JP2003009880A - 鋳型ｄｎａの製造方法及びそれを用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 - Google Patents
鋳型ｄｎａの製造方法及びそれを用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】タンパク質を発現、精製するための鋳型ＤＮＡ
の効率の良い調製方法を提供すること。 【解決手段】タンパク質をコードする第１の二本鎖ＤＮ
Ａ断片と、該第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する
配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片と、該第１のＤＮＡ
断片の3'末端領域と重複する配列を含む第３の二本鎖Ｄ
ＮＡ断片と、該第２のＤＮＡ断片の5'末端領域にアニー
ルするセンスプライマーと、及び該第３のＤＮＡ断片の
3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーと、
を接触させてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直
鎖状二本鎖ＤＮＡを増幅する方法において、該第２のＤ
ＮＡ断片が遺伝子の転写及び翻訳を制御する配列を含
み、該ＰＣＲ溶液中における第２のＤＮＡ断片及び第３
のＤＮＡ断片の濃度がそれぞれ、5〜2500pmol/Lである
ことを特徴とするタンパク質合成用鋳型ＤＮＡの製造方
法を提供する。
の効率の良い調製方法を提供すること。 【解決手段】タンパク質をコードする第１の二本鎖ＤＮ
Ａ断片と、該第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する
配列を含む第２の二本鎖ＤＮＡ断片と、該第１のＤＮＡ
断片の3'末端領域と重複する配列を含む第３の二本鎖Ｄ
ＮＡ断片と、該第２のＤＮＡ断片の5'末端領域にアニー
ルするセンスプライマーと、及び該第３のＤＮＡ断片の
3'末端領域にアニールするアンチセンスプライマーと、
を接触させてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直
鎖状二本鎖ＤＮＡを増幅する方法において、該第２のＤ
ＮＡ断片が遺伝子の転写及び翻訳を制御する配列を含
み、該ＰＣＲ溶液中における第２のＤＮＡ断片及び第３
のＤＮＡ断片の濃度がそれぞれ、5〜2500pmol/Lである
ことを特徴とするタンパク質合成用鋳型ＤＮＡの製造方
法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はタンパク質を合成す
るための鋳型ＤＮＡの製造方法及びその方法により製造
した鋳型ＤＮＡを用いてタンパク質を製造する方法に関
する。
るための鋳型ＤＮＡの製造方法及びその方法により製造
した鋳型ＤＮＡを用いてタンパク質を製造する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】生物の大量のゲノム配列情報から抽出さ
れる膨大な数の遺伝子について、それぞれにコードされ
たタンパク質の立体構造を決定し、機能との相関を系統
的かつ網羅的に解析する「構造ゲノム科学」と呼ばれる
研究が進展している。ゲノム塩基配列の全体が明らかに
なるに従って、無数にあると思われたタンパク質の立体
構造も、実は千種類から数千種類の基本構造（フォール
ド）単位の組み合わせから形成されており、この組み合
わせによって機能の多様性が実現されているらしいこと
が分かってきた。従って、タンパク質の合成から構造解
析までの全過程をハイスループット化することにより、
これらの基本構造の全体を解明し、これらの知識を基に
してタンパク質の構造と機能の関係を明らかにすること
ができると考えられる。
れる膨大な数の遺伝子について、それぞれにコードされ
たタンパク質の立体構造を決定し、機能との相関を系統
的かつ網羅的に解析する「構造ゲノム科学」と呼ばれる
研究が進展している。ゲノム塩基配列の全体が明らかに
なるに従って、無数にあると思われたタンパク質の立体
構造も、実は千種類から数千種類の基本構造（フォール
ド）単位の組み合わせから形成されており、この組み合
わせによって機能の多様性が実現されているらしいこと
が分かってきた。従って、タンパク質の合成から構造解
析までの全過程をハイスループット化することにより、
これらの基本構造の全体を解明し、これらの知識を基に
してタンパク質の構造と機能の関係を明らかにすること
ができると考えられる。
【０００３】多数のタンパク質試料を効率よく発現、調
製するシステムとして、無細胞タンパク質合成系があ
り、透析法の導入など様々な改良が行われた結果、数時
間でミリグラムオーダーのタンパク質が得られるように
なってきた（Kigawaら、FEBS Lett.、442巻、15−19
頁、1999年、及び特開2000-175695号公報参照）。この
無細胞タンパク質合成系でタンパク質を効率よく発現さ
せるためには、鋳型となるＤＮＡとして、適当な発現制
御領域と発現させたい所望のタンパク質をコードする遺
伝子配列とを含む二本鎖ＤＮＡが必要である。適当な発
現制御配列を持たないクローニングベクターにクローン
化された任意の遺伝子等を無細胞タンパク質合成系で発
現させるためにはこれらの遺伝子に適当な発現制御配列
を付加する必要がある。そのために、従来より、遺伝子
を含むプラスミドベクター等から制限酵素、ＰＣＲ等で
所望のＤＮＡ断片を切り出した後、適当な発現制御配列
を持つベクターにリクローニングしたり、更にＰＣＲで
所望のＤＮＡ断片を増幅する方法が行われてきた。
製するシステムとして、無細胞タンパク質合成系があ
り、透析法の導入など様々な改良が行われた結果、数時
間でミリグラムオーダーのタンパク質が得られるように
なってきた（Kigawaら、FEBS Lett.、442巻、15−19
頁、1999年、及び特開2000-175695号公報参照）。この
無細胞タンパク質合成系でタンパク質を効率よく発現さ
せるためには、鋳型となるＤＮＡとして、適当な発現制
御領域と発現させたい所望のタンパク質をコードする遺
伝子配列とを含む二本鎖ＤＮＡが必要である。適当な発
現制御配列を持たないクローニングベクターにクローン
化された任意の遺伝子等を無細胞タンパク質合成系で発
現させるためにはこれらの遺伝子に適当な発現制御配列
を付加する必要がある。そのために、従来より、遺伝子
を含むプラスミドベクター等から制限酵素、ＰＣＲ等で
所望のＤＮＡ断片を切り出した後、適当な発現制御配列
を持つベクターにリクローニングしたり、更にＰＣＲで
所望のＤＮＡ断片を増幅する方法が行われてきた。
【０００４】タンパク質の発現効率を上げるためには、
強力なプロモーターやターミネーターを用いて転写を促
進すると共に、ｍＲＮＡとリボゾームとの親和性を上げ
て翻訳効率を高める必要がある。また、合成されたタン
パク質を迅速に精製、若しくは検出するためには、アフ
ィニティー精製若しくは検出のための標識（タグ）配列
を組み込んだ融合タンパク質を設計することも必要にな
る。
強力なプロモーターやターミネーターを用いて転写を促
進すると共に、ｍＲＮＡとリボゾームとの親和性を上げ
て翻訳効率を高める必要がある。また、合成されたタン
パク質を迅速に精製、若しくは検出するためには、アフ
ィニティー精製若しくは検出のための標識（タグ）配列
を組み込んだ融合タンパク質を設計することも必要にな
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うなタンパク質の合成に適した鋳型ＤＮＡを調製する際
に、大腸菌等の生細胞を用いて遺伝子組み換えを行いク
ローン化する方法は、操作が複雑なため時間と手間がか
かるだけでなく自動化によるハイスループット化が極め
て困難である。また個々の遺伝子ごとに最適化して構築
しなければならず、このため複雑な遺伝子組換え操作を
行ったり、ＰＣＲのためのプライマーを何種類も合成し
なければならないという問題があった。
うなタンパク質の合成に適した鋳型ＤＮＡを調製する際
に、大腸菌等の生細胞を用いて遺伝子組み換えを行いク
ローン化する方法は、操作が複雑なため時間と手間がか
かるだけでなく自動化によるハイスループット化が極め
て困難である。また個々の遺伝子ごとに最適化して構築
しなければならず、このため複雑な遺伝子組換え操作を
行ったり、ＰＣＲのためのプライマーを何種類も合成し
なければならないという問題があった。
【０００６】そこで、本発明は、タンパク質を発現、精
製するための鋳型ＤＮＡの効率の良い調製方法を提供す
ることを課題とする。
製するための鋳型ＤＮＡの効率の良い調製方法を提供す
ることを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑みて、本発
明者らは無細胞タンパク質合成系における鋳型ＤＮＡの
調製方法について鋭意検討を行った結果、ｃＤＮＡライ
ブラリーから選択した任意のクローン化ＤＮＡを２段階
ＰＣＲにより増幅することによって、タンパク質の発現
に適した直鎖状鋳型ＤＮＡが極めて迅速かつ効率よく合
成できることを見出し本発明を完成するに到った。
明者らは無細胞タンパク質合成系における鋳型ＤＮＡの
調製方法について鋭意検討を行った結果、ｃＤＮＡライ
ブラリーから選択した任意のクローン化ＤＮＡを２段階
ＰＣＲにより増幅することによって、タンパク質の発現
に適した直鎖状鋳型ＤＮＡが極めて迅速かつ効率よく合
成できることを見出し本発明を完成するに到った。
【０００８】すなわち、本発明の第１の視点において、
タンパク質をコードする第１の二本鎖ＤＮＡ断片と、該
第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する配列を含む第
２の二本鎖ＤＮＡ断片と、該第１のＤＮＡ断片の3'末端
領域と重複する配列を含む第３の二本鎖ＤＮＡ断片と、
該第２のＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセンス
プライマーと、及び該第３のＤＮＡ断片の3'末端領域に
アニールするアンチセンスプライマーと、を接触させて
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直鎖状二本鎖Ｄ
ＮＡを増幅する方法において、該第２のＤＮＡ断片が遺
伝子の転写及び翻訳を制御する配列を含み、該ＰＣＲ溶
液中における第２のＤＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の
濃度がそれぞれ、5〜2500 pmol/Lであることを特徴とす
るタンパク質合成用鋳型ＤＮＡの製造方法を提供する。
タンパク質をコードする第１の二本鎖ＤＮＡ断片と、該
第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する配列を含む第
２の二本鎖ＤＮＡ断片と、該第１のＤＮＡ断片の3'末端
領域と重複する配列を含む第３の二本鎖ＤＮＡ断片と、
該第２のＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセンス
プライマーと、及び該第３のＤＮＡ断片の3'末端領域に
アニールするアンチセンスプライマーと、を接触させて
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直鎖状二本鎖Ｄ
ＮＡを増幅する方法において、該第２のＤＮＡ断片が遺
伝子の転写及び翻訳を制御する配列を含み、該ＰＣＲ溶
液中における第２のＤＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の
濃度がそれぞれ、5〜2500 pmol/Lであることを特徴とす
るタンパク質合成用鋳型ＤＮＡの製造方法を提供する。
