JPH0521118B2

JPH0521118B2 -

Info

Publication number: JPH0521118B2
Application number: JP59157643A
Authority: JP
Inventors: Toshio Takagi; Masahiro Fukuda; Kazuo Oobe
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1984-07-30
Filing date: 1984-07-30
Publication date: 1993-03-23
Also published as: US4654132A; DE3527139A1; JPS6136296A

Description

【発明の詳細な説明】 (1) 技術分野純度よく分離精製された生体膜蛋白質は単に蛋
白質の機能と構造を研究する上で重要であるばか
りでなく、薬学、医学、工学の分野においても有
益な産物となりつつある。本発明は特別に用意さ
れたアニオン性界面活性剤共存下で、ゲル電気泳
動法を行うことによつて目的とする膜蛋白質を純
度よくしかも生体機能を損なうことなく分離精製
する方法を含む分野のものである。

(2) 従来技術生体膜を構成する主成分は極性脂質と膜蛋白質
であり、生体機能を維持する膜蛋白質が極性脂
質、なかでもその大部分を占めるリン脂質の二重
膜中に挿入されている。

(i) 膜蛋白質例えば赤血球膜グリコホリン、大腸
菌外膜ポリン、チトクロムb₅、（Na⁺、K⁺）
ATPase、（Ca⁺⁺）ATPase、（H⁺）ATPaseな
どの多くはそれ自身難水溶性であり、水溶性球
状蛋白質とは異なり分離精製の第一段階として
膜蛋白質を可溶化する必要がある。

(ii) 膜蛋白質の可溶化には脂質二重層と類似の環
境をもつ媒質が必要となり、各種の有機溶媒、
界面活性剤水溶液が用いられる。有機溶媒の代
表例としてはアセトン、ブタノール、エタノー
ルおよびピリジン等であり、界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウムに代表される陰イ
オン性界面活性剤、トリメチルドデシルアンモ
ニウムクロリドに代表される陽イオン性界面活
性剤、ポリオキシエチレンドデシルエーテルに
代表される非イオン性界面活性剤がある。

(iii) しかし有機溶媒の多くは蛋白質に対し強力な
変性剤として働くため、生体機能を損なうこと
なく膜蛋白質を分離精製することが困難になる
場合が多い。

(iv) 又、従来生化学分野で用いられている陰イオ
ン性界面活性剤の一つのドデシル硫酸ナトリウ
ム（以後SDSと略）は強力な蛋白質変性剤とし
て働くため、生体機能を損なうことなく膜蛋白
質を分離精製することが困難になる場合が多
い。

(v) 蛋白変性能の低い非イオン性界面活性剤を可
溶化のための媒質として用いることが試みられ
ている。しかし多くの非イオン性界面活性剤は
臨界ミセル濃度が低く、分離精製後膜蛋白質に
結合した界面活性剤を透析によつて除去するこ
とが困難になるという欠点を有する。

(vi) 蛋白質変性能の低いアニオン性界面活性剤と
して、胆汁塩酸類を用いることは可能である
が、これらは生体界面活性物質に属するもので
工業的に多量使用できないという致命的欠陥が
ある。

(vii) カチオン性界面活性剤はむしろ生体膜を構成
する脂質との結合が他の界面活性剤より強く蛋
白質に対する変性作用も弱くないので、殺菌剤
として用いられることは多いが膜蛋白質の分離
精製に成功した例は少なく適用範囲の広い界面
活性剤とはいえない。

(viii) 蛋白質自身の物理的化学的特性に着目した分
離精製法には、熱あるいはPH処理法、分画沈澱
法、吸脱着法、イオン交換体によるクロマトグ
ラフイー法、等電点分画法、密度勾配遠心法、
電気泳動法、アフイニテイクロマトグラフイー
法、分子ふるい法、二相分配法、結晶化法があ
るがいずれも一長一短がある。

(ix) 我々はこのような現状にかんがみ、日夜研究
に精進した結果、膜蛋白質を変性させることな
く可溶化し、さらに生体機能を損なうことなく
分離精製することを可能にした界面活性剤共存
下でのゲル電気泳動法を発明した。

