JPS6232881A - カンデイダ・ボイデイニからギ酸脱水素酵素を精製し、必要により回収する方法およびギ酸脱水素酵素含有生成物 - Google Patents
カンデイダ・ボイデイニからギ酸脱水素酵素を精製し、必要により回収する方法およびギ酸脱水素酵素含有生成物Info
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- JPS6232881A JPS6232881A JP61177899A JP17789986A JPS6232881A JP S6232881 A JPS6232881 A JP S6232881A JP 61177899 A JP61177899 A JP 61177899A JP 17789986 A JP17789986 A JP 17789986A JP S6232881 A JPS6232881 A JP S6232881A
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- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01002—Formate dehydrogenase (1.2.1.2)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
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- C12Y102/02—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a cytochrome as acceptor (1.2.2)
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/921—Candida
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はカンディダ・ボイディニ（Ｃ：ａｎｄｉｄａ
−ｂｏｉｄｉｎｉｉ）からギ酸脱水酵素（Ｆｏｒｍａｔ
ｅ −ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、 Ｆ Ｄ Ｈと略
称）を精製および回収する方法ならびに該酵素含有生成
物に関する。
−ｂｏｉｄｉｎｉｉ）からギ酸脱水酵素（Ｆｏｒｍａｔ
ｅ −ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、 Ｆ Ｄ Ｈと略
称）を精製および回収する方法ならびに該酵素含有生成
物に関する。
（従来の技術）
ギ酸脱水素酵素はカンディダ・ボイディニの細胞内部に
存在する。ＦＤ）Ｉを回収するには従来２つの異った方
法が用いられてきた。すなわち、その１つはヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー６２ （１
９７６）第１５１〜第１６０ページに開示されている方
法で、カンディダ・ボイディニを培養し、得られた細胞
を凍結し、リン酸塩含有水性媒質中に放置した後、機械
的に破砕（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅ） Ｌ／、細胞破
片を遠心除去し、残存蛋白質をストレプトマイシンサル
フェートにより沈殿させ、沈殿物を遠心除去し、その上
澄液をＤＥＡＥセルロース上のイオン交換クロマトグラ
フィーにかけて酵素を回収する。また、ジャーナル・オ
ブ・ケミカル・テクノロジー・エンド・バイオテクノロ
ジー３２ （１９８２）第１３０〜第１３７ページに記
載された方法、すなわち、カンディダ・ボイディニを培
養し、得られた細胞を機械的に破砕し、その＠濁液を相
形成物質としてポリエチレングリコールとリン酸カリウ
ムを有する水性２相系を用いる４段の相分配処理にかけ
る方法が他の方法として知られている。
存在する。ＦＤ）Ｉを回収するには従来２つの異った方
法が用いられてきた。すなわち、その１つはヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー６２ （１
９７６）第１５１〜第１６０ページに開示されている方
法で、カンディダ・ボイディニを培養し、得られた細胞
を凍結し、リン酸塩含有水性媒質中に放置した後、機械
的に破砕（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅ） Ｌ／、細胞破
片を遠心除去し、残存蛋白質をストレプトマイシンサル
フェートにより沈殿させ、沈殿物を遠心除去し、その上
澄液をＤＥＡＥセルロース上のイオン交換クロマトグラ
フィーにかけて酵素を回収する。また、ジャーナル・オ
