JPH04200390A - 無細胞ポリペプチド合成系によるポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、無細胞ポリペプチド合成系によりポリペプチ
ドを製造する方法に係わり、より詳細には反応系に連続
的に基質（ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸等）を供給し、生
成ポリペプチドおよびＡＭＰ。

ＧＤＰ、ビロリン酸塩、無機リン酸等のポリペプチド合
成生産物を系から取り出すことを特徴とするポリペプチ
ドの製造方法に関す、る。

なお、ここで言う無細胞ポリペプチド合成系はｎ＋ＲＮ
　Ａの情報を読み取ってリポゾーム上でポリペプチドを
合成する無細胞翻訳系、もしくはＤＮＡを鋳型としてＲ
ＮＡを合成する無細胞転写系と前記無細胞翻訳系の両者
を含むもののいずれかを言い、化学的合成法によるポリ
ペプチド合成系は含まない。

また、ここで言うポリペプチドはアミノ酸残基数が複数
のものを言い、タンパク質も含まれる。

「従来の技術」 無細胞翻訳系を用いたポリペプチドの製造方法としては
、従来、特許出願公表率１−５０３１１９号公報に記載
された方法が提案されている。

この方法は、内因性および外因性の天然または人工のｍ
ＲＮ　Ａを含み、ＡＴＰ、ＧＴＰおよびアミノ酸を基質
として含んでいるリボゾームの無細胞翻訳系において、
最終生産物、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ビロリン酸塩、無機リン
酸を含んでいる翻訳生産物を生成するポリペプチドの製
造法において、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ビロリン酸塩、無機リ
ン酸および最終生産物であるポリペプチドを含んでＬす
る翻訳生産物を、前記系から取り出し、それと同時にア
ミノ酸、ＡＴＰおよびＧＴＰの形態の基質をそれらの初
期濃度を維持するために前記系へ送り出オポリペプチト
の製造方法である。

第６図は、上記従来法において使用される製造装置を例
示するものであって、この装置は、限外ろ過器２を備え
、無細胞翻訳系を収容する反応槽ｌ内に、基質溶液タン
ク３から基質溶液４を連続的に供給し、反応Ｉ’ｌｌ内
で合成反応を生じさせ、反応槽１から反応生産物を含む
液５を取り出すように構成されている。基質溶液タンク
３は窒素ガス（Ｎ、ガス）により加圧され、基質溶液４
を反応槽ｌに圧送するとともに、反応槽ｌが加圧され、
限外ろ過器２を通して反応槽１内の反応生産物を含む液
を系外に取り出すようになっている。

［発明が解決しようとする課題Ｊ 従来の方法では、基質溶液４の送液と限外ろ過器を備え
た反応槽１への加圧には、窒素ガスを用いていたため、
系内に気体部分６か存在した。

これによって、送液を行おうとするとこの気体部分が圧
縮したり、膨張したりするため反応槽１の圧力を制御す
ることが困難であり、安定した基質の送液が行えなかっ
た。

また、反応槽１内の圧力を高くすることが不可能なため
、反応槽ｌ内に気泡が発生し、この気相と液相との界面
でタンパク質の変性か生じやすかった。

これらの理由により、上述した従来法ではポリペプチド
を合成する際の再現性が著しく悪かった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、気体を介
さずに送液を行うことにより、反応槽ｌ内の制御性や送
液の安定性を向上させ、ポリペプチドを合成する際の再
現性を向上させることのできるポリペプチドの製造方法
を提供することを目的としている。

「課題を解決するための手段」 かかる課題は、無細胞ポリペプチド合成系が収容された
反応槽に基質溶液を供給しつつ、該反応槽内でポリペプ
チド合成反応を生じさせ、該反応槽から反応生産物を取
り出してポリペプチドを連続的に製造する方法において
、上記反応槽内の気相の存在を最小限に制御しつつ合成
反応を生しさせること（こよって解ｌ肖される。