【０００９】好ましい態様において、前記第１のＤＮＡ
断片を調製するために、あらかじめＰＣＲ（第１次ＰＣ
Ｒ）を行ってＤＮＡを増幅した後、該第１次ＰＣＲ溶液
を前記第１のＤＮＡ断片として用いて上記ＰＣＲ（第２
次ＰＣＲ）を行う方法であって、該第１次ＰＣＲ溶液中
に残存するプライマー及び該第１次ＰＣＲで生じたプラ
イマーダイマーの濃度が、該第２次ＰＣＲ溶液中におい
てそれぞれ20 nmol/L未満であることを特徴とする。
断片を調製するために、あらかじめＰＣＲ（第１次ＰＣ
Ｒ）を行ってＤＮＡを増幅した後、該第１次ＰＣＲ溶液
を前記第１のＤＮＡ断片として用いて上記ＰＣＲ（第２
次ＰＣＲ）を行う方法であって、該第１次ＰＣＲ溶液中
に残存するプライマー及び該第１次ＰＣＲで生じたプラ
イマーダイマーの濃度が、該第２次ＰＣＲ溶液中におい
てそれぞれ20 nmol/L未満であることを特徴とする。
【００１０】このように、前記第１次ＰＣＲに用いたプ
ライマー及び副産物として生じたプライマーダイマーの
第２次ＰＣＲへの持ち込み量を減らすためには、第１次
ＰＣＲに用いるプライマー濃度を20〜500 pmol/Lの範囲
内とするか、第１次ＰＣＲ溶液を１０〜１００倍に希釈
（第２次ＰＣＲ溶液中における終濃度で）して第２次Ｐ
ＣＲを行うか、若しくはこれらの両方を組み合わせて行
うか、又は第１次ＰＣＲ溶液中からプライマー及びプラ
イマーダイマーを除去した後に第２次ＰＣＲを行うこと
を特徴とする。
ライマー及び副産物として生じたプライマーダイマーの
第２次ＰＣＲへの持ち込み量を減らすためには、第１次
ＰＣＲに用いるプライマー濃度を20〜500 pmol/Lの範囲
内とするか、第１次ＰＣＲ溶液を１０〜１００倍に希釈
（第２次ＰＣＲ溶液中における終濃度で）して第２次Ｐ
ＣＲを行うか、若しくはこれらの両方を組み合わせて行
うか、又は第１次ＰＣＲ溶液中からプライマー及びプラ
イマーダイマーを除去した後に第２次ＰＣＲを行うこと
を特徴とする。
【００１１】また、本発明の一実施形態において、前記
第１次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、組換え微生物菌体又はそ
の培養液であることを特徴とする。
第１次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、組換え微生物菌体又はそ
の培養液であることを特徴とする。
【００１２】さらに好ましい態様において、前記センス
プライマーとアンチセンスプライマーが同一の塩基配列
であり、及び／又は前記第２のＤＮＡ断片は、転写終結
配列を含むことを特徴とする。
プライマーとアンチセンスプライマーが同一の塩基配列
であり、及び／又は前記第２のＤＮＡ断片は、転写終結
配列を含むことを特徴とする。
【００１３】別の好ましい態様において、前記第２のＤ
ＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の少なくとも一方がタグ
ペプチドをコードする配列を含み、該タグペプチドが前
記タンパク質又はその一部と融合して合成されることを
特徴とする。前記タグペプチドはマルトース結合タンパ
ク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳトラン
スフェラーゼ、チオレドキシン、ストレプトアビジン結
合ペプチド又はヒスチジンタグペプチドであることが好
ましい。
ＮＡ断片及び第３のＤＮＡ断片の少なくとも一方がタグ
ペプチドをコードする配列を含み、該タグペプチドが前
記タンパク質又はその一部と融合して合成されることを
特徴とする。前記タグペプチドはマルトース結合タンパ
ク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳトラン
スフェラーゼ、チオレドキシン、ストレプトアビジン結
合ペプチド又はヒスチジンタグペプチドであることが好
ましい。
【００１４】本発明の別の視点において、上記何れかの
方法により製造した鋳型ＤＮＡを用いることを特徴とす
る無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の製造方
法を提供する。
方法により製造した鋳型ＤＮＡを用いることを特徴とす
る無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の製造方
法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施形態につい
て添付図面に沿って詳述する。図１は、完全長ｃＤＮＡ
をクローン化したプラスミドＤＮＡを用いて、２段階Ｐ
ＣＲによって、タンパク質合成用の直鎖状二本鎖鋳型Ｄ
ＮＡを調製する方法を示したフローチャートである。
て添付図面に沿って詳述する。図１は、完全長ｃＤＮＡ
をクローン化したプラスミドＤＮＡを用いて、２段階Ｐ
ＣＲによって、タンパク質合成用の直鎖状二本鎖鋳型Ｄ
ＮＡを調製する方法を示したフローチャートである。
【００１６】（１）第１次ＰＣＲ
第１次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、所望のタンパク質をコー
ドする配列を含むものであればどのようなものでも良
く、例えばｃＤＮＡライブラリーからクローン化したも
のだけでなく、ゲノムＤＮＡクローンや合成ＤＮＡを用
いることもできる。また、精製されたＤＮＡでなくても
良く、例えば、上記配列を含むプラスミドベクターを保
持した菌体又はその菌体培養液を用いることができる。
図１では、プラスミドベクターpBLUESCRIPT SK+のSacI,
XhoI 部位にマウス完全長ｃＤＮＡをクローン化したプ
ラスミドmodified bluescript 1を示す。
ドする配列を含むものであればどのようなものでも良
く、例えばｃＤＮＡライブラリーからクローン化したも
のだけでなく、ゲノムＤＮＡクローンや合成ＤＮＡを用
いることもできる。また、精製されたＤＮＡでなくても
良く、例えば、上記配列を含むプラスミドベクターを保
持した菌体又はその菌体培養液を用いることができる。
図１では、プラスミドベクターpBLUESCRIPT SK+のSacI,
XhoI 部位にマウス完全長ｃＤＮＡをクローン化したプ
ラスミドmodified bluescript 1を示す。
【００１７】図１において、クローン化されたｃＤＮＡ
のタンパク質コード領域を増幅するために、5'側のプラ
イマーとして２種類のプライマー（5'-プライマー１及
び5'-プライマー２）を使用する。5'-プライマー２の塩
基配列は、クローン化したｃＤＮＡのコードするタンパ
ク質のアミノ末端領域に相当する塩基配列とアニールす
るように設計されている。5'-プライマー２は、更にそ
の5'末端側に任意の塩基配列を含むことができる。一
方、5'-プライマー１は、上記5'-プライマー２の5'末端
側の一部と共通の配列を有すれば良く、両方のプライマ
ーが重複して第１次ＰＣＲの5'側のプライマーとして機
能する。
のタンパク質コード領域を増幅するために、5'側のプラ
イマーとして２種類のプライマー（5'-プライマー１及
び5'-プライマー２）を使用する。5'-プライマー２の塩
基配列は、クローン化したｃＤＮＡのコードするタンパ
ク質のアミノ末端領域に相当する塩基配列とアニールす
るように設計されている。5'-プライマー２は、更にそ
の5'末端側に任意の塩基配列を含むことができる。一
方、5'-プライマー１は、上記5'-プライマー２の5'末端
側の一部と共通の配列を有すれば良く、両方のプライマ
ーが重複して第１次ＰＣＲの5'側のプライマーとして機
能する。
【００１８】一方、図１において、3'側のプライマー
は、タンパク質をコードする領域の3'下流であるプラス
ミドベクターとアニールするように設計され、上記5'側
のプライマーと共にＰＣＲによってＤＮＡ鎖を伸長さ
せ、発現させたいタンパク質をコードする第１のＤＮＡ
断片が増幅される。該第１のＤＮＡ断片は、後述する第
２次ＰＣＲの鋳型として用いるため、ＰＣＲ反応液から
従来公知の方法で精製することもできるが、ＰＣＲ反応
液をそのまま用いることもできる。この場合には、反応
液中に残存する上記プライマーが第２次ＰＣＲ反応を阻
害する可能性がある。従って、第１次ＰＣＲに用いたプ
ライマー及び第１次ＰＣＲで副産物として生じたプライ
マーダイマーの第２次ＰＣＲ溶液中への持ち込み量を20
nmol/L未満に減らすことが好ましく、具体的には、5'
プライマー、3'プライマーのそれぞれについて、複数本
のプライマーを用いる場合はその合計濃度で、20〜500
nmol/Lの濃度で用いる。更に好ましくは50〜100 nmol/L
である。
は、タンパク質をコードする領域の3'下流であるプラス
ミドベクターとアニールするように設計され、上記5'側
のプライマーと共にＰＣＲによってＤＮＡ鎖を伸長さ
せ、発現させたいタンパク質をコードする第１のＤＮＡ
断片が増幅される。該第１のＤＮＡ断片は、後述する第
２次ＰＣＲの鋳型として用いるため、ＰＣＲ反応液から
従来公知の方法で精製することもできるが、ＰＣＲ反応
液をそのまま用いることもできる。この場合には、反応
液中に残存する上記プライマーが第２次ＰＣＲ反応を阻
害する可能性がある。従って、第１次ＰＣＲに用いたプ
ライマー及び第１次ＰＣＲで副産物として生じたプライ
マーダイマーの第２次ＰＣＲ溶液中への持ち込み量を20
nmol/L未満に減らすことが好ましく、具体的には、5'
プライマー、3'プライマーのそれぞれについて、複数本
のプライマーを用いる場合はその合計濃度で、20〜500
nmol/Lの濃度で用いる。更に好ましくは50〜100 nmol/L
である。
【００１９】あるいは、第１次ＰＣＲ溶液を１０〜１０
０倍に希釈してプライマー及びプライマーダイマーの第
２次ＰＣＲへの持ち込み量を減らすことができる。
０倍に希釈してプライマー及びプライマーダイマーの第
２次ＰＣＲへの持ち込み量を減らすことができる。
【００２０】なお、このような方法の他に、上記第１の
ＤＮＡ断片を得るために種々のプライマーを用いたＰＣ
Ｒが可能であり、その際に用いられるプライマーの塩基
配列やＰＣＲの反応条件等は、通常使用されるものであ
ればよく、当業者において適宜設定されることが望まし
い。さらに、上記ｃＤＮＡクローンから直接制限酵素な
どでＤＮＡ断片を切り出すことによって上記第１のＤＮ
Ａ断片を取得することもできる。
ＤＮＡ断片を得るために種々のプライマーを用いたＰＣ
Ｒが可能であり、その際に用いられるプライマーの塩基
配列やＰＣＲの反応条件等は、通常使用されるものであ
ればよく、当業者において適宜設定されることが望まし
い。さらに、上記ｃＤＮＡクローンから直接制限酵素な
どでＤＮＡ断片を切り出すことによって上記第１のＤＮ
Ａ断片を取得することもできる。
【００２１】（２）第２次ＰＣＲ
次に、上記第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する配
列を含む二本鎖の第２のＤＮＡ断片（以下、「5'ＤＮＡ
断片」という場合もある。）を調製する。該第２のＤＮ
Ａ断片は、その3'末端領域で、上記第１のＤＮＡ断片の
5'末端領域と重複することによって、これら２つのＤＮ
Ａ断片が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が
起こり、第２次ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡが生成する。
重複する領域は、１２塩基対以上が好ましく、更に好ま
しくは１７塩基以上である。
列を含む二本鎖の第２のＤＮＡ断片（以下、「5'ＤＮＡ
断片」という場合もある。）を調製する。該第２のＤＮ
Ａ断片は、その3'末端領域で、上記第１のＤＮＡ断片の
5'末端領域と重複することによって、これら２つのＤＮ
Ａ断片が相互にプライマー及び鋳型となって伸長反応が