ブ・ケミカル・テクノロジー・エンド・バイオテクノロ
ジー３２ （１９８２）第１３０〜第１３７ページに記
載された方法、すなわち、カンディダ・ボイディニを培
養し、得られた細胞を機械的に破砕し、その＠濁液を相
形成物質としてポリエチレングリコールとリン酸カリウ
ムを有する水性２相系を用いる４段の相分配処理にかけ
る方法が他の方法として知られている。
その他に、非細胞内酵素のポリエチレングリコールと結
合したトリアジン染料を含有する相中ての親和力分配に
ついて一連の報告か開示されている。例えば、グリブナ
ウら「親和力クロマトグラフィーおよび関連技術」 （
エルスビール社、アムステルダム１９８２）の第４９１
〜第５０１ページ（クロナーら）、パブリケーション・
才ブ・サード・ヨーロピアン・コンブレス・オブ・バイ
オテクノロジー（ミュンヘン、１９８４）第３０、第５
５７〜第５６４ページ（コーデスら）、ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー１３１（１９８
３）ｔｊＳ５８９〜第５９４ページ、ジャーナル・才ブ
・クロマトグラフィー２５９ （１９８３）第９７〜第
１０５ページ、アナリティカル・バイオケミストリー１
３６（１９８４）第２６４〜第２７１ベージおよびジャ
ーナル・オブ・クロマトグラフィー２９８（１９８４）
第４８３〜第４９３ページそれぞれに記載された報告で
ある。最終的には、アナリティカル・バイオケミストリ
ー１２４ （１９８２）第１１７〜第１２４ページには
出発物質としてパン酵母を用い、非細胞内酵素として用
いたフルクトースリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒ
ｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）をポリエチレングリコールによ
り沈殿させ、次いでデキストラン、ポリエチレングリコ
ールおよびポリエチレングリコールと結合したトリアジ
ン染料であるシバクロン−ブルー−３３Ｇ−Ａ （Ｃｉ
ｂａｃｒｏｎ−ｂｌｕｅ−Ｓ ３ Ｇ −Ａ ）からな
る水性２相系における相分配処理する方法が開示されて
いる。
合したトリアジン染料を含有する相中ての親和力分配に
ついて一連の報告か開示されている。例えば、グリブナ
ウら「親和力クロマトグラフィーおよび関連技術」 （
エルスビール社、アムステルダム１９８２）の第４９１
〜第５０１ページ（クロナーら）、パブリケーション・
才ブ・サード・ヨーロピアン・コンブレス・オブ・バイ
オテクノロジー（ミュンヘン、１９８４）第３０、第５
５７〜第５６４ページ（コーデスら）、ヨーロピアン・
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー１３１（１９８
３）ｔｊＳ５８９〜第５９４ページ、ジャーナル・才ブ
・クロマトグラフィー２５９ （１９８３）第９７〜第
１０５ページ、アナリティカル・バイオケミストリー１
３６（１９８４）第２６４〜第２７１ベージおよびジャ
ーナル・オブ・クロマトグラフィー２９８（１９８４）
第４８３〜第４９３ページそれぞれに記載された報告で
ある。最終的には、アナリティカル・バイオケミストリ
ー１２４ （１９８２）第１１７〜第１２４ページには
出発物質としてパン酵母を用い、非細胞内酵素として用
いたフルクトースリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒ
ｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）をポリエチレングリコールによ
り沈殿させ、次いでデキストラン、ポリエチレングリコ
ールおよびポリエチレングリコールと結合したトリアジ
ン染料であるシバクロン−ブルー−３３Ｇ−Ａ （Ｃｉ
ｂａｃｒｏｎ−ｂｌｕｅ−Ｓ ３ Ｇ −Ａ ）からな
る水性２相系における相分配処理する方法が開示されて
いる。
（発明か解決しようとする問題点）
しかし、公知の方法についてはギ酸脱水素酵素を精製お
よび必要により回収するに際しては精製段階の数を減ら
すことが要求されている。
よび必要により回収するに際しては精製段階の数を減ら
すことが要求されている。
（問題点を解決するための手段）
この目的に対して、本発明によれば
（ａ）酵素含有細胞を破砕し、
（ｂ）細胞物質を細胞液とともに相分配（親和力抽出）
処理し、 （Ｃ）酵素を必要により１．それか豊富に含まれる相か
ら分離し、かつ必要により回収するに当り、（ｂ）の段
階を 必要により細胞物質を予じめ分離することなく。
処理し、 （Ｃ）酵素を必要により１．それか豊富に含まれる相か
