In quantification, a value obtained by correcting measurement error of GFP fluorescence using Alexa647 fluorescence was used.
  • reaction solution 2 GFP synthesis reaction and confirmation of synthetic GFP 166.7 ⁇ L of 3M potassium glutamate aqueous solution, 200 ⁇ L of 50 mM tyrosine aqueous solution, 50 ⁇ L of 200 mM cysteine aqueous solution, alanine and asparagine to 50 mM in 1M HEPES solution , Aspartic acid, arginine, glycine, glutamine, glutamic acid, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, valine, 500 ⁇ L, 1 M spermidine aqueous solution, 10 ⁇ L, 1 M magnesium acetate aqueous solution 66.3 ⁇ L, 1 M creatine phosphate aqueous solution 100 ⁇ L, 1 M dithiothreitol aqueous solution 5 ⁇ L, 1 mg / m
  • a solution D was prepared by mixing 45 ⁇ L (final concentration: 40 nM) and 2.59 ⁇ L of 0.20 mM T7 polymerase (final concentration: 100 nM).
  • Solution C 15.2 ⁇ L
  • Solution D 0.63 ⁇ L
  • conventional stock solution 8.17 ⁇ L
  • 50 ⁇ M ribosome 1.2 ⁇ L final concentration: 1.2 ⁇ M
  • RNase inhibitor RNasin Were mixed with 0.5 ⁇ L and 7.75 ⁇ M GFP RNA 1.3 ⁇ L, water 21 ⁇ L was added to make the total volume 50 ⁇ L, and reaction solution 2 (Comparative Example 1) was obtained.
  • composition of the conventional storage solution used for the reaction solution 2 is as follows. (Conventional stock solution (pH 7.6, after filtration)) 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6) 100 mM KCl 30% glycerol 10 mM MgCl 2 7 mM 2-mercaptoethanol Table 1 shows the composition of Reaction Solution 2.
  • AA refers to 20 types of amino acids (and so on).
  • reaction solution 2 20 ⁇ L of reaction solution 2 was measured at 37 ° C., GFP fluorescence with excitation wavelength 492 nm, fluorescence wavelength 516 nm, excitation wavelength 635 nm, and Alexa 647 fluorescence with fluorescence wavelength 665 nm up to 240 minutes every minute with Agilent quantitative PCR device Mx3005P. And GFP synthesis was confirmed. In quantification, a value obtained by correcting measurement error of GFP fluorescence using Alexa647 fluorescence was used.
  • reaction solution 3 GFP synthesis reaction and confirmation of synthetic GFP 3M potassium glutamate aqueous solution 235 ⁇ L, 50 mM tyrosine aqueous solution 100 ⁇ L, 200 mM cysteine aqueous solution 25 ⁇ L, 1 M HEPES solution 50 mM in alanine, asparagine, asparagine 250 ⁇ L of a solution in which acid, arginine, glycine, glutamine, glutamic acid, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, valine are dissolved, 1M spermidine aqueous solution 3.75 ⁇ L, 1M magnesium acetate aqueous solution 47.5 ⁇ L, 1M creatine phosphate aqueous solution 62.5 ⁇ L, 1M dithiothreitol aqueous solution 7.5 ⁇ L,
  • Solution E 20.8 ⁇ L
  • Solution F 1.9 ⁇ L
  • 50 ⁇ M Ribosome 1.0 ⁇ L (final concentration: 1.0 ⁇ M)
  • 10 ⁇ M Alexa647 aqueous solution 2 ⁇ L 10 ⁇ M Alexa647 aqueous solution 2 ⁇ L
  • RNase inhibitor RNasin 0.5 ⁇ L
  • 7.75 ⁇ M GFP 1.3 ⁇ L of RNA was mixed, 22.5 ⁇ L of water was added to make the total volume 50 ⁇ L, and reaction solution 3 (Example 2) was obtained.
  • reaction solution 3 20 ⁇ L of the reaction solution 3 was measured with an Agilent quantitative PCR apparatus Mx3005P at 37 ° C., GFP fluorescence with an excitation wavelength of 492 nm, a fluorescence wavelength of 516 nm, and Alexa647 fluorescence with an excitation wavelength of 635 nm and a fluorescence wavelength of 665 nm up to 240 minutes every minute. And GFP synthesis was confirmed. In quantification, a value obtained by correcting measurement error of GFP fluorescence using Alexa647 fluorescence was used.
  • reaction solution 4 GFP synthesis reaction and confirmation of synthetic GFP 3M potassium glutamate aqueous solution 235 ⁇ L, 50 mM tyrosine aqueous solution 100 ⁇ L, 200 mM cysteine aqueous solution 25 ⁇ L, 1M HEPES solution 50 mM in alanine, asparagine, asparagine 250 ⁇ L of a solution in which acid, arginine, glycine, glutamine, glutamic acid, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, valine are dissolved, 1M spermidine aqueous solution 3.75 ⁇ L, 1M magnesium acetate aqueous solution 45.4 ⁇ L, 1M creatine phosphate aqueous solution 62.5 ⁇ L, 1M dithiothreitol aqueous solution 7.5 ⁇ L,
  • a solution H was mixed with 22 ⁇ L (final concentration: 100 nM).
  • Solution G 20.9 ⁇ L, Solution H 2.4 ⁇ L, 50 ⁇ M Ribosome 1.0 ⁇ L (final concentration: 1.0 ⁇ M), 10 ⁇ M Alexa647 aqueous solution 2 ⁇ L, RNase inhibitor RNasin 0.5 ⁇ L, 7.75 ⁇ M GFP 1.3 ⁇ L of RNA was mixed, 21.9 ⁇ L of water was added to make the total volume 50 ⁇ L, and reaction solution 4 (Comparative Example 2) was obtained. The composition of the reaction solution 4 is shown in Table 2.
  • reaction solution 4 20 ⁇ L of the reaction solution 4 was measured with an Agilent quantitative PCR apparatus Mx3005P for GFP fluorescence at 37 ° C., excitation wavelength 492 nm, fluorescence wavelength 516 nm, and Alexa647 fluorescence at excitation wavelength 635 nm and fluorescence wavelength 665 nm up to 240 minutes every minute. And GFP synthesis was confirmed. In quantification, a value obtained by correcting measurement error of GFP fluorescence using Alexa647 fluorescence was used.
  • FIG. 1 shows the reconstituted cell-free case in each of the above-described reaction solution 1 (Example 1), reaction solution 2 (Comparative Example 1), reaction solution 3 (Example 2), and reaction solution 4 (Comparative Example 2). It is a graph which shows the result of translation, a vertical axis
  • the reaction solutions 1 and 3 using the reconstituted cell-free translation system enzyme storage solution of the present invention as a dialysis buffer did not use the storage solution. It can be seen that the protein synthesis efficiency is significantly improved compared to the case.
  • dialyzed 7.2 mM IF1 was 68.51 ⁇ L (final concentration: 98700 nM), 1.64 mM.
  • IF2 12.47 ⁇ L (final concentration: 4100 nM), 1.7 mM IF3 14.27 ⁇ L (final concentration: 4800 nM), 1.28 mM EF-G 16.77 ⁇ L (final concentration: 4300 nM), 3.04 mM EF-Tu 131.4 ⁇ L (final concentration: 80100 nM), 5.71 mM EF-Ts 12.71 ⁇ L (final concentration: 13200 nM), 0.42 mM RF1 2.33 ⁇ L (final concentration: 190 nM), 0.45 mM RF2 2.
  • reaction solution 5 (Example 3).
  • the final composition of the obtained reaction solution 5 is shown in Table 3.
  • reaction solution 5 20 ⁇ L of the reaction solution 5 was subjected to GFP fluorescence at 37 ° C., excitation wavelength 492 nm, fluorescence wavelength 516 nm, and Alexa 647 fluorescence at excitation wavelength 635 nm and fluorescence wavelength 665 nm every minute with Agilent quantitative PCR apparatus Mx3005P (Agilent Technologies). Measurement was performed up to 240 minutes to confirm GFP synthesis. In quantification, a value obtained by correcting measurement error of GFP fluorescence using Alexa647 fluorescence was used.
  • FIG. 2 shows the reconstituted cell-free translation in the case of the reaction solution 5 in Example 2 (Example 3), the reaction solution 2 in Experiment Example 1 (Comparative Example 1), and the reaction solution 4 (Comparative Example 2).
  • shaft is the amount of GTP synthesis (micromol)
  • a horizontal axis is time (minutes).
  • the reaction solution 5 (Example 3) was prepared using the preservation solution of the enzyme for reconstituted cell-free translation system of the present invention as a dialysis buffer and optimizing the internal component concentration of the reaction solution. ) Shows that the protein synthesis efficiency is remarkably improved.
  • the result of the reaction solution 5 exceeds the upper limit of the measuring apparatus, and the actual amount of GFP synthesis (quantification based on fluorescence) is 20 ⁇ M.
  • Example 3 A dialysis system (cell-free translation using the dialysis system reaction apparatus 1 as shown in FIG. 3), a tube, when the preservation solution of the enzyme for the reconstituted cell-free translation system of the present invention is used or not. Cell-free translation was performed using each of them (cell-free translation using a general plastic tube).