また上記基質溶液を、流路に気相を介在させずに液体を
圧送するポンプで反応槽内に連続的に圧送し、反応槽内
の下側に設けられｆニ限外ろ過器を通して反応生産物を
含む液を取り出しても良い。

さらに上記基質溶液を、上記ポンプで反応槽内に連続的
に圧送し、反応槽内の上側に設けられた限外ろ過器を通
して反応生産物を含む液を取り出すこともできる。

さらにまた、上記基質溶液を、上記ポンプで反応槽内に
連続的に圧送し、反応槽内の側方に設けられた限外ろ過
器を通して反応生産物を含む液を取り出すこともできる
。

以下、図面を参照して本発明の詳細な説明する。

本発明において使用される無細胞ポリペプチド合成系と
しては、リボゾーム、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ。

あるいはＤＮＡ等の本体と、アミノ酸、ＡＴＰ。

ＧＴＰ、ＣＴＰ、じＴＰ等の基質とを含み、これらを含
む溶液を、気相を含まない状態で反応槽ｌ内に収容した
ものか使用される。

上記合成系の本体は、合成系を２０〜４０℃の適宜な温
度に保つことにより、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴ
Ｐ、ＵＴＰ等を基質およびエネルギー源とし、ｍＲＮＡ
もしくはＤＮＡの情報を元に、ポリペプチドを合成する
。

合成されるポリペプチドとしては、各種の酵素やホルモ
ンなどのタンパク質等が合成可能である。

合成されるポリペプチドの種類は、合成系本体の情報に
よって決定される。

第１図は、本発明によるポリペプチドの製造方法の第１
の例を説明するための図である。この例では、無細胞ポ
リペプチド合成系ｌＯを気相を含まない状態で反応槽１
１に収容し、系内に気相を介することなく液体を圧送す
るポンプ１２によって基質溶液タンク１３内の基質溶液
１４を反応槽１１の上側から連続的に圧送し、反応槽Ｉ
ｆ内でポリペプチド合成反応を生じさせ、反応槽ＩＩの
下側に設けられた限外ろ過器１５を通して反応槽１１内
の反応生産物を含む液１６を系外に取り出し、反応生産
物を連続的に生産する。系外に取り出された反応生産物
を含む液は、フラクソヨンコレクターチューブ１７など
の採取容器に採取する。

なお反応槽１１内はマグネチックスターラーなどを用い
撹拌状態としても良い。

上記ポンプ１２は、系内に気相を介することなく、脈流
が少なく、圧力、流量の制御が可能なものか使用され、
プランジャーポンプ、ローラーチューブポンプ、ダイア
フラムポンプ、ベローズポンプ、ロータリーポンプなど
が使用され、より具体的には、高速液体クロマトグラフ
ィー用ポンプ、中圧液体クロマトグラフィー用ポンプ、
低圧液体クロマトグラフィー用ポンプが好適に使用され
る。

このポンプ１２による基質溶液の圧送量は、通常は一定
に設定されるが、反応時間の経過とともに圧送量を増加
させあるいは減少させても良い。

上記限外ろ過器１５は、反応槽ｌｌ内に収容されたりボ
ゾームやＲＮＡあるいはＤＮＡ等の合成系本体を透過さ
せることなく、合成されたポリペプチド、基質あるいは
その分解物（ＡＭＰ、ＧＭＰ。

ポリリン酸塩、無機リン酸塩なと）を透過させるような
孔径を有するろ過材を備えたものか使用される。

上記基質溶液タンク】３内の基質溶液１４は、１０°Ｃ
以下の温度で保存するのが望ましく、また反応槽ｌｌ内
は２０〜４０℃に保温するのが望ましい。

この例によるポリペプチドの製造方法では、基質溶液１
４を、流路に気相を介在させずに液体を圧送するポンプ
１２で反応槽１１内に連続的に圧送し、反応槽１１内の
下側に設けられた限外ろ過器１５を通して反応生産物を
含む液１６を取り出し、系内に気体部分を含まずに反応
生産物を連続的に生産することにより、反応槽ｌｌ内の
圧力制御や基質溶液１４の送液を安定して行うことがで
きる。

