NO157787B - Korrosjonshindrende, sinkrik maling inneholdende manganomanganioksyd-rkpigment. - Google Patents

Abstract

Maling pigmentert med en kombinasjon av sink og manganomanganioksyd-røyk eller et materiale som hovedsaklig inneholder manganomanganioksyd-røyk. Malingen har en fremragende korrosjonsinhiberende virkning.

Description

Fremgangsmåte til rensning av humant eller

animalsk plasminogen.

Nærværende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte til rensing av urent plasminogen.

Det er kjent at plasminogen fra mennesker kan renses ved en modi-fikasjon av Kline-metoden, fulgt av enten gel-filtrering gjennom dekstrahkol-onner, eller ved kromatografi på DEAE-dekstrankolonner (dietylaminoetyl-dékstran)

Videre har plasminogen fra mennesker også vært renset ved hjelp

av dietylaminoetylcellulosé-ioneutbyttere, idet lysin har vært anvendt for å drive ut plasminogen frå kolonnene før utdrivningen av de uønskede forurens-ninger i form av andre proteiner.

DEAE-cellulose kan således suspenderes i en ammoniumacetat-buffer-løsning på pH omkring 9 og inneholdende lysin ved en konsentrasjon av

Cf, 01 M, hvoretter plasminogen fra mennesker, som allerede er blitt delvis renset, oppløses i denne buffer og tilføres en kolonne som inneholder ovennevnte suspensjon. Når kolonnen blir eluert med ammoniumacetatbuffer som inneholder lysin, fremkommer en fraksjon som inneholder storparten av den kaseinolytiske og fibrinolytiske aktivitet, men bare en liten del av de øvrige proteiner.

Det er videre blitt fastslått at dekstran er i stand til å danne to-fase-systemer med andre polymerer. Som et eksempel: Når 5 g "Dekstran G 25" og 5 g polyetylenglykol som har en molekylvekt på 6000, tilsettes til 100 ml vann og det resulterende system blir ristet eller rørt, vil systemet skille seg i to faser etter sentrifugering etter noen tids henstand. Den øvre fase består hovedsakelig av polyetylenglykol, mens storparten av den lavere fase er "Dekstran G 25". Det er også fastslått at mange proteiner løses i dekstranpolyetylenglykolsystemet, og at distribusjonen av proteiner mellom de to faser avhenger av mol-vekt-forholdet av polymerene og også i høy grad av saltinnholdet. Således kan et protein overføres fra en fase til en annen bare ved å forandre ione - sammensetningen av fasesystemet.

I overensstemmelse med nærværende oppfinnelse er det nå funnet at urent plasminogen fra mennesker eller dyr kan renses i betydelig grad ved at det til en oppløsning av plasminogenet i vilkårlig rekkefølge tilsettes en med plasminogenet for likelig alifatisk aminosyre, en anion-utbytter og et med vann blandbart høymolekylært stoff, hvoretter den med renset plasminogen anrikede høymolekylære fase isoleres.

Det er funnet at når urent plasminogen behandles på ovennevnte måte; virker den alifatiske aminosyre til å konsentrere plasminogenet i den fase som inneholder den vannblandbare høymolekylære forbindelse, mens storparten av forurensningen blir konsentrert i anion-utbytterfasen. Den anvendte aminosyre må naturligvis være blandbar med plasminogen, dvs. den må velges blant de alifatiske aminosyrer, som ikke deaktiverer eller denaturerer plasminogenet.

Tofase-systemet som dannes av den vann-blandbare høymolekylære forbindelse og anionutbytter , kan være et væske/væske system eller et væske/ fast stoff system, avhengig av den spesifikke høymolekylære forbindelse og den anionutbytter som anvendes. Hvis det dannes et to-faset væske-system, vil det-rensede plasminogen bli konsentrert i den øvre fase. som vesentlig består av den vann-blandbare høymolekylære forbindelse. Eksempelvis vil i systemet polyetylenglykol/dekstran/plasminogen bli funnet i den øvre polyetylenglykol fase. Hvis det for eksempel brukes en anionutbytter av den faste "Amberlite<u->type, som "IRA - 400", sammen med f. eks. polyetylenglykol,

vil plasminogenet også konsentreres i polyetylenglykol-fasen, og den faste

anionutbytter vil samle seg som en fast bunnfase.

Plasminogenets konsentrering i den øvre fase er av betydelig praktisk fordel, fordi denne fase har en forholdsvis lav viskositet og derfor er grei å håndtere. Hvis den anvendte anionutbytter er av dekstrantypen, vil den lavere fase ofte ligne meget en gel, og er således vanskelig å håndtere. Når en "Amberlite" anion-utbytter blir brukt, vil den undre fase være fast.