  • reaction solution 6 (2) Preparation of reaction solution 6 and cell-free translation in a dialysis system (Example 4) 25.5 ⁇ L of solution I prepared in Experimental Example 2, 7.9 ⁇ L of solution J, 0.5 ⁇ L of RNase inhibitor RNasin, 8.9 ⁇ L of 56.1 ⁇ g / ⁇ L GFP plasmid were mixed, and 7.2 ⁇ L of water was mixed. The total amount was 50 ⁇ L, and reaction solution 6 was prepared. 50 microliters of this reaction liquid 6 was put into the molecular weight 3000 cut microdialyzer (brand name: Toru-kun).
  • This microdialyzer is composed of 116.6 ⁇ L of 3M potassium glutamate aqueous solution, 40 ⁇ L of 50 mM tyrosine aqueous solution, 10 ⁇ L of 200 mM cysteine aqueous solution, 50 mM in 1M HEPES solution, alanine, asparagine, aspartic acid, arginine, glycine, glutamine, glutamic acid, 100 ⁇ L of a solution containing histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, and valine, 1 ⁇ L of 1M spermidine aqueous solution, 18.4 ⁇ L of 1M magnesium acetate aqueous solution, 50 ⁇ L of 1M creatine phosphate aqueous solution 5 ⁇ L of 1M dithiothreitol aqueous solution, 60 ⁇ L of 1 mg /
  • reaction solution 6 (2) Preparation of reaction solution 6 and cell-free translation in a tube (Example 5) 25.5 ⁇ L of solution I prepared in Experimental Example 2, 7.9 ⁇ L of solution J, 0.5 ⁇ L of RNase inhibitor RNasin, 8.9 ⁇ L of 56.1 ⁇ g / ⁇ L GFP plasmid were mixed, and 7.2 ⁇ L of water was mixed. The total amount was 50 ⁇ L, and reaction solution 6 was prepared. 50 ⁇ L of this was placed in a 200 ⁇ L plastic tube. The tube was placed in a container to which 1 mL of water was added, and the reaction was performed by submerging in a 37 ° C. water bath (Example 5).
  • reaction solution 7 was prepared by mixing 8.9 ⁇ L of ⁇ L GFP plasmid, adding 16.3 ⁇ L of water to make the total volume 50 ⁇ L. 50 ⁇ L of this was put in a microdialyzer with a molecular weight of 3000 cut (trade name: Toru-kun).
  • This microdialyzer is composed of 94.0 ⁇ L of 3M potassium glutamate aqueous solution, 40 ⁇ L of 50 mM tyrosine aqueous solution, 10 ⁇ L of 200 mM cysteine aqueous solution, 50 mM in 1M HEPES solution, alanine, asparagine, aspartic acid, arginine, glycine, glutamine, glutamic acid, 100 ⁇ L of a solution in which histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, and valine are dissolved, 1 M spermidine aqueous solution 1.5 ⁇ L, 1 M magnesium acetate aqueous solution 18.18 ⁇ L, 1 M creatine phosphate aqueous solution 25 ⁇ L, 1 M dithiothreitol aqueous solution 1.5 ⁇ L, 1 mg / mL 10-formy
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • the vertical axis represents the amount of GFP synthesis ( ⁇ M), and the horizontal axis represents time (time). From the results shown in FIG. 4, when using the reconstituted cell-free translation system enzyme storage solution of the present invention, it was not possible to achieve this without using a dialysis system. It was found that constitutive cell-free translation is possible.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Experimental Example 4, and the vertical axis shows relative synthetic activity.
  • the horizontal axis shows the case of adding water (1), the case of adding HEPES (2), the case of adding aqueous potassium chloride (3), the case of adding potassium glutamate (4), and the addition of glycerol.
  • the results are shown for the case (5) when 2-mercaptoethanol is added (6).
  • the relative synthetic activity is low when the aqueous potassium chloride solution is added (3) and when the glycerol is added (5), and in particular, when the aqueous potassium chloride solution is added (3) is remarkable. I understand that there is.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Experimental Example 5.
  • the vertical axis represents relative GFP synthesis activity, and the horizontal axis represents the concentration (mM) of aqueous potassium chloride solution. From the results shown in FIG. 6, it was found that although the effect was not so much seen when the concentration of potassium chloride was 10 mM, the activity rapidly decreased when the concentration was higher than that. For this reason, the concentration of the aqueous potassium chloride solution is desirably 10 mM or less.
  • GFP fluorescence at 37 ° C., excitation wavelength 492 nm, fluorescence wavelength 516 nm and Alexa 647 fluorescence at excitation wavelength 635 nm and fluorescence wavelength 665 nm were measured every minute for up to 240 minutes to confirm GFP synthesis.
  • a value obtained by correcting measurement error of GFP fluorescence using Alexa647 fluorescence was used.
  • the amount of GFP synthesized in water added was taken as 1, and the ratio to that value was defined as relative GFP synthesis activity.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of Experimental Example 6.
  • the vertical axis represents relative GFP synthesis activity, and the horizontal axis represents the concentration (%) of glycerol. From the results shown in FIG. 7, it can be seen that in the case of glycerol, there is no effect up to a final concentration of 5%, and therefore glycerol is preferably 5% or less.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of Experimental Example 7, and the vertical axis shows the relative GFP synthesis rate. From the results shown in FIG. 8, the effects of K-Asp (potassium aspartate) and KOAc (potassium acetate) were almost the same as when KGlu (potassium glutamate) was added. It is considered that K-Asp or KOAc can be used together with KGlu. On the other hand, K-Cit (potassium citrate) completely inhibited the synthesis reaction.
  • Example 8 As an elongation factor, an EF-P modified form (purified from E. coli having a plasmid described in non-patent document Doerfel et al. 2013, Science, 85-88 by the method described in the above document [paragraph [ Prepared a reaction solution using the storage solution of the enzyme for reconstituted cell-free translation system of the present invention (dialysis was performed on the storage solution described in 0068] (pH 7.6, after filtration)). Cell-free translation was performed to synthesize GFP. The EF-P modified type was added to the above-mentioned reaction solution 5 (Example 3) so as to have concentrations of 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • reaction solution 5 itself was used when the EF-P modified type had a concentration of 0 ⁇ M.
  • 102 ⁇ L of solution I prepared in Experimental Example 2 31.6 ⁇ L of solution J, 8 ⁇ L of 10 ⁇ M Alexa647 aqueous solution, 2 ⁇ L of RNase inhibitor RNasin, 5.2 ⁇ L of 7.75 ⁇ M GFP RNA were mixed, 31.2 ⁇ L of water was added to make the total volume 180 ⁇ L.
  • FIGS. 9 to 11 are graphs respectively showing the results of Experimental Example 8.
  • the vertical axis represents GFP fluorescence (nM)
  • the horizontal axis represents time (minutes)
  • the vertical axis represents the initial reaction.
  • horizontal axis is EF-P concentration ( ⁇ M)
  • vertical axis in FIG. 11 is the amount of GFP finally synthesized (mg / mL)
  • horizontal axis is EF-P Concentration ( ⁇ M).
  • FIGS. 9 to 11 by adding the EF-P modified type to the cell-free translation system to which the reaction solution of the present invention was applied, the synthesis rate and the synthesis amount were improved.