ら分離し、かつ必要により回収するに当り、（ｂ）の段
階を 必要により細胞物質を予じめ分離することなく。
必要により異質の蛋白質を予じめ分離することなく、
相分配をポリエチレングリコールまたはポリプロピレン
グリコールと結合したトリアジン染料か濃厚に存在する
１相を有する水性２相系で行うことを特徴とするカンデ
ィダ・ボイディニからギ酸脱水素酵素を精製し、かつ必
要によりそれを回収する方法か提供される。
グリコールと結合したトリアジン染料か濃厚に存在する
１相を有する水性２相系で行うことを特徴とするカンデ
ィダ・ボイディニからギ酸脱水素酵素を精製し、かつ必
要によりそれを回収する方法か提供される。
それ故、本発明によれば意外にもギ酸脱水素酵素は細胞
物質および異質の蛋白質を予じめ分離することなしに不
活性な水溶性ポリマーに結合したトリアジン染料を含有
する水性２相系での相分配て処理すれば精製できること
が見いだされたのである。
物質および異質の蛋白質を予じめ分離することなしに不
活性な水溶性ポリマーに結合したトリアジン染料を含有
する水性２相系での相分配て処理すれば精製できること
が見いだされたのである。
本発明による方法の１実施態様においては、カンディダ
・ボイディニの細胞は予め凍結してからリン酸塩含有水
性媒質中に懸濁し、懸濁液中に最大的９０．８５または
７５％の酵素流出が生じるまで放置し、その後得られた
＠濁液を相分配処理する。リン酸塩含有媒質はリン酸カ
リウムおよび／またはリン酸水素カリウム（Ｋ ＨＰ
Ｏ４および／またはＫＨ２ＰＯ４）を含有していてもよ
い。
・ボイディニの細胞は予め凍結してからリン酸塩含有水
性媒質中に懸濁し、懸濁液中に最大的９０．８５または
７５％の酵素流出が生じるまで放置し、その後得られた
＠濁液を相分配処理する。リン酸塩含有媒質はリン酸カ
リウムおよび／またはリン酸水素カリウム（Ｋ ＨＰ
Ｏ４および／またはＫＨ２ＰＯ４）を含有していてもよ
い。
カンディダ・ボイディニ細胞の破砕は必要ではない。本
発明のこの実施態様は細胞を凍結し、リン酸塩含有水性
媒質中に懸濁させるとＦＤＨが拡散しはじめ、大部分の
たん白質か細胞中に残存しつづけるのにＦＤＨは殆んど
完全に拡散してしまうという観察結果に基づくものであ
る。
発明のこの実施態様は細胞を凍結し、リン酸塩含有水性
媒質中に懸濁させるとＦＤＨが拡散しはじめ、大部分の
たん白質か細胞中に残存しつづけるのにＦＤＨは殆んど
完全に拡散してしまうという観察結果に基づくものであ
る。
最大的９０．８５または７５％の酵素流出後の媒質は他
のＦＤＨ回収工程の出発物質としても使用することがで
きる。すなわち、この媒質は未発明による相分配に必ず
使用せねばならないことはない。
のＦＤＨ回収工程の出発物質としても使用することがで
きる。すなわち、この媒質は未発明による相分配に必ず
使用せねばならないことはない。
本発明による方法のもう１つの実施態様によると、破砕
処理された細胞の懸濁液を加熱し、かつ再び冷却するこ
ともできる。結果として、一部の蛋白質が凝固し、細胞
物質とともに容易に除去することができる。さらに、脱
水素酵素またはキナーゼなどの熱に不安定なたん白質は
活性を失い、したがって配位子といかなる結合をもでき
なくなる。
処理された細胞の懸濁液を加熱し、かつ再び冷却するこ
ともできる。結果として、一部の蛋白質が凝固し、細胞
物質とともに容易に除去することができる。さらに、脱
水素酵素またはキナーゼなどの熱に不安定なたん白質は
活性を失い、したがって配位子といかなる結合をもでき
なくなる。
好ましくは、相形成物質として
（ａ）ポリエチレンゲルコールまたはポリプロピレング
リコールおよび （ｂ）粗デキストラン、デキストラン、メチルセルロー
スまたはフィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）を含有した水性２相
系が使用される。さもなければ、当業者には、例えばＤ
Ｅ−Ｃ−２６３９１２９，７およびそこに記載されてい
る文献からは適切な２相系を選択することか残されてい
る。
リコールおよび （ｂ）粗デキストラン、デキストラン、メチルセルロー
スまたはフィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）を含有した水性２相
系が使用される。さもなければ、当業者には、例えばＤ
Ｅ−Ｃ−２６３９１２９，７およびそこに記載されてい
る文献からは適切な２相系を選択することか残されてい
る。
トリアゾン染料の例は次のとおりである。
プロジオンイエローＨ−５Ｇ （Ｃ，１，１８’？’７
２）ＣＩｌ プロジオンイエローＨ−Ａ （Ｃ，１，１３２４５）プ
ロジオンブラウンＥ −２Ｇ （Ｃ，１，２６４４０）