また、このことから反応槽１１内の圧力を高くすること
が可能となり、反応槽１１内での気泡の発生を抑えるこ
とが可能となる。従って気相と液相との界面で生じるタ
ンパク質の変性を防ぐことかできる。

これらのことからこの製造方法では、無細胞ポリペプチ
ド合成系においてポリペプチドを合成する際の再現性を
大巾に向上させることができる。

第２図は、本発明によるポリペプチドの製造方法の第２
の例を説明するための図である。この例では、上側に限
外ろ過器１５を設け、下側に基質溶液の供給口１９を設
けた反応槽１８を用い、この反応槽１８内に無細胞ポリ
ペプチド合成系を収納し、ポンプ１２により圧送される
基質溶液１４を供給口■９から導入し、上側の限外ろ過
器Ｉ５を通して反応生産物を含む液１６を系外に取り出
し、反応生産物を連続的に製造する方法である。

この第２の例では、反応槽１８の下側から基質溶液１４
を供給し、上側に限外ろ過器１５を設けて反応液を取り
出すようにしたので、万一反応槽１８内に気泡が生じて
も、気泡が直ちに上側の限外ろ過器１５を通って系外に
排出されるので、送液の供給量や系内の圧力制御を安定
に保ち、タンパク変性を防止する効果を一層確実にする
ことができ、ポリペプチドを合成する際の再現性をさら
ニ向上させることかできる。また反応槽１８内の気泡を
直ちに除去することか可能なことから、装置の運転が容
易となる。

第３図は、本発明によるポリペプチドの製造方法の第３
の例を説明するための図である。この例では、右側に限
外ろ過器１５を設け、左側に基質溶液の供給口を設けた
反応槽１１を用い、この反応槽ＩＩ内に無細胞ポリペプ
チド合成系を収納し、ポンプ１２により圧送される基質
溶液１４を導入し、上側の限外ろ過器１５を通して反応
生産物を含む液１６を系外に取り出し、反応生産物を連
続的に製造する。このようにしても反応槽ｌｌ内に気泡
が生じるのを防止できる。

なお、本発明においては、反応槽内の気泡発生を防ぐた
めに、次に記するような各種の気泡防止手段を用いるこ
ともできる。

■予め基質溶液を加熱、超音波処理または真空引きによ
り脱気する。

■基質溶液タンクとポンプの間に、減圧下ニ存在する特
殊合成高分子チューブ（溶液は透過せず、溶存ガスのみ
を透過させる高分子膜）を通すことにより脱気する。

■基質溶液かポンプに入る手Ｆｆで、基質溶液を反応槽
温度までもしくはそれ以上まで加熱し、発生し１こ気泡
をエアトラップにより分離する。

以下、実施例により本発明の効果を明確にする。

「実施例」 第１図に示す製造装置を構築し、ポリペプチド合成を実
施した。

無細胞ポリペプチド合成系としてはＺ　ｕｂａｙらの開
発した大腸菌の８３０抽出液を用いる転写翻訳共役系（
Ｚｕｂａｙ　Ｇ、　（１９７３）　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ
Ｇ　ｅｎｅｔ、　　７．２６７−２８７）を用い、ＣＡ
Ｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
）を合成させた。

■大腸菌Ｓ３０抽出液の調製 ７、　ｕｂａｙらの方法にしたがって、大腸菌Ａ、　１
９株（ｒｎａ、ｍｅｔ）から調製した。

■プラスミドＤＮＡ 転写翻訳共役系において、ＣＡＴを効率よく発現するよ
うに作製したプラスミドＤＮＡｐＡＣＬ６を用いた。

■連続無細胞タンパク質合成反応は、容１１１ｍ１の反
応槽で行った。ここに１７０μｍの大腸菌Ｓ３０抽出液
、■００μｇ　ｐＡＣＬ６　ＤＮＡ１１７４μｇｔＲＮ
Ａを含む、基質溶液（５５，０ｍＭ　　トリス酢酸溶液
（ｐＨ８，２）、１．６５ｍＭ　ＤＴＴ、Ｉ　。

