JP4768155B2

JP4768155B2 - 鋳型ｄｎａの製造方法及びそれを用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法

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Publication number: JP4768155B2
Application number: JP2001201356A
Authority: JP
Inventors: 容子元田; 孝矢吹; 隆則木川; 茂之横山
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2021-07-02
Also published as: EP1411131A1; EP1411131B1; WO2003004703A1; DE60219632D1; JP2003009880A; US20060147990A1; US20040214292A1; US7846694B2; US7195895B2; ATE360065T1; DE60219632T2; CA2452396A1; EP1411131A4

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタンパク質を合成するための鋳型ＤＮＡの製造方法及びその方法により製造した鋳型ＤＮＡを用いてタンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物の大量のゲノム配列情報から抽出される膨大な数の遺伝子について、それぞれにコードされたタンパク質の立体構造を決定し、機能との相関を系統的かつ網羅的に解析する「構造ゲノム科学」と呼ばれる研究が進展している。ゲノム塩基配列の全体が明らかになるに従って、無数にあると思われたタンパク質の立体構造も、実は千種類から数千種類の基本構造（フォールド）単位の組み合わせから形成されており、この組み合わせによって機能の多様性が実現されているらしいことが分かってきた。従って、タンパク質の合成から構造解析までの全過程をハイスループット化することにより、これらの基本構造の全体を解明し、これらの知識を基にしてタンパク質の構造と機能の関係を明らかにすることができると考えられる。
【０００３】
多数のタンパク質試料を効率よく発現、調製するシステムとして、無細胞タンパク質合成系があり、透析法の導入など様々な改良が行われた結果、数時間でミリグラムオーダーのタンパク質が得られるようになってきた（Kigawaら、FEBS Lett.、442巻、15−19頁、1999年、及び特開2000-175695号公報参照）。この無細胞タンパク質合成系でタンパク質を効率よく発現させるためには、鋳型となるＤＮＡとして、適当な発現制御領域と発現させたい所望のタンパク質をコードする遺伝子配列とを含む二本鎖ＤＮＡが必要である。適当な発現制御配列を持たないクローニングベクターにクローン化された任意の遺伝子等を無細胞タンパク質合成系で発現させるためにはこれらの遺伝子に適当な発現制御配列を付加する必要がある。そのために、従来より、遺伝子を含むプラスミドベクター等から制限酵素、ＰＣＲ等で所望のＤＮＡ断片を切り出した後、適当な発現制御配列を持つベクターにリクローニングしたり、更にＰＣＲで所望のＤＮＡ断片を増幅する方法が行われてきた。
【０００４】
タンパク質の発現効率を上げるためには、強力なプロモーターやターミネーターを用いて転写を促進すると共に、ｍＲＮＡとリボゾームとの親和性を上げて翻訳効率を高める必要がある。また、合成されたタンパク質を迅速に精製、若しくは検出するためには、アフィニティー精製若しくは検出のための標識（タグ）配列を組み込んだ融合タンパク質を設計することも必要になる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このようなタンパク質の合成に適した鋳型ＤＮＡを調製する際に、大腸菌等の生細胞を用いて遺伝子組み換えを行いクローン化する方法は、操作が複雑なため時間と手間がかかるだけでなく自動化によるハイスループット化が極めて困難である。また個々の遺伝子ごとに最適化して構築しなければならず、このため複雑な遺伝子組換え操作を行ったり、ＰＣＲのためのプライマーを何種類も合成しなければならないという問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、タンパク質を発現、精製するための鋳型ＤＮＡの効率の良い調製方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑みて、本発明者らは無細胞タンパク質合成系における鋳型ＤＮＡの調製方法について鋭意検討を行った結果、ｃＤＮＡライブラリーから選択した任意のクローン化ＤＮＡを２段階ＰＣＲにより増幅することによって、タンパク質の発現に適した直鎖状鋳型ＤＮＡが極めて迅速かつ効率よく合成できることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の視点において、
下記工程を含むことを特徴とする増幅された直鎖状二本鎖ＤＮＡの製造方法が提供される：
ｉ）以下の反応溶液を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅することによって増幅された第１のＤＮＡ断片を取得し、当該反応溶液は、
二本鎖ＤＮＡ断片をベクターにクローン化した鋳型であって、前記ＤＮＡ断片はタンパク質又はその一部をコードする配列を含み、
前記タンパク質のコード配列の５’末端領域にアニールする第１のセンスプライマー、
前記第１のセンスプライマーの少なくとも５’部分と同じ３’末端配列、及び所望のヌクレオチド配列と同じ５’末端配列を有する第２のセンスプライマー、及び
前記タンパク質のコード領域の下流のベクター配列部分にアニールする第１のアンチセンスプライマー
を含む工程；並びに
