NO157787B

NO157787B - CORROSION PREVENTION, SYNCHRIC PAINTING CONTAINING MANGANOMANGANOXYDE RKPIGMENT.

Info

Publication number: NO157787B
Application number: NO822181A
Authority: NO
Inventors: George Anthony Salensky; Kuldip Singh Chopra; Nicholas James Pappas
Original assignee: Elkem Metals
Priority date: 1981-06-30
Filing date: 1982-06-28
Publication date: 1988-02-08
Also published as: SE8203981D0; DD210463A5; ATA254482A; DE3223411C2; DE3223411A1; PT75000B; PT75000A; NO157787C; AT385049B; OA07137A; DK290382A; IT1151805B; FI822310A0; GB2103218A; FR2508475A1; SE8203981L; FI74482B; BR8203802A; ZA823625B; BE893676A

Abstract

Maling pigmentert med en kombinasjon av sink og manganomanganioksyd-røyk eller et materiale som hovedsaklig inneholder manganomanganioksyd-røyk. Malingen har en fremragende korrosjonsinhiberende virkning.Paint pigmented with a combination of zinc and manganese manganese dioxide fumes or a material containing mainly manganese manganese fumes. The paint has an excellent anti-corrosion effect.

Description

Fremgangsmåte til rensning av humant eller Procedure for purification of human or

animalsk plasminogen. animal plasminogen.

Nærværende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte til rensing av urent plasminogen. The present invention relates to a method for purifying impure plasminogen.

Det er kjent at plasminogen fra mennesker kan renses ved en modi-fikasjon av Kline-metoden, fulgt av enten gel-filtrering gjennom dekstrahkol-onner, eller ved kromatografi på DEAE-dekstrankolonner (dietylaminoetyl-dékstran) It is known that plasminogen from humans can be purified by a modification of the Kline method, followed by either gel filtration through dextran columns, or by chromatography on DEAE dextran columns (diethylaminoethyl dextran)

Videre har plasminogen fra mennesker også vært renset ved hjelp Furthermore, plasminogen from humans has also been purified using

av dietylaminoetylcellulosé-ioneutbyttere, idet lysin har vært anvendt for å drive ut plasminogen frå kolonnene før utdrivningen av de uønskede forurens-ninger i form av andre proteiner. of diethylaminoethylcellulose ion exchangers, as lysine has been used to expel plasminogen from the columns before the expulsion of the unwanted contaminants in the form of other proteins.

DEAE-cellulose kan således suspenderes i en ammoniumacetat-buffer-løsning på pH omkring 9 og inneholdende lysin ved en konsentrasjon av DEAE cellulose can thus be suspended in an ammonium acetate buffer solution at pH around 9 and containing lysine at a concentration of

Cf, 01 M, hvoretter plasminogen fra mennesker, som allerede er blitt delvis renset, oppløses i denne buffer og tilføres en kolonne som inneholder ovennevnte suspensjon. Når kolonnen blir eluert med ammoniumacetatbuffer som inneholder lysin, fremkommer en fraksjon som inneholder storparten av den kaseinolytiske og fibrinolytiske aktivitet, men bare en liten del av de øvrige proteiner. Cf, 01 M, after which human plasminogen, which has already been partially purified, is dissolved in this buffer and fed to a column containing the above suspension. When the column is eluted with ammonium acetate buffer containing lysine, a fraction emerges that contains most of the caseinolytic and fibrinolytic activity, but only a small part of the other proteins.

Det er videre blitt fastslått at dekstran er i stand til å danne to-fase-systemer med andre polymerer. Som et eksempel: Når 5 g "Dekstran G 25" og 5 g polyetylenglykol som har en molekylvekt på 6000, tilsettes til 100 ml vann og det resulterende system blir ristet eller rørt, vil systemet skille seg i to faser etter sentrifugering etter noen tids henstand. Den øvre fase består hovedsakelig av polyetylenglykol, mens storparten av den lavere fase er "Dekstran G 25". Det er også fastslått at mange proteiner løses i dekstranpolyetylenglykolsystemet, og at distribusjonen av proteiner mellom de to faser avhenger av mol-vekt-forholdet av polymerene og også i høy grad av saltinnholdet. Således kan et protein overføres fra en fase til en annen bare ved å forandre ione - sammensetningen av fasesystemet. It has further been established that dextran is capable of forming two-phase systems with other polymers. As an example: When 5 g of "Dekstran G 25" and 5 g of polyethylene glycol having a molecular weight of 6000 are added to 100 ml of water and the resulting system is shaken or stirred, the system will separate into two phases after centrifugation after some time lag . The upper phase consists mainly of polyethylene glycol, while most of the lower phase is "Dekstran G 25". It has also been established that many proteins are dissolved in the dextran polyethylene glycol system, and that the distribution of proteins between the two phases depends on the mole-weight ratio of the polymers and also to a high degree on the salt content. Thus, a protein can be transferred from one phase to another simply by changing the ion composition of the phase system.