(3) 構成・限界 (i) 一般式RO（―XO）_n――（―YO）―_oSO₃M式中Ｒは
炭素数６〜22の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基
あるいはアルキルフエニル基であり、Ｒ中に不
飽和炭素を有してもよい。ＸおよびＹは−CH₂
−、−CH₂CH₂−、−CH₂CH（CH₃）−、−
CH₂CH（C₂H₅）−のいずれかが好ましく、これ
らはホモ共重合体、ブロツク共重合体、ランダ
ム共重合体のいずれでもよい。ｍおよびｎは０
〜20、ｍ＋ｎは４〜40であり、これはアルキレ
ンオキシドの付加モル数あるいは平均付加モル
数を表わす。Ｍはアルカリ金属、アルカリ土類
金属、アミン、アンモニウムである。Ｒの炭素
数が６未満の場合には界面活性能が劣り、膜蛋
白質を効率よく可溶化できない。又、炭素数が
22を越えると分離精製後、膜蛋白質に結合した
界面活性剤を透析によつて除去することが困難
になる。好ましくはＲは炭素数８〜16の直鎖状
アルキル基および炭素数６〜14の分枝状アルキ
ルフエニル基であり、ｍ＋ｎは４〜20である。
特に好ましくは、炭素数10〜14の直鎖状アルキ
ル基もしくは分枝状アルキルフエニル基で、Ｘ
およびＹはいずれも−CH₂CH₂−からなり、ｍ
＋ｎが４〜15である。例えばポリオキシエチレ
ン（平均８モル）ラウリルエーテル硫酸ナトリ
ウム、オクタポリオキシエチレンドデシルエー
テル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（平
均6.9モル）分枝状ノニルフエニルエーテル硫
酸ナトリウムなどが使用できる。ｍ＋ｎが３以
下になると膜蛋白質に対する変性作用が増大す
るため、生体機能を損なうことなく分離精製で
きる膜蛋白質が制限されるので不利となる。
又、ｍ＋ｎが21以上になると陰イオン性界面活
性剤であるにもかかわらず、非イオン性界面活
性剤の性質を帯びるため上記記載の理由により
好ましくない。

(ii) ゲル電気泳動電気泳動の支持体としてセルロースアセテー
ト、セフアデツクス、塩化ビニル−酢酸ビニル
共重合体、ポリ塩化ビニル、デンプン粒、デン
プンゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミ
ドゲルなどが使用できる。ポリアクリルアミド
ゲルは化学的に安定なこと、ゲル濃度、架橋度
を自由にコントロールすることができ、即ちポ
アサイズを目的に応じて自由に変えられるこ
と、電気浸透性がなくPHおよび温度変化による
変化も少なく、自由な型に成型できること、再
現性が非常によいことなど多くの利点を有して
いるので特に好ましい。

イ装置と器具ポリアクリルアミドゲルを支持する容器
と、その両端に緩衝液を満たすための槽を使
用することができ、その容量、長さ等は分離
精製する蛋白質の種類・量により任意に設定
することができる。

ロ電源装置直流電流を用い、さらに定電流・定電圧発
生装置を用いると分離精製能および再現性が
向上するため特に好ましい。

ハ泳動用ポリアクリルアミドゲルの調整アクリルアミドを１〜30重量％、Ｎ，
N′−メチレンビスアクリルアミドをアクリ
ルアミドに対し0.05〜10重量％および本発明
における界面活性剤を0.01〜１重量％を含有
する水溶液を調製した後、重合反応により上
記水溶液をゲル化させて用いることができ
る。好ましいゲル濃度はアクリルアミドと
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミドの総
量が３〜15重量％でしかもＮ，N′−メチレ
ンビスアクリルアミドがアクリルアミドに対
して１〜５重量％の範囲である。又、界面活
性剤濃度は0.05〜0.2重量％が特に好ましい。
なお上記水溶液に重合用触媒、重合促進剤、
PH緩衝剤、防腐剤等を混合してゲル化するこ
とも可能である。光重合用触媒としてリボフ
ラビンあるいはラジカル重合用触媒として過
硫酸アンモニウムなどを任意の重量％におい
て使用することができ、好ましくは0.04〜
0.12重量％である。重合促進剤として例えば
Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレンジ
アミンを任意の重量％範囲において使用する
ことができ、好ましくは0.1〜0.5重量％であ
る。