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Abstract

　塩化物塩の濃度が１０ｍＭ以下であり、かつ、グリセロールの濃度が５％以下である、再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液、ならびに、当該保存液を含む、再構成型無細胞翻訳システム用反応液によって、従来と比較してタンパク質合成の効率を格段に向上することができる、再構成型無細胞翻訳システム用反応液が提供できる。

Description

酵素の保存液およびそれを用いた再構成型無細胞翻訳システム用反応液
　本発明は、タンパク質翻訳に必要なタンパク質性の因子、リボソーム、ＲＮＡなどを精製した後に、再び組み合わせた再構成型無細胞翻訳システムに用いられる酵素の保存液、ならびに、当該保存液を用いた再構成型無細胞翻訳システム用反応液に関する。
　ＤＮＡ、ＲＮＡを人工的に翻訳してタンパク質を合成する技術として、無細胞翻訳システムが知られており、市販品も多く存在する。無細胞翻訳システムとして、細胞からの粗抽出液を用いる抽出液型の無細胞翻訳システムと、タンパク質合成に必要なタンパク質性の因子、リボソーム、ＲＮＡなどを精製した後に、再び組み合わせることにより再構成したものである再構成型の無細胞翻訳システムとが知られている（たとえば、Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）　１９，　７５１－７５５（非特許文献１）を参照。）。再構成型の無細胞翻訳システムは、抽出液型の無細胞翻訳システムと比較して、系内にどのような成分がどれだけ入っているのかを把握し、制御することができ、かつ、混入する反応阻害物を限りなく低く抑えることができるという利点がある。
国際公開第２００５／０７５６６０号
Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）　１９，　７５１－７５５ 粗抽出型無細胞翻訳系（Ｓ３０　Ｔ７　Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）の使用法ガイド（http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj27/PJ_No27-3.pdf）
　しかしながら、これまでの再構成型無細胞翻訳システムは、抽出液型の無細胞翻訳システムに比べて、極めてタンパク質の合成活性が低いものであった。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、従来と比較してタンパク質合成の効率を格段に向上することができる、再構成型無細胞翻訳システム用反応液を提供することである。
　本発明は、塩化物塩の濃度が１０ｍＭ以下であり、かつ、グリセロールの濃度が５％以下である、酵素の保存液である。
　本発明の保存液は、塩化物塩を含まないことが好ましく、当該塩化物塩としては塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの少なくともいずれかであることが特に好ましい。
　本発明の保存液は、グリセロールを含まないことが好ましい。
　本発明の保存液は、グルタミン酸カリウム、酢酸カリウムまたはアスパラギン酸カリウムを含むことが好ましい。
　また本発明の保存液は、グルタミン酸マグネシウム、酢酸マグネシウムまたはアスパラギン酸マグネシウムを含むことが好ましい。
　本発明の酵素の保存液は、再構成型無細胞翻訳システムに用いるための酵素の保存液であることが、好ましい。
　本発明は、上述した本発明の保存液を含む再構成型無細胞翻訳システム用反応液についても提供する。
　本発明によれば、従来の再構成型の無細胞翻訳システムと比較して、タンパク質の合成量を著しく増加させることができる。また、従来の再構成型の無細胞翻訳システムでは達成することができなかった透析系を用いたタンパク質合成により、タンパク質の合成量を著しく増加させることができる。
実験例１における、反応液１（実施例１）、反応液２（比較例１）、反応液３（実施例２）および反応液４（比較例２）それぞれの場合の再構成型無細胞翻訳の結果を示すグラフである。 実験例２における反応液５（実施例３）と、実験例１における反応液２（比較例１）および反応液４（比較例２）それぞれの場合の再構成型無細胞翻訳の結果を示すグラフである。 本発明の再構成型無細胞翻訳システム用反応液を好適に利用できる透析系反応装置１の無細胞翻訳を模式的に示す図である。 実験例３の結果を示すグラフである。 実験例４の結果を示すグラフである。 実験例５の結果を示すグラフである。 実験例６の結果を示すグラフである。 実験例７の結果を示すグラフである。 実験例８の結果を示すグラフである。 実験例８の結果を示すグラフである。 実験例８の結果を示すグラフである。
　本発明は、再構成型無細胞翻訳システムに用いるための酵素の保存に好適な酵素の保存液であって、塩化物塩の濃度が１０ｍＭ以下であり、かつ、グリセロールの濃度が５％以下である、酵素の保存液であることを特徴とする。本発明者らは、再構成型無細胞翻訳システムに用いられる酵素の保存液の組成を従来と変更することで、従来再構成型では問題となっていたタンパク質合成の効率を著しく改善することができることを見出した。すなわち、再構成型無細胞翻訳システムに用いるための酵素の保存液に、慣用的に含まれていた塩化物塩およびグリセロールが、実際には、再構成型の無細胞翻訳を阻害するように作用していたことを見出し、保存液中に含まれる塩化物塩およびグリセロールの濃度を低くする、さらに望ましくは塩化物塩およびグリセロールが含まれないようにすることで、無細胞翻訳の効率を格段に向上することができる。なお、本発明の酵素の保存液は、上述のように再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存に好適であるが、再構成型無細胞翻訳システム用以外の用途の酵素の保存に用いても勿論よい。
　ここで、図１は、後述する実験例１における、反応液１（実施例１）、反応液２（比較例１）、反応液３（実施例２）および反応液４（比較例２）それぞれの場合の再構成型無細胞翻訳の結果を示すグラフである。反応液１、３は、塩化物塩およびグリセロールを含まない酵素の保存液を用いた場合であり、反応液２、４は、従来品の塩化物塩およびグリセロールを含む場合である。具体的には、反応液２、４に用いた従来品の保存液の組成は、以下のとおりである。
　（従来品の保存液（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　塩化カリウム（ＫＣｌ）
　　　３０％　グリセロール
　　１０ｍＭ　塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　これに対し、反応液１、３に用いた保存液（この場合は透析バッファー）の組成は、以下のとおりである。
　（本発明の保存液の好適な一例）
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　グルタミン酸カリウム（ＫＧｌｕ）
　　１０ｍＭ　酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＯＡｃ）２）
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　これらを比較すると、本発明の保存液では、塩化物塩として塩化カリウム、塩化マグネシウムを含んでおらず、代わりに、カリウムの塩としてグルタミン酸カリウム、マグネシウムの塩として酢酸マグネシウムを含んでいる。さらに本発明の保存液は、グリセロールを含んでいない。図１に示す結果から、このような用いた保存液の組成の違いに起因して、無細胞翻訳の効率が格段に相違することが理解できる。
　ここで、従来の保存液に含まれた塩化物塩については、その濃度は、一般的には、タンパク質の溶解度は、添加した塩の濃度が比較的低い場合には塩濃度と共に増加し、塩濃度が高い領域では逆に塩濃度と共に減少する。たとえば、国際公開第２００５／０７５６６０（特許文献１）には、効率を高めるために反応組成にマグネシウムを添加することが開示されているが、Ｃｌ－が無細胞翻訳系におけるタンパク質合成を阻害することが知られているため、ＭｇＣｌ２ではなくＭｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２などとしてマグネシウムを供給することが好ましいとの記載がある。しかしながら、これは、抽出液型の無細胞翻訳に関してであり、再構成型の無細胞翻訳システムに用いられる、酵素の保存液における塩化物塩に関して何ら教示も示唆しない。ましてや、上記保存液における塩化物塩およびグリセロールを同時に変更することは教示も示唆もするものではない。
　また、グリセロールについては、水溶液中においてタンパク質を安定化する効果をもたらし、凍結融解の過程においてタンパク質を安定化させるとされ、従来の保存液に含まれていた。たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａ社から販売されている粗抽出型無細胞翻訳系（Ｓ３０　Ｔ７　Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）の使用法ガイド（http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj27/PJ_No27-3.pdf）（非特許文献２）によると、タンパク質の収量を上げるためには鋳型ＤＮＡに高濃度のグリセロールや塩を添加しないようにと記載されている。しかしながら、この非特許文献２の記載も、抽出液型の無細胞翻訳に関してであり、再構成型の無細胞翻訳システムに用いられる、酵素の保存液におけるグリセロールに関して何ら教示も示唆しない。ましてや、上記保存液における塩化物塩およびグリセロールを同時に変更することは教示も示唆もするものではない。
　本発明の保存液は、塩化物塩の濃度が１０ｍＭ以下であり、かつ、グリセロールの濃度が５％以下であるが、塩化物塩を含まないことが好ましく、当該塩化物塩としては塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの少なくともいずれかであることがより好ましく、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの両方を含まないことが特に好ましい。また、本発明の保存液は、グリセロールを含まないことが好ましい。
　本発明の保存液は、塩化カリウムの代わりに、カリウムの塩として、グルタミン酸カリウム、酢酸カリウムまたはアスパラギン酸カリウムを含むことが好ましい。これらのいずれかのカリウム塩であれば、本発明による効率的な無細胞翻訳の効果が奏される。
　また本発明の保存液は、塩化マグネシウムの代わりに、マグネシウムの塩として、グルタミン酸マグネシウム、酢酸マグネシウムまたはアスパラギン酸マグネシウムを含むことが好ましい。
　本発明の保存液により保存する酵素としては、再構成型無細胞翻訳システムに用いられる酵素（たとえばＨｒｐＡ、Ｔｉｇ、Ｐｔｈの三種類の翻訳反応を向上させる酵素およびＲＮＡタンパク質複合体であるリボソームを含む）が挙げられる。
　本発明はまた、本発明の保存液を含む、再構成型無細胞翻訳システム用反応液についても提供する。本発明の再構成型無細胞翻訳システム用反応液は、上述した本発明の保存液を含むのであれば特に制限されるものではなく、その組成は、従来公知の適宜の再構成型無細胞翻訳システム用反応液であってよい。実験例２で後述するように、本発明者は、本発明の保存液を含み、さらに最適化された組成の反応液の調製を行ない、その結果が図２に示されており、従来と比較しても著しく無細胞翻訳の効率が向上されていることが理解できる。
　ここで、図３は、本発明の反応液を用いた再構成型の無細胞翻訳に好適に適用できる透析系反応装置１の一例を模式的に示す図である。透析を利用して（透析系で）無細胞翻訳を行うことは従来より知られており、そのための反応装置も市販されているが、再構成型の無細胞翻訳の場合、その理由は不明だが、透析系を利用した無細胞翻訳が困難であった。しかしながら、本発明の保存液を含む本発明の反応液を用いることで、図４にもその結果を示すように再構成型でも透析系を使用した無細胞翻訳が可能となった。
　なお、図３に示す透析系反応装置１は、たとえば、チューブ状物の内部空間を深さ方向に仕切る透析膜２を備え、透析膜２上（チューブ状物の開口側）には、無細胞翻訳反応液３を収容した微量透析器であり、透析膜２下（チューブ状物の底側）には、透析膜を通過して微量透析器内に出入可能な透析外液４が収容され、無細胞翻訳のため必要な成分５は、経時的に透析膜２を通過して透析外液４から微量透析器内に入って反応に用いられ、逆に反応により生じた老廃物６は、経時的に透析膜２を追加して微量透析器から透析外液４へと排出される。このような透析系を利用することで、一般的なプラスチックチューブ内で単に無細胞翻訳を行う場合と比較して、長時間の無細胞翻訳が可能となる。本発明によれば、再構成型でありながら、このような透析系でも無細胞翻訳を行うことができる反応液を提供するものである。
　＜実験例１＞
　（１）Ｈｉｓ－ｔａｇを付けた再構成型無細胞翻訳システムに添加する酵素の精製
　ジャーファメンターを用いて終夜培養を行ったＨｉｓ－ｔａｇを付けた、再構成型無細胞翻訳システムに添加する酵素（タンパク質合成因子）の大量発現プラスミドを有する大腸菌に、下記組成のＡバッファーを２ｖｏｌ．と、菌体およびＡバッファーを合計した重量と同じ重量のガラスビーズとを加えて、マルチビーズショッカーで菌体破砕を行った。８０００ｒｐｍで１５分間遠心してガラスビーズを除去し、さらに１４０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心の後、上清を回収し、その上清を０．４５μｍのフィルターでｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ後、下記組成の５％　Ｂバッファーを含むＡバッファーで平衡化したＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰカラム５ｍＬ×２本×４セットに手動でアプライした。濃度勾配は以下のとおりとした。
