JP2654681B2 - ポリマー、および電気泳動のためのゲルとしてのその使用方法 - Google Patents
ポリマー、および電気泳動のためのゲルとしてのその使用方法Info
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- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
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- C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
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- Y10S524/00—Synthetic resins or natural rubbers -- part of the class 520 series
- Y10S524/916—Hydrogel compositions
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、ポリマー、および電気泳動のためのゲル
としてのその使用方法に関する。
としてのその使用方法に関する。
発明の背景 電気泳動は、電界の影響のもとに分子または他の単位
が支持媒質に沿って移動する技術である。泳動速度が電
荷および摩擦抵抗性に依存した状態で、異なった種類の
分子および単位が異なって動作するので、その技術は分
離の目的に広く使用される。支持媒質は通常ゲルであ
り、かつ平らなシートの形で使用される。分離されるべ
き混合物はシートの一方端に位置づけられ、かつ分離を
もたらす混合物内の分子または単位の差動泳動を引き起
こすシートに沿って（一方端から他方端へ）、適当な電
界が与えられる。
が支持媒質に沿って移動する技術である。泳動速度が電
荷および摩擦抵抗性に依存した状態で、異なった種類の
分子および単位が異なって動作するので、その技術は分
離の目的に広く使用される。支持媒質は通常ゲルであ
り、かつ平らなシートの形で使用される。分離されるべ
き混合物はシートの一方端に位置づけられ、かつ分離を
もたらす混合物内の分子または単位の差動泳動を引き起
こすシートに沿って（一方端から他方端へ）、適当な電
界が与えられる。
電気泳動は多くの目的に応用されることができ、かつ
生物体に見出される分子である有生分子の混合物の分離
に典型的に使用される。これらは、多くの多糖類、ポリ
リン酸、およびプロテオグリカンと同様に、細胞蛋白質
および核酸、たとえばDNA（デオキシリボ核酸）および
その断片または変性されたものによって典型化される。
ゲルそれ自体が電界によって影響されるべきでないこと
が当然重要である。
生物体に見出される分子である有生分子の混合物の分離
に典型的に使用される。これらは、多くの多糖類、ポリ
リン酸、およびプロテオグリカンと同様に、細胞蛋白質
および核酸、たとえばDNA（デオキシリボ核酸）および
その断片または変性されたものによって典型化される。
ゲルそれ自体が電界によって影響されるべきでないこと
が当然重要である。
有生分子の電気泳動分離のために最も広く使用される
対流防止媒質は、アクリルアミドポリマーまたはアガロ
ースに基づいている。これらの両方とも、特にいかなる
電荷（ポリアクリルアミド）も持たず、しかも少数の帯
電群（アガロース）のみしか持たない親水性の比較的安
定したポリマーである（参考文献１を参照されたい）。
対流防止媒質は、アクリルアミドポリマーまたはアガロ
ースに基づいている。これらの両方とも、特にいかなる
電荷（ポリアクリルアミド）も持たず、しかも少数の帯
電群（アガロース）のみしか持たない親水性の比較的安
定したポリマーである（参考文献１を参照されたい）。
公知のアクリルアミドポリマーゲルは、N,N′−メチ
レンビスアクリルアミド（ビス）によって交差結合され
たアクリルアミドである。それらは、これ以降ポリ（ア
クリルアミド＋ビス）と称され、かつ変性または非変性
状態にもかかわらず、２ないし５から1000kDaまでの分
子質量を有する分子の分離に優れている（参考文献２−
４を参照されたい）。しかしながら、最低の作用可能な
濃度（約３％）のポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲルで
さえもその顕著なふるい分け効果のため、より大きな分
子または多分子の複合体は十分に分解されることができ
ない。他方では、より多孔質のアガロースゲルはいくつ
かの応用では適当ではない（参考文献5,6を参照された