プロジオンレッドＨ−３Ｂ （Ｃ，１，１８１５９）プ
ロジオンブルーＨ−Ｂ （Ｃ，１，６１２１１）プロジ
オンイエローＭＸ−６Ｇ （Ｃ，１，１８９７１）プロ
ジオンレッドＭＸ−２Ｂ （Ｃ，Ｌ １８１５８）Ｏ プロジオンルピンＭＸ−Ｂ （Ｃ，１，１７９６５）プ
ロジオンブルーレツトＭＸ−Ｇ （Ｃ，１，１７９０８
）プロジオンブルーＭＸ−Ｒ・ＣＣ，１，６１２０５）
プロジオンオレンジＭＸ−Ｇ プロジオンレッドＭＸ−５Ｂ プロジオンブルーＭＸ−３Ｇ プロジオンオレンジＨ−ＧＲ プロジオン グリーンＭＸ シバクロンブルー３ＧＡ染料の構造式 Ｒ１＝Ｈまたは５Ｏ３Ｎａ Ｒ２−ＳＯ３ＮａまたはＨ プロ７オンレノドＨＥ３ｂ染料の構造式％式％ ＨＥ３ｂ）が特に適している。トリアジン染料と不活性
水溶性重合体を結合させるには例えば、アナリティカル
・バイオケミストリー１２４（１９８２）第１１７〜第
１２４ページおよび下記の方法１か参考になる。この２
引用文献から得られる情報は他の不活性水溶性重合体に
ついても適用することができる。
２）ＣＩｌ プロジオンイエローＨ−Ａ （Ｃ，１，１３２４５）プ
ロジオンブラウンＥ −２Ｇ （Ｃ，１，２６４４０）
プロジオンレッドＨ−３Ｂ （Ｃ，１，１８１５９）プ
ロジオンブルーＨ−Ｂ （Ｃ，１，６１２１１）プロジ
オンイエローＭＸ−６Ｇ （Ｃ，１，１８９７１）プロ
ジオンレッドＭＸ−２Ｂ （Ｃ，Ｌ １８１５８）Ｏ プロジオンルピンＭＸ−Ｂ （Ｃ，１，１７９６５）プ
ロジオンブルーレツトＭＸ−Ｇ （Ｃ，１，１７９０８
）プロジオンブルーＭＸ−Ｒ・ＣＣ，１，６１２０５）
プロジオンオレンジＭＸ−Ｇ プロジオンレッドＭＸ−５Ｂ プロジオンブルーＭＸ−３Ｇ プロジオンオレンジＨ−ＧＲ プロジオン グリーンＭＸ シバクロンブルー３ＧＡ染料の構造式 Ｒ１＝Ｈまたは５Ｏ３Ｎａ Ｒ２−ＳＯ３ＮａまたはＨ プロ７オンレノドＨＥ３ｂ染料の構造式％式％ ＨＥ３ｂ）が特に適している。トリアジン染料と不活性
水溶性重合体を結合させるには例えば、アナリティカル
・バイオケミストリー１２４（１９８２）第１１７〜第
１２４ページおよび下記の方法１か参考になる。この２
引用文献から得られる情報は他の不活性水溶性重合体に
ついても適用することができる。
本発明はまた相形成物質として
（ａ）相形成物質としてポリエチレングリコールまたは
ポリプロピレングリコールおよび（ｂ）粗デキストラン
、デキストラン、メチルセルロースまたはフィコルを有
し、配位子としてポリエチレングリコールまたはポリプ
ロピレングリコールと結合したトリアジン染料（プロシ
オン−レッド−ＨＥ３ｂなど） を有する水性２相系を用いて、濃厚な酵素を含有°する
上部相を下部相から分離し、これに塩、特にリン酸カリ
ウムおよび／またはリン酸水素カリウムを添加し、得ら
れた２相系の下部相へ酵素を移動させ、必要により酵素
を塩類および相形成物質から分離（特に限外ろ過により
）する方法に関するものである。
ポリプロピレングリコールおよび（ｂ）粗デキストラン
、デキストラン、メチルセルロースまたはフィコルを有
し、配位子としてポリエチレングリコールまたはポリプ
ロピレングリコールと結合したトリアジン染料（プロシ
オン−レッド−ＨＥ３ｂなど） を有する水性２相系を用いて、濃厚な酵素を含有°する
上部相を下部相から分離し、これに塩、特にリン酸カリ
ウムおよび／またはリン酸水素カリウムを添加し、得ら
れた２相系の下部相へ酵素を移動させ、必要により酵素
を塩類および相形成物質から分離（特に限外ろ過により
）する方法に関するものである。
好ましくは、配位子を含有する上部相は再度使用され、
かつ好ましくはポリエチレングリコールまたはポリプロ
ピレングリコールを酵素が移動した下部相へ添加し、得
られた２相系の上部相を先に分離した上部相と合体して
再度使用する。
かつ好ましくはポリエチレングリコールまたはポリプロ
ピレングリコールを酵素が移動した下部相へ添加し、得
られた２相系の上部相を先に分離した上部相と合体して
再度使用する。
相形成物質および塩類を含有しない液体媒質中に存在す
る酵素をサッカロース（ショ糖）の存在下で凍結乾燥す
ることは得られた生成物か貯蔵安定性にすぐれるから有
利である。本発明は最後にこのサッカロースを含有する
ギ酸脱水素酵素固型生成物に関する。
る酵素をサッカロース（ショ糖）の存在下で凍結乾燥す
ることは得られた生成物か貯蔵安定性にすぐれるから有
利である。本発明は最後にこのサッカロースを含有する
ギ酸脱水素酵素固型生成物に関する。
本発明に使用されるトリアジン染料と不活性水溶性重合
体の結合物は下記の方法により調製することができる。
体の結合物は下記の方法により調製することができる。
友仄ユ
第１段：塩素化。出発物質として、例えば分子Ｆｆｒ４
