CN112625111B - 突触囊泡蛋白sv2a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种突触囊泡蛋白SV2A的制备方法，包括如下步骤：1)过表达：将带有蛋白亲和纯化用标签的人源SV2A基因的第104‑742氨基酸通过病毒载体转入动物细胞，使其过表达；2)溶解：裂解动物细胞，用相对于膜蛋白过量的正十二烷基β‑D‑麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐的混合溶液溶解膜蛋白；其中正十二烷基β‑D‑麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐的质量浓度比是10:1；3)纯化：离心，取上清使用亲和层析纯化，使用相对于膜蛋白过量的的毛地黄皂苷溶液替代蛋白溶液中的正十二烷基β‑D‑麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐，再用分子筛进行再次纯化，得到SV2A蛋白。本发明能成功分离得到稳定构型的SV2A蛋白。

Description

突触囊泡蛋白SV2A的制备方法

技术领域

本发明涉及膜蛋白表达与纯化领域。

背景技术

突触囊泡蛋白SV2A是一类具有12个跨膜结构的糖蛋白，存在于所有突触泡和内分泌泡中。SV2A同时是抗癫痫药物左乙拉西坦的靶分子。但是SV2A具体的功能不清楚，大规模制备SV2A有助于对其结构与功能的研究，有利于相关药物的开发。

制备膜蛋白通常需要经历4个主要步骤：宿主系统内过表达、去垢剂溶解细胞膜、纯化蛋白、Nanodisc(磷脂纳米盘)组装。

其中过表达是膜蛋白制备流程中的最大瓶颈。宿主系统的选择要依赖于对膜蛋白的要求(如翻译后修饰等)及可操作性(实验室是否有相关设备及操作人员是否具备相关经验)(丁晓萍.膜蛋白的纯化[J].生物产业技术,2009(3):90.右栏末段)。

去垢剂溶解细胞膜也是制备流程中的主要难题之一。因为膜蛋白的结构需要维持，如果任选去垢剂，则容易导致膜蛋白结构不稳定，继而降低膜蛋白的得率。

Nanodisc组装是膜蛋白制备的另一个难题。Nanodisc是由膜支架蛋白(membranescaffold proteins,MSP)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构，膜蛋白可以整合到Nanodisc中，保持其生物活性。其中：(1)MSP、磷脂分子以及膜蛋白的比例，(2)MSP的类型(比如MSP1D1、MSP1E3D1等)，(3)膜蛋白本身的序列和结构，都对所制备的膜蛋白的稳定性影响很大。

由于SV2A蛋白结构复杂，研究人员在体外表达、纯化该蛋白时往往遇到蛋白高聚的情况，以致得到的SV2A无法以膜蛋白固有构象稳定存在，高聚状态的膜蛋白与该膜蛋白的自然构象区别极大，理论上不具备该膜蛋白的生物学功能。

至今也尚未见体外表达出具有膜蛋白稳定构象的SV2A蛋白的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种SV2A蛋白的制备方法。

本发明的技术方案包括：

一种突触囊泡蛋白SV2A的制备方法，包括如下步骤：

1)过表达：将带有蛋白亲和纯化用标签的人源SV2A基因的第104-742氨基酸通过病毒载体转入动物细胞，使其过表达；

2)溶解：裂解动物细胞，用相对于膜蛋白过量的正十二烷基β-D-麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐的混合溶液溶解膜蛋白；其中正十二烷基β-D-麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐的质量浓度比是10:1；

3)纯化：离心，取上清使用亲和层析纯化，使用0.8-1.2mg/mL毛地黄皂苷溶液洗脱，再用分子筛进行再次纯化，得到SV2A蛋白。

如前述的制备方法，步骤1)是将带有蛋白亲和纯化用标签的人源SV2A基因的第104-742氨基酸通过病毒载体转入动物细胞1，扩增出病毒，再将此病毒感染动物细胞2，使其过表达。

如前述的制备方法，步骤1)所述动物细胞1是昆虫细胞；优选地，为昆虫细胞sf9。

如前述的制备方法，步骤1)所述动物细胞2是high5细胞或HEK293细胞。

如前述的制备方法，步骤1)中的载体是Pfastbac载体。

如前述的制备方法，步骤1)中的蛋白亲和纯化用标签是N-flag标签。

如前述的制备方法，步骤2)中正十二烷基β-D-麦芽糖苷的浓度是0.02％(w/v)。

如前述的制备方法，步骤3)的毛地黄皂苷溶液的浓度是1mg/ml；和/或，步骤3)的分子筛缓冲液pH为7.4；和/或，含有25mM Tris、150mM NaCl、0.02％(w/v)正十二烷基β-D-麦芽糖苷、0.002％(w/v)胆固醇半琥珀酸三盐。