　（濃度勾配）
　・条件：　０分　　　　６０分
　　％Ｂ　　５％　　　　６８％
　・流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
　また、ＡバッファーおよびＢバッファーの組成は以下のとおりとした。
　（Ａバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　　　１Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（Ｂバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　５００ｍＭ　イミダゾール
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　溶出したフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで目的物を含むフラクションを集め、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行った。濃縮を行ったサンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過後、ゲルろ過バッファーで平衡化したＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇカラムにかけ、ゲルろ過を行った。ゲルろ過に用いたバッファー組成を以下に示す。
　（ゲルろ過バッファー（ｐＨ７．６））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　ゲルろ過溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより目的フラクションを確認後、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行い、Ｈｉｓ－ｔａｇをつけたタンパク質合成因子を得た。
　（２）Ｈｉｓ－ｔａｇを付けたＥＦ－Ｔｕ（翻訳伸長因子Ｔｕ）の精製
　ジャーファメンターを用いて終夜培養を行ったＨｉｓ－ｔａｇを付けたＥＦ－Ｔｕ発現プラスミドを有する大腸菌に、下記組成のＥＦ－Ｔｕ用Ａバッファーを２ｖｏｌ．と、菌体およびＥＦ－Ｔｕ用Ａバッファーを合計した重量と同量のガラスビーズを加えてマルチビーズショッカーで菌体破砕を行った。８０００ｒｐｍで１５分間遠心してガラスビーズを除去し、さらに１４０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心の後、上清を回収し、その上清を０．４５μｍのフィルターでｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ後、下記組成の５％　ＥＦ－Ｔｕ用Ｂバッファーを含むＥＦ－Ｔｕ用Ａバッファーで平衡化したＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰカラム５ｍＬ×２本×４セットに手動でアプライした。濃度勾配は以下のとおりとした。
　（濃度勾配）
　・条件：　０分　　　　６０分
　　％Ｂ　　５％　　　　６８％
　・流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
　また、ＥＦ－Ｔｕ用のＡバッファーおよびＢバッファーの組成は以下のとおりとした。
　（ＥＦ－Ｔｕ用Ａバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　　　１Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　１５％　グリセロール
　　１０μＭ　ＧＤＰ
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（ＥＦ－Ｔｕ用Ｂバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　１５％　グリセロール
　　１０μＭ　ＧＤＰ
　５００ｍＭ　イミザゾール
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　溶出したフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで目的物を含むフラクションを集め、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行った。濃縮を行ったサンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過後、ＥＦ－Ｔｕ用ゲルろ過バッファーで平衡化したＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇカラムにかけ、ゲルろ過を行った。ゲルろ過に用いたバッファー組成を以下に示す。
　（ＥＦ－Ｔｕ用ゲルろ過バッファー（ｐＨ７．６））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　１５％　グリセロール
　　１０μＭ　ＧＤＰ
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　ゲルろ過溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより目的フラクションを確認後、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行い、Ｈｉｓ－ｔａｇを付けたＥＦ－Ｔｕを得た。
　（３）Ｈｉｓ－ｔａｇを付けたＨｒｐＡ（ＡＴＰ依存性大腸菌ＲＮＡヘリカーゼ）の精製
　ジャーファメンターを用いて終夜培養を行ったＨｉｓ－ｔａｇを付けたＨｒｐＡ発現プラスミドを有する大腸菌に、下記組成のＨｒｐＡ破砕用バッファーを２ｖｏｌ．と、菌体とＨｒｐＡ破砕用バッファーの重量を合計したものと同量のガラスビーズを加えてマルチビーズショッカーで菌体破砕を行った後、８０００ｒｐｍで１５分間遠心して上清を除去した。破砕済み菌体とガラスビーズ混合物に、下記組成のＡバッファーを２ｖｏｌ．と、菌体およびＡバッファーを合計した重量と同量のガラスビーズを加えてタンパク質の抽出を行った後に、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心の後、上清を回収し、その上清を０．４５μｍのフィルターでｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ後、下記組成の５％　Ｂバッファーを含むＡバッファーで平衡化したＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰ　カラム５ｍＬ×２本×４セットに手動でアプライした。濃度勾配は以下のとおりとした。
　（濃度勾配）
　・条件：　０分　　　　６０分
　　％Ｂ　　５％　　　　６８％
　・流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
　また、ＨｒｐＡ破砕用バッファー、ＡバッファーおよびＢバッファーの組成は以下のとおりとした。
　（ＨｒｐＡ破砕用バッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（Ａバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　　　１Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（Ｂバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　５００ｍＭ　イミダゾール
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　溶出したフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで目的物を含むフラクションを集め、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行った。濃縮を行ったサンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過後、ゲルろ過バッファーで平衡化したＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇカラムにかけ、ゲルろ過を行った。ゲルろ過に用いたバッファー組成を以下に示す。
　（ＨｒｐＡ用ゲルろ過バッファー（ｐＨ７．６））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　ゲルろ過溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより目的フラクションを確認後、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行い、Ｈｉｓ－ｔａｇを付けたＨｒｐＡを得た。
　（４）リボソームの精製
　ジャーファメンターにより、ＯＤ４まで培養した大腸菌Ａ１９株に、下記組成のリボソーム破砕用バッファーを２ｖｏｌ．と、菌体およびリボソーム破砕用バッファーの重量を合計したものと同量のガラスビーズを加えてマルチビーズショッカーで菌体破砕を行った後、８０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を除去した。
　（リボソーム破砕用バッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　５０ｍＭ　ＫＣｌ
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　さらに１４０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った後、上清を回収し、液量（ｍｌ）×０．２２２（ｇ）の硫酸アンモニウムをスターラーで攪拌しながらゆっくりと入れ、４℃で３０分間攪拌を行った。１４０００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、沈殿を除去した後に０．４５μｍのフィルターでｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ後、下記組成のＡバッファーで平衡化したＨｉＴｒａｐブチルカラムＦＦ　５ｍＬ×４本にアプライした。アプライ終了後、下記組成の２０％　Ｂバッファーを含むＡバッファーでカラムを洗浄し、５０％　Ｂバッファーで溶出させた。
　（Ａバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　１０ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２
　　１．５Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（Ｂバッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　１０ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　５０％　Ｂバッファーで溶出された画分のうち特に２６０ｎｍの吸光度が高い画分を集め、下記組成の３０％　ショ糖バッファー上に重層した後に、３００００ｒｐｍで１７時間、超遠心を行った。
　（３０％　ショ糖バッファー（ｐＨ７．６、ろ過後）
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　１０ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２
　　３０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ
　　　３０％　ショ糖
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　超遠心終了後、ペレットに下記組成の７０Ｓ　バッファーを加えてペレットを溶解し、得られたリボソーム溶液を分子量３０００カットの遠心濃縮器により濃縮を行い、リボソームを得た。
　（７０Ｓ　バッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　　６ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２
　　３０ｍＭ　ＫＣｌ
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（５）Ｈｉｓ－ｔａｇを付けた再構成型無細胞翻訳システムに添加する酵素、ＥＦ－Ｔｕ、リボソームのバッファー（保存液）交換
　Ｈｉｓ－ｔａｇを付けた再構成型無細胞翻訳システムに添加する酵素、ＥＦ－Ｔｕ、リボソームを分子量３０００カットの微量透析器に５０～１００μＬを入れ、４℃で１７時間、下記組成の透析バッファー（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）に対して透析を行った。透析済みの溶液は、分子量３０００または１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行い、マイナス８０℃で保存した。