００１５００４０００６０００士たは１００００を有す
るモノメトキシ−ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）
またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（以下ＰＥＧ
と略称）を使用する。固体のＰＥＧまたはＭＰＥＧは乾
燥室内において７０°Ｃで夜通し溶融する。次いで溶融
ＰＥＧまたはＭＰＥＧは随意に真空下で脱水する。塩素
化は回転蒸発器中において５０モル過剰のチオニルクロ
ライドを用い７０℃で行う。操作はＨＣｊｌ生成の危険
をさけるため絶対無水状態で行わねばならないから、反
応容器に窒素ガスを満たし、冷却器に乾燥管を設置する
。約８時間後に反応は完了する。過剰のチオニルクロラ
イドは真空下で除去する。
００１５００４０００６０００士たは１００００を有す
るモノメトキシ−ポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）
またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（以下ＰＥＧ
と略称）を使用する。固体のＰＥＧまたはＭＰＥＧは乾
燥室内において７０°Ｃで夜通し溶融する。次いで溶融
ＰＥＧまたはＭＰＥＧは随意に真空下で脱水する。塩素
化は回転蒸発器中において５０モル過剰のチオニルクロ
ライドを用い７０℃で行う。操作はＨＣｊｌ生成の危険
をさけるため絶対無水状態で行わねばならないから、反
応容器に窒素ガスを満たし、冷却器に乾燥管を設置する
。約８時間後に反応は完了する。過剰のチオニルクロラ
イドは真空下で除去する。
第２段ニアミノ化、塩素化ＰＥＧまたはＭＰＥＧはガラ
ス製オートクレーブ（１，５１容）中で大過剰のアンモ
ニア水（２５％）中に溶解する。反応容器は容量の約３
／４まで満たすべきて、その後気密に密封する。続いて
アミノ化を油浴中１１０°Ｃにおいて約３０分間行う０
反応生ｒ＆物は回転蒸発中で過剰のアンモニアを除去し
っつ濃縮する。
ス製オートクレーブ（１，５１容）中で大過剰のアンモ
ニア水（２５％）中に溶解する。反応容器は容量の約３
／４まで満たすべきて、その後気密に密封する。続いて
アミノ化を油浴中１１０°Ｃにおいて約３０分間行う０
反応生ｒ＆物は回転蒸発中で過剰のアンモニアを除去し
っつ濃縮する。
第３段二カップリング。トリアジン染料（例えばプロシ
オン−レッド−ＨＥ３ｂ）１モルを上記アミノ化により
得たアミン１モル中へ添加する。次いてｐＨを１１に調
整し、反応を６０°Ｃで約２４時間行わせる０反応生成
物は染料を分離するためゲルろ過（セファデックス−Ｇ
５０）処理し、その後透析する。
オン−レッド−ＨＥ３ｂ）１モルを上記アミノ化により
得たアミン１モル中へ添加する。次いてｐＨを１１に調
整し、反応を６０°Ｃで約２４時間行わせる０反応生成
物は染料を分離するためゲルろ過（セファデックス−Ｇ
５０）処理し、その後透析する。
（実施例）
本発明を実施例に基づき、さらに詳細に説明する。
実施例１
第１段：懸濁液調製、凍結酵母１０ｋｇをリン酸カリウ
ム緩衝液中にプロペラ攪拌機を用いて夜通し懸濁させた
。液は容量で４０％の細胞、１０％のギ酸アンモニウム
および０．１モルのリン酸カリウムを含有し、全量は２
５ｆＬであった。翌朝、酵素活性を測定した。
ム緩衝液中にプロペラ攪拌機を用いて夜通し懸濁させた
。液は容量で４０％の細胞、１０％のギ酸アンモニウム
および０．１モルのリン酸カリウムを含有し、全量は２
５ｆＬであった。翌朝、酵素活性を測定した。
第２段：熱変性、細胞懸濁液を温浴（７５℃）中で加熱
し、攪拌しながら６０°Ｃに保持した。温度は反応容器
中に入れた温度計により監視した。
し、攪拌しながら６０°Ｃに保持した。温度は反応容器
中に入れた温度計により監視した。
昇湿時間は約１５分であった。細胞懸濁液は６０°Ｃて
約１０分間保持後、氷水中で室温まで冷却した。
約１０分間保持後、氷水中で室温まで冷却した。
第３段：親和力分配。次のとおり秤取し、混合した。
９％ＰＥＧ１００ＯＯ（ＰＥＧ−
レッドにより希釈）（Ｙ均分子量
１００００のポリエチレングリ
４コール） ４３５６ｋｇ
４３ミリモルＭＰＨＧ−レッド （平均分子量５０００のモノ メトキシ−ポリエチレングリコ ールと結合したプロジオン− レッド−ＨＥ３ｂ、水溶液） １２４０ｋｇ１％
粗デキストラン（１０％溶液）０．５００ｋｇ２５２４
０％細胞懸濁液（密度＝ １ 、０７６ ｋｇ／ ｌ ） ２６００
０ ｋｇ水を加えて ５０
ｋｇ系はブレード攪拌機を用いて３０分間十分混合した
。その際、過度の泡が形成しないよう注意した０次いで
、系をノズル分離器（直径０．４ｍｍのノズル４本）に