起こり、第２次ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡが生成する。
重複する領域は、１２塩基対以上が好ましく、更に好ま
しくは１７塩基以上である。
【００２２】続いて、上記第１のＤＮＡ断片の3'末端領
域と重複する配列を含む二本鎖の第３のＤＮＡ断片（以
下「3'ＤＮＡ断片」という場合もある。）を調製する。
該第３のＤＮＡ断片は、その5'末端領域で、上記第１の
ＤＮＡ断片の3'末端領域と重複することによって、これ
ら２つのＤＮＡ断片が相互にプライマー及び鋳型となっ
て伸長反応が起こり、第２次ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡ
が生成する。重複する領域は、１２塩基対以上が好まし
く、更に好ましくは１７塩基以上である。
域と重複する配列を含む二本鎖の第３のＤＮＡ断片（以
下「3'ＤＮＡ断片」という場合もある。）を調製する。
該第３のＤＮＡ断片は、その5'末端領域で、上記第１の
ＤＮＡ断片の3'末端領域と重複することによって、これ
ら２つのＤＮＡ断片が相互にプライマー及び鋳型となっ
て伸長反応が起こり、第２次ＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡ
が生成する。重複する領域は、１２塩基対以上が好まし
く、更に好ましくは１７塩基以上である。
【００２３】次に、第２次ＰＣＲ用のプライマーとし
て、上記5'ＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセン
スプライマーと、上記3'ＤＮＡ断片の3'末端領域にアニ
ールするアンチセンスプライマーを合成する。これらの
プライマーは、第２次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとアニールし
てＤＮＡ伸長反応を起こし、所望のＤＮＡ断片が増幅で
きればよく、上記鋳型ＤＮＡの両末端領域とアニールす
る複数のプライマーを用いることができるが、好ましく
は図１に示したように、上記両末端配列が相補的な塩基
配列である場合には、１種類のプライマー（ユニバーサ
ルプライマー）で増幅反応が可能である。該プライマー
は、通常、5〜50塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドであ
り、好ましくは15〜25塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド
からなる。２種類のプライマーを用いるよりも１種類の
ユニバーサルプライマーを用いる方がＰＣＲによる副産
物が少ない点で有利である。
て、上記5'ＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセン
スプライマーと、上記3'ＤＮＡ断片の3'末端領域にアニ
ールするアンチセンスプライマーを合成する。これらの
プライマーは、第２次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとアニールし
てＤＮＡ伸長反応を起こし、所望のＤＮＡ断片が増幅で
きればよく、上記鋳型ＤＮＡの両末端領域とアニールす
る複数のプライマーを用いることができるが、好ましく
は図１に示したように、上記両末端配列が相補的な塩基
配列である場合には、１種類のプライマー（ユニバーサ
ルプライマー）で増幅反応が可能である。該プライマー
は、通常、5〜50塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドであ
り、好ましくは15〜25塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド
からなる。２種類のプライマーを用いるよりも１種類の
ユニバーサルプライマーを用いる方がＰＣＲによる副産
物が少ない点で有利である。
【００２４】一般に、ＰＣＲではプライマー同士が対合
した副産物（プライマーダイマー）が生じることが知ら
れている。２種類のプライマーを用いた場合には、一旦
生じたプライマーダイマーが鋳型ＤＮＡとして働いてこ
の副産物が増幅されてしまい、目的産物の増幅に使用さ
れるプライマー量が減ってしまう。その結果目的産物量
が少なくなると考えられる。一方、１種類のプライマー
のみを用いてＰＣＲを行った場合は、生じたプライマー
ダイマーは同一分子内に相補的配列を有するためヘアピ
ン構造をとりやすく、ＰＣＲにより増幅されにくいため
副産物が少なくなると考えられる。
した副産物（プライマーダイマー）が生じることが知ら
れている。２種類のプライマーを用いた場合には、一旦
生じたプライマーダイマーが鋳型ＤＮＡとして働いてこ
の副産物が増幅されてしまい、目的産物の増幅に使用さ
れるプライマー量が減ってしまう。その結果目的産物量
が少なくなると考えられる。一方、１種類のプライマー
のみを用いてＰＣＲを行った場合は、生じたプライマー
ダイマーは同一分子内に相補的配列を有するためヘアピ
ン構造をとりやすく、ＰＣＲにより増幅されにくいため
副産物が少なくなると考えられる。
【００２５】また、上記5'ＤＮＡ断片は、第１のＤＮＡ
断片と重複する領域の上流に、遺伝子の転写及び翻訳を
誘導、制御する配列を含む。遺伝子の転写を誘導、制御
する配列はプロモーター及びオペレーター配列と呼ば
れ、大腸菌や酵母等の原核及び真核生物において詳細に
研究されている。例えば、大腸菌のファージに由来する
Ｔ７プロモーター等が使用される。Ｔ７プロモーターは
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって強力な転写が行われる
ことが知られている。ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳
は、リボゾーム等の翻訳開始複合体がｍＲＮＡに結合す
ることによって誘導される。リボゾーム結合配列(RBS)
は、ＳＤ配列とも呼ばれタンパク質の効率的な発現にと
って重要である。
断片と重複する領域の上流に、遺伝子の転写及び翻訳を
誘導、制御する配列を含む。遺伝子の転写を誘導、制御
する配列はプロモーター及びオペレーター配列と呼ば
れ、大腸菌や酵母等の原核及び真核生物において詳細に
研究されている。例えば、大腸菌のファージに由来する
Ｔ７プロモーター等が使用される。Ｔ７プロモーターは
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって強力な転写が行われる
ことが知られている。ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳
は、リボゾーム等の翻訳開始複合体がｍＲＮＡに結合す
ることによって誘導される。リボゾーム結合配列(RBS)
は、ＳＤ配列とも呼ばれタンパク質の効率的な発現にと
って重要である。
【００２６】さらに、これらの発現制御配列の上流に
は、ＰＣＲにおいて上記センスプライマーがアニールす
る配列を含む。ここでセンスプライマーの塩基配列は5'
ＤＮＡ断片の5'末端領域とハイブリダイズしてプライマ
ーとして働くものであれば良く、鋳型ＤＮＡと相補的な
配列中の１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された
ものを含む。
は、ＰＣＲにおいて上記センスプライマーがアニールす
る配列を含む。ここでセンスプライマーの塩基配列は5'
ＤＮＡ断片の5'末端領域とハイブリダイズしてプライマ
ーとして働くものであれば良く、鋳型ＤＮＡと相補的な
配列中の１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された
ものを含む。
【００２７】同様に、3'ＤＮＡ断片の3'末端領域には、
ＰＣＲにおいて上記アンチセンスプライマーがアニール
する配列を含む。アンチセンスプライマーは、3'ＤＮＡ
断片の3'末端領域とハイブリダイズしてプライマーとし
て働くものであれば良く、鋳型ＤＮＡと相補的な配列中
の１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたものを
含む。
ＰＣＲにおいて上記アンチセンスプライマーがアニール
する配列を含む。アンチセンスプライマーは、3'ＤＮＡ
断片の3'末端領域とハイブリダイズしてプライマーとし
て働くものであれば良く、鋳型ＤＮＡと相補的な配列中
の１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたものを
含む。
【００２８】第２次ＰＣＲの反応液中における5'ＤＮＡ
断片及び3'ＤＮＡ断片の濃度は、通常のＰＣＲにおける
プライマーＤＮＡ濃度よりも低濃度にすることが好まし
く、5 〜 2500 pmol/L、より好ましくは10〜500 pmol/
Lの濃度で用いられる。これらのＤＮＡ断片の濃度が250
0 pmol/Lよりも高いとＰＣＲ中に副産物が生じやすい。
すなわち、5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片に結合したユ
ニバーサルプライマーから生成される一本鎖ＤＮＡ同士
が上述したプライマーダイマーと同様の仕組みで結合
し、その結果5'ＤＮＡ断片と3'ＤＮＡ断片とが直接結合
したような副産物ができやすい。この副産物は目的産物
よりも短いためＰＣＲで増幅されやすく、また、タンパ
ク質合成においても短いタンパク質のみを発現する鋳型
として働くため目的とするタンパク質の合成に悪影響を
与えるからである。
断片及び3'ＤＮＡ断片の濃度は、通常のＰＣＲにおける
プライマーＤＮＡ濃度よりも低濃度にすることが好まし
く、5 〜 2500 pmol/L、より好ましくは10〜500 pmol/
Lの濃度で用いられる。これらのＤＮＡ断片の濃度が250
0 pmol/Lよりも高いとＰＣＲ中に副産物が生じやすい。
すなわち、5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片に結合したユ
ニバーサルプライマーから生成される一本鎖ＤＮＡ同士
が上述したプライマーダイマーと同様の仕組みで結合
し、その結果5'ＤＮＡ断片と3'ＤＮＡ断片とが直接結合
したような副産物ができやすい。この副産物は目的産物
よりも短いためＰＣＲで増幅されやすく、また、タンパ
ク質合成においても短いタンパク質のみを発現する鋳型
として働くため目的とするタンパク質の合成に悪影響を
与えるからである。
【００２９】一方、ＤＮＡ断片の濃度が5 pmol/Lよりも
低いと、鋳型として働くＤＮＡの量そのものが少なくな
って十分な量の目的ＤＮＡが増幅されない。第２次ＰＣ
Ｒのその他の反応条件については、当業者において適宜
反応条件を選択して用いることができる。
低いと、鋳型として働くＤＮＡの量そのものが少なくな
って十分な量の目的ＤＮＡが増幅されない。第２次ＰＣ
Ｒのその他の反応条件については、当業者において適宜
反応条件を選択して用いることができる。
【００３０】上記5'ＤＮＡ断片は、さらに転写終結配列
を含むことが好ましい。転写終結配列は、ＲＮＡポリメ
ラーゼの脱離を促すＤＮＡ塩基配列であって、一般にＧ
Ｃに富んだ対称性を示す配列と、それに続くＴの連続す
る特徴的な構造を有し、転写反応を効率化する。
を含むことが好ましい。転写終結配列は、ＲＮＡポリメ
ラーゼの脱離を促すＤＮＡ塩基配列であって、一般にＧ
Ｃに富んだ対称性を示す配列と、それに続くＴの連続す
る特徴的な構造を有し、転写反応を効率化する。
【００３１】なお、上記の5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断
片の何れか一方又は両方が二本鎖ＤＮＡの代わりに一本
鎖ＤＮＡであっても上記第２次ＰＣＲを行うことがで
き、このような態様も本発明の範囲に含まれる。
片の何れか一方又は両方が二本鎖ＤＮＡの代わりに一本