い）。それは概して、マトリックス内の残余の帯電群に
よって引き起こされた内浸透が分解を弱めるからであ
る。
レンビスアクリルアミド（ビス）によって交差結合され
たアクリルアミドである。それらは、これ以降ポリ（ア
クリルアミド＋ビス）と称され、かつ変性または非変性
状態にもかかわらず、２ないし５から1000kDaまでの分
子質量を有する分子の分離に優れている（参考文献２−
４を参照されたい）。しかしながら、最低の作用可能な
濃度（約３％）のポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲルで
さえもその顕著なふるい分け効果のため、より大きな分
子または多分子の複合体は十分に分解されることができ
ない。他方では、より多孔質のアガロースゲルはいくつ
かの応用では適当ではない（参考文献5,6を参照された
い）。それは概して、マトリックス内の残余の帯電群に
よって引き起こされた内浸透が分解を弱めるからであ
る。
ビスの濃度を５％よりも高く増加することによって
（参考文献7,8）、または新しい交差結合体を使用する
ことによって（参考文献９）、より多孔質のポリアクリ
ルアミドゲルを生成しようとする数多くの試みがなされ
てきた。さらに、複合ポリアクリルアミド−アガロース
ゲルもまた、電気泳動のための媒質として試験されてき
た（参考文献10−12）。
（参考文献7,8）、または新しい交差結合体を使用する
ことによって（参考文献９）、より多孔質のポリアクリ
ルアミドゲルを生成しようとする数多くの試みがなされ
てきた。さらに、複合ポリアクリルアミド−アガロース
ゲルもまた、電気泳動のための媒質として試験されてき
た（参考文献10−12）。
より大きな有生分子の電気泳動分析に付加えて、多孔
質の高いマトリックスが、ポリ（アクリルアミド＋ビ
ス）ゲルの広いふるい分けが不利益を示す他の電気泳動
技術に有益であろう。これらは、滴定曲線内（参考文献
５）だけでなく、両性担体または固定化pH勾配（IPG）
内に（参考文献13）等電点電気泳動（IEF）を含む。さ
らに、非ふるい分け媒質が、多相域電気泳動（multipha
sic zone electrophoresis）内の濃縮用ゲルに必要と
される（参考文献14−17）。
質の高いマトリックスが、ポリ（アクリルアミド＋ビ
ス）ゲルの広いふるい分けが不利益を示す他の電気泳動
技術に有益であろう。これらは、滴定曲線内（参考文献
５）だけでなく、両性担体または固定化pH勾配（IPG）
内に（参考文献13）等電点電気泳動（IEF）を含む。さ
らに、非ふるい分け媒質が、多相域電気泳動（multipha
sic zone electrophoresis）内の濃縮用ゲルに必要と
される（参考文献14−17）。
この発明は、電気泳動で使用するのに適当なゲルとし
て、使用するための新しいポリマーを提供することを目
的とする。
て、使用するための新しいポリマーを提供することを目
的とする。
発明の概要 この発明の１つの局面に従えば、２つのまたはそれよ
りも多くの二重結合を有する交差結合体（CL）によって
交差結合されたＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（NAT）を含むポリマーが提供さ
れる。このポリマーは、便宜上ポリ（NAT＋CL）と称さ
れてもよい。
りも多くの二重結合を有する交差結合体（CL）によって
交差結合されたＮ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（NAT）を含むポリマーが提供さ
れる。このポリマーは、便宜上ポリ（NAT＋CL）と称さ
れてもよい。
N,N′−（1,2−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリル
アミド、N,N′−ビス−アクリリルシスタミンおよびジ
アクリル酸エチレンのような交差結合体が使用されても
よいが、好ましい交差結合体はN,N′−メチレンビスア
クリルアミド（ビス）を含む。その際ポリマーは、便宜
上ポリ（NAT＋ビス）と称されてもよい。
アミド、N,N′−ビス−アクリリルシスタミンおよびジ
アクリル酸エチレンのような交差結合体が使用されても
よいが、好ましい交差結合体はN,N′−メチレンビスア
クリルアミド（ビス）を含む。その際ポリマーは、便宜
上ポリ（NAT＋ビス）と称されてもよい。
この発明のポリ（NAT＋CL）は、単にNATと交差結合体
とを反応させることによって本質的に調製されてもよ
い。NATおよびビスはアクリル酸型の二重結合を持ち、
かつアクリル酸モノマーの重合は、様々な方法、たとえ