如前述的制备方法，它还包括对SV2A蛋白进行Nanodisc组装；优选地，组装使用的膜支架蛋白是MSP2N2，组装时SV2A、MSP2N2、磷脂的质量比是1:4:100。

前述任一方法制备得到的SV2A蛋白。

本发明通过特定的膜蛋白表达纯化参数组合，得到非高聚状态的、构象稳定的SV2A蛋白；而任一表达纯化参数发生改变后，均得到高聚状态的SV2A，没有生物活性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是过表达后的蛋白SDS-PAGE图。

图2是分子筛纯化后的SDS-PAGE图。

图3是本发明所纯化SV2A蛋白的FSEC检测图。

图4是SV2A第1-742碱基作为目的片段时得到SV2A蛋白的FSEC检测图。

图5是将溶解用去垢剂换成DDM的方案对应的SV2A蛋白的FSEC检测图。

图6是将溶解用去垢剂换成LMNG+CHS的方案对应的SV2A蛋白的FSEC检测图。

图7是对比例组A(SV2A:MSP2N2:LIPID＝1:4:200)的FSEC检测图。

图8是对比例组B(SV2A:MSP2N2:LIPID＝1:4:400)的FSEC检测图。

图9是对比例组C(SV2A:MSP2N2:LIPID＝1:2:100)的FSEC检测图。

图10是对比例组D(SV2A:MSP2N2:LIPID＝1:2:300)的FSEC检测图。

图11是对比例组E(SV2A:MSP2N2:LIPID＝1:2:400)的FSEC检测图。

图12是对比例组F(SV2A:MSP1D1:LIPID＝1:4:100)的FSEC检测图。

图13是是对比例组G(SV2A:MSP1E3D1:LIPID＝＝1:4:100)的FSEC检测图。

具体实施方式

实施例1本发明的SV2A蛋白制备方法

1.方法

(1)过表达：把带有N-flag标签(N端flag标签)的人源SV2A基因的第104-742氨基酸序列(SV2A完整序列如SEQ ID NO.1所示)构建到Pfastbac载体上，转化DH10BAC细菌，以得到Bacmid(杆状病毒质粒[带有杆状病毒基因组的质粒,可在细菌和昆虫细胞之间穿梭])。用Bacmid转染昆虫细胞sf9,生产的病毒是P1代,然后扩增P2、P3代，用P3感染high5细胞(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)卵细胞系)或HEK293细胞，感染2天收集细胞。

(2)溶解：细胞用600g离心10min收集，收集后倒掉细胞液，细胞用20mMTris HCL150mM Nacl重悬，并加入蛋白酶抑制剂1mM PMSF,超声破碎(超声10秒，停10秒，共5分钟)，细胞超声破碎后，600g离心10min去掉未破碎的细胞。上清液加入1％DDM在4度翘班摇床摇1小时，进行裂解，然后进行38000g离心1小时超速离心提取膜组分。膜组分用含有0.02％(w/v)DDM(十二烷基-β-D-麦芽糖苷)和0.002％(w/v)CHS(半琥珀酸胆固醇三盐)的溶液进行溶解。

(3)纯化：然后高速离心(4000rpm，1hr)，上清与N-flag标签抗体孵育，通过亲和层析进行纯化；使用去垢剂1mg/ml的digitonin(毛地黄皂苷)作为亲和层析的洗脱液洗脱目标蛋白，以稳定SV2A蛋白的构型，再过分子筛进行进一步纯化，得SV2A蛋白。