ｉｉ）以下の反応溶液を用いて、前記第１の増幅されたＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、当該反応溶液は、
ａ）以下のものを含む鋳型混合物：
ａａ）前記第１の増幅されたＤＮＡ断片、
ａｂ）前記第１の増幅されたＤＮＡ断片の５’末端領域にハイブリダイズする配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片、及び
ａｃ）前記第１の増幅されたＤＮＡ断片の３’末端領域にハイブリダイズする配列を含む第３の二本鎖ＤＮＡ断片；
ｂ）前記第２のＤＮＡ断片の５’末端領域にアニールする第３のセンスプライマー；及び
ｃ）前記第３のＤＮＡ断片の３’末端領域にアニールする第２のアンチセンスプライマー
を含み；
ここで、前記第２のＤＮＡ断片ａｂ）は遺伝子の転写及び翻訳の調節配列を含み、前記第２のＤＮＡ断片ａｂ）及び前記第３のＤＮＡ断片ａｃ）の反応溶液ｉｉ）における濃度がそれぞれ、５〜２５００ｐｍｏｌ／Lである工程。
本発明は、以下の形態を含む。
タンパク質をコードする第１の二本鎖ＤＮＡ断片と、
該第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片と、
該第１のＤＮＡ断片の3'末端領域と重複する配列を含む第３の二本鎖ＤＮＡ断片と、
該第２のＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと、及び
該第３のＤＮＡ断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーと、
を接触させてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直鎖状二本鎖ＤＮＡを増幅する方法において、
該第２のＤＮＡ断片が遺伝子の転写及び翻訳を制御する配列を含み、
該ＰＣＲ溶液中における第２のＤＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の濃度がそれぞれ、5〜2500 pmol/Lであることを特徴とするタンパク質合成用鋳型ＤＮＡの製造方法。
【０００９】
好ましい態様において、前記第１のＤＮＡ断片を調製するために、あらかじめＰＣＲ（第１次ＰＣＲ）を行ってＤＮＡを増幅した後、該第１次ＰＣＲ溶液を前記第１のＤＮＡ断片として用いて上記ＰＣＲ（第２次ＰＣＲ）を行う方法であって、該第１次ＰＣＲ溶液中に残存するプライマー及び該第１次ＰＣＲで生じたプライマーダイマーの濃度が、該第２次ＰＣＲ溶液中においてそれぞれ20 nmol/L未満であることを特徴とする。
【００１０】
このように、前記第１次ＰＣＲに用いたプライマー及び副産物として生じたプライマーダイマーの第２次ＰＣＲへの持ち込み量を減らすためには、第１次ＰＣＲに用いるプライマー濃度を20〜500 pmol/Lの範囲内とするか、第１次ＰＣＲ溶液を１０〜１００倍に希釈（第２次ＰＣＲ溶液中における終濃度で）して第２次ＰＣＲを行うか、若しくはこれらの両方を組み合わせて行うか、又は第１次ＰＣＲ溶液中からプライマー及びプライマーダイマーを除去した後に第２次ＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の一実施形態において、前記第１次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、組換え微生物菌体又はその培養液であることを特徴とする。
【００１２】
さらに好ましい態様において、前記センスプライマーとアンチセンスプライマーが同一の塩基配列であり、及び／又は前記第２のＤＮＡ断片は、転写終結配列を含むことを特徴とする。
【００１３】
別の好ましい態様において、前記第２のＤＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の少なくとも一方がタグペプチドをコードする配列を含み、該タグペプチドが前記タンパク質又はその一部と融合して合成されることを特徴とする。前記タグペプチドはマルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、チオレドキシン、ストレプトアビジン結合ペプチド又はヒスチジンタグペプチドであることが好ましい。
【００１４】
本発明の別の視点において、上記何れかの方法により製造した鋳型ＤＮＡを用いることを特徴とする無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の製造方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一実施形態について添付図面に沿って詳述する。図１は、完全長ｃＤＮＡをクローン化したプラスミドＤＮＡを用いて、２段階ＰＣＲによって、タンパク質合成用の直鎖状二本鎖鋳型ＤＮＡを調製する方法を示したフローチャートである。
【００１６】
（１）第１次ＰＣＲ
第１次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、所望のタンパク質をコードする配列を含むものであればどのようなものでも良く、例えばｃＤＮＡライブラリーからクローン化したものだけでなく、ゲノムＤＮＡクローンや合成ＤＮＡを用いることもできる。また、精製されたＤＮＡでなくても良く、例えば、上記配列を含むプラスミドベクターを保持した菌体又はその菌体培養液を用いることができる。図１では、プラスミドベクターpBLUESCRIPT SK+のSacI, XhoI 部位にマウス完全長ｃＤＮＡをクローン化したプラスミドmodified bluescript 1を示す。
【００１７】
図１において、クローン化されたｃＤＮＡのタンパク質コード領域を増幅するために、5'側のプライマーとして２種類のプライマー（5'-プライマー１及び5'-プライマー２）を使用する。5'-プライマー２の塩基配列は、クローン化したｃＤＮＡのコードするタンパク質のアミノ末端領域に相当する塩基配列とアニールするように設計されている。5'-プライマー２は、更にその5'末端側に任意の塩基配列を含むことができる。一方、5'-プライマー１は、上記5'-プライマー２の5'末端側の一部と共通の配列を有すれば良く、両方のプライマーが重複して第１次ＰＣＲの5'側のプライマーとして機能する。