鎖ＤＮＡであっても上記第２次ＰＣＲを行うことがで
き、このような態様も本発明の範囲に含まれる。
【００３２】（３）タグペプチド
上記5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の少なくとも一方
に、タグペプチドをコードする配列を含むことが好まし
い。タグペプチドとは、発現させるタンパク質のＮ末端
及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、
該タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタン
ブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列であ
る。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GS
T）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシ
ン(TrxA)、セルロース結合ドメイン(CBD)、ストレプト
アビジン結合ペプチド（例えば、StreptagTM）、及びヒ
スチジンタグ等が挙げられる。
に、タグペプチドをコードする配列を含むことが好まし
い。タグペプチドとは、発現させるタンパク質のＮ末端
及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、
該タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタン
ブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列であ
る。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GS
T）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシ
ン(TrxA)、セルロース結合ドメイン(CBD)、ストレプト
アビジン結合ペプチド（例えば、StreptagTM）、及びヒ
スチジンタグ等が挙げられる。
【００３３】グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GS
T）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子
配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込む
とGSTとの融合タンパク質として発現させることができ
る。このための組換えベクターpGEX Vectorsはアマシャ
ムファルマシアバイオテック社から市販されている。GS
Tのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタ
チオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や
酵素免疫染色に利用されている。
T）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子
配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込む
とGSTとの融合タンパク質として発現させることができ
る。このための組換えベクターpGEX Vectorsはアマシャ
ムファルマシアバイオテック社から市販されている。GS
Tのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタ
チオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や
酵素免疫染色に利用されている。
【００３４】マルトース結合タンパク質（MBP）は、大
腸菌のマルトース結合タンパク質であり、MBPとの融合
タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた
後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗
MBP抗体を使用することもできる。
腸菌のマルトース結合タンパク質であり、MBPとの融合
タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた
後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗
MBP抗体を使用することもできる。
【００３５】チオレドキシン(TrxA)は、酸化還元反応を
触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチ
オール基によって金属キレートアフィニティークロマト
グラフィーで精製できる。このための担体として、例え
ばThioBondTM Resin(Invitorogen社製)等が市販されて
いる。
触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチ
オール基によって金属キレートアフィニティークロマト
グラフィーで精製できる。このための担体として、例え
ばThioBondTM Resin(Invitorogen社製)等が市販されて
いる。
【００３６】セルロース結合ドメイン(CBD)はClostridi
um cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロー
ス結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する
性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に
化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。
um cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロー
ス結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する
性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に
化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。
【００３７】ストレプトアビジン結合ペプチドとして、
例えばStrep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなる
ペプチドが知られており、StrepTactinTMやStreptavidi
neTMに選択的に結合させて精製することができる。
例えばStrep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなる
ペプチドが知られており、StrepTactinTMやStreptavidi
neTMに選択的に結合させて精製することができる。
【００３８】ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配
された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好
ましい。このヒスチジンタグに直接又はアミノ酸配列を
介して上記第１のＤＮＡ断片によってコードされるタン
パク質が結合される。ヒスチジンタグは、二価の金属原
子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチ
ジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティー
マトリックスにしっかりと結合し、容易に精製すること
ができる。
された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好
ましい。このヒスチジンタグに直接又はアミノ酸配列を
介して上記第１のＤＮＡ断片によってコードされるタン
パク質が結合される。ヒスチジンタグは、二価の金属原
子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチ
ジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティー
マトリックスにしっかりと結合し、容易に精製すること
ができる。
【００３９】特に好ましい形態において、上記ヒスチジ
ンタグは配列番号１で示したアミノ酸配列を有する。こ
の配列は、トリ筋肉の乳酸脱水素酵素のＮ末端に由来す
る天然の配列(native His tag)である。塩基性アミノ酸
である６個のヒスチジン残基が適度に分散して存在する
ため、連続する６個のヒスチジンタグよりも等電点が低
く、中性の緩衝液条件でアフィニティー精製ができると
いう利点を有する。
ンタグは配列番号１で示したアミノ酸配列を有する。こ
の配列は、トリ筋肉の乳酸脱水素酵素のＮ末端に由来す
る天然の配列(native His tag)である。塩基性アミノ酸
である６個のヒスチジン残基が適度に分散して存在する
ため、連続する６個のヒスチジンタグよりも等電点が低
く、中性の緩衝液条件でアフィニティー精製ができると
いう利点を有する。
【００４０】本形態において、これらのタグペプチドは
発現させたタンパク質をアフィニティー精製したり、検
出のために有用なだけでなく、天然型のタンパク質に比
べてタグペプチドとの融合タンパク質の方が発現量の増
大する場合がある。その理由は明らかではないが、翻訳
開始段階においてｍＲＮＡやリボゾーム等との複合体を
安定化して翻訳効率を高めるためではないかと推測され
る。
発現させたタンパク質をアフィニティー精製したり、検
出のために有用なだけでなく、天然型のタンパク質に比
べてタグペプチドとの融合タンパク質の方が発現量の増
大する場合がある。その理由は明らかではないが、翻訳
開始段階においてｍＲＮＡやリボゾーム等との複合体を
安定化して翻訳効率を高めるためではないかと推測され
る。
【００４１】これらのタグ配列の下流には、トロンビ
ン、Factor Xa、エンテロキナーゼ等のプロテアーゼ切
断部位ができるような塩基配列を含んでいても良く、目
的タンパク質を上記タグ配列から切り離して精製するこ
ともできる。
ン、Factor Xa、エンテロキナーゼ等のプロテアーゼ切
断部位ができるような塩基配列を含んでいても良く、目
的タンパク質を上記タグ配列から切り離して精製するこ
ともできる。
【００４２】また、上記タグ配列は目的タンパク質のＣ
末端側に配し、Ｎ末端側のリーダー配列の機能を残した
まま、精製も容易に行えるようにすることもできる。
末端側に配し、Ｎ末端側のリーダー配列の機能を残した
まま、精製も容易に行えるようにすることもできる。
【００４３】（４）無細胞タンパク質合成系を用いたタ
ンパク質の合成 このようにして製造した鋳型ＤＮＡは、種々の方法によ
りタンパク質を合成することができる。例えば、無細胞
タンパク質合成系によりタンパク質を合成することが好
ましい。無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用い
て試験管内でタンパク質を合成する系であり、上記細胞
抽出液としては、リボゾーム、t-RNA等のタンパク質合
成に必要な成分を含む、従来より公知の真核細胞又は原
核細胞の抽出液が使用可能である。好ましくは小麦胚芽
や大腸菌由来のもの（例えば大腸菌S30細胞抽出液）又
は高度好熱菌(Thermus thermophilus)由来のものが高い
合成量を得る点において好ましい。この大腸菌Ｓ３０細
胞抽出液は、大腸菌A19（rna, met）, BL21, BL21 sta
r, BL21 codon plus株等から公知の方法（Pratt, J.M.