溶存酸素がゲル化を阻害する場合があるの
で脱気あるいはゲル化時に水溶液の上層部を
さらに水で覆い空気と水溶液が接触しないよ
うにすることが望ましい。PH緩衝剤としては
リン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナト
リウム系、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウム系などが使用でき、目的とするPHでゲル
電気泳動をすることができる。PH緩衝剤濃度
は10〜500ｍＭ、好ましくは50〜200ｍＭ、特
に好ましくは100ｍＭに調整される。

ニ緩衝液槽内の水溶液泳動用ポリアクリルアミドゲルの両端は緩
衝液で満たされる必要がある。この緩衝液
は、ポリアクリルアミドゲル作成用の水溶液
に含まれる緩衝剤、界面活性剤および水から
構成される。緩衝剤、界面活性剤濃度はポリ
アクリルアミドゲル作成用水溶液におけるも
のと同一であることが望ましい。

ホ分離精製される膜蛋白質を含む水溶液本水溶液中には、膜蛋白質以外に本発明に
おける界面活性剤が0.1〜５重量％、好まし
くは0.2〜３重量％、特に好ましくは0.5〜２
重量％含まれる。又、分離精製能を向上させ
る目的でグリセリン等の粘稠な液を１〜30重
量％加えることもできるが好ましくは10〜20
重量％である。

又、この水溶液にはゲルおよび緩衝液中の
緩衝剤を含むことができ、その濃度は好まし
くは500ｍＭ以下でしかも緩衝液中の緩衝剤
濃度以下であることが好ましい。特に好まし
くは緩衝液中の緩衝剤濃度の1/2〜1/20の濃
度である。

更にこの水溶液には標準移動度を示す水溶
性の陰イオン性染料、色素例えばブロモフエ
ノールブルー等を、又、界面活性剤ミセルの
移動度を示すために、ミセルに可溶で水不溶
性の色素、例えば油溶性色素であるイエロー
OB等を混合することも可能である。これら
の濃度は任意の範囲で使用できるが、好まし
くは前者の場合0.001〜0.05重量％、後者の
場合0.01〜0.5重量％である。

この水溶液を泳動溶ポリアクリルアミドゲ
ル上端部に置くことにより、電気泳動が開始
される。膜蛋白質はゲル中でデイスク状に分
離精製される。デイスク状に分離された膜蛋
白質は染料によつて染色され、着色したバン
ドとして認められる。ここで用いられる染料
は、例えばアミドブラツク、クマシーブリリ
アントブルーなどであり、常法（例えば瓜谷
郁三・志村憲助・中村道徳・船津勝二編集、
“生化学実験法−蛋白質の電気的性質”学会
出版センター）に従がつて膜蛋白質の分離精
製を確認することができる。

(iii) 対象物本発明による方法によつて分離精製できる対
象物は動物臓器、培養細胞、微生物細胞、植物
細胞等から抽出、可溶化される生体膜蛋白質す
べてを包含する。

(iv) 分離精製可溶化された膜蛋白質成分すべてを含む上清
をそのまま本発明による方法によつて分離精製
することができる。またさらに可溶化液に対し
て除核酸等を通常行われる処理を施した溶液あ
るいはさらに分画沈澱、密度勾配遠心法等、目
的に応じて精製の初期段階を経た溶液を本発明
による方法によつて高度に分離精製することも
可能である。この場合本発明による分離精製を
行う前段階における粗い分離精製においては膜
蛋白質が生体機能を損なうことなく又たとえ変
性が生じても変性を引き起こす要因を取り除く
と可逆的に活性を取り戻せ得る方法を採用する
ことが望ましい。以上のように本発明による生
体膜蛋白質の分離精製法はあらゆる生体膜蛋白
質に対し適用可能であるとともにいずれの精製
段階においても適用可能であるため有利であ
る。

(4) 効果・作用 (i) 本発明に用いる前述した陰イオン性界面活性
剤は蛋白質変性能が低く、しかも肝汁酸塩類と
は異なり、工業的に安価に又、容易に合成され
るもので有利である。