【００１８】
一方、図１において、3'側のプライマーは、タンパク質をコードする領域の3'下流であるプラスミドベクターとアニールするように設計され、上記5'側のプライマーと共にＰＣＲによってＤＮＡ鎖を伸長させ、発現させたいタンパク質をコードする第１のＤＮＡ断片が増幅される。該第１のＤＮＡ断片は、後述する第２次ＰＣＲの鋳型として用いるため、ＰＣＲ反応液から従来公知の方法で精製することもできるが、ＰＣＲ反応液をそのまま用いることもできる。この場合には、反応液中に残存する上記プライマーが第２次ＰＣＲ反応を阻害する可能性がある。従って、第１次ＰＣＲに用いたプライマー及び第１次ＰＣＲで副産物として生じたプライマーダイマーの第２次ＰＣＲ溶液中への持ち込み量を20 nmol/L未満に減らすことが好ましく、具体的には、5'プライマー、3'プライマーのそれぞれについて、複数本のプライマーを用いる場合はその合計濃度で、20〜500 nmol/Lの濃度で用いる。更に好ましくは50〜100 nmol/Lである。
【００１９】
あるいは、第１次ＰＣＲ溶液を１０〜１００倍に希釈してプライマー及びプライマーダイマーの第２次ＰＣＲへの持ち込み量を減らすことができる。
【００２０】
なお、このような方法の他に、上記第１のＤＮＡ断片を得るために種々のプライマーを用いたＰＣＲが可能であり、その際に用いられるプライマーの塩基配列やＰＣＲの反応条件等は、通常使用されるものであればよく、当業者において適宜設定されることが望ましい。さらに、上記ｃＤＮＡクローンから直接制限酵素などでＤＮＡ断片を切り出すことによって上記第１のＤＮＡ断片を取得することもできる。
【００２１】
（２）第２次ＰＣＲ
次に、上記第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する配列を含む二本鎖の第２のＤＮＡ断片（以下、「5'ＤＮＡ断片」という場合もある。）を調製する。該第２のＤＮＡ断片は、その3'末端領域で、上記第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複することによって、これら２つのＤＮＡ断片が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が起こり、第２次ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡが生成する。重複する領域は、１２塩基対以上が好ましく、更に好ましくは１７塩基以上である。
【００２２】
続いて、上記第１のＤＮＡ断片の3'末端領域と重複する配列を含む二本鎖の第３のＤＮＡ断片（以下「3'ＤＮＡ断片」という場合もある。）を調製する。該第３のＤＮＡ断片は、その5'末端領域で、上記第１のＤＮＡ断片の3'末端領域と重複することによって、これら２つのＤＮＡ断片が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が起こり、第２次ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡが生成する。重複する領域は、１２塩基対以上が好ましく、更に好ましくは１７塩基以上である。
【００２３】
次に、第２次ＰＣＲ用のプライマーとして、上記5'ＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセンスプライマーと、上記3'ＤＮＡ断片の3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーを合成する。これらのプライマーは、第２次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとアニールしてＤＮＡ伸長反応を起こし、所望のＤＮＡ断片が増幅できればよく、上記鋳型ＤＮＡの両末端領域とアニールする複数のプライマーを用いることができるが、好ましくは図１に示したように、上記両末端配列が相補的な塩基配列である場合には、１種類のプライマー（ユニバーサルプライマー）で増幅反応が可能である。該プライマーは、通常、5〜50塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくは15〜25塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる。２種類のプライマーを用いるよりも１種類のユニバーサルプライマーを用いる方がＰＣＲによる副産物が少ない点で有利である。
【００２４】
一般に、ＰＣＲではプライマー同士が対合した副産物（プライマーダイマー）が生じることが知られている。２種類のプライマーを用いた場合には、一旦生じたプライマーダイマーが鋳型ＤＮＡとして働いてこの副産物が増幅されてしまい、目的産物の増幅に使用されるプライマー量が減ってしまう。その結果目的産物量が少なくなると考えられる。一方、１種類のプライマーのみを用いてＰＣＲを行った場合は、生じたプライマーダイマーは同一分子内に相補的配列を有するためヘアピン構造をとりやすく、ＰＣＲにより増幅されにくいため副産物が少なくなると考えられる。
【００２５】
また、上記5'ＤＮＡ断片は、第１のＤＮＡ断片と重複する領域の上流に、遺伝子の転写及び翻訳を誘導、制御する配列を含む。遺伝子の転写を誘導、制御する配列はプロモーター及びオペレーター配列と呼ばれ、大腸菌や酵母等の原核及び真核生物において詳細に研究されている。例えば、大腸菌のファージに由来するＴ７プロモーター等が使用される。Ｔ７プロモーターはＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって強力な転写が行われることが知られている。ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳は、リボゾーム等の翻訳開始複合体がｍＲＮＡに結合することによって誘導される。リボゾーム結合配列(RBS)は、ＳＤ配列とも呼ばれタンパク質の効率的な発現にとって重要である。