et al., Transcription and translation - a practica
l approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggi
ns, S.J.編、IRL Press, Oxford参照）に従って調製で
き、又はPromega社、Novagen社又はRoche社から市販さ
れるものを使用してもよい。
ンパク質の合成 このようにして製造した鋳型ＤＮＡは、種々の方法によ
りタンパク質を合成することができる。例えば、無細胞
タンパク質合成系によりタンパク質を合成することが好
ましい。無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用い
て試験管内でタンパク質を合成する系であり、上記細胞
抽出液としては、リボゾーム、t-RNA等のタンパク質合
成に必要な成分を含む、従来より公知の真核細胞又は原
核細胞の抽出液が使用可能である。好ましくは小麦胚芽
や大腸菌由来のもの（例えば大腸菌S30細胞抽出液）又
は高度好熱菌(Thermus thermophilus)由来のものが高い
合成量を得る点において好ましい。この大腸菌Ｓ３０細
胞抽出液は、大腸菌A19（rna, met）, BL21, BL21 sta
r, BL21 codon plus株等から公知の方法（Pratt, J.M.
et al., Transcription and translation - a practica
l approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggi
ns, S.J.編、IRL Press, Oxford参照）に従って調製で
き、又はPromega社、Novagen社又はRoche社から市販さ
れるものを使用してもよい。
【００４４】本発明の無細胞タンパク質合成系には、バ
ッチ法、フロー法の他、従来公知の技術がいずれも適用
可能であり、例えば限外濾過膜法や透析膜法、樹脂に翻
訳鋳型を固定化したカラムクロマト法等（Spirin, A.
ら、Meth. In Enzymol. ２１７巻、１２３〜１４２頁、
１９９３年参照）を挙げることができる
ッチ法、フロー法の他、従来公知の技術がいずれも適用
可能であり、例えば限外濾過膜法や透析膜法、樹脂に翻
訳鋳型を固定化したカラムクロマト法等（Spirin, A.
ら、Meth. In Enzymol. ２１７巻、１２３〜１４２頁、
１９９３年参照）を挙げることができる
【００４５】なお、上記無細胞タンパク質合成系の他に
も、例えば動物細胞にリポフェクション等で鋳型ＤＮＡ
を導入して遺伝子を発現させ、生細胞中での、その遺伝
子産物の機能解析に利用することも可能である。
も、例えば動物細胞にリポフェクション等で鋳型ＤＮＡ
を導入して遺伝子を発現させ、生細胞中での、その遺伝
子産物の機能解析に利用することも可能である。
【００４６】
【実施例】以下に本発明の実施例として、ヒト c-Ha-Ra
sタンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ(CAT)、及びマウス完全長ｃＤＮＡライブラ
リーから任意に選択した種々のｃＤＮＡクローン（理化
学研究所ゲノム科学総合研究センター、遺伝子構造・機
能研究グループ、林崎良英博士から提供を受けた。)を
無細胞タンパク質合成系で発現させた結果を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
sタンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ(CAT)、及びマウス完全長ｃＤＮＡライブラ
リーから任意に選択した種々のｃＤＮＡクローン（理化
学研究所ゲノム科学総合研究センター、遺伝子構造・機
能研究グループ、林崎良英博士から提供を受けた。)を
無細胞タンパク質合成系で発現させた結果を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【００４７】[実施例１] Rasタンパク質の発現
（１）第１次ＰＣＲ
Rasタンパク質をコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡ（配列
番号２に塩基配列を示した。）を鋳型とし、5'プライマ
ー１：hRBS>B+6（配列番号３）、5'プライマー２：pRas
（配列番号４）及び3'プライマー：p8.2（配列番号５）
の３種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ
溶液組成、及び増幅プログラムは、それぞれ表１及び表
２に示した。
番号２に塩基配列を示した。）を鋳型とし、5'プライマ
ー１：hRBS>B+6（配列番号３）、5'プライマー２：pRas
（配列番号４）及び3'プライマー：p8.2（配列番号５）
の３種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ
溶液組成、及び増幅プログラムは、それぞれ表１及び表
２に示した。
【００４８】5'プライマー１：hRBS>B+6（配列番号３）
5' -CCGAAGGAGCCGCCACCAT- 3'
5'プライマー２：pRas（配列番号４）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGACCGAATACAAACTGGTTGTAG- 3'
3'プライマー：p8.2（配列番号５）
5' -GCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC- 3'
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】（２）第２次ＰＣＲ
次に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、
T７プロモーター配列の下流に各種のタグ配列を有する
５’ＤＮＡ断片：T7P（配列番号６〜１０）と、T７ター
ミネーター配列を有する３’ＤＮＡ断片：T7T（配列番
号１１）と、ユニバーサルプライマー(YA1.2)：5'-GCCG
CTGTCCTCGTTCCCAGCC-3'（配列番号１２）とを用い第２
次オーバーラップＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及
びプログラムは、それぞれ表３及び表２に示した。ま
た、ここで用いた5'ＤＮＡ断片にコードされたタグペプ
チドの概要を表４に示した。この結果、図１に示したよ
うに、T７プロモーターの制御下で、各種のタグ配列とR
asタンパク質との融合タンパク質を発現することのでき
る直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
T７プロモーター配列の下流に各種のタグ配列を有する
５’ＤＮＡ断片：T7P（配列番号６〜１０）と、T７ター
ミネーター配列を有する３’ＤＮＡ断片：T7T（配列番
号１１）と、ユニバーサルプライマー(YA1.2)：5'-GCCG
CTGTCCTCGTTCCCAGCC-3'（配列番号１２）とを用い第２
次オーバーラップＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及
びプログラムは、それぞれ表３及び表２に示した。ま
た、ここで用いた5'ＤＮＡ断片にコードされたタグペプ
チドの概要を表４に示した。この結果、図１に示したよ
うに、T７プロモーターの制御下で、各種のタグ配列とR
asタンパク質との融合タンパク質を発現することのでき
る直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
なお、His tag及びnative His tagについては、それら
のアミノ酸配列を一文字の略号で表した。
のアミノ酸配列を一文字の略号で表した。
【００５４】（３）無細胞タンパク質合成系におけるタ
ンパク質の合成 大腸菌S30抽出液はZubayら（Annu.Rev.Geneti.,7,267-2
87,1973）の方法に従って、大腸菌BL21株から調製し
た。タンパク質合成反応は９６ウエルマイクロプレート
を用い、その各ウエルに下記の表５に示した組成の溶液
に、上記第２次ＰＣＲ産物１μl、上記大腸菌S30抽出液
7.2μlを加え、反応液の全量を30μlとし、37℃で１時
間、Rasタンパク質の合成を行った。
ンパク質の合成 大腸菌S30抽出液はZubayら（Annu.Rev.Geneti.,7,267-2
87,1973）の方法に従って、大腸菌BL21株から調製し
た。タンパク質合成反応は９６ウエルマイクロプレート
を用い、その各ウエルに下記の表５に示した組成の溶液
に、上記第２次ＰＣＲ産物１μl、上記大腸菌S30抽出液
7.2μlを加え、反応液の全量を30μlとし、37℃で１時
間、Rasタンパク質の合成を行った。
【００５５】
【表５】
【００５６】[実施例２] ＣＡＴタンパク質の発現
（１）第１次ＰＣＲ
ＣＡＴタンパク質をコードする配列番号１３に示した塩
基配列の直鎖状二本鎖ＤＮＡを鋳型として、実施例１と
同様の方法で第１次ＰＣＲを行った。ただし、5'プライ
マー２としては、ＣＡＴ遺伝子に特異的な、配列番号１
４に示した塩基配列のプライマーpCATを用いた。
基配列の直鎖状二本鎖ＤＮＡを鋳型として、実施例１と
同様の方法で第１次ＰＣＲを行った。ただし、5'プライ
マー２としては、ＣＡＴ遺伝子に特異的な、配列番号１
４に示した塩基配列のプライマーpCATを用いた。
【００５７】5'プライマー２：pCAT（配列番号１４）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC- 3'
【００５８】（２）第２次ＰＣＲ及び無細胞タンパク質
合成系におけるタンパク質の合成 実施例１と同様の方法により、第２次ＰＣＲ及び無細胞
タンパク質合成系におけるタンパク質の合成を行った。
合成系におけるタンパク質の合成 実施例１と同様の方法により、第２次ＰＣＲ及び無細胞
タンパク質合成系におけるタンパク質の合成を行った。
【００５９】[実施例３] マウスｃＤＮＡクローンの発
現 （１）第１次ＰＣＲ マウス完全長ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択した
１０種類のｃＤＮＡクローンを鋳型として用いた。これ
らは、プラスミドpBluescriptSK+のSacI, XhoI部位にそ
れぞれのｃＤＮＡがクローン化されたものであり、GenB
ankに登録されている（Accession No.は、それぞれ m16
206、m21532、x13605、u51204、l16904、s68022、d8766
3、x65627、m32599、u85511である。）。5'プライマー
１及び3'プライマーとしては実施例１と共通のプライマ
ーを用い、5'プライマー２としてはそれぞれのｃＤＮＡ
に特異的な以下の塩基配列を有するプライマーを用いて
ＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及びプログラムは、
それぞれ表６及び表２に示した。
現 （１）第１次ＰＣＲ マウス完全長ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択した
１０種類のｃＤＮＡクローンを鋳型として用いた。これ
らは、プラスミドpBluescriptSK+のSacI, XhoI部位にそ
れぞれのｃＤＮＡがクローン化されたものであり、GenB
ankに登録されている（Accession No.は、それぞれ m16
206、m21532、x13605、u51204、l16904、s68022、d8766
3、x65627、m32599、u85511である。）。5'プライマー
１及び3'プライマーとしては実施例１と共通のプライマ
ーを用い、5'プライマー２としてはそれぞれのｃＤＮＡ
に特異的な以下の塩基配列を有するプライマーを用いて
ＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液組成、及びプログラムは、
それぞれ表６及び表２に示した。
【００６０】5'プライマー２：p1A2（配列番号１５）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGCTCAAAGTCACGGTGCCC- 3'