　（透析バッファー（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＧｌｕ
　　１０ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（６）反応液１の調製、ＧＦＰ合成反応および合成ＧＦＰの確認
　３Ｍ　グルタミン酸カリウム水溶液を８３．５μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を１００μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を２５μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を２５０μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を５μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を３４．５μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を５０μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を２．５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を２５μＬ、１８５μｇ／μＬ　ｔＲＮＡ水溶液を３６μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を５０μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を５０μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を２５μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を２５μＬ混合したものを溶液Ａとした。
　透析バッファー（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）に透析済みの４．２ｍＭ　ＩＦ１（翻訳開始因子１）を１．４６μＬ（最終濃度：２４７０ｎＭ）、１．６４ｍＭ　ＩＦ２（翻訳開始因子２）を０．６２μＬ（最終濃度：４１０ｎＭ）、１．７ｍＭ　ＩＦ３（翻訳開始因子３）を１．０７μＬ（最終濃度：７３０ｎＭ）、１．２８ｍＭ　ＥＦ－Ｇ（翻訳伸長因子Ｇ）を２．５１μＬ（最終濃度：１３００ｎＭ）、４．７１ｍＭ　ＥＦ－Ｔｕ（翻訳伸長因子Ｔｕ）を１．２２μＬ（最終濃度：２３００ｎＭ）、４．７８ｍＭ　ＥＦ－Ｔｓ（翻訳伸長因子Ｔｓ）を１．７３μＬ（最終濃度：３３００ｎＭ）、０．４２ｍＭ　ＲＦ１（翻訳解離因子１）を１．４６μＬ（最終濃度：２５０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＲＦ２（翻訳解離因子２）を２．６４μＬ（最終濃度：４８０ｎＭ）、０．３２ｍＭ　ＲＦ３（翻訳解離因子３）を１．３μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、２．１６ｍＭ　ＲＲＦ（リボソームリサイクリング因子）を０．５６μＬ（最終濃度：４９０ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＡｌａＲＳ（アラニルｔＲＮＡ合成酵素）を１．９９μＬ（最終濃度：７３０ｎＭ）、０．３４ｍＭ　ＡｒｇＲＳ（アルギニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．２２μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．５４ｍＭ　ＡｓｎＲＳ（アスパラギニルｔＲＮＡ合成酵素）を１．９２μＬ（最終濃度：４２０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＡｓｐＲＳ（アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素）を０．６７μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．２９ｍＭ　ＣｙｓＲＳ（システイニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．２０μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、１．０５ｍＭ　ＧｌｎＲＳ（グルタミニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．１４μＬ（最終濃度：６０ｎＭ）、０．５６ｍＭ　ＧｌｕＲＳ（グルタミルｔＲＮＡ合成酵素）を１．０３μＬ（最終濃度：２３０ｎＭ）、０．１４ｍＭ　ＧｌｙＲＳ（グリシニルｔＲＮＡ合成酵素）を１．４７μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．７２ｍＭ　ＨｉｓＲＳ（ヒスチジニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．３０μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＩｌｅＲＳ（イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素）を１．４７μＬ（最終濃度：３７０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＬｅｕＲＳ（ロイシルｔＲＮＡ合成酵素）を０．３８μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、１．３２ｍＭ　ＬｙｓＲＳ（リジルｔＲＮＡ合成酵素）を０．２２μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＭｅｔＲＳ（メチオニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．４４μＬ（最終濃度：１１０ｎＭ）、０．５３ｍＭ　ＰｈｅＲＳ（フェニルアラニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．６３μＬ（最終濃度：１３０ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＰｒｏＲＳ（プロリルｔＲＮＡ合成酵素）を０．４６μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、０．５８ｍＭ　ＳｅｒＲＳ（セリルｔＲＮＡ合成酵素）を１．６７μＬ（最終濃度：３９０ｎＭ）、０．１６ｍＭ　ＴｈｒＲＳ（スレオニルｔＲＮＡ合成酵素）を１．３１μＬ（最終濃度：８０ｎＭ）、０．４９ｍＭ　ＴｒｐＲＳ（トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素）を０．１４μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．１４ｍＭ　ＴｙｒＲＳ（チロシルｔＲＮＡ合成酵素）を０．１４μＬ（最終濃度：８ｎＭ）、０．３８ｍＭ　ＶａｌＲＳ（ヴァリルｔＲＮＡ合成酵素）を０．１１μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、０．８２ｍＭ　ＭＴＦ（メチオニルｔＲＮＡホルミルトランスフェラーゼ）を１．７７μＬ（最終濃度：５９０ｎＭ）、１．９７ｍＭ　ＭＫ（ミオキナーゼ）を０．１８μＬ（最終濃度：１４０ｎＭ）、０．３７ｍＭ　ＣＫ（クレアチンキナーゼ）を０．６２μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＮＤＫ（ＮＤＰキナーゼ）を０．６７μＬ（最終濃度：７０ｎＭ）、０．２８ｍＭ　ＰＰｉａｓｅ（ピロホスファターゼ）を０．３６μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、０．０４６ｍＭ　Ｔ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ）を５．４３μＬ（最終濃度：１００ｎＭ）混合したものを溶液Ｂとした。溶液Ａを１５．２μＬ、溶液Ｂを２．０μＬ、５０μＭ　リボソームを１．２μＬ（最終濃度：１．２μＭ）、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を２μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰＲＮＡを１．３μＬ混合し、水２８．８μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液１（実施例１）を得た。反応液１のうち２０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。
　（７）反応液２の調製、ＧＦＰ合成反応および合成ＧＦＰの確認
　３Ｍ　グルタミン酸カリウム水溶液を１６６．７μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を２００μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を５０μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を５００μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を１０μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を６６．３μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を１００μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を５０μＬ、１８５μｇ／μＬ　ｔＲＮＡ水溶液を７２μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を１００μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を１００μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を５０μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を５０μＬ混合したものを溶液Ｃとした。
　透析バッファー（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）に透析していない６．３５ｍＭ　ＩＦ１を１．９４μＬ（最終濃度：２４７０ｎＭ）、０．７１ｍＭ　ＩＦ２を２．８９μＬ（最終濃度：４１０ｎＭ）、１．２ｍＭ　ＩＦ３を３．１８μＬ（最終濃度：７３０ｎＭ）、１．１１ｍＭ　ＥＦ－Ｇを５．７８μＬ（最終濃度：１３００ｎＭ）、２．８０ｍＭ　ＥＦ－Ｔｕを４．１３μＬ（最終濃度：２３００ｎＭ）、２．８４ｍＭ　ＥＦ－Ｔｓを５．８０μＬ（最終濃度：３３００ｎＭ）、１．０３ｍＭ　ＲＦ１を１．２０μＬ（最終濃度：２５０ｎＭ）、１．０７ｍＭ　ＲＦ２を２．２７μＬ（最終濃度：４８０ｎＭ）、２．４７ｍＭ　ＲＦ３を０．３４μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、４．４４ｍＭ　ＲＲＦを０．５５μＬ（最終濃度：４９０ｎＭ）、０．４８ｍＭ　ＡｌａＲＳを７．６４μＬ（最終濃度：７３０ｎＭ）、０．３１ｍＭ　ＡｒｇＲＳを０．５０μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、１．７６ｍＭ　ＡｓｎＲＳを１．１９μＬ（最終濃度：４２０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＡｓｐＲＳを０．９７μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．３７ｍＭ　ＣｙｓＲＳを０．３２μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、０．７６ｍＭ　ＧｌｎＲＳを０．３９μＬ（最終濃度：６０ｎＭ）、１．４２ｍＭ　ＧｌｕＲＳを０．８２μＬ（最終濃度：２３０ｎＭ）、０．１８ｍＭ　ＧｌｙＲＳを２．４３μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、１．６５ｍＭ　ＨｉｓＲＳを０．２６μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．６８ｍＭ　ＩｌｅＲＳを２．６９μＬ（最終濃度：３７０ｎＭ）、０．６６ｍＭ　ＬｅｕＲＳを０．３１μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、１．５５ｍＭ　ＬｙｓＲＳを０．３７μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．２１ｍＭ　ＭｅｔＲＳを２．６５μＬ（最終濃度：１１０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＰｈｅＲＳを２．５５μＬ（最終濃度：１３０ｎＭ）、１．６９ｍＭ　ＰｒｏＲＳを０．４９μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、１．８３ｍＭ　ＳｅｒＲＳを１．０６μＬ（最終濃度：３９０ｎＭ）、０．１１ｍＭ　ＴｈｒＲＳを３．９９μＬ（最終濃度：８０ｎＭ）、０．３８ｍＭ　ＴｒｐＲＳを０．３７μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．０６ｍＭ　ＴｙｒＲＳを０．６３μＬ（最終濃度：８ｎＭ）、０．１７ｍＭ　ＶａｌＲＳを０．５１μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、１．０３ｍＭ　ＭＴＦを２．８５μＬ（最終濃度：５９０ｎＭ）、１．３３ｍＭ　ＭＫを０．５２μＬ（最終濃度：１４０ｎＭ）、０．８９ｍＭ　ＣＫを０．５２μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．７７ｍＭ　ＮＤＫを０．４６μＬ（最終濃度：７０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＰＰｉａｓｅを０．４５μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、０．２０ｍＭ　Ｔ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．５９μＬ（最終濃度：１００ｎＭ）混合したものを溶液Ｄとした。溶液Ｃを１５．２μＬ、溶液Ｄを０．６３μＬ、従来品の保存液８．１７μＬ、５０μＭ　リボソームを１．２μＬ（最終濃度：１．２μＭ）、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を２μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを１．３μＬ混合し、水２１μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液２（比較例１）を得た。