(ii) 上記陰イオン性界面活性剤の蛋白質変性能は
非イオン性界面活性剤と同等で極めて低いが、
前者によつて可溶化された膜蛋白質にはそれぞ
れ固有量の陰イオン性界面活性剤が結合してお
り、それぞれ異なる陰電荷数を有する蛋白質−
界面活性剤複合体となる。これらが電気泳動支
持体中を陽極に向つてそれぞれ固有の速度で移
動する。この際支持体による分子ふるい効果が
加わるため、従来の非イオン性界面活性剤によ
つて可溶化された膜蛋白質のゲル過法に較
べ、はるかに分離精製能が向上する。

(iii) 非イオン性活性剤で可溶化された膜蛋白質の
ゲル過法による分離精製の第二の欠点は、大
量の溶媒が必要なことである。本発明による分
離精製法ではその必要がなく有利である。

(iv) 非イオン性界面活性剤は臨界ミセル濃度が低
いため、膜蛋白質に結合した非イオン性界面活
性剤を透析によつて除去することが困難な場合
が多い。本発明による分離精製法では、使用す
る界面活性剤の臨界ミセル濃度が非イオン性界
面活性剤に較べ高いために透析によつて容易に
界面活性剤の除去がおこなえ、また電気透析を
適用することができるので有利である。

(v) 本発明に用いる陰イオン性界面活性剤は膜蛋
白質を変性することなく可溶化するのみでなく
電気泳動支持体中においても膜蛋白質の変性を
著しく制限する。

(5) 実施の態様の説明イヌ腎（Na⁺、K⁺）ATPaseの分離精製に対
し本発明による方法を適用したので以下に参考
例、実施例、比較例をあげさらに詳しく説明す
る。

分離精製後のATPase活性の有無は、次のよう
にして測定した。

４ｍMATP、100ｍMNaCl、25ｍMKCl、3.9
ｍＭ MgCl₂、0.2ｍＭ EDTAを含む30ｍＭイ
ミダゾール／30ｍＭグリシルグリシン緩衝液（PH
7.2、20℃）中に、適量の大豆由来リン脂質を加
え、37℃、2.5〜４分間処理し、次いで濃厚SDS
水溶液を加えることによつて反応を終了させた。
しかる後無機リン酸の生成の有無をHegyvaryら
の方法〔Anal.Biochem、94、397−401（1979）〕
に準じて判定した。

又、分離精製の度合は、本発明によるポリアク
リルアミドゲル電気泳動終了後、ゲルを取り出
し、スラブ式二次元電気泳動装置を用いて、従来
行われているSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動をすることにより確認した。即ち、（Na⁺、
K⁺）ATPaseはαとβの分子量の異なるサブユ
ニツトからなりこれらが数個集合してオリゴマー
を形成していることが知られており、〔Y.
Hayashi et al.、B.B.A.748、153−167（1983）〕、
純粋な（Na⁺、K⁺）ATPaseに対してSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、αとβ
に対応する二本のバンドが得られ、それ以外のバ
ンドは得られない、従つて第三のバンドの有無が
分離精製の度合を調べる指標となり得る。

参考例 Jφrgensenの方法〔B.B.A.、356、36−52
（1974）〕で精製した（Na⁺、K⁺）ATPaseの
C₁₂H₂₅O（CH₂CH₂O）₈SO₃Na存在下でのポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行つた。一次元およ
び二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し
たゲル組成、緩衝液組成をそれぞれ下記表−１、
表−２に示した。

表−１ゲル組成アクリルアミド５重量％Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド
2.7重量％（但しアクリルアミドに対する）過硫酸アンモニウム 0.07重量％Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチレンジアミン
0.15重量％リン酸緩衝液（PH７） 100ｍＭ界面活性剤 0.1重量％水バランス表−２緩衝液組成リン酸緩衝液（PH７） 100ｍＭ界面活性剤 0.1重量％水バランスゲル電気泳動は文献・成書に開示されるSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に準じて行つ
た。〔例えば、J.V、Maizel、Jr.、“Methods in
Virology”、Academic Press.（1971）、P179：高
木俊夫、三宅淳、“新実験化学講座20巻生物化学
（日本化学会編）”丸善（1978）、P.109〕但し、
Ｓ−Ｓ結合解裂剤は加えず、SDSを本発明におけ
る界面活性剤に読み替えた。