より５００ ｍｌ１分の流速で分離した。相の純度は上
部相で９５％、下部相で９０％であった。ゼラチン状の
下部相は捨てた。
４３ミリモルＭＰＨＧ−レッド （平均分子量５０００のモノ メトキシ−ポリエチレングリコ ールと結合したプロジオン− レッド−ＨＥ３ｂ、水溶液） １２４０ｋｇ１％
粗デキストラン（１０％溶液）０．５００ｋｇ２５２４
０％細胞懸濁液（密度＝ １ 、０７６ ｋｇ／ ｌ ） ２６００
０ ｋｇ水を加えて ５０
ｋｇ系はブレード攪拌機を用いて３０分間十分混合した
。その際、過度の泡が形成しないよう注意した０次いで
、系をノズル分離器（直径０．４ｍｍのノズル４本）に
より５００ ｍｌ１分の流速で分離した。相の純度は上
部相で９５％、下部相で９０％であった。ゼラチン状の
下部相は捨てた。
第４段：酵素−配位子の分離、上部相
（３８，５７文）をリン酸カリウム９％液（重量／容量
、ＰＥＧ１００００の１０．５％とリン酸カリウム９．
９％よりなる系）と混合し、塩が溶解後もさらに１０分
間攪拌を続けた後、ディスク分離器（ノズル長１４５ｍ
ｍ）中で４００ｍ文／分の流速で分離を行った。両相の
純度は１００％台であった。上部相は再用するため一２
０’Ｃに保持した。下部相はＰＥＧ１００ＯＯの１％液
と混合し、その溶解後再度分離器中で４００ｍＪＬ／分
で分離させた。上部相は最初のＰＥＧ／塩系の上部相と
ともに貯蔵した。
、ＰＥＧ１００００の１０．５％とリン酸カリウム９．
９％よりなる系）と混合し、塩が溶解後もさらに１０分
間攪拌を続けた後、ディスク分離器（ノズル長１４５ｍ
ｍ）中で４００ｍ文／分の流速で分離を行った。両相の
純度は１００％台であった。上部相は再用するため一２
０’Ｃに保持した。下部相はＰＥＧ１００ＯＯの１％液
と混合し、その溶解後再度分離器中で４００ｍＪＬ／分
で分離させた。上部相は最初のＰＥＧ／塩系の上部相と
ともに貯蔵した。
第５段：限外ろ過。下部相（２７，３！；Ｌ）から１８
１６ ’Ｍ ｋ ｒｇ ＆ ＋１ 工４ １／
’／ ／ｆ １１ １− １し３ ゴーｔｈ Ｉｋｌ
ｉＸ（ろ過量５０文／時間）て除去し、容量５．２８文
まで濃縮した。続いて、第２の毛管膜装置中で濃縮し、
最終容量ｌ立にした。
１６ ’Ｍ ｋ ｒｇ ＆ ＋１ 工４ １／
’／ ／ｆ １１ １− １し３ ゴーｔｈ Ｉｋｌ
ｉＸ（ろ過量５０文／時間）て除去し、容量５．２８文
まで濃縮した。続いて、第２の毛管膜装置中で濃縮し、
最終容量ｌ立にした。
第６段：凍結乾燥。限外ろ過で得られた液に１７１ｇの
サッカロースを添加した次いで凍結乾燥を冷凍乾燥器中
で行った。凍結乾燥物１ ｍ ｇあたり０．２３Ｕ
ＦＤＨの活性度を有する生成物か得られた。
サッカロースを添加した次いで凍結乾燥を冷凍乾燥器中
で行った。凍結乾燥物１ ｍ ｇあたり０．２３Ｕ
ＦＤＨの活性度を有する生成物か得られた。
実施例２
４３ミリモルＭＰＥＧ−レッドの代りに４００ミリモル
ＭＰＨＧ−ブルー（モノメトキシ−ポリエチレングリコ
ールに結合したシバクロン−ブルー３Ｏ−Ａ）を用いる
以外は実施例１と同じ操作をくり返した。実施例１に比
べて活性度および収率が低い結果が得られた。
ＭＰＨＧ−ブルー（モノメトキシ−ポリエチレングリコ
ールに結合したシバクロン−ブルー３Ｏ−Ａ）を用いる
以外は実施例１と同じ操作をくり返した。実施例１に比
べて活性度および収率が低い結果が得られた。
Claims (11)
- （１）（ａ）酵素含有細胞を破砕し、 （ｂ）相分配（親和力分配）を行い、 （ｃ）必要により酵素をそれが濃厚に存在する相から分
離し、かつ必要により回収するに当り、（ｂ）の段階を
必要により細胞および細胞破片を予じめ分離することな
く、 必要により異質の蛋白質を予じめ分離することなく、 相分配を不活性水溶性重合体と結合したトリアジン染料
（配位子）が濃厚に存在する１つの相を有する水性２相
系において行うことを特徴とするカンディダ・ボイディ
ニ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）からギ酸脱水
素酵素を精製し、かつ必要により回収する方法。 - （２）カンディダ・ボイディニの細胞を予じめ凍結した
後、リン酸塩含有水性媒質、特にリン酸カリウムおよび
／またはリン酸水素カリウムを含有する媒質中に懸濁し
最大約９０．８５または７５％（ギ酸脱水素酵素活性度
）の酵素流出が生じるまで放置し、得られた懸濁液を随
意に相分配処理することを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （３）細胞が破砕されていないことを特徴とする請求の
範囲第２項記載の方法。 - （４）得られた細胞破砕懸濁液を加熱し、次いで再度冷