　なお、反応液２に用いた従来品の保存液の組成は、以下のとおりである。
　（従来品の保存液（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　　３０％　グリセロール
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　また反応液２の組成を表１に示す。なお、表１中、「ＡＡ」は２０種類のアミノ酸を指す（以降も同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　反応液２のうち２０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。
　（８）反応液３の調製、ＧＦＰ合成反応および合成ＧＦＰの確認
　３Ｍ　グルタミン酸カリウム水溶液を２３５μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を１００μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を２５μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を２５０μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を３．７５μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を４７．５μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を６２．５μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を７．５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を５０μＬ、１８５μｇ／μＬ　ｔＲＮＡ水溶液を５４μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を９３．７５μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を５０μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を３１．２５μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を３１．２５μＬ混合したものを溶液Ｅとした。
　透析バッファー（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）に透析済みの４．２ｍＭ　ＩＦ１を１４．６４μＬ（最終濃度：２４７００ｎＭ）、１．６４ｍＭ　ＩＦ２を１．５６μＬ（最終濃度：１０００ｎＭ）、１．７ｍＭ　ＩＦ３を１．７８μＬ（最終濃度：１２００ｎＭ）、１．２８ｍＭ　ＥＦ－Ｇを２．０９μＬ（最終濃度：１１００ｎＭ）、４．７１ｍＭ　ＥＦ－Ｔｕを４２．５８μＬ（最終濃度：８０２００ｎＭ）、４．７８ｍＭ　ＥＦ－Ｔｓを１．７３μＬ（最終濃度：３３００ｎＭ）、０．４２ｍＭ　ＲＦ１を０．２９μＬ（最終濃度：５０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＲＦ２を２．６４μＬ（最終濃度：５０ｎＭ）、０．３２ｍＭ　ＲＦ３を１．３μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、２．１６ｍＭ　ＲＲＦを４．４９μＬ（最終濃度：３９００ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＡｌａＲＳを１．９９μＬ（最終濃度：７３０ｎＭ）、０．３４ｍＭ　ＡｒｇＲＳを０．２２μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．５４ｍＭ　ＡｓｎＲＳを１．９２μＬ（最終濃度：４２０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＡｓｐＲＳを０．６７μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．２９ｍＭ　ＣｙｓＲＳを０．２０μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、１．０５ｍＭ　ＧｌｎＲＳを０．１４μＬ（最終濃度：６０ｎＭ）、０．５６ｍＭ　ＧｌｕＲＳを１．０３μＬ（最終濃度：２３０ｎＭ）、０．１４ｍＭ　ＧｌｙＲＳを１．４７μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．７２ｍＭ　ＨｉｓＲＳを０．３０μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＩｌｅＲＳを１．４７μＬ（最終濃度：３７０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＬｅｕＲＳを０．３８μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、１．３２ｍＭ　ＬｙｓＲＳを０．２２μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＭｅｔＲＳを０．４４μＬ（最終濃度：１１０ｎＭ）、０．５３ｍＭ　ＰｈｅＲＳを０．６３μＬ（最終濃度：１３０ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＰｒｏＲＳを０．４６μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、０．５８ｍＭ　ＳｅｒＲＳを１．６７μＬ（最終濃度：８０ｎＭ）、０．１６ｍＭ　ＴｈｒＲＳを１．３１μＬ（最終濃度：８０ｎＭ）、０．４９ｍＭ　ＴｒｐＲＳを０．１４μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．１４ｍＭ　ＴｙｒＲＳを０．１４μＬ（最終濃度：１５０ｎＭ）、０．３８ｍＭ　ＶａｌＲＳを０．１１μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、０．８２ｍＭ　ＭＴＦを１．７７μＬ（最終濃度：６００ｎＭ）、１．９７ｍＭ　ＭＫを１．７５μＬ（最終濃度：１４００ｎＭ）、０．３７ｍＭ　ＣＫを１．６６μＬ（最終濃度：２５０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＮＤＫを０．１５μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、０．２８ｍＭ　ＰＰｉａｓｅを０．３６μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、０．０４６ｍＭ　Ｔ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．７１μＬ（最終濃度：５０ｎＭ）、５．４９μＭ　Ｔｉｇ（トリガーファクター）を０．４６μＬ（最終濃度：１０００ｎＭ）、０．４７μＭ　ＨｒｐＡを０．４９μＬ（最終濃度：１００ｎＭ）を混合したものを溶液Ｆとした。溶液Ｅを２０．８μＬ、溶液Ｆを１．９μＬ、５０μＭ　リボソームを１．０μＬ（最終濃度：１．０μＭ）、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を２μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを１．３μＬ混合し、水２２．５μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液３（実施例２）を得た。反応液３のうちの２０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。
　（９）反応液４の調製、ＧＦＰ合成反応および合成ＧＦＰの確認
　３Ｍ　グルタミン酸カリウム水溶液を２３５μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を１００μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を２５μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を２５０μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を３．７５μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を４５．４μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を６２．５μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を７．５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を５０μＬ、１８５μｇ／μＬ　ｔＲＮＡ水溶液を５４μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を９３．７５μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を５０μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を３１．２５μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を３１．２５μＬ混合したものを溶液Ｇとした。
　透析バッファー（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）に透析していない６．３５ｍＭ　ＩＦ１を９．７１μＬ（最終濃度：２４７００ｎＭ）、０．７１ｍＭ　ＩＦ２を３．６１μＬ（最終濃度：１０００ｎＭ）、１．２ｍＭ　ＩＦ３を２．６５μＬ（最終濃度：１２００ｎＭ）、１．１１ｍＭ　ＥＦ－Ｇを２．４１μＬ（最終濃度：１１００ｎＭ）、２．８０ｍＭ　ＥＦ－Ｔｕを７１．５２μＬ（最終濃度：８０２００ｎＭ）、２．８４ｍＭ　ＥＦ－Ｔｓを２．９０μＬ（最終濃度：３３００ｎＭ）、０．５１ｍＭ　ＲＦ１を０．２４μＬ（最終濃度：５０ｎＭ）、０．５３ｍＭ　ＲＦ２を０．２３μＬ（最終濃度：５０ｎＭ）、１．２３ｍＭ　ＲＦ３を０．３４μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、４．４４ｍＭ　ＲＲＦを２．１９μＬ（最終濃度：３９００ｎＭ）、０．４８ｍＭ　ＡｌａＲＳを３．８１μＬ（最終濃度：７３０ｎＭ）、０．３１ｍＭ　ＡｒｇＲＳを０．２５μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、１．７６ｍＭ　ＡｓｎＲＳを０．５９μＬ（最終濃度：４２０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＡｓｐＲＳを０．４８μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．１９ｍＭ　ＣｙｓＲＳを０．３２μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、０．３８ｍＭ　ＧｌｎＲＳを０．３９μＬ（最終濃度：６０ｎＭ）、１．４２ｍＭ　ＧｌｕＲＳを０．４１μＬ（最終濃度：２３０ｎＭ）、０．１８ｍＭ　ＧｌｙＲＳを１．２２μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．８２ｍＭ　ＨｉｓＲＳを０．２６μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、０．６８ｍＭ　ＩｌｅＲＳを１．３５μＬ（最終濃度：３７０ｎＭ）、０．３３ｍＭ　ＬｅｕＲＳを０．３１μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、０．