I overensstemmelse med nærværende oppfinnelse er det nå funnet at urent plasminogen fra mennesker eller dyr kan renses i betydelig grad ved at det til en oppløsning av plasminogenet i vilkårlig rekkefølge tilsettes en med plasminogenet for likelig alifatisk aminosyre, en anion-utbytter og et med vann blandbart høymolekylært stoff, hvoretter den med renset plasminogen anrikede høymolekylære fase isoleres. In accordance with the present invention, it has now been found that impure plasminogen from humans or animals can be purified to a significant extent by adding to a solution of the plasminogen in any order one with the plasminogen for equal aliphatic amino acid, an anion exchanger and a water-miscible high molecular substance, after which the high molecular phase enriched with purified plasminogen is isolated.

Det er funnet at når urent plasminogen behandles på ovennevnte måte; virker den alifatiske aminosyre til å konsentrere plasminogenet i den fase som inneholder den vannblandbare høymolekylære forbindelse, mens storparten av forurensningen blir konsentrert i anion-utbytterfasen. Den anvendte aminosyre må naturligvis være blandbar med plasminogen, dvs. den må velges blant de alifatiske aminosyrer, som ikke deaktiverer eller denaturerer plasminogenet. It has been found that when impure plasminogen is treated in the above manner; the aliphatic amino acid acts to concentrate the plasminogen in the phase containing the water-miscible high molecular weight compound, while most of the contamination is concentrated in the anion-exchanger phase. The amino acid used must of course be miscible with plasminogen, i.e. it must be chosen from among the aliphatic amino acids, which do not deactivate or denature the plasminogen.

Tofase-systemet som dannes av den vann-blandbare høymolekylære forbindelse og anionutbytter , kan være et væske/væske system eller et væske/ fast stoff system, avhengig av den spesifikke høymolekylære forbindelse og den anionutbytter som anvendes. Hvis det dannes et to-faset væske-system, vil det-rensede plasminogen bli konsentrert i den øvre fase. som vesentlig består av den vann-blandbare høymolekylære forbindelse. Eksempelvis vil i systemet polyetylenglykol/dekstran/plasminogen bli funnet i den øvre polyetylenglykol fase. Hvis det for eksempel brukes en anionutbytter av den faste "Amberlite<u->type, som "IRA - 400", sammen med f. eks. polyetylenglykol, The two-phase system formed by the water-miscible high molecular compound and anion exchanger can be a liquid/liquid system or a liquid/solid system, depending on the specific high molecular compound and the anion exchanger used. If a two-phase liquid system is formed, the purified plasminogen will be concentrated in the upper phase. which essentially consists of the water-miscible high molecular weight compound. For example, in the system polyethylene glycol/dextran/plasminogen will be found in the upper polyethylene glycol phase. If, for example, an anion exchanger of the solid "Amberlite<u->type, such as "IRA - 400", is used together with e.g. polyethylene glycol,

vil plasminogenet også konsentreres i polyetylenglykol-fasen, og den faste the plasminogen will also be concentrated in the polyethylene glycol phase, and the solid

anionutbytter vil samle seg som en fast bunnfase. anion yields will accumulate as a solid bottom phase.

Plasminogenets konsentrering i den øvre fase er av betydelig praktisk fordel, fordi denne fase har en forholdsvis lav viskositet og derfor er grei å håndtere. Hvis den anvendte anionutbytter er av dekstrantypen, vil den lavere fase ofte ligne meget en gel, og er således vanskelig å håndtere. Når en "Amberlite" anion-utbytter blir brukt, vil den undre fase være fast. The concentration of plasminogen in the upper phase is of considerable practical advantage, because this phase has a relatively low viscosity and is therefore easy to handle. If the anion exchanger used is of the dextran type, the lower phase will often look very much like a gel, and is thus difficult to handle. When an "Amberlite" anion exchanger is used, the second phase will be solid.

I motsetning til rensing på dekstrankolonner som i alminnelighet er vanskelige å håndtere i teknisk målestokk på grunn av små flytehastigheter, er det fordelaktig å bruke et tofase system som ved porsjonsvis drift kan ad-skilles i to faser. I henhold til oppfinnelsen kan der også oppnås betydelig bedre utbytte sammenlignet med de tradisjonelle rensemetoder. In contrast to purification on dextran columns, which are generally difficult to handle on a technical scale due to low flow rates, it is advantageous to use a two-phase system which can be separated into two phases during batch operation. According to the invention, significantly better yield can also be achieved compared to the traditional cleaning methods.