I motsetning til rensing på dekstrankolonner som i alminnelighet er vanskelige å håndtere i teknisk målestokk på grunn av små flytehastigheter, er det fordelaktig å bruke et tofase system som ved porsjonsvis drift kan ad-skilles i to faser. I henhold til oppfinnelsen kan der også oppnås betydelig bedre utbytte sammenlignet med de tradisjonelle rensemetoder.

Når plasminogen fra mennesker eller dyr blir renset på den ovenfor beskrevne måte, er den oppnådde renhetsgrad tilstrekkelig høy til alminnelig anvendelse, og videre rensing blir således overflødig. Det plasminogen som er blitt renset i henhold til metoden ut fra nærværende oppfinnelse, kan således brukes direkte til aktivering av plasmin uten det relativt høye antall av løsning og påfølgende bunnfelling, som i alminnelighet er nødvendig for å rense et plasminogen som er utfelt fra blodserum.

Som ovenfor nevnt kan anionutbytteren velges blant flere typer, hvor-av kan nevnes anionutbyttere av dekstrantype, f. eks. såkalt DEAE-dekstran, og anionutbytter-harpikser av den velkjente "Amberlite"serie, for eksempel "Amberlite IRA - 400", og en anionutbytter av cellulosetypen, for eksempel DEAE -cellulose.

Den vannblandbare høymolekylære forbindelse som er anvendt i nærværende fremgangsmåte for å danne den øvre fase i to-fasesystemet, kan og-så velges blant et stort antall forbindelser, som f. eks. polyetylenglykol, po-lyvinylpyr rolidon og metylcellulose. I sammenheng med en anionutbytter - fase som består av DEAE-dekstran, har man funnet anvendelse av polyetylenglykol særlig skikket til å danne den annen fase. Foretatte eksperimenter synes å indikere at polyetylenglykol også er effektivt i tilfelle av "Amberlite" anionutbyttere.

De alifatiske aminosyrer som kan anvendes i den hensikt å distribu-ere plasminogenet mellom de to faser hvortil er referert i det foregående, er sådanne aminosyrer som lysin, * -aminosmør syre, ornitin, fe-aminokapron-syre og arginin, blitt funnet å være særlig passende, spesielt lysin. Der kan imidlertid brukes også andre alifatiske aminosyrer, f.eks. glysin, guanidino-eddiksyre , kreatin, fi -alanin, DL-valin, DL-leucin, DL-isoleucin, DL-nor-leucin, L(+)-aspartinsyre , L(+)-citrullin, et-N-acetyl-L-arginin og glysyl-glysin.

Når man utfører fremgangsmåten i henhold til nærværende oppfinnelse, foretrekker man i praksis å anvende en alifatisk aminosyre av den type som har en endestillet aminogruppe og en endestillet karboksylgruppe i hovedkjeden av molekylet, fortrinnsvis med 5 til 6 karbonatomer i hovedkjeden.

De relative mengder av aminosyre, vannløselig høymolekylær forbindelse og anioneutbytter kan variere betraktelig, avhengig av hvilke spesifikke forbindelser som er valgt i hvert tilfelle. Et eksperiment i liten labo-ratorieskala vil imidlertid i alminnelighet være tilstrekkelig til å fastslå de passende relative mengder av ovenstående forbindelser. Med hensyn til den høymolekylære forbindelse må det imidlertid bemerkes at hvis der velges en relativt lav molkylvekt, f. eks. på polyetylenglykolet, må forbindelsen som regel brukes i relativt høye konsentrasjoner.

Det foretrekkes å bruke anionutbytter i mengder som ligger fra omtrent 0.1 til omtrent 10% av utgangsløsningen av plasminogen. Hvis anionutbytteren er en harpiks, kan det være ønskverdig å bruke denne i enda høy-ere konsentrasjon, f. eks. opp til 30%. Grunnen til det er at harpiksen ikke sveller så mye som de øvrige nevnte typer av anionutbyttere, slik at harpiksen ikke vil binde så meget av vannfasen som de andre nevnte typene av anionutbyttere gjør. Mengden av vann-løselig høymolekylær forbindelse avhenger av naturen av den spesifikke forbindelse som er anvendt, og i særdeleshet av dens molekylvekt. Aminosyren brukes fortrinsvis i en mengde som er mindre enn omtrent 1 mol pr. liter av utgangsløsningen av plasminogen.