ば熱、ガンマ放射線、遊離基との反応等によって達成さ
れ得ることは公知である。NATおよびCLの濃度、温度、
様々な溶媒およびイニシエータのような重合化状態に依
存して、形成された交差結合ポリマーはゲル状であって
もよく、またはゲルのものとは異なった特性を有しても
よい。
とを反応させることによって本質的に調製されてもよ
い。NATおよびビスはアクリル酸型の二重結合を持ち、
かつアクリル酸モノマーの重合は、様々な方法、たとえ
ば熱、ガンマ放射線、遊離基との反応等によって達成さ
れ得ることは公知である。NATおよびCLの濃度、温度、
様々な溶媒およびイニシエータのような重合化状態に依
存して、形成された交差結合ポリマーはゲル状であって
もよく、またはゲルのものとは異なった特性を有しても
よい。
形成されたポリ（NAT＋CL）は、物理的状態の範囲で
得られることができる。特に興味のある１つの状態は、
ゲルのような、すなわちポリマー内の水の固定分散であ
る。これらのゲルは、電気泳動のための支持媒質として
大きな価値がある。
得られることができる。特に興味のある１つの状態は、
ゲルのような、すなわちポリマー内の水の固定分散であ
る。これらのゲルは、電気泳動のための支持媒質として
大きな価値がある。
したがってさらに他の局面において、この発明はポリ
（NAT＋CL）を含む電気泳動で使用するためゲルを提供
する。
（NAT＋CL）を含む電気泳動で使用するためゲルを提供
する。
交差結合体CLは好ましくはビスである。
ゲルは、望ましくは４％と24％（Ｔ）の間のポリ（NA
T＋CL）を含み、その５％（Ｃ）またはそれ以下がビス
である。なぜならば、このようなゲルはより透明である
からである。
T＋CL）を含み、その５％（Ｃ）またはそれ以下がビス
である。なぜならば、このようなゲルはより透明である
からである。
ゲル濃度（Ｔ）および交差結合体の量（Ｃ）は、次の
ように規定される。ゲルの全体濃度（Ｔ）は、溶液の10
0mlごとのグラムで表わされる、モノマーと交差結合体
の重量の和（すなわち、ポリマーを作る全固体）であ
る。交差結合体の濃度（Ｃ）は、モノマーと交差結合体
の重量の和に関連して交差結合体の百分重量として与え
られる。こうして、たとえば５％T,3％Ｃは、100mlの溶
液内に4.850gのNATおよび0.150gのCLを含むであろう。
小さいＣを有するゲルでは、モノマー濃度とＴとの差は
非常に小さく、かつそれは時々論議では無視される。
ように規定される。ゲルの全体濃度（Ｔ）は、溶液の10
0mlごとのグラムで表わされる、モノマーと交差結合体
の重量の和（すなわち、ポリマーを作る全固体）であ
る。交差結合体の濃度（Ｃ）は、モノマーと交差結合体
の重量の和に関連して交差結合体の百分重量として与え
られる。こうして、たとえば５％T,3％Ｃは、100mlの溶
液内に4.850gのNATおよび0.150gのCLを含むであろう。
小さいＣを有するゲルでは、モノマー濃度とＴとの差は
非常に小さく、かつそれは時々論議では無視される。
ゲルは均質（すなわち全体的に均一なＴを有する）で
あってもよく、またはたとえば、ゲルのシートの長さに
沿って４％ないし24％（Ｔ）の範囲にあるポリ（NAT＋C
L）含量を有する、勾配ゲルの形であってもよい。
あってもよく、またはたとえば、ゲルのシートの長さに
沿って４％ないし24％（Ｔ）の範囲にあるポリ（NAT＋C
L）含量を有する、勾配ゲルの形であってもよい。
さらにゲルは、ポリアクリルアミドまたはアガロース
のようなさらに他のポリマー材料と混合されてもよく、
または付加的なモノマーを取入れてもよい。このような
複合ゲルは、便宜上、単にポリ（NAT＋CL）である４％
（Ｔ）の一方端に、および単にポリ（アクリルアミド＋
CL）である24％（Ｔ）の他方端に組成を有する、勾配ゲ
ルの形である。このようなゲルは、NATをさらに他のゲ
ル材料、たとえばアクリルアミドおよび交差結合体と共
重合化することによって有利にも調製されてもよい。
のようなさらに他のポリマー材料と混合されてもよく、
または付加的なモノマーを取入れてもよい。このような
複合ゲルは、便宜上、単にポリ（NAT＋CL）である４％
（Ｔ）の一方端に、および単にポリ（アクリルアミド＋
CL）である24％（Ｔ）の他方端に組成を有する、勾配ゲ
ルの形である。このようなゲルは、NATをさらに他のゲ
ル材料、たとえばアクリルアミドおよび交差結合体と共
重合化することによって有利にも調製されてもよい。
この発明に従ってゲルは、電気泳動分離および等電点
電気泳動のための媒質としてうまく作用するとわかる。
４％ないし24％のポリ（NAT＋CL）勾配ゲルは、自然蛋
白質を大きさに従って分解する。これらの勾配ゲルの排