Når plasminogen fra mennesker eller dyr blir renset på den ovenfor beskrevne måte, er den oppnådde renhetsgrad tilstrekkelig høy til alminnelig anvendelse, og videre rensing blir således overflødig. Det plasminogen som er blitt renset i henhold til metoden ut fra nærværende oppfinnelse, kan således brukes direkte til aktivering av plasmin uten det relativt høye antall av løsning og påfølgende bunnfelling, som i alminnelighet er nødvendig for å rense et plasminogen som er utfelt fra blodserum. When plasminogen from humans or animals is purified in the manner described above, the degree of purity achieved is sufficiently high for general use, and further purification thus becomes redundant. The plasminogen that has been purified according to the method of the present invention can thus be used directly for the activation of plasmin without the relatively high amount of solution and subsequent sedimentation, which is generally necessary to purify a plasminogen that has been precipitated from blood serum.

Som ovenfor nevnt kan anionutbytteren velges blant flere typer, hvor-av kan nevnes anionutbyttere av dekstrantype, f. eks. såkalt DEAE-dekstran, og anionutbytter-harpikser av den velkjente "Amberlite"serie, for eksempel "Amberlite IRA - 400", og en anionutbytter av cellulosetypen, for eksempel DEAE -cellulose. As mentioned above, the anion exchanger can be selected from several types, of which dextran-type anion exchangers can be mentioned, e.g. so-called DEAE dextran, and anion exchanger resins of the well-known "Amberlite" series, for example "Amberlite IRA - 400", and an anion exchanger of the cellulose type, for example DEAE cellulose.

Den vannblandbare høymolekylære forbindelse som er anvendt i nærværende fremgangsmåte for å danne den øvre fase i to-fasesystemet, kan og-så velges blant et stort antall forbindelser, som f. eks. polyetylenglykol, po-lyvinylpyr rolidon og metylcellulose. I sammenheng med en anionutbytter - fase som består av DEAE-dekstran, har man funnet anvendelse av polyetylenglykol særlig skikket til å danne den annen fase. Foretatte eksperimenter synes å indikere at polyetylenglykol også er effektivt i tilfelle av "Amberlite" anionutbyttere. The water-miscible high molecular weight compound which is used in the present method to form the upper phase in the two-phase system can also be chosen from among a large number of compounds, such as e.g. polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone and methylcellulose. In connection with an anion exchanger phase consisting of DEAE-dextran, the use of polyethylene glycol has been found particularly suitable for forming the second phase. Experiments conducted seem to indicate that polyethylene glycol is also effective in the case of "Amberlite" anion exchangers.

De alifatiske aminosyrer som kan anvendes i den hensikt å distribu-ere plasminogenet mellom de to faser hvortil er referert i det foregående, er sådanne aminosyrer som lysin, * -aminosmør syre, ornitin, fe-aminokapron-syre og arginin, blitt funnet å være særlig passende, spesielt lysin. Der kan imidlertid brukes også andre alifatiske aminosyrer, f.eks. glysin, guanidino-eddiksyre , kreatin, fi -alanin, DL-valin, DL-leucin, DL-isoleucin, DL-nor-leucin, L(+)-aspartinsyre , L(+)-citrullin, et-N-acetyl-L-arginin og glysyl-glysin. The aliphatic amino acids which can be used for the purpose of distributing the plasminogen between the two phases referred to in the foregoing, such amino acids as lysine, *-aminobutyric acid, ornithine, fe-aminocaproic acid and arginine, have been found to be particularly suitable, especially lysine. However, other aliphatic amino acids can also be used, e.g. glycine, guanidino-acetic acid, creatine, β-alanine, DL-valine, DL-leucine, DL-isoleucine, DL-nor-leucine, L(+)-aspartic acid, L(+)-citrulline, et-N-acetyl- L-arginine and glycyl-glycine.

Når man utfører fremgangsmåten i henhold til nærværende oppfinnelse, foretrekker man i praksis å anvende en alifatisk aminosyre av den type som har en endestillet aminogruppe og en endestillet karboksylgruppe i hovedkjeden av molekylet, fortrinnsvis med 5 til 6 karbonatomer i hovedkjeden. When carrying out the method according to the present invention, it is preferred in practice to use an aliphatic amino acid of the type which has a terminal amino group and a terminal carboxyl group in the main chain of the molecule, preferably with 5 to 6 carbon atoms in the main chain.

De relative mengder av aminosyre, vannløselig høymolekylær forbindelse og anioneutbytter kan variere betraktelig, avhengig av hvilke spesifikke forbindelser som er valgt i hvert tilfelle. Et eksperiment i liten labo-ratorieskala vil imidlertid i alminnelighet være tilstrekkelig til å fastslå de passende relative mengder av ovenstående forbindelser. Med hensyn til den høymolekylære forbindelse må det imidlertid bemerkes at hvis der velges en relativt lav molkylvekt, f. eks. på polyetylenglykolet, må forbindelsen som regel brukes i relativt høye konsentrasjoner. The relative amounts of amino acid, water soluble high molecular weight compound and anion yields can vary considerably depending on the specific compounds selected in each case. However, a small laboratory scale experiment will generally be sufficient to determine the appropriate relative amounts of the above compounds. With respect to the high molecular weight compound, however, it must be noted that if a relatively low molecular weight is chosen, e.g. on the polyethylene glycol, the compound usually has to be used in relatively high concentrations.