その結果、明瞭な２本のバンドが得られた。同
時にゲル電気泳動を行い、染色処理は施さなかつ
た明瞭な２本のバンドに相当する部位に含まれる
蛋白質をゲル外に泳動させた後、ATPase活性に
有無を判定したところ陽性であつた。また、同様
の操作を行つたゲルを取り出し、スラブ式二次元
電気泳動装置を用いて、従来行われているSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行つたとこ
ろ、２本のバンドからそれぞれαとβに対応する
２つのスポツトが得られ、それ以外のスポツトは
認められなかつた。この場合、一次元と二次元ゲ
ル電気泳動において、バンドの移動度に差が認め
られた。これは本発明による界面活性剤とSDSと
では、α、βのサブユニツトの流体力学的体積変
化に及ぼす効果に差があることを示すものであ
る。即ち、本発明によるポリアクリルアミドゲル
電気泳動で得られた２本のバンドは、αおよびβ
であり、再構成することにより、生体機能を回復
することがわかる。

実施例１イヌ腎から分画したミクロソームをC₁₂H₂₅O
（CH₂CH₂O）₈SO₃Na水溶液（１重量％）に混合
し超音波照射した後遠心分離し、上清をとり、こ
れの分離精製を行つた。条件は参考例と全く同一
である。参考例で得られた二本のバンドに対応す
る移動度を示すゲル部位を切断し、これらに含ま
れる膜蛋白質の回収を行つた。ATPase活性は陽
性であつた。また、分離精製の度合をスラブ式二
次元ゲル電気泳動装置を用い、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い確認したところ、二
つのバンドからそれぞれαとβに対応する明瞭な
スポツトが得られ、それら以外のスポツトは認め
られなかつた。従つて、分離精製の度合は極めて
良いといえる。又、一次元ゲル電気泳動と二次元
ゲル電気泳動における二つのバンドの移動度には
差が認められた。

実施例２実施例１における界面活性剤をポリオキシエチ
レン（平均７モル）ラウリルエーテル硫酸ナトリ
ウムに起き換え、同様の操作を行つた。但し、本
発明によるポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて（Na⁺、K⁺）ATPaseの泳動速度は用いる
界面活性剤によつて異なるため、あらかじめ参考
例に示した予備試験を、上記界面活性剤に置き換
えて目的とする膜蛋白質の泳動位置を求めておい
た。その結果、ATPase活性は陽性、純度は極め
て良かつた。

実施例３ポリオキシエチレン（平均10モル）ノニルフエ
ニルエーテル硫酸ナトリウムを用いて実施例１お
よび２に記載した操作を行つた結果、ATPase活
性は陽性であり、純度は極めて良好であつた。

比較例 SDSを用いて参考例と同様の操作を行つたとこ
ろ明瞭な二本のバンドが得られた。明瞭な二本の
バンドを切り出した後、再構成することにより
ATPase活性の有無を判定したところ活性は陰性
であつた。又、スラブ式二次元ゲル電気泳動法に
より純度の確認をした結果、明瞭な二本のバンド
のうち移動度の大きなものは二次元電気泳動にお
いても移動度が大きな単一のスポツトになり、も
う一方の移動度の比較的小さな明瞭なバンドは、
二次元電気泳動においても比較的移動度が小さな
単一のスポツトになり、いずれも一次元ゲル電気
泳動で得られた移動度とほとんど差がなかつた。
即ち、SDSを用いると、（Na⁺、K⁺）ATPaseの
αとβのサブユニツトは、流体力学的体積を変化
させ、結果として生体機能の回復が不可能になる
まで変性しているといえる。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式RO（―XO）_n――（―YO）―_oSO₃M （式中Ｒは炭素数６〜22のアルキル基又はアルキ
ルフエニル基であり、ＸおよびＹは炭素数１〜４
の炭化水素であり、ｍおよびｎはそれぞれ０〜
20、ｍ＋ｎは４〜40であり、Ｍはアルカリ金属、
アルカリ土類金属、アミン、アンモニウムであ
る。）で示される界面活性剤共存下でのゲル電気
泳動法を用いることを特徴とする生体膜蛋白質の
分離精製法。