Det plasminogen som skal renses, kan være av menneskelig eller dyrisk opprinnelse. Fortrinsvis brukes plasminogen som er isolert av griseblod. Plasminogenet kan da utfelles fra serum eller plasma av griseblod ved å fortynne 4 til 7 ganger med vann ved en pH-verdi på 5 - 6, slik som åpen-bart i Norsk Patentsøknad nr. 151080. Videre kan fremgangsmåten etter oppfinnelsen anvendes til rensing av plasminogen som er blitt utfelt fra serum eller plasma av griseblod, ved å tilsette et organisk løsningsmiddel slik som etanol i en mengde på minst 10% ved en pH på 5 - 9 og ved en temperatur mellom blandingens frysepunkt og omtrent 15°C. Denne fremgangsmåte er åpen-bart i Norsk Patentsøknad nr. 154077.

I de følgende eksperimenter ble det tilsatt lysin og deretter dietylaminoetyldekstran og polyetylenglykol (mol-vekt 6000) til 20 ml's porsjoner av plasminogenløsninger som var laget av plasminogen utfelt fra griseserum ved 0°C og pH lik 6. 0 ved hjelp av 20%-ig etanol. pH ble innstillet til en gitt verdi, og løsningen ble henstillet i 10 minutter ved romtemperatur og ble så sentrifugert ved den samme temperatur. Den øvre. fase ble adskilt og volumet av den ble målt, hvoretter denne fase ble analysert på følgende måte: Plasminaktiviteten ble bestemt etter aktivering av plasminogen med urokinase, og den totale plasminaktivitet ble så beregnet i prosent av plasminaktiviteten hos den originale plasminogenløsning. Den prosent som således er beregnet, er lik utbyttet Y i den nærværende fremgangsmåte.

Proteinkonsentrasjonen ble bestemt som tyrosin + tryptofan ved

280 nyVi 0. 1 N NaOH ved å måle den optiske tetthet (OD2gQ) hos eksperi-mental-løsningen sammenlignet med den optiske tetthet hos standardløsnin-gen som inneholder varierende kjente proteinmengder.

Plasminaktiviteten ble beregnet som antall plasminenheter ved OD^gQ, idet den eksperimentelle optiske tetthet ble korrigert ved hjelp av blindver-dien, dvs. OD^gQ hos det system som i det hele tatt ikke inneholder protein. Effektiviteten for rensing av plasminogen ble beregnet som den såkalte anrikningsfaktor E som angir det antall ganger den spesifikke aktivitet var øket ved den nærværende fremgangsmåte.

I eksperimentene, hvis resultater er stillet opp i de følgende tabeller, ble dietylaminoetyldekstran, "DEAE-Sefadex A-50" Medium, brukt som anioneutbytter-fase. I de eksperimentserier som danner grunnlaget for tabell III, var dekstranet vasket med destillert vann og derpå frysetørket før bruk. Der-ved oppnåddes den lavest mulige blindverdi ved OD_Qn. Det nevnte dekstran frigjør i alminnelighet forbindelser med ultrafiolett absorbsjon når det røres opp i vann. Vanninnholdet av det frysetørkede dekstran var 10.8 % , mens normalt dekstran har et vanninnhold på 4.9 %.

Det i eksperimentene anvendte polyetylenglykol var et produkt av typen "PEG 6000" med et vanninnhold på 14.2

De eksperimentelle resultater som er stillet opp i tabell I ble oppnådd ved å anvende en lysinkonsentrasjon på 0. 2 mol/l, en dietylaminoetyldekstran-konsentrasjon på 3.75 %, og en polyetylenglykol-konsentrasjon på 3.75 %, idet pH-verdien varierte mellom 2.0 og 10.0. Det fremgår av tabell I at det er mulig å oppnå en betraktelig rensing i pH-området fra 4 til 8. Den beste rensing og det høyeste utbytte ble oppnådd ved pH 8, men det fremgår av tabellen at praktisk talt samme resultater blir oppnådd når en pH-verdi på 6 blir anvendt.

De resultater som er stillet opp i tabell II ble oppnådd ved å bruke de samme konsentrasjoner av dietylaminoetyldekstran og polyetylenglykol som ovenfor. pH-verdien ble imidlertid holdt konstant på 8.0 hvorimot lysinkonsentrasjonen ble variert fra 0.05 til 0.25 mol/l.

Av tabell II fremgår det at utbyttet økes når lysin-konsentrasjonen økes fra 0.05 til 0.Z5 mol/l. Anrikningsfaktoren E viser derimot sin maks-imumsverdi ved en lysin-konsentrasjon på omtrent 0. 1 mol/l. Ved denne lysin-konsentrasjon er utbyttet bare omtrent 34 %.