２２ｍＭ　ＡＴＰ、０．８４ｍＭ　ＣＴＰ−ＧＴＰ−Ｕ
ＴＰ、２７．０ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸エステ
ル、１．９％ポリエチレングリコール−６０００，３４
，４μｇ／ａ＋１フォリン酸、０．６４　ｍＭ　３′、
５′−サイクリックＡＭＰ、３６．０ｍＭ酢酸アンモニ
ウム、７２．０ｍＭ酢酸カリウム、９　、７　ｍＭ酢酸
カルシウム、１０．０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３５
ｍＭ　のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸が反
応液として入っている。この反応槽を３７℃に加温し、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のポンプ（
東ソー社製、ＣＣＰＭ）を用いて基質溶液を反応槽に供
給し、同時に分画分子量１０万ダルトンの限外ろ過膜Ｙ
Ｍ１００（アミコン社製）を通して、反応生産物および
反応に用いられ１ニヌクレオチト、アミノ酸等の低分子
量の基質を反応液から取り出しに。なお基質溶液の供給
量は２ｍ１／時間に設定しｆコ。また基質溶液は約４°
Ｃて保存した。

以上のようなンステムを用い、１７時間にわたり無細胞
ポリペプチド合成系によりタンパク質（ＣＡＴ）の合成
を行った。基質溶液の供給は、１７時間にわたって極め
て安定していた。

単位時間当りのＣＡＴの合成量は流出液のＣＡＴ活性を
指標として見た。ＣＡＴ活性測定法は次の操作により行
った。

１）　１　、５　ｍｌのエッペンドルフチューブに［”
Ｃ］シクロムフェニコールを３　、７　ｋＢｑ、アセチ
ルＣＯＡ　（８０ｍｍｏｌ）とサンプル溶液を加え、最
終濃度０゜２Ｍトリス塩酸溶液（ｐＨ７，５）で全量を
１８０μｌとする。

２）３７８Ｃで３０分間インキユベーノヨンする。

３）水冷して反応を止め、ｌ　ｍｌの冷酢酸エチル（０
１＝　ｌ　ｍｇ／　ｍｌのクロラムフェニコールを含む
）を加え、数秒撹拌する。

４）静置した後、下層（水層）２００μｌを取り除く。

酢酸エチルを窒素ガスで蒸発させ、再び２０μｍの酢酸
エチルを加えて再溶解し、ワットマンＬＫ６ＤＦ　　Ｔ
ＬＣプレートにスポットする。

５）クロロホルム・メタノール（９４：８）で平衡化し
たタンク内で展開する。展開後プレートを乾燥させ、Ｈ
ｙｐｅｒｆｉｌｍ−βｍａＸなとのフィルムを用いオー
トラジオグラフィーを行う、ＣＡＴ活性によるが通常１
６時間以上露出させる。

このＣＡＴ活性測定法により反応液中のＣＡＴ活性を測
定しその結果を第４図に示した。第４図において１番左
のレーン［Ｓ］は供給する基質溶液の、１つおいてそれ
ぞれ５時間後Ｃ５］、８時間後［８］、１１時間後［１
１］、１４時間後［１４］、１７時間後［１７］の流出
液のＣＡＴアッセイである。

ＣＡＴの合成は各時間で安定して行なわれており、ＨＰ
　Ｌ　Ｃポツプによる基質溶液の供給によって、長時間
安定してタンパク合成を持続させることかできた。しか
も１７時間反応しｆコ後の反応液（Ｆ（）にちＣＡＴは
同様に存在し、１７時間反応後の反応液は依然として十
分なタンパク質合成能力を持−ていることが分かり、さ
らに長時間反応することが可能であると考えられる。