Det foretrekkes å bruke anionutbytter i mengder som ligger fra omtrent 0.1 til omtrent 10% av utgangsløsningen av plasminogen. Hvis anionutbytteren er en harpiks, kan det være ønskverdig å bruke denne i enda høy-ere konsentrasjon, f. eks. opp til 30%. Grunnen til det er at harpiksen ikke sveller så mye som de øvrige nevnte typer av anionutbyttere, slik at harpiksen ikke vil binde så meget av vannfasen som de andre nevnte typene av anionutbyttere gjør. Mengden av vann-løselig høymolekylær forbindelse avhenger av naturen av den spesifikke forbindelse som er anvendt, og i særdeleshet av dens molekylvekt. Aminosyren brukes fortrinsvis i en mengde som er mindre enn omtrent 1 mol pr. liter av utgangsløsningen av plasminogen. It is preferred to use anion yields in amounts ranging from about 0.1 to about 10% of the starting solution of plasminogen. If the anion exchanger is a resin, it may be desirable to use this in an even higher concentration, e.g. up to 30%. The reason for this is that the resin does not swell as much as the other mentioned types of anion exchangers, so that the resin will not bind as much of the water phase as the other mentioned types of anion exchangers do. The amount of water-soluble high molecular compound depends on the nature of the specific compound used, and in particular on its molecular weight. The amino acid is preferably used in an amount that is less than about 1 mole per liters of the starting solution of plasminogen.

Det plasminogen som skal renses, kan være av menneskelig eller dyrisk opprinnelse. Fortrinsvis brukes plasminogen som er isolert av griseblod. Plasminogenet kan da utfelles fra serum eller plasma av griseblod ved å fortynne 4 til 7 ganger med vann ved en pH-verdi på 5 - 6, slik som åpen-bart i Norsk Patentsøknad nr. 151080. Videre kan fremgangsmåten etter oppfinnelsen anvendes til rensing av plasminogen som er blitt utfelt fra serum eller plasma av griseblod, ved å tilsette et organisk løsningsmiddel slik som etanol i en mengde på minst 10% ved en pH på 5 - 9 og ved en temperatur mellom blandingens frysepunkt og omtrent 15°C. Denne fremgangsmåte er åpen-bart i Norsk Patentsøknad nr. 154077. The plasminogen to be purified can be of human or animal origin. Preferably, plasminogen is used which is isolated from pig blood. The plasminogen can then be precipitated from serum or plasma of pig blood by diluting 4 to 7 times with water at a pH value of 5 - 6, as shown in Norwegian Patent Application No. 151080. Furthermore, the method according to the invention can be used for the purification of plasminogen which has been precipitated from pig blood serum or plasma, by adding an organic solvent such as ethanol in an amount of at least 10% at a pH of 5 - 9 and at a temperature between the freezing point of the mixture and about 15°C. This method is disclosed in Norwegian Patent Application No. 154077.

I de følgende eksperimenter ble det tilsatt lysin og deretter dietylaminoetyldekstran og polyetylenglykol (mol-vekt 6000) til 20 ml's porsjoner av plasminogenløsninger som var laget av plasminogen utfelt fra griseserum ved 0°C og pH lik 6. 0 ved hjelp av 20%-ig etanol. pH ble innstillet til en gitt verdi, og løsningen ble henstillet i 10 minutter ved romtemperatur og ble så sentrifugert ved den samme temperatur. Den øvre. fase ble adskilt og volumet av den ble målt, hvoretter denne fase ble analysert på følgende måte: Plasminaktiviteten ble bestemt etter aktivering av plasminogen med urokinase, og den totale plasminaktivitet ble så beregnet i prosent av plasminaktiviteten hos den originale plasminogenløsning. Den prosent som således er beregnet, er lik utbyttet Y i den nærværende fremgangsmåte. In the following experiments, lysine and then diethylaminoethyldextran and polyethylene glycol (mol-weight 6000) were added to 20 ml portions of plasminogen solutions which were made from plasminogen precipitated from pig serum at 0°C and pH equal to 6.0 using 20%-ig ethanol. The pH was adjusted to a given value, and the solution was allowed to stand for 10 minutes at room temperature and was then centrifuged at the same temperature. The upper one. phase was separated and its volume was measured, after which this phase was analyzed in the following way: The plasmin activity was determined after activation of plasminogen with urokinase, and the total plasmin activity was then calculated as a percentage of the plasmin activity of the original plasminogen solution. The percentage thus calculated is equal to the yield Y in the present method.

Proteinkonsentrasjonen ble bestemt som tyrosin + tryptofan ved The protein concentration was determined as tyrosine + tryptophan by

280 nyVi 0. 1 N NaOH ved å måle den optiske tetthet (OD2gQ) hos eksperi-mental-løsningen sammenlignet med den optiske tetthet hos standardløsnin-gen som inneholder varierende kjente proteinmengder. 280 nyVi 0.1 N NaOH by measuring the optical density (OD2gQ) of the experimental solution compared to the optical density of the standard solution containing varying known amounts of protein.