I de eksperimenter hvis resultater er stillet opp i tabell III, er anvendt en lysin-konsentrasjon på 0. 2 mol/l og en pH-verdi på 8.0, mens konsentrasjonene av dietylaminoetyldekstranet og polyetylenglykolen ble variert.

Det fremgår av tabell III at plasminogen i høy grad kan renses

når der anvendes tilstrekkelig høye konsentrasjoner av dietylaminoetyl - dekstran og polyetylenglykol såvel som lysin. Når der således anvendes lysin-konsentrasjoner på 0.2 mol/l i forbindelse med 5%'s konsentrasjoner av både dekstran-forbindelsen og polyetylenglykol, oppnås der en anrikningsfaktor så høy som 8.2 ved siden av et utbytte på omtrent 45 %. Totalutbyttet kan imidlertid økes opp til 70 % ved å ryste dietylaminoetyldekstranfasen en gang til med en frisk por sjon polyetylenglykol, hvorved ytterligere 23 % kan trekkes ut. Nærværende metode til å rense plasminogen kan således brukes for å oppnå en høy anrikningsfaktor og et høyt utbytte på samme tid.

I de eksperimenter hvis resultater er stillet opp i tabell IV, er anvendt en pH-verdi på 8.0 og en lysin-konsentrasjon på 0. 2 mol/l. I dis se eksperimenter ble imidlertid polyvinylpyrrolidon brukt istedenfor polyetylenglykol. Det fremgår av tabellen at en viss grad av rensing blir oppnådd på denne måte.

De resultater som fremgår av tabell V ble oppnådd ved å bruke metylcellulose som den vann-løselige høymolekylærforbindelse i to-fase systemet.

Tabellen viser at anrikningsfaktoren er av samme størrelsesorden som ble oppnådd ovenfor.

I tabell VI er vist resultater av eksperimenter hvori to-fase systemet av DEAE-dekstran og polyetylenglykol ble anvendt i forbindelse med andre aminosyrer enn lysin. Man ser av denne tabell at bruken avd-amino-smørsyre og av epsylon-amino kapronsyre gir resultater som svarer til dem som er oppnådd ved lysin, hvorimot bruken av ornitin gir en noe mindre anrikningsfaktor. Det er imidlertid meget mulig at en høyere ornitin-konsentrasjon vil medføre en høyere grad av rensing.

Lignende eksperimenter er også utført med arginin. I disse eksperimenter var arginin-konsentrasjonen 0.2 mol/l; De øvrige betingelser var som angitt i forbindelse med tabell VI. Resultatene av disse eksperimenter fremgår av tabell VII.

Anvendeligheten av oppfinnelsens fremgangsmåte på rensingen

av plasminogen fra kreaturer fremgår av de eksperimenter som er angitt i tabell VIII. I disse eksperimenter var den anvendte aminosyre lysin i en konsentrasjon på 0. 2 mol/l. Det rå kreaturplasminogen var erholdt fra kreaturserum, som var fortynnet med 20 ganger sitt volum med vann ved pH 5.3 hvorved ble dannet et bunnfall som ble adskilt og løst igjen i vann. Eksperimentene ble utført ved en pH på 8.0 og en temperatur på 25°C.

Tabell IX illustrerer resultatene i sammenheng med rensingen av rått menneske-plasminogen som var erholdt fra menneskeserum på samme måte som det rå kreatur-plasminogen som ble nevnt ovenfor.

Enn videre ble der utført eksperimenter for å vise at harpiks - ioneutbyttere kan brukes i oppfinnelsens fremgangsmåte. Den anvendte utbytter var "Resine Amberlite IRA-400" (CI). Denne "Amberlite" er en sterk anioneutbytter . Det urene plasminogen var svine-plasminogen som ble laget som beskrevet i forbindelse med tabell VII, og den anvendte aminosyre var lysin i en konsentrasjon på 0. 2 mol/l. Temperaturen under eksperimentene var 25°C. Resultatene er oppstillet i tabell X.

Eksperimentene viser at den optimale rensing oppnås ved pH 6.0, mens ved bruk av dekstran-ioneutbytter oppnåddes praktisk talt samme rensing i pH-området 6 til 8. Eksperimentene viser også at den oppnådde rensing avhenger av polyetylenglykol-konsentrasjonen. Ved pH 8.0 øker anrikningsfaktoren fra omtrent 1.4 til omtrent 2. 7 når konsentrasjonen av "PEG 6000" øker fra 0 % til 3. 75.