5'プライマー２：p1B2（配列番号１６）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGAGGAGCAGCGCTGTTC- 3'
5'プライマー２：p1C8（配列番号１７）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGCCCGAACCAAGCAGAC- 3'
5'プライマー２：p1D2（配列番号１８）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGGTGTTGACAAAATCATTCC- 3'
5'プライマー２：p1D9（配列番号１９）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGTTGGAGACCTACAGCAACC- 3'
5'プライマー２：p1D10（配列番号２０）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGCGGTGCAGGTGGTGC- 3'
5'プライマー２：p1E4（配列番号２１）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGATGATCGGGAGGATCTG- 3'
5'プライマー２：p1G4（配列番号２２）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGTCGAGTTATTCTAGTGAC- 3'
5'プライマー２：p1H1（配列番号２３）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC- 3'
5'プライマー２：p1H5（配列番号２４）
5' -GAAGGAGCCGCCACCATGGCCAACAGTGAGCG- 3'
【００６１】
【表６】
【００６２】（２）第２次ＰＣＲ
実施例１と同様の方法により、第２次ＰＣＲを行った。
但し、ＰＣＲ溶液組成は表３に代えて表７に示した組成
の反応溶液を用いた。
但し、ＰＣＲ溶液組成は表３に代えて表７に示した組成
の反応溶液を用いた。
【００６３】
【表７】
【００６４】[実施例４] 合成産物の確認
実施例１及び２の方法によりＰＣＲで増幅した反応液の
一部を１％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を図
２に示した。レーン１〜７はそれぞれ、１：第１次ＰＣ
Ｒ産物、２：Hisタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、
３：native Hisタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、４：
GSTタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、５：MBPタグを付
加した第２次ＰＣＲ産物、６：CBDタグを付加した第２
次ＰＣＲ産物、及び７：TrxAタグを付加した第２次ＰＣ
Ｒ産物を示す。第１次ＰＣＲ及び第２次ＰＣＲ共に、単
一のＤＮＡのバンドのみが検出され、第２次ＰＣＲで
は、それぞれの標識ペプチドをコードするタグ配列を結
合した正しい長さのＤＮＡが増幅されていることが分か
る。
一部を１％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を図
２に示した。レーン１〜７はそれぞれ、１：第１次ＰＣ
Ｒ産物、２：Hisタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、
３：native Hisタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、４：
GSTタグを付加した第２次ＰＣＲ産物、５：MBPタグを付
加した第２次ＰＣＲ産物、６：CBDタグを付加した第２
次ＰＣＲ産物、及び７：TrxAタグを付加した第２次ＰＣ
Ｒ産物を示す。第１次ＰＣＲ及び第２次ＰＣＲ共に、単
一のＤＮＡのバンドのみが検出され、第２次ＰＣＲで
は、それぞれの標識ペプチドをコードするタグ配列を結
合した正しい長さのＤＮＡが増幅されていることが分か
る。
【００６５】実施例１及び２の方法により、無細胞タン
パク質合成系で合成されたタンパク質量を、14C標識Leu
存在下で合成後、TOPCOUNTを用いて定量した。その結果
を下記表８及び図３に示した。表８は、６種類の標識ペ
プチドとの融合タンパク質として合成されたRasタンパ
ク質及びCATタンパク質の推定分子量と発現量を示し
た。対照として、ＤＮＡ無添加で合成した結果及び環状
二本鎖ＤＮＡであるプラスミドpk7-Ras及びpk7-CAT（Ki
gawaら、FEBS Lett.、442巻、15−19頁、1999年、参
照）を用いて無細胞タンパク質合成系で合成した結果を
示した。これらの結果より、用いたタグペプチドの種類
によって発現量は異なるものの、これらのタグペプチド
のない環状二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合とほぼ
同等の発現量が得られることが分かった。
パク質合成系で合成されたタンパク質量を、14C標識Leu
存在下で合成後、TOPCOUNTを用いて定量した。その結果
を下記表８及び図３に示した。表８は、６種類の標識ペ
プチドとの融合タンパク質として合成されたRasタンパ
ク質及びCATタンパク質の推定分子量と発現量を示し
た。対照として、ＤＮＡ無添加で合成した結果及び環状
二本鎖ＤＮＡであるプラスミドpk7-Ras及びpk7-CAT（Ki
gawaら、FEBS Lett.、442巻、15−19頁、1999年、参
照）を用いて無細胞タンパク質合成系で合成した結果を
示した。これらの結果より、用いたタグペプチドの種類
によって発現量は異なるものの、これらのタグペプチド
のない環状二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合とほぼ
同等の発現量が得られることが分かった。
【００６６】
【表８】
【００６７】また、上記14C標識Leu存在下でタンパク質
合成を行った溶液5μlを用いてSDS-PAGEを行った結果を
図４に示した。図４において、レーン１〜７はそれぞ
れ、１：Hisタグを付加したRas又はCATタンパク質、
２：native Hisタグを付加したRas又はCATタンパク質、
３：GSTタグをRas又はCATタンパク質、４：MBPタグを付
加したRas又はCATタンパク質、５：CBDタグを付加したR
as又はCATタンパク質、及び６：TrxAタグを付加したRas
又はCATタンパク質を示す。なお、図中、Ras及びCATと
示したレーンには、対照として、プラスミドpk7-Ras及
びpk7-CATを鋳型として無細胞タンパク質合成系で合成
したタンパク質を、Ｈ、Ｌはそれぞれ高分子量及び低分
子量の分子量マーカーを示す。これらの結果より、それ
ぞれのタグを付加したRas及びCATタンパク質が正しい分
子量で合成されていることが分かる。
合成を行った溶液5μlを用いてSDS-PAGEを行った結果を
図４に示した。図４において、レーン１〜７はそれぞ
れ、１：Hisタグを付加したRas又はCATタンパク質、
２：native Hisタグを付加したRas又はCATタンパク質、
３：GSTタグをRas又はCATタンパク質、４：MBPタグを付
加したRas又はCATタンパク質、５：CBDタグを付加したR
as又はCATタンパク質、及び６：TrxAタグを付加したRas
又はCATタンパク質を示す。なお、図中、Ras及びCATと
示したレーンには、対照として、プラスミドpk7-Ras及
びpk7-CATを鋳型として無細胞タンパク質合成系で合成
したタンパク質を、Ｈ、Ｌはそれぞれ高分子量及び低分
子量の分子量マーカーを示す。これらの結果より、それ
ぞれのタグを付加したRas及びCATタンパク質が正しい分
子量で合成されていることが分かる。
【００６８】実施例３の方法により、GST及びnative Hi
s tag配列と融合して合成したマウスｃＤＮＡクローン
由来のタンパク質の合成量を図５に示した。これらの結
果より多検体のｃＤＮＡクローンから効率よくタンパク
質が合成できることが示された。
s tag配列と融合して合成したマウスｃＤＮＡクローン
由来のタンパク質の合成量を図５に示した。これらの結
果より多検体のｃＤＮＡクローンから効率よくタンパク
質が合成できることが示された。
【００６９】[比較例１]第２次ＰＣＲに用いた5'ＤＮＡ
断片(T7P(GST)又はT7P(His tag))及び3'ＤＮＡ断片(T7
T)の濃度を変化させて、実施例１及び２と同様の方法に
より２段階ＰＣＲを行った。この他の条件は全て実施例
１及び２と同じ条件とした。第２次ＰＣＲ産物を１％ア
ガロースゲル電気泳動により調べた結果を表９に示し
た。
断片(T7P(GST)又はT7P(His tag))及び3'ＤＮＡ断片(T7
T)の濃度を変化させて、実施例１及び２と同様の方法に
より２段階ＰＣＲを行った。この他の条件は全て実施例
１及び２と同じ条件とした。第２次ＰＣＲ産物を１％ア
ガロースゲル電気泳動により調べた結果を表９に示し
た。
【００７０】
【表９】
【００７１】なお、アガロースゲル電気泳動の評価基準
は次の通りである。 −：ＰＣＲ産物なし。 ○：正しいＰＣＲ産物のみ認められる。 △：正しいＰＣＲ産物と副産物の両方が認められる。 ×：副産物のみが認められる。
は次の通りである。 −：ＰＣＲ産物なし。 ○：正しいＰＣＲ産物のみ認められる。 △：正しいＰＣＲ産物と副産物の両方が認められる。 ×：副産物のみが認められる。
【００７２】これらの結果より、第２次ＰＣＲ溶液中に
おける5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の濃度がそれぞれ
1 pmol/LではＤＮＡの増幅が起こらず、一方、5000 pmo
l/L以上では副産物の量が増えて鋳型ＤＮＡの純度が低
下する。従って、5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片濃度が
それぞれ5〜2500 pmol/Lの範囲内において効率よく鋳型
ＤＮＡの増幅が起こることが分かる。
おける5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片の濃度がそれぞれ
1 pmol/LではＤＮＡの増幅が起こらず、一方、5000 pmo
l/L以上では副産物の量が増えて鋳型ＤＮＡの純度が低
下する。従って、5'ＤＮＡ断片及び3'ＤＮＡ断片濃度が
それぞれ5〜2500 pmol/Lの範囲内において効率よく鋳型
ＤＮＡの増幅が起こることが分かる。
【００７３】[比較例２]第１次ＰＣＲに用いたプライマ
ー濃度を下記のように変化させて、実施例１及び２と同
様の方法により２段階ＰＣＲを行った。第２次ＰＣＲに
おける5'ＤＮＡ断片としては、T7P(GST)及びT7P(His ta
g)を用いた。この他の条件は全て実施例１及び２と同じ
条件とした。第２次ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電
気泳動により調べた結果を表１０に示した。
ー濃度を下記のように変化させて、実施例１及び２と同
様の方法により２段階ＰＣＲを行った。第２次ＰＣＲに
おける5'ＤＮＡ断片としては、T7P(GST)及びT7P(His ta
g)を用いた。この他の条件は全て実施例１及び２と同じ
条件とした。第２次ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電
気泳動により調べた結果を表１０に示した。
【００７４】
【表１０】
【００７５】なお、アガロースゲル電気泳動の評価基準
は次の通りである。 −：ＰＣＲ産物なし ○：正しいＰＣＲ産物のみ認められる △：正しいＰＣＲ産物と副産物の両方が認められる。 ×：副産物のみが認められる
は次の通りである。 −：ＰＣＲ産物なし ○：正しいＰＣＲ産物のみ認められる △：正しいＰＣＲ産物と副産物の両方が認められる。 ×：副産物のみが認められる
【００７６】これらの結果より、Ras及びCAT発現用の鋳
型ＤＮＡの調製において、第１次ＰＣＲで用いた3'プラ
イマー：p8.2の第２次ＰＣＲ溶液中での濃度を指標とし
て、25nmol/L以上の濃度では副産物の量が増えて目的と