【００２６】
さらに、これらの発現制御配列の上流には、ＰＣＲにおいて上記センスプライマーがアニールする配列を含む。ここでセンスプライマーの塩基配列は5'ＤＮＡ断片の5'末端領域とハイブリダイズしてプライマーとして働くものであれば良く、鋳型ＤＮＡと相補的な配列中の１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたものを含む。
【００２７】
同様に、3'ＤＮＡ断片の3'末端領域には、ＰＣＲにおいて上記アンチセンスプライマーがアニールする配列を含む。アンチセンスプライマーは、3'ＤＮＡ断片の3'末端領域とハイブリダイズしてプライマーとして働くものであれば良く、鋳型ＤＮＡと相補的な配列中の１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたものを含む。
【００２８】
第２次ＰＣＲの反応液中における5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の濃度は、通常のＰＣＲにおけるプライマーＤＮＡ濃度よりも低濃度にすることが好ましく、5 〜 2500 pmol/L、より好ましくは10〜500 pmol/Lの濃度で用いられる。これらのＤＮＡ断片の濃度が2500 pmol/Lよりも高いとＰＣＲ中に副産物が生じやすい。すなわち、5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片に結合したユニバーサルプライマーから生成される一本鎖ＤＮＡ同士が上述したプライマーダイマーと同様の仕組みで結合し、その結果5'ＤＮＡ断片と3'ＤＮＡ断片とが直接結合したような副産物ができやすい。この副産物は目的産物よりも短いためＰＣＲで増幅されやすく、また、タンパク質合成においても短いタンパク質のみを発現する鋳型として働くため目的とするタンパク質の合成に悪影響を与えるからである。
【００２９】
一方、ＤＮＡ断片の濃度が5 pmol/Lよりも低いと、鋳型として働くＤＮＡの量そのものが少なくなって十分な量の目的ＤＮＡが増幅されない。第２次ＰＣＲのその他の反応条件については、当業者において適宜反応条件を選択して用いることができる。
【００３０】
上記5'ＤＮＡ断片は、さらに転写終結配列を含むことが好ましい。転写終結配列は、ＲＮＡポリメラーゼの脱離を促すＤＮＡ塩基配列であって、一般にＧＣに富んだ対称性を示す配列と、それに続くＴの連続する特徴的な構造を有し、転写反応を効率化する。
【００３１】
なお、上記の5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の何れか一方又は両方が二本鎖ＤＮＡの代わりに一本鎖ＤＮＡであっても上記第２次ＰＣＲを行うことができ、このような態様も本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
（３）タグペプチド
上記5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の少なくとも一方に、タグペプチドをコードする配列を含むことが好ましい。タグペプチドとは、発現させるタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、該タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタンブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列である。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン(TrxA)、セルロース結合ドメイン(CBD)、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Streptag^TM）、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。
【００３３】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込むとGSTとの融合タンパク質として発現させることができる。このための組換えベクターpGEX Vectorsはアマシャムファルマシアバイオテック社から市販されている。GSTのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタチオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や酵素免疫染色に利用されている。
【００３４】
マルトース結合タンパク質（MBP）は、大腸菌のマルトース結合タンパク質であり、MBPとの融合タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗MBP抗体を使用することもできる。
【００３５】
チオレドキシン(TrxA)は、酸化還元反応を触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチオール基によって金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。このための担体として、例えばThioBond^TM Resin(Invitorogen社製)等が市販されている。
【００３６】
セルロース結合ドメイン(CBD)はClostridium cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロース結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。
【００３７】