其中，亲和层析步骤为：溶解的细胞膜组分与Ni-NTA孵育，并装柱，用不同咪唑浓度洗脱(50mM，100mM，200mM，300mM)。

分子筛buffer为：25mM tris ph 7.4,150mM Nacl，0.02％(w/v)DDM,0.002％(w/v)CHS。

(4)组装：SV2A和MSP2N2进行Nanodisc组装，质量比SV2A:MSP2N2:LIPID(磷脂)＝1:4:100，组装之后的SV2A可以长期存放。

SEQ ID NO.1：

ATGGCCGAGAGCGGTGGTAAAGGTGAGCGTATGGCCGACGGTGCCCCCCTCGCTGGTGTCCGTGGTGGTCTCAGCGACGGTGAAGGTCCCCCTGGTGGTCGTGGCGAAGCTCAGCGCCGCAAGGAGCGTGAAGAGCTGGCTCAGCAGTACGAAGCTATTCTGCGCGAGTGCGGCCACGGCCGTTTCCAGTGGACTCTCTATTTCGTCCTCGGTTTAGCTTTAATGGCTGATGGTGTCGAGGTGTTCGTGGTGGGTTTCGTCCTGCCTAGCGCTGAGAAGGACATGTGCCTGAGCGATAGCAACAAGGGCATGCTGGGCCTGATCGTCTACCTGGGTATGATGGTGGGCGCTTTCCTCTGGGGCGGTCTGGCTGATCGTCTCGGCCGCCGTCAGTGCCTGCTGATTTCCCTCTCCGTGAATAGCGTCTTCGCCTTCTTCAGCAGCTTCGTCCAGGGTTACGGCACCTTTCTGTTCTGCCGCCTCCTGTCCGGTGTCGGTATTGGCGGCTCCATCCCCATCGTGTTCTCCTACTTCAGCGAGTTCCTGGCTCAGGAGAAGCGTGGCGAGCACCTGTCCTGGCTGTGCATGTTCTGGATGATCGGTGGTGTGTACGCTGCCGCCATGGCTTGGGCCATTATCCCTCACTACGGCTGGAGCTTCCAGATGGGCTCCGCTTACCAATTCCACTCCTGGCGCGTCTTCGTCCTGGTGTGTGCTTTCCCCAGCGTCTTTGCTATTGGCGCCCTGACCACCCAACCTGAGAGCCCTCGTTTCTTTCTGGAGAACGGCAAGCACGACGAGGCTTGGATGGTGCTCAAGCAGGTGCATGACACCAACATGCGCGCTAAGGGCCACCCCGAACGCGTCTTCTCCGTGACCCACATCAAAACCATCCATCAGGAAGACGAACTCATCGAGATCCAGTCCGACACCGGTACTTGGTACCAACGTTGGGGCGTCCGCGCTCTGTCCCTGGGTGGTCAGGTGTGGGGCAACTTCCTCTCCTGCTTCGGTCCCGAATACCGCCGCATTACCCTGATGATGATGGGTGTCTGGTTCACCATGAGCTTCTCCTACTACGGCCTCACTGTGTGGTTCCCCGACATGATCCGCCATCTGCAAGCCGTTGATTACGCCTCTCGCACCAAAGTCTTCCCTGGCGAGCGTGTGGAGCACGTGACTTTCAACTTTACTCTCGAAAATCAGATCCACCGCGGTGGTCAATACTTCAACGATAAGTTCATCGGCCTCCGTCTGAAGTCCGTCAGCTTTGAGGATAGCCTGTTTGAGGAGTGCTACTTCGAGGACGTCACCAGCTCCAACACTTTCTTCCGTAACTGTACTTTCATTAACACCGTGTTCTACAACACTGACCTGTTCGAGTACAAGTTCGTGAATAGCCGTCTCATTAACAGCACTTTTCTCCACAACAAAGAGGGTTGCCCCCTGGACGTCACTGGTACCGGCGAGGGTGCCTACATGGTGTACTTTGTCTCCTTCCTCGGCACTCTGGCCGTGCTCCCCGGTAACATTGTCTCCGCCCTGCTCATGGACAAGATTGGTCGTCTCCGTATGCTGGCCGGCAGCTCCGTGATGAGCTGTGTGTCCTGCTTCTTCCTGAGCTTTGGCAACTCCGAATCCGCCATGATCGCTCTGCTGTGCCTGTTCGGCGGTGTGTCCATCGCCAGCTGGAACGCCCTGGATGTGCTGACCGTGGAACTGTACCCCAGCGACAAACGTACCACTGCTTTCGGCTTCCTGAACGCTCTGTGCAAGCTGGCCGCCGTCCTGGGTATTAGCATCTTCACCTCCTTCGTCGGCATCACTAAGGCCGCTCCTATCCTCTTCGCCTCCGCTGCCCTGGCTCTCGGCAGCTCCCTGGCTCTCAAGCTGCCCGAAACCCGCGGCCAGGTGCTGCAG