Plasminaktiviteten ble beregnet som antall plasminenheter ved OD^gQ, idet den eksperimentelle optiske tetthet ble korrigert ved hjelp av blindver-dien, dvs. OD^gQ hos det system som i det hele tatt ikke inneholder protein. Effektiviteten for rensing av plasminogen ble beregnet som den såkalte anrikningsfaktor E som angir det antall ganger den spesifikke aktivitet var øket ved den nærværende fremgangsmåte. The plasmin activity was calculated as the number of plasmin units at OD^gQ, the experimental optical density being corrected using the blank value, i.e. OD^gQ of the system that contains no protein at all. The efficiency for purification of plasminogen was calculated as the so-called enrichment factor E, which indicates the number of times the specific activity was increased by the present method.

I eksperimentene, hvis resultater er stillet opp i de følgende tabeller, ble dietylaminoetyldekstran, "DEAE-Sefadex A-50" Medium, brukt som anioneutbytter-fase. I de eksperimentserier som danner grunnlaget for tabell III, var dekstranet vasket med destillert vann og derpå frysetørket før bruk. Der-ved oppnåddes den lavest mulige blindverdi ved OD_Qn. Det nevnte dekstran frigjør i alminnelighet forbindelser med ultrafiolett absorbsjon når det røres opp i vann. Vanninnholdet av det frysetørkede dekstran var 10.8 % , mens normalt dekstran har et vanninnhold på 4.9 %. In the experiments, the results of which are listed in the following tables, diethylaminoethyldextran, "DEAE-Sefadex A-50" Medium, was used as the anion exchanger phase. In the experimental series that form the basis for Table III, the dextran was washed with distilled water and then freeze-dried before use. Thereby, the lowest possible blank value was achieved at OD_Qn. The aforementioned dextran generally releases compounds with ultraviolet absorption when stirred up in water. The water content of the freeze-dried dextran was 10.8%, while normal dextran has a water content of 4.9%.

Det i eksperimentene anvendte polyetylenglykol var et produkt av typen "PEG 6000" med et vanninnhold på 14.2 The polyethylene glycol used in the experiments was a product of the type "PEG 6000" with a water content of 14.2

De eksperimentelle resultater som er stillet opp i tabell I ble oppnådd ved å anvende en lysinkonsentrasjon på 0. 2 mol/l, en dietylaminoetyldekstran-konsentrasjon på 3.75 %, og en polyetylenglykol-konsentrasjon på 3.75 %, idet pH-verdien varierte mellom 2.0 og 10.0. Det fremgår av tabell I at det er mulig å oppnå en betraktelig rensing i pH-området fra 4 til 8. Den beste rensing og det høyeste utbytte ble oppnådd ved pH 8, men det fremgår av tabellen at praktisk talt samme resultater blir oppnådd når en pH-verdi på 6 blir anvendt. The experimental results listed in Table I were obtained by using a lysine concentration of 0.2 mol/l, a diethylaminoethyldextran concentration of 3.75%, and a polyethylene glycol concentration of 3.75%, the pH value varying between 2.0 and 10.0. It appears from Table I that it is possible to achieve considerable purification in the pH range from 4 to 8. The best purification and the highest yield was achieved at pH 8, but it appears from the table that practically the same results are obtained when a A pH value of 6 is used.

De resultater som er stillet opp i tabell II ble oppnådd ved å bruke de samme konsentrasjoner av dietylaminoetyldekstran og polyetylenglykol som ovenfor. pH-verdien ble imidlertid holdt konstant på 8.0 hvorimot lysinkonsentrasjonen ble variert fra 0.05 til 0.25 mol/l. The results listed in Table II were obtained using the same concentrations of diethylaminoethyl dextran and polyethylene glycol as above. However, the pH value was kept constant at 8.0, whereas the lysine concentration was varied from 0.05 to 0.25 mol/l.

Av tabell II fremgår det at utbyttet økes når lysin-konsentrasjonen økes fra 0.05 til 0.Z5 mol/l. Anrikningsfaktoren E viser derimot sin maks-imumsverdi ved en lysin-konsentrasjon på omtrent 0. 1 mol/l. Ved denne lysin-konsentrasjon er utbyttet bare omtrent 34 %. Table II shows that the yield is increased when the lysine concentration is increased from 0.05 to 0.25 mol/l. The enrichment factor E, on the other hand, shows its maximum value at a lysine concentration of approximately 0.1 mol/l. At this lysine concentration, the yield is only about 34%.