ストレプトアビジン結合ペプチドとして、例えばStrep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなるペプチドが知られており、StrepTactin^TMやStreptavidine^TMに選択的に結合させて精製することができる。
【００３８】
ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好ましい。このヒスチジンタグに直接又はアミノ酸配列を介して上記第１のＤＮＡ断片によってコードされるタンパク質が結合される。ヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、容易に精製することができる。
【００３９】
特に好ましい形態において、上記ヒスチジンタグは配列番号１で示したアミノ酸配列を有する。この配列は、トリ筋肉の乳酸脱水素酵素のＮ末端に由来する天然の配列(native His tag)である。塩基性アミノ酸である６個のヒスチジン残基が適度に分散して存在するため、連続する６個のヒスチジンタグよりも等電点が低く、中性の緩衝液条件でアフィニティー精製ができるという利点を有する。
【００４０】
本形態において、これらのタグペプチドは発現させたタンパク質をアフィニティー精製したり、検出のために有用なだけでなく、天然型のタンパク質に比べてタグペプチドとの融合タンパク質の方が発現量の増大する場合がある。その理由は明らかではないが、翻訳開始段階においてｍＲＮＡやリボゾーム等との複合体を安定化して翻訳効率を高めるためではないかと推測される。
【００４１】
これらのタグ配列の下流には、トロンビン、Factor Xa、エンテロキナーゼ等のプロテアーゼ切断部位ができるような塩基配列を含んでいても良く、目的タンパク質を上記タグ配列から切り離して精製することもできる。
【００４２】
また、上記タグ配列は目的タンパク質のＣ末端側に配し、Ｎ末端側のリーダー配列の機能を残したまま、精製も容易に行えるようにすることもできる。
【００４３】
（４）無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の合成
このようにして製造した鋳型ＤＮＡは、種々の方法によりタンパク質を合成することができる。例えば、無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を合成することが好ましい。無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系であり、上記細胞抽出液としては、リボゾーム、t-RNA等のタンパク質合成に必要な成分を含む、従来より公知の真核細胞又は原核細胞の抽出液が使用可能である。好ましくは小麦胚芽や大腸菌由来のもの（例えば大腸菌S30細胞抽出液）又は高度好熱菌(Thermus thermophilus)由来のものが高い合成量を得る点において好ましい。この大腸菌Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌A19（rna, met）, BL21, BL21 star, BL21 codon plus株等から公知の方法（Pratt, J.M. et al., Transcription and translation - a practical approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggins, S.J.編、IRL Press, Oxford参照）に従って調製でき、又はPromega社、Novagen社又はRoche社から市販されるものを使用してもよい。
【００４４】
本発明の無細胞タンパク質合成系には、バッチ法、フロー法の他、従来公知の技術がいずれも適用可能であり、例えば限外濾過膜法や透析膜法、樹脂に翻訳鋳型を固定化したカラムクロマト法等（Spirin, A.ら、Meth. In Enzymol. ２１７巻、１２３〜１４２頁、１９９３年参照）を挙げることができる
【００４５】
なお、上記無細胞タンパク質合成系の他にも、例えば動物細胞にリポフェクション等で鋳型ＤＮＡを導入して遺伝子を発現させ、生細胞中での、その遺伝子産物の機能解析に利用することも可能である。
【００４６】
【実施例】
以下に本発明の実施例として、ヒト c-Ha-Rasタンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、及びマウス完全長ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択した種々のｃＤＮＡクローン（理化学研究所ゲノム科学総合研究センター、遺伝子構造・機能研究グループ、林崎良英博士から提供を受けた。)を無細胞タンパク質合成系で発現させた結果を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
[実施例１] Rasタンパク質の発現
（１）第１次ＰＣＲ
Rasタンパク質をコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ（配列番号２に塩基配列を示した。）を鋳型とし、5'プライマー１：hRBS>B+6（配列番号３）、5'プライマー２：pRas（配列番号４）及び3'プライマー：p8.2（配列番号５）の３種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及び増幅プログラムは、それぞれ表１及び表２に示した。
【００４８】
5'プライマー１：hRBS>B+6（配列番号３）
5' -CCGAAGGAGCCGCCACCAT- 3'
5'プライマー２：pRas（配列番号４）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGACCGAATACAAACTGGTTGTAG- 3'
3'プライマー：p8.2（配列番号５）
5' -GCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC- 3'
【００４９】
【表１】