するＤＮＡの増幅が行われないことが分かる。対照とし
て鋳型ＤＮＡを用いなかった場合でもプライマーダイマ
ーに相当する副産物のみの増幅が認められた。一方、第
１次ＰＣＲに用いるプライマー濃度が10 nmol/L以下の
場合には、第２次ＰＣＲで効率の良いＤＮＡの増幅が認
められなかった。
型ＤＮＡの調製において、第１次ＰＣＲで用いた3'プラ
イマー：p8.2の第２次ＰＣＲ溶液中での濃度を指標とし
て、25nmol/L以上の濃度では副産物の量が増えて目的と
するＤＮＡの増幅が行われないことが分かる。対照とし
て鋳型ＤＮＡを用いなかった場合でもプライマーダイマ
ーに相当する副産物のみの増幅が認められた。一方、第
１次ＰＣＲに用いるプライマー濃度が10 nmol/L以下の
場合には、第２次ＰＣＲで効率の良いＤＮＡの増幅が認
められなかった。
【００７７】
【発明の効果】本発明の方法によれば、タンパク質をコ
ードする配列を含むｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを基に、無
細胞タンパク質合成系等によりタンパク質を合成、精
製、検出するための鋳型ＤＮＡを迅速かつ効率よく製造
することができる。これにより構造ゲノム科学の研究を
目的とするタンパク質の構造と機能解析のための自動化
システムの構築が可能となる。
ードする配列を含むｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを基に、無
細胞タンパク質合成系等によりタンパク質を合成、精
製、検出するための鋳型ＤＮＡを迅速かつ効率よく製造
することができる。これにより構造ゲノム科学の研究を
目的とするタンパク質の構造と機能解析のための自動化
システムの構築が可能となる。
【００７８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Methods for producing a linear template DNA and producing a prote
in in cell free system using thereof
<130> RJH13-021T
<160> 24
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> native His tag
<400> 1
Met Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Glu His Ala His
1 5 10 15
Ala His Asn Lys
20
<210> 2
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> double stranded linear DNA coding for Ras protein
<400> 2
ggcgtataca tatgaccgaa tacaaactgg ttgtagttgg cgctggtggt gtaggcaaaa 60
gcgcgctgac cattcagttg atccagaacc acttcgtaga tgagtacgac ccgactattg 120
aagactctta ccgtaagcag gttgttatcg acggtgagac ctgtttgctg gacatccttg 180
ataccgcagg ccaagaagaa tactctgcta tgcgtgatca gtatatgcgt accggcgaag 240
gcttcctgtg cgttttcgct atcaacaaca ccaaatcttt tgaagacatc catcaatacc 300
gtgaacagat caaacgtgtt aaagactctg atgacgttcc gatggttctg gttggtaaca 360
aatgcgactt ggcagcgcgt actgttgaat ctcgtcaggc tcaggatctg gctcgttctt 420
acggaattcc gtacatcgaa acctctgcta aaactcgtca aggcgttgaa gacgctttct 480
acaccttggt tcgtgaaatc cgtcagcaca agctgcgtaa gctttgatag aattccgtga 540
tagctcgagt cgaccggctg ctaacaaagc ccgaaagggt ttcctgtgtg aaattgttat 600
ccgct 605
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-1 universal
<400> 3
ccgaaggagc cgccaccat 19
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for Ras
<400> 4
gaaggagccg ccaccatgac cgaatacaaa ctggttgtag 40
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer universal
<400> 5
gcggataaca atttcacaca ggaaac 26
<210> 6
<211> 844
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' DNA fragment comprising GST tag sequence
<400> 6
ccgctgtcct cgttcccagc ccatgattac gaattcagat ctcgatcccg cgaaattaat 60
acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 120
agaaggagat atacatatgt cccctatact aggttattgg aaaattaagg gccttgtgca 180
acccactcga cttcttttgg aatatcttga agaaaaatat gaagagcatt tgtatgagcg 240
cgatgaaggt gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg ggtttggagt ttcccaatct 300
tccttattat attgatggtg atgttaaatt aacacagtct atggccatca tacgttatat 360
agctgacaag cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag cgtgcagaga tttcaatgct 420
tgaaggagcg gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga attgcatata gtaaagactt 480
tgaaactctc aaagttgatt ttcttagcaa gctacctgaa atgctgaaaa tgttcgaaga 540
tcgtttatgt cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta acccatcctg acttcatgtt 600
gtatgacgct cttgatgttg ttttatacat ggacccaatg tgcctggatg cgttcccaaa 660
attagtttgt tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa attgataagt acttgaaatc 720
cagcaagtat atagcatggc ctttgcaggg ctggcaagcc acgtttggtg gtggcgacca 780
tcctccaaaa tcggatagct ctggcgcctc cctggtgcca cgcggatccg aaggagccgc 840
cacc 844
<210> 7
<211> 217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' DNA fragment comprising His tag sequence
<400> 7
ccgctgtcct cgttcccagc ccatgattac gaattcagat ctcgatcccg cgaaattaat 60
acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 120
agaaggagat atacatatga aaggcagcag ccatcatcat catcatcaca gcagcggcgc 180
ctccctggtg ccacgcggat ccgaaggagc cgccacc 217
<210> 8
<211> 244
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' DNA fragment comprising native His tag sequence
<400> 8
ccgctgtcct cgttcccagc ccatgattac gaattcagat ctcgatcccg cgaaattaat 60
acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 120
agaaggagat atacatatga aagatcatct catccacaat gtccacaaag aggagcacgc 180
tcatgcccac aacaagagct ctggcgcctc cctggtgcca cgcggatccg aaggagccgc 240
cacc 244
<210> 9
<211> 652
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' DNA fragment comprising CBD
<400> 9
ccgctgtcct cgttcccagc ccatgattac gaattcagat ctcgatcccg cgaaattaat 60
acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 120
agaaggagat atacatatgt cagttgaatt ttacaactct aacaaatcag cacaaacaaa 180
ctcaattaca ccaataatca aaattactaa cacatctgac agtgatttaa atttaaatga 240
cgtaaaagtt agatattatt acacaagtga tggtacacaa ggacaaactt tctggtgtga 300
ccatgctggt gcattattag gaaatagcta tgttgataac actagcaaag tgacagcaaa 360
cttcgttaaa gaaacagcaa gcccaacatc aacctatgat acatatgttg aatttggatt 420
tgcaagcgga gcagctactc ttaaaaaagg acaatttata actattcaag gaagaataac 480
aaaatcagac tggtcaaact acactcaaac aaatgactat tcatttgatg caagtagttc 540
aacaccagtt gtaaatccaa aagttacagg atatataggt ggagctaaag ttcttggtac 600
agcaagctct ggcgcctccc tggtgccacg cggatccgaa ggagccgcca cc 652
<210> 10
<211> 511
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' DNA fragment comprising Thioredoxin sequence
<400> 10
ccgctgtcct cgttcccagc ccatgattac gaattcagat ctcgatcccg cgaaattaat 60
acgactcact atagggagac cacaacggtt tccctctaga aataattttg tttaacttta 120
agaaggagat atacatatga gcgataaaat tattcacctg actgacgaca gttttgacac 180