I de eksperimenter hvis resultater er stillet opp i tabell III, er anvendt en lysin-konsentrasjon på 0. 2 mol/l og en pH-verdi på 8.0, mens konsentrasjonene av dietylaminoetyldekstranet og polyetylenglykolen ble variert. In the experiments whose results are listed in Table III, a lysine concentration of 0.2 mol/l and a pH value of 8.0 were used, while the concentrations of the diethylaminoethyl dextran and the polyethylene glycol were varied.

Det fremgår av tabell III at plasminogen i høy grad kan renses Table III shows that plasminogen can be purified to a high degree

når der anvendes tilstrekkelig høye konsentrasjoner av dietylaminoetyl - dekstran og polyetylenglykol såvel som lysin. Når der således anvendes lysin-konsentrasjoner på 0.2 mol/l i forbindelse med 5%'s konsentrasjoner av både dekstran-forbindelsen og polyetylenglykol, oppnås der en anrikningsfaktor så høy som 8.2 ved siden av et utbytte på omtrent 45 %. Totalutbyttet kan imidlertid økes opp til 70 % ved å ryste dietylaminoetyldekstranfasen en gang til med en frisk por sjon polyetylenglykol, hvorved ytterligere 23 % kan trekkes ut. Nærværende metode til å rense plasminogen kan således brukes for å oppnå en høy anrikningsfaktor og et høyt utbytte på samme tid. when sufficiently high concentrations of diethylaminoethyl dextran and polyethylene glycol as well as lysine are used. Thus, when lysine concentrations of 0.2 mol/l are used in connection with 5% concentrations of both the dextran compound and polyethylene glycol, an enrichment factor as high as 8.2 is obtained in addition to a yield of approximately 45%. However, the total yield can be increased up to 70% by shaking the diethylaminoethyldextran phase once more with a fresh portion of polyethylene glycol, whereby a further 23% can be extracted. The present method for purifying plasminogen can thus be used to achieve a high enrichment factor and a high yield at the same time.

I de eksperimenter hvis resultater er stillet opp i tabell IV, er anvendt en pH-verdi på 8.0 og en lysin-konsentrasjon på 0. 2 mol/l. I dis se eksperimenter ble imidlertid polyvinylpyrrolidon brukt istedenfor polyetylenglykol. Det fremgår av tabellen at en viss grad av rensing blir oppnådd på denne måte. In the experiments whose results are listed in Table IV, a pH value of 8.0 and a lysine concentration of 0.2 mol/l were used. In these experiments, however, polyvinylpyrrolidone was used instead of polyethylene glycol. It appears from the table that a certain degree of purification is achieved in this way.

De resultater som fremgår av tabell V ble oppnådd ved å bruke metylcellulose som den vann-løselige høymolekylærforbindelse i to-fase systemet. The results shown in Table V were obtained by using methylcellulose as the water-soluble high molecular weight compound in the two-phase system.

Tabellen viser at anrikningsfaktoren er av samme størrelsesorden som ble oppnådd ovenfor. The table shows that the enrichment factor is of the same order of magnitude as was obtained above.

I tabell VI er vist resultater av eksperimenter hvori to-fase systemet av DEAE-dekstran og polyetylenglykol ble anvendt i forbindelse med andre aminosyrer enn lysin. Man ser av denne tabell at bruken avd-amino-smørsyre og av epsylon-amino kapronsyre gir resultater som svarer til dem som er oppnådd ved lysin, hvorimot bruken av ornitin gir en noe mindre anrikningsfaktor. Det er imidlertid meget mulig at en høyere ornitin-konsentrasjon vil medføre en høyere grad av rensing. Table VI shows the results of experiments in which the two-phase system of DEAE-dextran and polyethylene glycol was used in connection with amino acids other than lysine. It can be seen from this table that the use of d-amino-butyric acid and epsilon-amino caproic acid gives results that correspond to those obtained with lysine, whereas the use of ornithine gives a somewhat smaller enrichment factor. However, it is very possible that a higher ornithine concentration will result in a higher degree of purification.

Lignende eksperimenter er også utført med arginin. I disse eksperimenter var arginin-konsentrasjonen 0.2 mol/l; De øvrige betingelser var som angitt i forbindelse med tabell VI. Resultatene av disse eksperimenter fremgår av tabell VII. Similar experiments have also been carried out with arginine. In these experiments, the arginine concentration was 0.2 mol/l; The other conditions were as indicated in connection with table VI. The results of these experiments appear in Table VII.

Anvendeligheten av oppfinnelsens fremgangsmåte på rensingen The applicability of the method of the invention to the purification

av plasminogen fra kreaturer fremgår av de eksperimenter som er angitt i tabell VIII. I disse eksperimenter var den anvendte aminosyre lysin i en konsentrasjon på 0. 2 mol/l. Det rå kreaturplasminogen var erholdt fra kreaturserum, som var fortynnet med 20 ganger sitt volum med vann ved pH 5.3 hvorved ble dannet et bunnfall som ble adskilt og løst igjen i vann. Eksperimentene ble utført ved en pH på 8.0 og en temperatur på 25°C. of plasminogen from cattle appears from the experiments indicated in Table VIII. In these experiments, the amino acid used was lysine in a concentration of 0.2 mol/l. The crude animal plasminogen was obtained from animal serum, which was diluted 20 times its volume with water at pH 5.3, whereby a precipitate was formed which was separated and dissolved again in water. The experiments were carried out at a pH of 8.0 and a temperature of 25°C.