2.结果

(1)过表达的结果

SDS-PAGE图如图1所示，可见目标蛋白的纯度较高。

(2)纯化结果

过完分子筛后样品电泳图如图2所示。据测定，纯度90％以上。目标蛋白得率为：平均每L细胞培养得到0.5mg蛋白。

(3)Nanodisc组装后的稳定性结果

Nanodisc组装后可以在没有去垢剂的情况下过分子筛(分子筛buffer：25mMtris，pH 7.4，150mM NaCl)。

以下用对比例的形式对本发明的效果进一步说明。

对比例1不同表达体系对蛋白纯化的影响

1.方法

在实施例1的基础上，将所述步骤(1)改为：用细菌表达体系，进行表达。

即，把基因构建到PET20载体上，利用BL21(DE3)表达菌株进行表达，在37摄氏度培养菌体到OD600＝0.6,加入1mM IPTG进行诱导3小时，或者20摄氏度诱导过夜。收集菌体。其余步骤不变。

2.结果

细菌表达体系得不到蛋白，没有表达。

对比例2目的基因序列本身对蛋白纯化的影响

借助体外表达的膜蛋白产物容易呈现高聚状态，会导致纯化难度大、蛋白产物活性低等问题。为了尝试解决这个问题，发明人删除了不同的序列区段，构建了多种目的基因，并列举了包括本发明的目的基因在内的5种目的片段对蛋白纯化的影响。

1.方法

在实施例1的基础上，将步骤(1)的碱基序列分别设置为人源SV2A基因的第1-742，80-742，104-742，136-742，168-742碱基，其余步骤不变。

2.结果

其中只有第104-742氨基酸对应目的片段表达获得了状态好的蛋白。具体的SEC(Size-Exclusion Chromatograph，荧光检测尺寸排除色谱)结果如图3所示，可见，12.11毫升处的峰显示的分子量大小刚好是一个二聚体的SV2A。

其他目的片段表达得到的蛋白均呈现高聚的状态，图4显示了目的片段为SV2A基因第1-742碱基时的FSEC检测结果蛋白主要在8.59ml位置出现，显示SV2A呈高聚状态，不具备SV2A的活性，其他目的序列(人源SV2A基因的第80-742，136-742，168-742碱基)对应结果也是高聚。

对比例3不同去垢剂对蛋白得率和纯度的影响

1.方法

在实施例1的基础上，将DDM+CHS(0.02％(w/v)DDM和

0.002％(w/v)CHS)换成100mg/ml的DDM、LMNG+CHS(100mg/ml的LMNG和10mg/ml的CHS)、100mg/ml的Digitonin、100mg/ml的Chaps或100mg/ml的C12E8等去垢剂。

2.结果

换做其他去垢剂后，在分子筛上出现高聚的峰，表明蛋白是聚合的状态。图5、图6分别显示了去垢剂换成DDM以及LMNG+CHS的情形，其余去垢剂与之类似。

对比例4不同Nanodisc组装参数对蛋白表达纯化的影响

1.方法

在实施例1的基础上，将步骤(4)中SV2A:MSP2N2:LIPID＝1:4:100的质量比换成1:4:200(组A)、1:4:400(组B)、1:2:100(组C)、1:2:300(组D)或1:2:400(组E)。

或者，将步骤(4)中的MSP2N2换成MSP1D1(组F)或MSP1E3D1(组G)。

2.结果

FSEC显示，组A～G均出现不同程度高聚(图7-图13)。

综上，本发明的表达纯化方法的各种条件相(表达体系、目的片段、去垢剂、Nanodisc)互配合，才能够有效得到聚集程度低的SV2A。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 突触囊泡蛋白SV2A的制备方法

<130> GYKH1257-2019P016512CC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1920

<212> DNA

<213> 人类(homo sapiens)