除限界は、同じ濃度のポリアクリルアミド勾配ゲルの排
除限界の３倍よりも多い3x106Daを越えることがわかっ
た。こうして、このようなポリ（NAT＋CL）ゲルは、大
きな自然蛋白質の分解のための比較し得るポリアクリル
アミドゲルよりも優れている。その結果によって、ポリ
アクリルアミドマトリックスによる広いふるい分けが望
ましくない応用で、ポリ（NAT＋CL）−ビスゲルが有利
にも使用され得ることもまた示される。
電気泳動のための媒質としてうまく作用するとわかる。
４％ないし24％のポリ（NAT＋CL）勾配ゲルは、自然蛋
白質を大きさに従って分解する。これらの勾配ゲルの排
除限界は、同じ濃度のポリアクリルアミド勾配ゲルの排
除限界の３倍よりも多い3x106Daを越えることがわかっ
た。こうして、このようなポリ（NAT＋CL）ゲルは、大
きな自然蛋白質の分解のための比較し得るポリアクリル
アミドゲルよりも優れている。その結果によって、ポリ
アクリルアミドマトリックスによる広いふるい分けが望
ましくない応用で、ポリ（NAT＋CL）−ビスゲルが有利
にも使用され得ることもまた示される。
ポリ（NAT＋CL）ゲルは、核酸の分離にもまた非常に
優れている。その分解は、100または200と4000ないし50
00との間の塩基対を有する酸に特に優れている。最適化
状態のもとで、20kよりも多くの塩基のDNA分子は完全に
分解されることができる（参考文献28）。
優れている。その分解は、100または200と4000ないし50
00との間の塩基対を有する酸に特に優れている。最適化
状態のもとで、20kよりも多くの塩基のDNA分子は完全に
分解されることができる（参考文献28）。
ここで使用されるように、用語「核酸」は、小さい分
子および大きい分子の両方（オリゴヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチド）ならびにその断片を含むように意図
される。ポリ（NAT＋CL）ゲルの最も興味ある応用の１
つは、DNA塩基配列の分析であろう。分解される必要の
あるDNA断片の大きさは、ポリ（NAT＋ビス）ゲルの最適
分離範囲内に十分にある、数十ないし数百のヌクレオチ
ドの範囲にある（参考文献28）。
子および大きい分子の両方（オリゴヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチド）ならびにその断片を含むように意図
される。ポリ（NAT＋CL）ゲルの最も興味ある応用の１
つは、DNA塩基配列の分析であろう。分解される必要の
あるDNA断片の大きさは、ポリ（NAT＋ビス）ゲルの最適
分離範囲内に十分にある、数十ないし数百のヌクレオチ
ドの範囲にある（参考文献28）。
さらに、ポリ（NAT＋CL）ゲルは優れた乾燥特性およ
び膨潤特性を有する。すなわち、それらは乾燥しても割
れず、かつ再び湿らせても短時間で元の大きさに膨張す
る。
び膨潤特性を有する。すなわち、それらは乾燥しても割
れず、かつ再び湿らせても短時間で元の大きさに膨張す
る。
さらに他の局面においてこの発明は、この発明に従っ
て支持媒質としてポリ（NAT＋CL）ゲルを使用すること
によって電気泳動がもたらされる電気泳動の方法をもま
た提供する。
て支持媒質としてポリ（NAT＋CL）ゲルを使用すること
によって電気泳動がもたらされる電気泳動の方法をもま
た提供する。
この発明の方法は、自然蛋白質、変性蛋白質、核酸、
変性核酸、固有の帯電群（たとえば、多糖類、ポリリン
酸、プロテオグリカン、合成ポリマーなど）を有する他
の分子、および非帯電分子の誘導化によって形成された
電荷を有する分子を含む、広範囲の材料を分解するのに
使用され得る。
変性核酸、固有の帯電群（たとえば、多糖類、ポリリン
酸、プロテオグリカン、合成ポリマーなど）を有する他
の分子、および非帯電分子の誘導化によって形成された
電荷を有する分子を含む、広範囲の材料を分解するのに
使用され得る。
連続のまたは不連続の緩衝系または勾配ゲルでの均質
ゲル上で、時間または電界の不連続を伴なって、または
それを伴なわずに電気泳動が行なわれ得る。
ゲル上で、時間または電界の不連続を伴なって、または
それを伴なわずに電気泳動が行なわれ得る。
この発明は、両性担体によって形成されたpH勾配で、
または固定化pH勾配で等電点電気泳動にもまた応用され
得る。
または固定化pH勾配で等電点電気泳動にもまた応用され
得る。
この発明のポリ（NAT＋CL）を作るのに使用されたＮ
−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンまたはNATは、公知の化合物であり、かつ公知の方