【００５０】
【表２】

【００５１】
（２）第２次ＰＣＲ
次に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、T７プロモーター配列の下流に各種のタグ配列を有する５’ＤＮＡ断片：T7P（配列番号６〜１０）と、T７ターミネーター配列を有する３’ＤＮＡ断片：T7T（配列番号１１）と、ユニバーサルプライマー(YA1.2)：5'-GCCGCTGTCCTCGTTCCCAGCC-3'（配列番号１２）とを用い第２次オーバーラップＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及びプログラムは、それぞれ表３及び表２に示した。また、ここで用いた5'ＤＮＡ断片にコードされたタグペプチドの概要を表４に示した。この結果、図１に示したように、T７プロモーターの制御下で、各種のタグ配列とRasタンパク質との融合タンパク質を発現することのできる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
【００５２】
【表３】

【００５３】
【表４】

なお、His tag及びnative His tagについては、それらのアミノ酸配列を一文字の略号で表した。
【００５４】
（３）無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成
大腸菌S30抽出液はZubayら（Annu.Rev.Geneti.,7,267-287,1973）の方法に従って、大腸菌BL21株から調製した。タンパク質合成反応は９６ウエルマイクロプレートを用い、その各ウエルに下記の表５に示した組成の溶液に、上記第２次ＰＣＲ産物１μl、上記大腸菌S30抽出液7.2μlを加え、反応液の全量を30μlとし、37℃で１時間、Rasタンパク質の合成を行った。
【００５５】
【表５】

【００５６】
[実施例２] ＣＡＴタンパク質の発現
（１）第１次ＰＣＲ
ＣＡＴタンパク質をコードする配列番号１３に示した塩基配列の直鎖状二本鎖ＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の方法で第１次ＰＣＲを行った。ただし、5'プライマー２としては、ＣＡＴ遺伝子に特異的な、配列番号１４に示した塩基配列のプライマーpCATを用いた。
【００５７】
5'プライマー２：pCAT（配列番号１４）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC- 3'
【００５８】
（２）第２次ＰＣＲ及び無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成
実施例１と同様の方法により、第２次ＰＣＲ及び無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成を行った。
【００５９】
[実施例３] マウスｃＤＮＡクローンの発現
（１）第１次ＰＣＲ
マウス完全長ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択した１０種類のｃＤＮＡクローンを鋳型として用いた。これらは、プラスミドpBluescriptSK+のSacI, XhoI部位にそれぞれのｃＤＮＡがクローン化されたものであり、GenBankに登録されている（Accession No.は、それぞれ m16206、m21532、x13605、u51204、l16904、s68022、d87663、x65627、m32599、u85511である。）。5'プライマー１及び3'プライマーとしては実施例１と共通のプライマーを用い、5'プライマー２としてはそれぞれのｃＤＮＡに特異的な以下の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及びプログラムは、それぞれ表６及び表２に示した。
【００６０】
5'プライマー２：p1A2（配列番号１５）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGCTCAAAGTCACGGTGCCC- 3'
5'プライマー２：p1B2（配列番号１６）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGAGGAGCAGCGCTGTTC- 3'
5'プライマー２：p1C8（配列番号１７）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGCCCGAACCAAGCAGAC- 3'
5'プライマー２：p1D2（配列番号１８）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGGTGTTGACAAAATCATTCC- 3'
5'プライマー２：p1D9（配列番号１９）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGTTGGAGACCTACAGCAACC- 3'
5'プライマー２：p1D10（配列番号２０）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGCGGTGCAGGTGGTGC- 3'
5'プライマー２：p1E4（配列番号２１）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGATGATCGGGAGGATCTG- 3'
5'プライマー２：p1G4（配列番号２２）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGTCGAGTTATTCTAGTGAC- 3'
5'プライマー２：p1H1（配列番号２３）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC- 3'
5'プライマー２：p1H5（配列番号２４）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGCCAACAGTGAGCG- 3'
【００６１】
【表６】

【００６２】
（２）第２次ＰＣＲ
実施例１と同様の方法により、第２次ＰＣＲを行った。但し、ＰＣＲ溶液組成は表３に代えて表７に示した組成の反応溶液を用いた。
【００６３】
【表７】

【００６４】
[実施例４] 合成産物の確認
実施例１及び２の方法によりＰＣＲで増幅した反応液の一部を１％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を図２に示した。レーン１〜７はそれぞれ、１：第１次ＰＣＲ産物、２：Hisタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、３：native Hisタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、４：GSTタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、５：MBPタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、６：CBDタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、及び７：TrxAタグを付加した第２次ＰＣＲ産物を示す。第１次ＰＣＲ及び第２次ＰＣＲ共に、単一のＤＮＡのバンドのみが検出され、第２次ＰＣＲでは、それぞれの標識ペプチドをコードするタグ配列を結合した正しい長さのＤＮＡが増幅されていることが分かる。
【００６５】
実施例１及び２の方法により、無細胞タンパク質合成系で合成されたタンパク質量を、¹⁴C標識Leu存在下で合成後、TOPCOUNTを用いて定量した。その結果を下記表８及び図３に示した。表８は、６種類の標識ペプチドとの融合タンパク質として合成されたRasタンパク質及びCATタンパク質の推定分子量と発現量を示した。対照として、ＤＮＡ無添加で合成した結果及び環状二本鎖ＤＮＡであるプラスミドpk7-Ras及びpk7-CAT（Kigawaら、FEBS Lett.、442巻、15−19頁、1999年、参照）を用いて無細胞タンパク質合成系で合成した結果を示した。これらの結果より、用いたタグペプチドの種類によって発現量は異なるものの、これらのタグペプチドのない環状二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合とほぼ同等の発現量が得られることが分かった。
【００６６】
【表８】