Eksperimenter er også utført med en cellulose-ioneutbytter, nemlig DEAE-cellulose (Powder DE 50). I disse eksperimenter ble brukt det samme rå svine ^plasminogen, som det som ble brukt i de foregående eksperimenter. Den anvendte aminosyre var lysin i konsentrasjonen 0.2 mol/l. pH-verdien var 8.0 og temperaturen 25°C. Resultatene er oppstilt i tabell

XI.

I de foregående eksperimenter har det vært anvendt en polymer som har en molkylvekt på 6000. Det er imidlertid mulig å bruke polymerer som har en meget lavere molekylvekt, for eksempel ned til 400 og endog lavere. Dette kan illustreres ved henvisning til eksperimentene som er samlet i tabell XII. I disse eksperimenter ble brukt "PEG 400" som er en flytende polyetylenglykol, som har en molkylvekt på 400. Plasminogenet som skulle renses, var rått svine-plasminogen som man fikk på den måte som er nevnt ovenfor, den anvendte aminosyre var lysin i en konsentrasjon på 0.2 mol/l, og ioneutbytteren var DEAE-dekstran i en konsentrasjon på 5.0 %. pH-verdien var 8.0 og temperaturen 25°C.

Som det vil fremgå av resultatene må en polymer som har en

relativt lav molekylvekt, bli brukt i betraktelig høyere konsentrasjoner enn en polymer som har en relativt høy molekylvekt, som for eksempel "PEG 6000". For å få en E-verdi på omtrent 6.0, er det nødvendig å

bruke "PEG 400" i en mengde på omtrent 40 vol. -% , mens den samme E-verdi kan oppnås med "PEG 6000"i en konsentrasjon på 4 til 5 vekts-%.

Gjennom hele den nærværende beskrivelse er plasminaktiviteten

uttrykt i plasminenheter. En plasminenhet er definert som den mengde plasmin som i løpet av 20 minutter bevirker dannelse av spaltningspro -

dukter som er løselige i perklorsyre og har en ekstinksjon av 1 enhet ved 275 nyV under følgende eksperimentelle betingelser:

1 ml av den plasminløsning hvis aktivitet skal bestemmes og hvis

pH er 7.5, tilsettes til to reagensglass som hvert inneholder i 0.4 molar fosfatpuffer (pH 7.50), 1 ml av en 3 %'s løsning av Hammarstens kasein,

som på forhånd har vært opphetet til 35. 5°C. Etter 2 minutters henstand i termostat ved 35. 5°C, tilsettes til et av reagensglas sene 3 ml av en 1.7

molar løsning av perklorsyre i destillert vann, og etter henstand i 22 min-

utter ved 35.5°C, tilsettes det til det annet reagensglass den samme mengde perklor syr eløsning . Ved tilsetningen av perklorsyre foregår en utfelling,

og de to reagensglass står nu i 20 minutter, hvoretter filtreres to ganger gjennom filtrerpapir (J. H. Munktells unrivalled Genuine Swedish Filtering Paper No. 0.9 cm). Ekstinksjonen for de to løsninger måles deretter ved

275 myu/ i et Beckman D U Spectrophotometer (l cm kvarts kyvette), ver-

dien for den prøve som har stått i 2 minutter, brukes som blindverdi. Den plasminløsning hvis aktivitet skal bestemmes, fortynnes i en slik grad at ekstinksjonen ikke overskrider 0. 5, fordi der ikke er noen proporsjonali-

tet mellom ekstinksjonen og plasmin-konsentrasjonen ved høyere plasmin-konsentrasjoner.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte til rensning av humant eller animalsk plasminogen, karakterisert ved at det til en oppløsning av plasminogenet i vilkårlig rekkefølge tilsettes en med plasminogenet forlikelig alifatisk aminosyre, en anion-utbytte r og et med vann blandbart høymolekylært stoff, hvoretter den med renset plasminogen anrikede høymolekylære fase isoleres. 2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en alifatisk aminosyre med endestillet aminogruppe og en

endestillet karboksylgruppe i molekylets hovedkjede, f. eks. lysin.T- amino-smørsyre, ornithin eller é.-aminokapronsyre.

3. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes en anion-utbytter av dekstran - typen.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes en anion-utbytter av tverrbundet polystyrenharpiks med kvar-tære ammoniumgrupper.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes en anion-utbytter av cellulosetypen.

6. Fremgangsmåte som angitt i et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at polyetylenglykol, metylcellulose eller polyvinylpyrrolidon anvendes som det med-vann blandbare høymolekylære stoff.