Tabell IX illustrerer resultatene i sammenheng med rensingen av rått menneske-plasminogen som var erholdt fra menneskeserum på samme måte som det rå kreatur-plasminogen som ble nevnt ovenfor. Table IX illustrates the results in connection with the purification of crude human plasminogen obtained from human serum in the same manner as the crude cattle plasminogen mentioned above.

Enn videre ble der utført eksperimenter for å vise at harpiks - ioneutbyttere kan brukes i oppfinnelsens fremgangsmåte. Den anvendte utbytter var "Resine Amberlite IRA-400" (CI). Denne "Amberlite" er en sterk anioneutbytter . Det urene plasminogen var svine-plasminogen som ble laget som beskrevet i forbindelse med tabell VII, og den anvendte aminosyre var lysin i en konsentrasjon på 0. 2 mol/l. Temperaturen under eksperimentene var 25°C. Resultatene er oppstillet i tabell X. Furthermore, experiments were carried out to show that resin ion exchangers can be used in the method of the invention. The solvent used was "Resine Amberlite IRA-400" (CI). This "Amberlite" is a strong anion exchanger. The impure plasminogen was porcine plasminogen which was prepared as described in connection with Table VII, and the amino acid used was lysine at a concentration of 0.2 mol/l. The temperature during the experiments was 25°C. The results are listed in table X.

Eksperimentene viser at den optimale rensing oppnås ved pH 6.0, mens ved bruk av dekstran-ioneutbytter oppnåddes praktisk talt samme rensing i pH-området 6 til 8. Eksperimentene viser også at den oppnådde rensing avhenger av polyetylenglykol-konsentrasjonen. Ved pH 8.0 øker anrikningsfaktoren fra omtrent 1.4 til omtrent 2. 7 når konsentrasjonen av "PEG 6000" øker fra 0 % til 3. 75. The experiments show that the optimal purification is achieved at pH 6.0, while when using dextran ion yields practically the same purification was achieved in the pH range 6 to 8. The experiments also show that the purification achieved depends on the polyethylene glycol concentration. At pH 8.0, the enrichment factor increases from about 1.4 to about 2.7 as the concentration of "PEG 6000" increases from 0% to 3.75.

Eksperimenter er også utført med en cellulose-ioneutbytter, nemlig DEAE-cellulose (Powder DE 50). I disse eksperimenter ble brukt det samme rå svine ^plasminogen, som det som ble brukt i de foregående eksperimenter. Den anvendte aminosyre var lysin i konsentrasjonen 0.2 mol/l. pH-verdien var 8.0 og temperaturen 25°C. Resultatene er oppstilt i tabell Experiments have also been carried out with a cellulose ion exchanger, namely DEAE cellulose (Powder DE 50). In these experiments, the same crude porcine plasminogen as that used in the previous experiments was used. The amino acid used was lysine in a concentration of 0.2 mol/l. The pH value was 8.0 and the temperature 25°C. The results are listed in a table

XI. XI.

I de foregående eksperimenter har det vært anvendt en polymer som har en molkylvekt på 6000. Det er imidlertid mulig å bruke polymerer som har en meget lavere molekylvekt, for eksempel ned til 400 og endog lavere. Dette kan illustreres ved henvisning til eksperimentene som er samlet i tabell XII. I disse eksperimenter ble brukt "PEG 400" som er en flytende polyetylenglykol, som har en molkylvekt på 400. Plasminogenet som skulle renses, var rått svine-plasminogen som man fikk på den måte som er nevnt ovenfor, den anvendte aminosyre var lysin i en konsentrasjon på 0.2 mol/l, og ioneutbytteren var DEAE-dekstran i en konsentrasjon på 5.0 %. pH-verdien var 8.0 og temperaturen 25°C. In the preceding experiments, a polymer has been used which has a molecular weight of 6000. However, it is possible to use polymers which have a much lower molecular weight, for example down to 400 and even lower. This can be illustrated by reference to the experiments collected in Table XII. In these experiments, "PEG 400" was used, which is a liquid polyethylene glycol, which has a molecular weight of 400. The plasminogen to be purified was crude porcine plasminogen obtained in the manner mentioned above, the amino acid used was lysine in a concentration of 0.2 mol/l, and the ion exchanger was DEAE-dextran at a concentration of 5.0%. The pH value was 8.0 and the temperature 25°C.