【００６７】
また、上記¹⁴C標識Leu存在下でタンパク質合成を行った溶液5μlを用いてSDS-PAGEを行った結果を図４に示した。図４において、レーン１〜７はそれぞれ、１：Hisタグを付加したRas又はCATタンパク質、２：native Hisタグを付加したRas又はCATタンパク質、３：GSTタグをRas又はCATタンパク質、４：MBPタグを付加したRas又はCATタンパク質、５：CBDタグを付加したRas又はCATタンパク質、及び６：TrxAタグを付加したRas又はCATタンパク質を示す。なお、図中、Ras及びCATと示したレーンには、対照として、プラスミドpk7-Ras及びpk7-CATを鋳型として無細胞タンパク質合成系で合成したタンパク質を、Ｈ、Ｌはそれぞれ高分子量及び低分子量の分子量マーカーを示す。これらの結果より、それぞれのタグを付加したRas及びCATタンパク質が正しい分子量で合成されていることが分かる。
【００６８】
実施例３の方法により、GST及びnative His tag配列と融合して合成したマウスｃＤＮＡクローン由来のタンパク質の合成量を図５に示した。これらの結果より多検体のｃＤＮＡクローンから効率よくタンパク質が合成できることが示された。
【００６９】
[比較例１]
第２次ＰＣＲに用いた5'ＤＮＡ断片(T7P(GST)又はT7P(His tag))及び3'ＤＮＡ断片(T7T)の濃度を変化させて、実施例１及び２と同様の方法により２段階ＰＣＲを行った。この他の条件は全て実施例１及び２と同じ条件とした。第２次ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により調べた結果を表９に示した。
【００７０】
【表９】

【００７１】
なお、アガロースゲル電気泳動の評価基準は次の通りである。
−：ＰＣＲ産物なし。
○：正しいＰＣＲ産物のみ認められる。
△：正しいＰＣＲ産物と副産物の両方が認められる。
×：副産物のみが認められる。
【００７２】
これらの結果より、第２次ＰＣＲ溶液中における5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の濃度がそれぞれ1 pmol/LではＤＮＡの増幅が起こらず、一方、5000 pmol/L以上では副産物の量が増えて鋳型ＤＮＡの純度が低下する。従って、5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片濃度がそれぞれ5〜2500 pmol/Lの範囲内において効率よく鋳型ＤＮＡの増幅が起こることが分かる。
【００７３】
[比較例２]
第１次ＰＣＲに用いたプライマー濃度を下記のように変化させて、実施例１及び２と同様の方法により２段階ＰＣＲを行った。第２次ＰＣＲにおける5'ＤＮＡ断片としては、T7P(GST)及びT7P(His tag)を用いた。この他の条件は全て実施例１及び２と同じ条件とした。第２次ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により調べた結果を表１０に示した。
【００７４】
【表１０】

【００７５】
なお、アガロースゲル電気泳動の評価基準は次の通りである。
−：ＰＣＲ産物なし
○：正しいＰＣＲ産物のみ認められる
△：正しいＰＣＲ産物と副産物の両方が認められる。
×：副産物のみが認められる
【００７６】
これらの結果より、Ras及びCAT発現用の鋳型ＤＮＡの調製において、第１次ＰＣＲで用いた3'プライマー：p8.2の第２次ＰＣＲ溶液中での濃度を指標として、25nmol/L以上の濃度では副産物の量が増えて目的とするＤＮＡの増幅が行われないことが分かる。対照として鋳型ＤＮＡを用いなかった場合でもプライマーダイマーに相当する副産物のみの増幅が認められた。一方、第１次ＰＣＲに用いるプライマー濃度が10 nmol/L以下の場合には、第２次ＰＣＲで効率の良いＤＮＡの増幅が認められなかった。
【００７７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、タンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを基に、無細胞タンパク質合成系等によりタンパク質を合成、精製、検出するための鋳型ＤＮＡを迅速かつ効率よく製造することができる。これにより構造ゲノム科学の研究を目的とするタンパク質の構造と機能解析のための自動化システムの構築が可能となる。
【００７８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態である直鎖状鋳型ＤＮＡの調製方法を示した図である。
【図２】種々のタグペプチドと融合したRas及びCATタンパク質をコードする鋳型ＤＮＡを本発明の方法によりＰＣＲ増幅した結果をアガロースゲル電気泳動で分析した結果である。
【図３】種々のタグペプチドと融合したRas及びCATタンパク質の合成量を表したグラフである。
【図４】種々のタグペプチドと融合したRas及びCATタンパク質をSDS-PAGEで分析した結果である。
【図５】 GST及びnative His tag配列と融合して合成したマウスｃＤＮＡクローン由来のタンパク質の合成量を表したグラフである。