<400> 1

atggccgaga gcggtggtaa aggtgagcgt atggccgacg gtgcccccct cgctggtgtc 60

cgtggtggtc tcagcgacgg tgaaggtccc cctggtggtc gtggcgaagc tcagcgccgc 120

aaggagcgtg aagagctggc tcagcagtac gaagctattc tgcgcgagtg cggccacggc 180

cgtttccagt ggactctcta tttcgtcctc ggtttagctt taatggctga tggtgtcgag 240

gtgttcgtgg tgggtttcgt cctgcctagc gctgagaagg acatgtgcct gagcgatagc 300

aacaagggca tgctgggcct gatcgtctac ctgggtatga tggtgggcgc tttcctctgg 360

ggcggtctgg ctgatcgtct cggccgccgt cagtgcctgc tgatttccct ctccgtgaat 420

agcgtcttcg ccttcttcag cagcttcgtc cagggttacg gcacctttct gttctgccgc 480

ctcctgtccg gtgtcggtat tggcggctcc atccccatcg tgttctccta cttcagcgag 540

ttcctggctc aggagaagcg tggcgagcac ctgtcctggc tgtgcatgtt ctggatgatc 600

ggtggtgtgt acgctgccgc catggcttgg gccattatcc ctcactacgg ctggagcttc 660

cagatgggct ccgcttacca attccactcc tggcgcgtct tcgtcctggt gtgtgctttc 720

cccagcgtct ttgctattgg cgccctgacc acccaacctg agagccctcg tttctttctg 780

gagaacggca agcacgacga ggcttggatg gtgctcaagc aggtgcatga caccaacatg 840

cgcgctaagg gccaccccga acgcgtcttc tccgtgaccc acatcaaaac catccatcag 900

gaagacgaac tcatcgagat ccagtccgac accggtactt ggtaccaacg ttggggcgtc 960

cgcgctctgt ccctgggtgg tcaggtgtgg ggcaacttcc tctcctgctt cggtcccgaa 1020

taccgccgca ttaccctgat gatgatgggt gtctggttca ccatgagctt ctcctactac 1080

ggcctcactg tgtggttccc cgacatgatc cgccatctgc aagccgttga ttacgcctct 1140

cgcaccaaag tcttccctgg cgagcgtgtg gagcacgtga ctttcaactt tactctcgaa 1200

aatcagatcc accgcggtgg tcaatacttc aacgataagt tcatcggcct ccgtctgaag 1260

tccgtcagct ttgaggatag cctgtttgag gagtgctact tcgaggacgt caccagctcc 1320

aacactttct tccgtaactg tactttcatt aacaccgtgt tctacaacac tgacctgttc 1380

gagtacaagt tcgtgaatag ccgtctcatt aacagcactt ttctccacaa caaagagggt 1440

tgccccctgg acgtcactgg taccggcgag ggtgcctaca tggtgtactt tgtctccttc 1500

ctcggcactc tggccgtgct ccccggtaac attgtctccg ccctgctcat ggacaagatt 1560

ggtcgtctcc gtatgctggc cggcagctcc gtgatgagct gtgtgtcctg cttcttcctg 1620

agctttggca actccgaatc cgccatgatc gctctgctgt gcctgttcgg cggtgtgtcc 1680

atcgccagct ggaacgccct ggatgtgctg accgtggaac tgtaccccag cgacaaacgt 1740

accactgctt tcggcttcct gaacgctctg tgcaagctgg ccgccgtcct gggtattagc 1800

atcttcacct ccttcgtcgg catcactaag gccgctccta tcctcttcgc ctccgctgcc 1860

ctggctctcg gcagctccct ggctctcaag ctgcccgaaa cccgcggcca ggtgctgcag 1920

Claims (6)

1.一种突触囊泡蛋白SV2A的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）过表达：将带有蛋白亲和纯化用标签的人源SV2A基因的第104-742位氨基酸通过病毒载体转入动物细胞，使其过表达；所述人源SV2A基因的碱基序列如SEQ ID NO. 1第4-1920位碱基序列所示；

2）溶解：裂解动物细胞，用相对于膜蛋白过量的正十二烷基β-D-麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐的混合溶液溶解膜蛋白；其中正十二烷基β-D-麦芽糖苷和胆固醇半琥珀酸三盐的质量浓度比是10:1；

3）纯化：离心，取上清使用亲和层析纯化，使用0.8-1.2mg/mL毛地黄皂苷溶液洗脱，再用分子筛进行再次纯化，得到SV2A蛋白；

步骤1）中的蛋白亲和纯化用标签是N-flag标签；

还包括对SV2A蛋白进行Nanodisc组装；

Nanodisc组装使用的膜支架蛋白是MSP2N2，组装时SV2A、MSP2N2、磷脂的质量比是1:4:100。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）是将带有蛋白亲和纯化用标签的人源SV2A基因的第104-742氨基酸通过病毒载体转入动物细胞1，扩增出病毒，再将此病毒感染动物细胞2，使其过表达；

所述动物细胞1是昆虫细胞；所述动物细胞2是high5细胞或HEK293细胞。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述动物细胞1为昆虫细胞sf9。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中的载体是Pfastbac载体。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中正十二烷基β-D-麦芽糖苷的浓度是0.02%(w/v)。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤3）的毛地黄皂苷溶液的浓度是1 mg/ml；

步骤3）的分子筛缓冲液pH为 7.4；和/或，含有25 mM Tris 、150mM NaCl、0.02%（w/v）正十二烷基β-D-麦芽糖苷、0.002%（w/v）胆固醇半琥珀酸三盐。