このようにして合成したＣＡＴを含し・流出液からＣＡ
ＴのアフィニティークロマトクラフィーによりＣＡＴを
精製した。この精製し１こＣＡＴを、１４〜６４６万ク
ルトンの分子量マーカーととしにＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動て分析し、クマジーブリリアントブルーで
染色した。その結果を第５図に示した。ＣＡＴ（分子Ｎ
２，５万ダルトンの三量体）に相当する位置に単一のバ
ンドが見られ、クマジーブリリアントブルーＣ−２５０
で十分に染色できる量のＣＡＴを、無細胞ポリペプチド
合成系から得ることができた。この結果からＣＡＴの合
成量はＯ、ｌ　ｍｇ程度と見積もることができた。

一発明の効果」 以上説明したように、本発明によるポリペプチドの製造
方法では、無細胞ポリペプチド合成系内に気体部分を存
在させずに基質溶液を連続的に圧送しつつ、反応生産物
を系外に取り出してポリペプチドを連続的に生産するこ
とにより、反応槽内の圧力制御や基質溶液の送液を安定
して行うことがてきる。

また、このことから反応槽内の圧力を高（することか可
能となり、反応槽内での気泡の発生を抑えることが可能
となる。従って気相と液相との界面で生じるタンパク質
の変性を防くことができる。

これらのことから、無細胞ポリペプチド合成系において
ポリペプチドを合成する際の再現性を大巾に向上させる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の無細胞ポリペプチド合成系によるポ
リペプチドの製造方法の第１の例を説明するための概略
構成図、第２図は、同ポリペプチドの製造方法の第２の
例を説明するための概略構成図、第３図は、同ポリペプ
チドの製造方法の第３の例を説明するための概略構成図
、第４図は、実施例の結果を示す図てＣＡＴ活性測定結
果を示す図、第５図は同実施例で製造しｔコＣＡ　Ｔの
電気泳動結果を示す図である。 第６図は、従来の無細胞翻訳系によるポリペプチドの製
造方法を説明するための概略構成図である。 １０・・・無細胞ポリペプチド合成系 １１．１８・・反応槽 １２・・・ポンプ １３・・・基質溶液タンク １４・・基質溶液 １５・・・限外ろ過器 １６・・反応生産物を含む液

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）無細胞ポリペプチド合成系が収容された反応槽に
   基質溶液を供給しつつ、該反応槽内でポリペプチド合成
   反応を生じさせ、該反応槽から反応生産物を取り出して
   ポリペプチドを連続的に製造する方法において、 上記反応槽内の気相の存在を最小限に制御しつつ合成反
   応を生じさせることを特徴とする無細胞ポリペプチド合
   成系によるポリペプチドの製造方法。
2. （２）上記基質溶液を、流路に気相を介在させずに液体
   を圧送するポンプで反応槽内に連続的に圧送し、反応槽
   内の下側に設けられた限外ろ過器を通して反応生産物を
   含む液を取り出すことを特徴とする請求項１に記載の無
   細胞ポリペプチド合成系によるポリペプチドの製造方法
   。
3. （３）上記基質溶液を、上記ポンプで反応槽内に連続的
   に圧送し、反応槽内の上側に設けられた限外ろ過器を通
   して反応生産物を含む液を取り出すことを特徴とする請
   求項１に記載の無細胞ポリペプチド合成系によるポリペ
   プチドの製造方法。
4. （４）上記基質溶液を、上記ポンプで反応槽内に連続的
   に圧送し、反応槽内の側方に設けられた限外ろ過器を通
   して反応生産物を含む液を取り出すことを特徴とする請
   求項１に記載の無細胞ポリペプチド合成系によるポリペ
   プチドの製造方法。