却してから相分配処理することを特徴とする特許請求の
範囲第１、第２または第３項記載の方法。 - （５）ａ）ポリエチレングリコールまたはポリプロピレ
ングリコールおよび ｂ）粗デキストラン、デキストラン、メチルセルロース
またはフィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）を相形成物質とする水
性２相系を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１
、第２、第３または第４項に記載の方法。 - （６）配位子としてポリエチレングリコールまたはポリ
プロピレングリコールに結合したプロシオン−レッド−
ＨＥ３ｂ（Ｐｒｏｃｉｏｎ−ｒｅｄ−ＨＥ３ｂ）を使用
することを特徴とする特許請求の範囲第１、第２、第３
、第４、第５または第６項に記載の方法。 - （７）特許請求の範囲第５項または第６項記載の２相系
使用に際し、濃厚な酵素を含有する上部相を下部相から
分離し、該相へ塩、特にリン酸カリウムおよび／または
リン酸水素カリウムを添加し、得られた２相系の下部相
へ酵素を移動させ、所望ならば酵素を塩類および相形成
物質から分離（特に限外ろ過により分離）することを特
徴とする特許請求の範囲第５項または第６項記載の方法
。 - （８）配位子を含有する上部相を再度使用することを特
徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 - （９）ポリエチレングリコールまたはポリプロピレング
リコールを酵素が移動した下部相へ添加し、得られた２
相系の上部相を請求の範囲第７項記載事項により分離し
た上部相に合体し、次いでこれを再度使用することを特
徴とする特許請求の範囲第７項または第８項記載の方法
。 - （１０）特許請求の範囲第７項記載事項により、相形成
物質および塩類が含まれない液体媒質中に存在する酵素
をサッカロースの存在下で凍結乾燥することを特徴とす
る特許請求の範囲第１、第２、第３、第４、第５、第６
、第７、第８または第９項に記載の方法。 - （１１）ある量のサッカロースを含有し、特許請求の範
囲第１０項記載事項により得られるギ酸脱水素酵素含有
固型生成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853527268 DE3527268A1 (de) | 1985-07-30 | 1985-07-30 | Verfahren zur reinigung und gegebenenfalls gewinnung von formiat-dehydrogenase (fdh) aus candida boidinii und fdh-haltiges produkt |
| DE3527268.6 | 1985-07-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6232881A true JPS6232881A (ja) | 1987-02-12 |
Family
ID=6277169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61177899A Pending JPS6232881A (ja) | 1985-07-30 | 1986-07-30 | カンデイダ・ボイデイニからギ酸脱水素酵素を精製し、必要により回収する方法およびギ酸脱水素酵素含有生成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4879234A (ja) |
| EP (1) | EP0210532B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6232881A (ja) |
| AT (1) | ATE70298T1 (ja) |
| DE (2) | DE3527268A1 (ja) |
| DK (1) | DK360786A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| US6001590A (en) * | 1995-09-12 | 1999-12-14 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Promoter and terminator sequences of formate dehydrogenase gene of Candida boidinii |
| US6020373A (en) * | 1995-10-20 | 2000-02-01 | Eastern Virginia Medical School | Chelate derivatives as protectors against tissue injury |