７７ｍＭ　ＬｙｓＲＳを０．３７μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．２１ｍＭ　ＭｅｔＲＳを１．３３μＬ（最終濃度：１１０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＰｈｅＲＳを１．２８μＬ（最終濃度：１３０ｎＭ）、１．６９ｍＭ　ＰｒｏＲＳを０．２５μＬ（最終濃度：１７０ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＳｅｒＲＳを０．９１μＬ（最終濃度：８０ｎＭ）、０．１１ｍＭ　ＴｈｒＲＳを１．９９μＬ（最終濃度：８０ｎＭ）、０．１９ｍＭ　ＴｒｐＲＳを０．３７μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．６ｍＭ　ＴｙｒＲＳを０．６３μＬ（最終濃度：１５０ｎＭ）、０．１７ｍＭ　ＶａｌＲＳを０．２５μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、１．０３ｍＭ　ＭＴＦを１．４２μＬ（最終濃度：６００ｎＭ）、１．３３ｍＭ　ＭＫを２．６１μＬ（最終濃度：１４００ｎＭ）、０．８９ｍＭ　ＣＫを０．６９μＬ（最終濃度：２５０ｎＭ）、０．１９ｍＭ　ＮＤＫを０．２０μＬ（最終濃度：２０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＰＰｉａｓｅを０．２２μＬ（最終濃度：４０ｎＭ）、０．２０ｍＭ　Ｔ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．２８μＬ（最終濃度：５０ｎＭ）、８．５１μＭ　Ｔｉｇを０．２９μＬ（最終濃度：１０００ｎＭ）、１．１２μＭ　ＨｒｐＡを０．２２μＬ（最終濃度：１００ｎＭ）を混合したものを溶液Ｈとした。溶液Ｇを２０．９μＬ、溶液Ｈを２．４μＬ、５０μＭ　リボソームを１．０μＬ（最終濃度：１．０μＭ）、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を２μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを１．３μＬを混合し、水２１．９μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液４（比較例２）を得た。反応液４の組成を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この反応液４のうち２０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。
　図１は、上述した反応液１（実施例１）、反応液２（比較例１）、反応液３（実施例２）および反応液４（比較例２）それぞれの場合の再構成型無細胞翻訳の結果を示すグラフであり、縦軸はＧＴＰ合成量（μＭ）、横軸は時間（分）である。図１から明らかなように、本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液を透析バッファーとして用いた反応液１、３（実施例１、２）は、当該保存液を用いなかった場合と比較して、格段にタンパク質合成効率が向上されていることが分かる。
　＜実験例２＞
　３Ｍ　グルタミン酸カリウム（Ｋ－Ｇｌｕ）水溶液を５８３．３μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を２００μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を５０μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を５００μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を５μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を９２．１μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を２５０μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を２５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を３００μＬ、１８５μｇ／μＬのｔＲＮＡ水溶液を１０８μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を１８７．５μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を１２５μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を６２．５μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を６２．５μＬ混合したものを溶液Ｉとした。
　実験例１で用いたのと同じ透析バッファー（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）に透析済みの７．２ｍＭ　ＩＦ１を６８．５１μＬ（最終濃度：９８７００ｎＭ）、１．６４ｍＭ　ＩＦ２を１２．４７μＬ（最終濃度：４１００ｎＭ）、１．７ｍＭ　ＩＦ３を１４．２７μＬ（最終濃度：４８００ｎＭ）、１．２８ｍＭ　ＥＦ－Ｇを１６．７７μＬ（最終濃度：４３００ｎＭ）、３．０４ｍＭ　ＥＦ－Ｔｕを１３１．４μＬ（最終濃度：８０１００ｎＭ）、５．１８ｍＭ　ＥＦ－Ｔｓを１２．７１μＬ（最終濃度：１３２００ｎＭ）、０．４２ｍＭ　ＲＦ１を２．３３μＬ（最終濃度：１９０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＲＦ２を２．１１μＬ（最終濃度：１９０ｎＭ）、０．３２ｍＭ　ＲＦ３を１０．４μＬ（最終濃度：６７０ｎＭ）、２．３２ｍＭ　ＲＲＦを３３．３６μＬ（最終濃度：１５５００ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＡｌａＲＳを１５．９μＬ（最終濃度：２９００ｎＭ）、０．３４ｍＭ　ＡｒｇＲＳを１．７８μＬ（最終濃度：１２０ｎＭ）、０．５４ｍＭ　ＡｓｎＲＳを１５．３７μＬ（最終濃度：１６７０ｎＭ）、０．４５ｍＭ　ＡｓｐＲＳを５．３７μＬ（最終濃度：４８０ｎＭ）、１．４７ｍＭ　ＣｙｓＲＳを０．３２μＬ（最終濃度：９０ｎＭ）、１．０５ｍＭ　ＧｌｎＲＳを１．１３μＬ（最終濃度：２４０ｎＭ）、０．５６ｍＭ　ＧｌｕＲＳを８．２１μＬ（最終濃度：９２０ｎＭ）、０．１４ｍＭ　ＧｌｙＲＳを１１．８２μＬ（最終濃度：３４０ｎＭ）、０．７２ｍＭ　ＨｉｓＲＳを２．３６μＬ（最終濃度：３４０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＩｌｅＲＳを１１．７５μＬ（最終濃度：１４５０ｎＭ）、０．２６ｍＭ　ＬｅｕＲＳを３．０８μＬ（最終濃度：１６０ｎＭ）、１．３２ｍＭ　ＬｙｓＲＳを１．７３μＬ（最終濃度：４５０ｎＭ）、０．６２ｍＭ　ＭｅｔＲＳを３．５μＬ（最終濃度：４３０ｎＭ）、０．５３ｍＭ　ＰｈｅＲＳを５．０６μＬ（最終濃度：５３０ｎＭ）、０．９１ｍＭ　ＰｒｏＲＳを３．６５μＬ（最終濃度：６６０ｎＭ）、０．５８ｍＭ　ＳｅｒＲＳを１．３３μＬ（最終濃度：１５０ｎＭ）、０．１６ｍＭ　ＴｈｒＲＳを１０．４５μＬ（最終濃度：３３０ｎＭ）、０．４９ｍＭ　ＴｒｐＲＳを１．１３μＬ（最終濃度：１１０ｎＭ）、１．３８ｍＭ　ＴｙｒＲＳを０．５４μＬ（最終濃度：３０ｎＭ）、０．３８ｍＭ　ＶａｌＲＳを０．８９μＬ（最終濃度：６０ｎＭ）、０．８２ｍＭ　ＭＴＦを１４．１８μＬ（最終濃度：２３５０ｎＭ）、１．９７ｍＭ　ＭＫを１４．０３μＬ（最終濃度：５５５０ｎＭ）、０．３７ｍＭ　ＣＫを１３．２７μＬ（最終濃度：９９０ｎＭ）、１．３１ｍＭ　ＮＤＫを０．２３μＬ（最終濃度：６０ｎＭ）、１．４ｍＭ　Ｐｐｉａｓｅ１を０．５８μＬ（最終濃度：１６０ｎＭ）、０．０４ｍＭ　Ｔ７　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１１７．３μＬ（最終濃度：５００ｎＭ）、０．５５ｍＭ　Ｔｉｇを９．１μＬ（最終濃度：１０００ｎＭ）、２３．８μＭ　ＨｒｐＡを２１μＬ（最終濃度：２００ｎＭ）、１．０６ｍＭ　Ｐｔｈ（ぺプチジルｔＲＮＡ加水分解酵素）を４．７μＬ（最終濃度：１０００ｎＭ）、５０μＭ　リボソームを１００μＬ（最終濃度：３μＭ）混合したものを溶液Ｊとした。
　溶液Ｉを２５．５μＬ、溶液Ｊを７．９μＬ、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を２μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを１．３μＬを混合し、水を１２．８μＬ加え全量を５０μＬとし、反応液５（実施例３）を得た。得られた反応液５の最終組成を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　反応液５のうち２０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐ（アジレント・テクノロジーズ）で、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。
　図２は、実験例２における反応液５（実施例３）と、実験例１における反応液２（比較例１）および反応液４（比較例２）それぞれの場合の再構成型無細胞翻訳の結果を示すグラフであり、縦軸はＧＴＰ合成量（μＭ）、横軸は時間（分）である。図２から明らかなように、本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液を透析バッファーとして用い、かつ、反応液の内部成分濃度に最適化を施した反応液５（実施例３）は、さらに顕著にタンパク質合成効率が向上されていることが分かる。なお、図２に示したグラフにおいて、反応液５の結果は、測定装置の上限を越えており、実際のＧＦＰ合成量（蛍光に基づく定量）は２０μＭとなる。
　＜実験例３＞
　本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液を用いた場合、用いない場合とで、透析系（図３に示したような透析系反応装置１を利用した無細胞翻訳）、チューブ内（一般的なプラスチックチューブを利用した無細胞翻訳）、それぞれを利用して無細胞翻訳を行なった。
　（１）反応液６の調製および透析系での無細胞翻訳（実施例４）
　実験例２で調製した溶液Ｉを２５．５μＬ、溶液Ｊを７．９μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、５６．１μｇ／μＬ　ＧＦＰプラスミドを８．９μＬ混合し、水７．２μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液６を調製した。この反応液６のうちの５０μＬを分子量３０００カット微量透析器（商品名：透くん）に入れた。この微量透析器を３Ｍ　グルタミン酸カリウム水溶液を１１６．６μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を４０μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を１０μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を１００μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を１μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を１８．４μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を５０μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を６０μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を３７．５μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を２５μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を１２．５μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を１２．５μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを１０μＬ、実験例１で用いた透析バッファーと同組成の以下の組成の保存液（本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液）を８．１μＬを加えたものに水を加えて１ｍＬとした溶液（透析反応用外液１）を入れた密閉容器に入れ、３７℃の水浴に沈め反応を行った（実施例４）。
　（保存液（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＧｌｕ
　　１０ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　また、実施例４で用いた透析反応用外液１の各成分の濃度を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（２）反応液６の調製およびチューブ内での無細胞翻訳（実施例５）