ggatgtactc aaagcggacg gggcgatcct cgtcgatttc tgggcagagt ggtgcggtcc 240
gtgcaaaatg atcgccccga ttctggatga aatcgctgac gaatatcagg gcaaactgac 300
cgttgcaaaa ctgaacatcg atcaaaaccc tggcactgcg ccgaaatatg gcatccgtgg 360
tatcccgact ctgctgctgt tcaaaaacgg tgaagtggcg gcaaccaaag tgggtgcact 420
gtctaaaggt cagttgaaag agttcctcga cgctaacctg gccagctctg gcgcctccct 480
ggtgccacgc ggatccgaag gagccgccac c 511
<210> 11
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' DNA fragment comprising T7 terminater
<400> 11
gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctgct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 60
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 120
actatatccg gataacctcg agctgcaggc atgcaagctt ggggctggga acgaggacag 180
cgg 183
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer for 2nd PCR
<400> 12
gccgctgtcc tcgttcccag cc 22
<210> 13
<211> 760
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> double stranded linear DNA coding for CAT protein
<400> 13
ggcgtataca tatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc 60
atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg 120
ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc 180
cggcctttat tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa 240
tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg 300
agcaaactga aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc 360
tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag 420
ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg 480
atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt 540
atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtctgtg 600
atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg 660
gcggggcgta atttttttaa ggcagttatt ggtgccctta aacgtcgacc ggctgctaac 720
aaagcccgaa agggtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 760
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for CAT
<400> 14
gaaggagccg ccaccatgga gaaaaaaatc actggatata c 41
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1A2
<400> 15
gaaggagccg ccaccatgct caaagtcacg gtgccc 36
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1B2
<400> 16
gaaggagccg ccaccatgga ggagcagcgc tgttc 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1C8
<400> 17
gaaggagccg ccaccatggc ccgaaccaag cagac 35
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1D2
<400> 18
gaaggagccg ccaccatggg tgttgacaaa atcattcc 38
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1D9
<400> 19
gaaggagccg ccaccatgtt ggagacctac agcaacc 37
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1D10
<400> 20
gaaggagccg ccaccatggc ggtgcaggtg gtgc 34
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1E4
<400> 21
gaaggagccg ccaccatgga tgatcgggag gatctg 36
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1G4
<400> 22
gaaggagccg ccaccatgtc gagttattct agtgac 36
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1H1
<400> 23
gaaggagccg ccaccatggt gaaggtcggt gtgaac 36
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer-2 for 1H5
<400> 24
gaaggagccg ccaccatggc caacagtgag cg 32
【図１】本発明の一実施形態である直鎖状鋳型ＤＮＡの
調製方法を示した図である。
調製方法を示した図である。
【図２】種々のタグペプチドと融合したRas及びCATタン
パク質をコードする鋳型ＤＮＡを本発明の方法によりＰ
ＣＲ増幅した結果をアガロースゲル電気泳動で分析した
結果である。
パク質をコードする鋳型ＤＮＡを本発明の方法によりＰ
ＣＲ増幅した結果をアガロースゲル電気泳動で分析した
結果である。
【図３】種々のタグペプチドと融合したRas及びCATタン
パク質の合成量を表したグラフである。
パク質の合成量を表したグラフである。
【図４】種々のタグペプチドと融合したRas及びCATタン
パク質をSDS-PAGEで分析した結果である。
パク質をSDS-PAGEで分析した結果である。
【図５】GST及びnative His tag配列と融合して合成し
たマウスｃＤＮＡクローン由来のタンパク質の合成量を
表したグラフである。
たマウスｃＤＮＡクローン由来のタンパク質の合成量を
表したグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 木川 隆則
神奈川県横浜市鶴見区末広町１丁目７番22
号 理化学研究所 横浜研究所内
(72)発明者 横山 茂之
神奈川県横浜市鶴見区末広町１丁目７番22
号 理化学研究所 横浜研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 BA80 CA01 CA04
CA07 EA04 HA03 HA14
4B064 AG01 CA21 CC24 CD12
Claims (13)
- 【請求項１】タンパク質又はその一部をコードする配列
を含む第１の二本鎖ＤＮＡ断片と、 該第１のＤＮＡ断片の5'末端領域と重複する配列を含む
第２の二本鎖ＤＮＡ断片と、 該第１のＤＮＡ断片の3'末端領域と重複する配列を含む
第３の二本鎖ＤＮＡ断片と、 該第２のＤＮＡ断片の5'末端領域にアニールするセンス
プライマーと、及び 該第３のＤＮＡ断片の3'末端領域にアニールするアンチ
センスプライマーと、 を接触させてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により直
鎖状二本鎖ＤＮＡを増幅する方法において、 該第２のＤＮＡ断片が遺伝子の転写及び翻訳を制御する
配列を含み、 該ＰＣＲ溶液中における第２のＤＮＡ断片及び第３のＤ
ＮＡ断片の濃度がそれぞれ、5〜2500 pmol/Lであること
を特徴とするタンパク質合成用鋳型ＤＮＡの製造方法。 - 【請求項２】前記第１のＤＮＡ断片を調製するために、
あらかじめＰＣＲ（第１次ＰＣＲ）を行ってＤＮＡを増
幅した後、該第１次ＰＣＲ溶液を前記第１のＤＮＡ断片
として用いて請求項１記載のＰＣＲ（第２次ＰＣＲ）を
行う方法であって、該第１次ＰＣＲ溶液中に残存するプ
ライマー及び該第１次ＰＣＲで生じたプライマーダイマ
ーの濃度が、該第２次ＰＣＲ溶液中においてそれぞれ20
nmol/L未満であることを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】前記第１次ＰＣＲに用いるプライマーの濃
度が、それぞれ20〜500 nmol/Lであることを特徴とする
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】前記第１次ＰＣＲ溶液を１０〜１００倍に
希釈（第２次ＰＣＲ溶液中における終濃度で）して前記
第２次ＰＣＲを行うことを特徴とする請求項２記載の方
法。 - 【請求項５】前記第１次ＰＣＲ溶液中からプライマー及
びプライマーダイマーを除去することを特徴とする請求
項２記載の方法。 - 【請求項６】前記第１次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、組換え
微生物菌体又はその培養液であることを特徴とする請求
項２記載の方法。 - 【請求項７】前記第２のＤＮＡ断片及び／又は第３のＤ
ＮＡ断片が、二本鎖ＤＮＡに代えて一本鎖ＤＮＡである
ことを特徴とする請求項１〜６記載の方法。 - 【請求項８】前記センスプライマーとアンチセンスプラ
イマーとが同一の塩基配列であることを特徴とする請求
項１〜７何れか記載の方法。 - 【請求項９】前記第３のＤＮＡ断片が、転写終結配列を
含むことを特徴とする請求項１〜８何れか記載の方法。 - 【請求項１０】前記第２のＤＮＡ断片及び第３のＤＮＡ
断片の少なくとも一方がタグペプチドをコードする配列
を含み、該タグペプチドが前記タンパク質又はその一部
と融合して合成されることを特徴とする請求項１〜９何
れか記載の方法。 - 【請求項１１】前記タグペプチドはマルトース結合タン
パク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳトラ
ンスフェラーゼ、チオレドキシン、ストレプトアビジン
結合ペプチド又はヒスチジンタグペプチドであることを
特徴とする請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】前記タグペプチドが、配列番号１のアミ
ノ酸配列からなるヒスチジンタグペプチドであることを
特徴とする請求項１０記載の方法。 - 【請求項１３】請求項１〜１２何れか記載の方法により
製造した鋳型ＤＮＡを用いることを特徴とする無細胞タ
ンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
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