| EP1463807A4 (en) | 2001-12-19 | 2006-04-12 | Bristol Myers Squibb Co | FORMATHYDROGENASE FROM PICHIA PASTORIS AND USES THEREOF |
| DE102008013490A1 (de) * | 2008-03-10 | 2009-09-17 | Bayer Technology Services Gmbh | Verfahren zur Reinigung therapeutischer Proteine |
| WO2014029012A1 (en) * | 2012-08-23 | 2014-02-27 | Stemcell Technologies Inc. | Compositions and methods for rapid and reversible biomolecular labeling |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3133001A (en) * | 1959-11-26 | 1964-05-12 | Muset Pedro Puig | Stabilization of enzymes |
| FR2252351A2 (en) * | 1973-11-28 | 1975-06-20 | Air Liquide | Isolation of enzymes by selective extraction - partition of polyinhibitor-enzyme complex between water and polyethylene glycol |
| DE2712004C2 (de) * | 1977-03-18 | 1979-05-23 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Formiat oder in Formiat überführbaren Verbindungen und hierfür geeignetes Reagens |
| SE8302483L (sv) * | 1983-05-02 | 1984-11-03 | Pharmacia Ind | Forfarande vid rening av biologiskt aktiva substanser |
-
1985
- 1985-07-30 DE DE19853527268 patent/DE3527268A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-15 AT AT86109675T patent/ATE70298T1/de active
- 1986-07-15 DE DE8686109675T patent/DE3682844D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-15 EP EP86109675A patent/EP0210532B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-29 DK DK360786A patent/DK360786A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-07-30 JP JP61177899A patent/JPS6232881A/ja active Pending
- 1986-07-30 US US06/891,868 patent/US4879234A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE70298T1 (de) | 1991-12-15 |
| DK360786A (da) | 1987-01-31 |
| DE3682844D1 (de) | 1992-01-23 |
| EP0210532A2 (de) | 1987-02-04 |
| US4879234A (en) | 1989-11-07 |
| DK360786D0 (da) | 1986-07-29 |
| DE3527268A1 (de) | 1987-02-05 |
| EP0210532B1 (de) | 1991-12-11 |
| EP0210532A3 (en) | 1988-09-21 |
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