Som det vil fremgå av resultatene må en polymer som har en As will be seen from the results, a polymer having a

relativt lav molekylvekt, bli brukt i betraktelig høyere konsentrasjoner enn en polymer som har en relativt høy molekylvekt, som for eksempel "PEG 6000". For å få en E-verdi på omtrent 6.0, er det nødvendig å relatively low molecular weight, be used in considerably higher concentrations than a polymer that has a relatively high molecular weight, such as "PEG 6000". To obtain an E-value of approximately 6.0, it is necessary to

bruke "PEG 400" i en mengde på omtrent 40 vol. -% , mens den samme E-verdi kan oppnås med "PEG 6000"i en konsentrasjon på 4 til 5 vekts-%. use "PEG 400" in an amount of about 40 vol. -%, while the same E-value can be achieved with "PEG 6000" in a concentration of 4 to 5% by weight.

Gjennom hele den nærværende beskrivelse er plasminaktiviteten Throughout the present description, the plasmin activity is

uttrykt i plasminenheter. En plasminenhet er definert som den mengde plasmin som i løpet av 20 minutter bevirker dannelse av spaltningspro - expressed in plasmin units. A unit of plasmin is defined as the amount of plasmin that within 20 minutes causes the formation of cleavage pro -

dukter som er løselige i perklorsyre og har en ekstinksjon av 1 enhet ved 275 nyV under følgende eksperimentelle betingelser: ducts which are soluble in perchloric acid and have an extinction of 1 unit at 275 nyV under the following experimental conditions:

1 ml av den plasminløsning hvis aktivitet skal bestemmes og hvis 1 ml of the plasmin solution whose activity is to be determined and if

pH er 7.5, tilsettes til to reagensglass som hvert inneholder i 0.4 molar fosfatpuffer (pH 7.50), 1 ml av en 3 %'s løsning av Hammarstens kasein, pH is 7.5, is added to two test tubes that each contain 0.4 molar phosphate buffer (pH 7.50), 1 ml of a 3% solution of Hammarsten's casein,

som på forhånd har vært opphetet til 35. 5°C. Etter 2 minutters henstand i termostat ved 35. 5°C, tilsettes til et av reagensglas sene 3 ml av en 1.7 which has previously been heated to 35.5°C. After 2 minutes' rest in the thermostat at 35.5°C, add to one of the test tubes 3 ml of a 1.7

molar løsning av perklorsyre i destillert vann, og etter henstand i 22 min- molar solution of perchloric acid in distilled water, and after standing for 22 min-

utter ved 35.5°C, tilsettes det til det annet reagensglass den samme mengde perklor syr eløsning . Ved tilsetningen av perklorsyre foregår en utfelling, otter at 35.5°C, the same amount of perchloric acid solution is added to the other test tube. When perchloric acid is added, a precipitation takes place,

og de to reagensglass står nu i 20 minutter, hvoretter filtreres to ganger gjennom filtrerpapir (J. H. Munktells unrivalled Genuine Swedish Filtering Paper No. 0.9 cm). Ekstinksjonen for de to løsninger måles deretter ved and the two test tubes now stand for 20 minutes, after which they are filtered twice through filter paper (J. H. Munktell's unrivaled Genuine Swedish Filtering Paper No. 0.9 cm). The extinction for the two solutions is then measured by

275 myu/ i et Beckman D U Spectrophotometer (l cm kvarts kyvette), ver- 275 myu/ in a Beckman D U Spectrophotometer (l cm quartz cuvette), ver-

dien for den prøve som har stått i 2 minutter, brukes som blindverdi. Den plasminløsning hvis aktivitet skal bestemmes, fortynnes i en slik grad at ekstinksjonen ikke overskrider 0. 5, fordi der ikke er noen proporsjonali- The value for the sample that has stood for 2 minutes is used as a blank value. The plasmin solution whose activity is to be determined is diluted to such an extent that the extinction does not exceed 0.5, because there is no proportional

tet mellom ekstinksjonen og plasmin-konsentrasjonen ved høyere plasmin-konsentrasjoner. tet between the extinction and the plasmin concentration at higher plasmin concentrations.

Claims

1. Process for purifying human or animal plasminogen, characterized in that an aliphatic amino acid compatible with the plasminogen, an anion yield r and a water-miscible high molecular weight substance are added to a solution of the plasminogen in any order, after which the purified plasminogen enriched high molecular weight phase is isolated. 2. Method as stated in claim 1, characterized in that an aliphatic amino acid with a terminal amino group is used and a

terminal carboxyl group in the main chain of the molecule, e.g. lysine.T-amino-butyric acid, ornithine or é.-aminocaproic acid.

3. Method as stated in any of the preceding claims, characterized in that an anion exchanger of the dextran type is used.

4. Method as stated in claim 1 or 2, characterized in that an anion exchanger of crosslinked polystyrene resin with quaternary ammonium groups is used.

5. Method as stated in claim 1 or 2, characterized in that an anion exchanger of the cellulose type is used.

6. Method as stated in any one of the preceding claims, characterized in that polyethylene glycol, methyl cellulose or polyvinylpyrrolidone is used as the water-miscible high molecular weight substance.