　実験例２で調製した溶液Ｉを２５．５μＬ、溶液Ｊを７．９μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、５６．１μｇ／μＬ　ＧＦＰプラスミドを８．９μＬ混合し、水７．２μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液６を調製した。この５０μＬを、２００μＬプラスチックチューブに入れた。このチューブを水１ｍＬを加えた容器に入れ、３７℃の水浴に沈め反応を行った（実施例５）。
　（３）反応液７の調製および透析系での無細胞翻訳（比較例３）
　実験例１で上述した溶液Ｇを２０．９μＬ、溶液Ｈを２．４μＬ、５０μＭ　リボソームを１．０μＬ（最終濃度：１．０μＭ）、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、５６．１μｇ／μＬ　ＧＦＰプラスミドを８．９μＬ混合し、水１６．３μＬを加え全量を５０μＬとし、反応液７を調製した。この５０μＬを分子量３０００カット微量透析器（商品名：透くん）に入れた。この微量透析器を３Ｍ　グルタミン酸カリウム水溶液を９４．０μＬ、５０ｍＭ　チロシン水溶液を４０μＬ、２００ｍＭ　システイン水溶液を１０μＬ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ溶液に５０ｍＭになるようにアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリンを溶かした溶液を１００μＬ、１Ｍ　スペルミジン水溶液を１．５μＬ、１Ｍ　酢酸マグネシウム水溶液を１８．１８μＬ、１Ｍ　クレアチンリン酸水溶液を２５μＬ、１Ｍ　ジチオスレイトール水溶液を１．５μＬ、１ｍｇ／ｍＬの１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸水溶液を２０μＬ、１００ｍＭ　ＡＴＰ水溶液を３７．５μＬ、１００ｍＭ　ＧＴＰ水溶液を２５μＬ、１００ｍＭ　ＣＴＰ水溶液を１２．５μＬ、１００ｍＭ　ＵＴＰ水溶液を１２．５μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを１０μＬ、上述した実験例１において反応液２に用いた従来品の保存液を４８μＬ加えたものに水を加えて１ｍｌとした溶液（透析反応用外液２）を入れた密閉容器に入れ、３７℃の水浴に沈め反応を行った（比較例３）。比較例３で用いた透析反応用外液２の各成分の濃度を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（４）反応液７の調製およびチューブ内での無細胞翻訳（比較例４）
　実験例１で上述した溶液Ｇを２０．９μＬ、溶液Ｈを２．４μＬ、５０μＭ　リボソームを１．０μＬ（最終濃度：１．０μＭ）、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを０．５μＬ、５６．１μｇ／μＬ　ＧＦＰプラスミドを８．９μＬ混合し、水１６．３μＬを加え全量を５０μＬとし、２００μＬプラスチックチューブに入れた。このチューブを水１ｍＬを加えた容器に入れ、３７℃の水浴に沈め反応を行った（比較例４）。
　（５）結果
　実施例４、５、比較例３、４のそれぞれについて、微量透析器内あるいはチューブの溶液を一部とり、希釈した後にＧＦＰ量を励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光を測定することにより定量を行った。図４は、実験例３の結果を示すグラフであり、縦軸はＧＦＰ合成量（μＭ）、横軸は時間（時間）を示している。図４に示す結果から、本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液を用いた場合には、これを用いなかった場合では達成することができなかった、透析系を利用した再構成型の無細胞翻訳が可能であることが分かった。
　＜実験例４＞
　実験例１と同様に調製した溶液Ｇを８３．６μＬ、溶液Ｈを９．６μＬ、５０μＭ　リボソームを４．０μＬ（最終濃度：１．０μＭ）、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを２．０μＬ、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を８μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを５．２μＬ混合し、水６８．６μＬを加え全量を１８０μＬとした。このうちの１８μＬずつに、水、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ　塩化カリウム水溶液、１００ｍＭ　グルタミン酸カリウム水溶液、３０％　グリセロール水溶液あるいは７ｍＭ　２－メルカプトエタノール水溶液のいずれか２μＬを加え、Ａｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。水を加えたもののＧＦＰ合成量との差を求めて、相対合成活性とした。
　図５は、実験例４の結果を示すグラフであり、縦軸は相対合成活性を示している。図５において、横軸は、水を添加した場合（１）、ＨＥＰＥＳを添加した場合（２）、塩化カリウム水溶液を添加した場合（３）、グルタミン酸カリウムを添加した場合（４）、グリセロールを添加した場合（５）、２－メルカプトエタノールを添加した場合（６）の各結果を示している。図５に示す結果から、塩化カリウム水溶液を添加した場合（３）、ならびに、グリセロールを添加した場合（５）に相対合成活性が低く、中でも、塩化カリウム水溶液を添加した場合（３）が顕著であることが分かる。
　＜実験例５＞
　実験例２で調製した溶液Ｉを１０２μＬ、溶液Ｊを１９．６μＬ、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を８μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを２μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡ　５．２μＬを混合し、水２３．２μＬを加え全量を１６０μＬとした。このうちの１６μＬずつに、水、塩化カリウム水溶液（濃度：２．５ｍＭ、５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、２５０ｍＭまたは５００ｍＭ）４μＬを加え、Ａｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。水を加えたもののＧＦＰ合成量を１として、その値との比率を相対ＧＦＰ合成活性とした。
　図６は、実験例５の結果を示すグラフであり、縦軸は相対ＧＦＰ合成活性、横軸は塩化カリウム水溶液の濃度（ｍＭ）である。図６に示す結果から、塩化カリウムの濃度が１０ｍＭまではあまり影響が見られなかったが、それ以上の濃度となると急激に活性が低下することが分かった。このことから、塩化カリウム水溶液の濃度は１０ｍＭ以下とすることが望ましい。
　＜実験例６＞
　実験例２で調製した溶液Ｉを１０２μＬ、溶液Ｊを１９．６μＬ、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を８μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを２μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡ　５．２μＬを混合し、水２３．２μＬを加え全量を１６０μＬとした。このうちの１６μＬずつに、水、グリセロール（濃度：０．１％、０．５％、２．５％、５％、２５％または５０％）４μＬを加え、Ａｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。水を加えたもののＧＦＰ合成量を１として、その値との比率を相対ＧＦＰ合成活性とした。
　図７は、実験例６の結果を示すグラフであり、縦軸は相対ＧＦＰ合成活性、横軸はグリセロールの濃度（％）である。図７に示す結果から、グリセロールの場合には、最終濃度５％まで影響が見られず、このためグリセロールは５％以下とすることが望ましいことが分かる。
　＜実験例７＞
　実験例２で調製した溶液Ｉを１０２μＬ、溶液Ｊを３１．６μＬ、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を８μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを２μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを５．２μＬ混合し、水１１．２μＬを加え全量を１６０μＬとした。このうちの１６μＬずつに、水、２５０ｍＭ　グルタミン酸カリウム（ＫＧｌｕ）水溶液、２５０ｍＭ　塩化カリウム（ＫＣｌ）水溶液、２５０ｍＭ　アスパラギン酸カリウム（Ｋ－Ａｓｐ）水溶液、２５０ｍＭ　酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）水溶液、２５０ｍＭ　クエン酸カリウム（Ｋ－Ｃｉｔ）水溶液のいずれか４μＬを加え、Ａｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに２４０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。速度はＧＦＰ合成反応開始より１０分から３０分までの値をもとに１分間あたりの合成速度を求めた。相対ＧＦＰ合成速度は水を加えたものの合成速度を１として、その値との比率を相対ＧＦＰ合成速度とした。
　図８は、実験例７の結果を示すグラフであり、縦軸は相対ＧＦＰ合成速度を示している。図８に示す結果から、ＫＧｌｕ（グルタミン酸カリウム）を添加した場合と比較して、Ｋ－Ａｓｐ（アスパラギン酸カリウム）、ＫＯＡｃ（酢酸カリウム）を加えた場合は同程度の影響しか与えなかったため、ＫＣｌを置き換える塩としては、ＫＧｌｕとともにＫ－ＡｓｐあるいはＫＯＡｃも使用可能であると考えられる。一方、Ｋ－Ｃｉｔ（クエン酸カリウム）は完全に合成反応を阻害した。
　＜実験例８＞
　伸長因子として、ＥＦ－Ｐ修飾型（非特許文献であるDoerfel et al. 2013, Science, 85-88に記載のプラスミドを持つ大腸菌から同文献に記載された方法により精製を行なったものを段落〔００６８〕に記載した保存液（ｐＨ７．６、ろ過後）に対して透析を行なったもの）を用い、本発明の再構成型無細胞翻訳システム用酵素の保存液を用いた反応液を調製し、無細胞翻訳を行ない、ＧＦＰを合成した。上述した反応液５（実施例３）に、それぞれ１μＭ、３μＭ、５μＭおよび１０μＭの濃度となるようにＥＦ－Ｐ修飾型を添加した。また反応液５そのものを、ＥＦ－Ｐ修飾型が０μＭの濃度の場合とした。具体的には、実験例２で調製した溶液Ｉを１０２μＬ、溶液Ｊを３１．６μＬ、１０μＭ　Ａｌｅｘａ６４７水溶液を８μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮａｓｉｎを２μＬ、７．７５μＭ　ＧＦＰ　ＲＮＡを５．２μＬ混合し、水３１．２μＬを加え全量を１８０μＬとした。そのうち１８μＬにそれぞれ０μＭ、１０μＭ、３０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの各濃度のＥＦ－Ｐ修飾型を２μＬ加えることにより、０μＭ、１μＭ、３μＭ、５μＭおよび１０μＭの各濃度のＥＦ－Ｐ修飾型を含む反応液をそれぞれ得た。
　各反応液２０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ社製定量ＰＣＲ装置Ｍｘ３００５Ｐで、３７℃、励起波長４９２ｎｍ、蛍光波長５１６ｎｍのＧＦＰ蛍光と励起波長６３５ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍのＡｌｅｘａ６４７蛍光を１分ごとに６０分まで測定を行い、ＧＦＰ合成の確認を行った。定量に際しては、Ａｌｅｘａ６４７蛍光を用いてＧＦＰ蛍光の測定誤差の補正を行った値を用いた。
　図９～図１１は、実験例８の結果をそれぞれ示すグラフであり、図９において縦軸はＧＦＰ蛍光（ｎＭ）、横軸は時間（分）であり、図１０において縦軸は反応の初期速度（ＧＦＰ　ｎＭ／分）、横軸はＥＦ－Ｐの濃度（μＭ）であり、図１１において縦軸は最終的に合成されたＧＦＰの量（ｍｇ／ｍＬ）、横軸はＥＦ－Ｐの濃度（μＭ）である。図９～図１１から分かるように、ＥＦ－Ｐ修飾型を本発明の反応液を適用した無細胞翻訳システムに添加することで、合成速度、合成量の改善が見られた。

Claims (8)

  1. 　塩化物塩の濃度が１０ｍＭ以下であり、かつ、グリセロールの濃度が５％以下である、酵素の保存液。
  2. 　塩化物塩を含まない、請求項１に記載の保存液。
  3. 　塩化物塩が塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの少なくともいずれかである、請求項２に記載の保存液。
  4. 　グリセロールを含まない、請求項１～３のいずれか１項に記載の保存液。
  5. 　グルタミン酸カリウム、酢酸カリウムまたはアスパラギン酸カリウムを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の保存液。
  6. 　グルタミン酸マグネシウム、酢酸マグネシウムまたはアスパラギン酸マグネシウムを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の保存液。
  7. 　再構成型無細胞翻訳システムに用いるための酵素の保存液である、請求項１～６のいずれか１項に記載の保存液。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の保存液を含む、再構成型無細胞翻訳システム用反応液。
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