Claims

下記工程を含むことを特徴とする増幅された直鎖状二本鎖ＤＮＡの製造方法：
ｉ）以下の反応溶液を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅することによって増幅された第１のＤＮＡ断片を取得し、当該反応溶液は、
二本鎖ＤＮＡ断片をベクターにクローン化した鋳型であって、前記ＤＮＡ断片はタンパク質又はその一部をコードする配列を含み、
前記タンパク質のコード配列の５’末端領域にアニールする第１のセンスプライマー、
前記第１のセンスプライマーの少なくとも５’部分と同じ３’末端配列、及び所望のヌクレオチド配列と同じ５’末端配列を有する第２のセンスプライマー、及び
前記タンパク質のコード領域の下流のベクター配列部分にアニールする第１のアンチセンスプライマー
を含む工程；並びに
ｉｉ）以下の反応溶液を用いて、前記第１の増幅されたＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、当該反応溶液は、
ａ）以下のものを含む鋳型混合物：
ａａ）前記第１の増幅されたＤＮＡ断片、
ａｂ）前記第１の増幅されたＤＮＡ断片の５’末端領域にハイブリダイズする配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片、及び
ａｃ）前記第１の増幅されたＤＮＡ断片の３’末端領域にハイブリダイズする配列を含む第３の二本鎖ＤＮＡ断片；
ｂ）前記第２のＤＮＡ断片の５’末端領域にアニールする第３のセンスプライマー；及び
ｃ）前記第３のＤＮＡ断片の３’末端領域にアニールする第２のアンチセンスプライマー
を含み；
ここで、前記第２のＤＮＡ断片ａｂ）は遺伝子の転写及び翻訳の調節配列を含み、前記第２のＤＮＡ断片ａｂ）及び前記第３のＤＮＡ断片ａｃ）の反応溶液ｉｉ）における濃度がそれぞれ、５〜２５００ｐｍｏｌ／Lである工程。
前記工程ｉｉ）において、前記第１及び第２のセンスプライマー並びに前記第１のアンチセンスプライマー並びに前記工程ｉ）で生じたプライマーダイマーの濃度が、それぞれ20 nmol/L未満であることを特徴とする請求項１記載の方法。
前記工程ｉ）に用いるプライマーの濃度が、それぞれ20〜500 nmol/Lであることを特徴とする請求項２記載の方法。
前記第１の増幅されたＤＮＡ断片を含む前記工程ｉ）の反応溶液を１０〜１００倍に希釈して前記工程ｉｉ）を行うことを特徴とする請求項２記載の方法。
前記工程ｉ）において形成された前記第１及び第２のセンスプライマー及び第１のアンチセンスプライマー並びに前記工程ｉ）で生じたプライマーダイマーを除去することを特徴とする請求項２記載の方法。
前記工程ｉ）は、鋳型を含む組換え微生物菌体又はその培養液を用いて行われることを特徴とする請求項２記載の方法。
前記第２のＤＮＡ断片及び／又は第３のＤＮＡ断片が、二本鎖ＤＮＡに代えて一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜６記載の方法。
前記ＤＮＡ断片ａｃ）は、前記ＤＮＡ断片ａｂ）の５’末端配列の補体である３’末端配列を有し、前記センスプライマーｂ）と前記アンチセンスプライマーｃ）とが同一の塩基配列であることを特徴とする請求項１〜７何れか記載の方法。
前記第３のＤＮＡ断片が、転写終結配列を含むことを特徴とする請求項１〜８何れか記載の方法。
前記第２のＤＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の少なくとも一方がタグペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１〜９何れか記載の方法。
前記第２のセンスプライマーの前記所望のヌクレオチド配列がタグペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする請求項１〜９何れか記載の方法。
前記タグペプチドはマルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、チオレドキシン、ストレプトアビジン結合ペプチド又はヒスチジンタグペプチドであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
前記タグペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒスチジンタグペプチドであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
前記タグペプチドはマルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、チオレドキシン、ストレプトアビジン結合ペプチド又はヒスチジンタグペプチドであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
前記タグペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒスチジンタグペプチドであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
請求項１〜１５何れか記載の方法により製造した増幅された直鎖状二本鎖ＤＮＡを用いることを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。