法のいずれか１つ、たとえば塩化アクリロイルとトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの反応によって調
製され得る。しかしながら、我々は、反応の注意深い制
御、ならびに最終の生成物の引き続く分離および精製が
より良い質のNATを与えることがわかった。
−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンまたはNATは、公知の化合物であり、かつ公知の方
法のいずれか１つ、たとえば塩化アクリロイルとトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの反応によって調
製され得る。しかしながら、我々は、反応の注意深い制
御、ならびに最終の生成物の引き続く分離および精製が
より良い質のNATを与えることがわかった。
したがって、さらに他の局面において、この発明は、
塩化アクリロイルとトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（トリス）との反応によってＮ−アクリロイル−
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（NAT）を調
製する方法を提供し、その反応は、水の相内の所望のNA
T生成物を与えるように強塩基の存在においてかつ二相
の水性有機溶媒において達成され、かつこの相は、強陽
イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂の混合物を使
用するイオン交換方法によって分離されかつ精製され、
さらに所望のNATを与えるように気圧で蒸発される。
塩化アクリロイルとトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（トリス）との反応によってＮ−アクリロイル−
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（NAT）を調
製する方法を提供し、その反応は、水の相内の所望のNA
T生成物を与えるように強塩基の存在においてかつ二相
の水性有機溶媒において達成され、かつこの相は、強陽
イオン交換樹脂および弱陰イオン交換樹脂の混合物を使
用するイオン交換方法によって分離されかつ精製され、
さらに所望のNATを与えるように気圧で蒸発される。
強塩基は好ましくはアルカリ金属水酸化物であり、典
型的には水酸化カリウムであり、かつその反応は便宜上
８ないし９のpHで達成される。さらに、有利にもその反
応は０℃にまたはそれに近い温度に冷却することによっ
ては行なわれ、かつ亜硝酸ナトリウムのような重合イン
ヒビターの存在によって行なわれる。
型的には水酸化カリウムであり、かつその反応は便宜上
８ないし９のpHで達成される。さらに、有利にもその反
応は０℃にまたはそれに近い温度に冷却することによっ
ては行なわれ、かつ亜硝酸ナトリウムのような重合イン
ヒビターの存在によって行なわれる。
水性有機二相溶媒は好ましくはハロカーボン水であ
り、典型的にはジクロロメタン水である。
り、典型的にはジクロロメタン水である。
調製されたNATを含む分離された水の相は、有利にも
強陽イオン交換樹脂（IR−120,H+型）と弱陰イオン交換
樹脂（IRA−68,遊離塩基型）との混合物を使用すること
によって精製される。
強陽イオン交換樹脂（IR−120,H+型）と弱陰イオン交換
樹脂（IRA−68,遊離塩基型）との混合物を使用すること
によって精製される。
この発明はさらに、上で規定された方法によって調製
されるときはいつでも、Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンを拡げる。
されるときはいつでも、Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンを拡げる。
この発明は、添付の図面を参照することにより図示す
ることによってさらに述べられるであろう。
ることによってさらに述べられるであろう。
第１図は、５重量％（0.7M）アクリルアミド（Ａ）お
よび12.5重量％（0.7M）NAT（Ｂ）を含むモノマーの重
合運動を示すグラフである。
よび12.5重量％（0.7M）NAT（Ｂ）を含むモノマーの重
合運動を示すグラフである。
第２図は、様々な全体的なモノマー濃度（Ｔ）および
交差結合体濃度（Ｃ）でのポリ（NAT＋ビス）ゲルの透
明度を示す。
交差結合体濃度（Ｃ）でのポリ（NAT＋ビス）ゲルの透
明度を示す。
第３図は、ポリアクリルアミド勾配（４％ないし24％
T,2.6％Ｃ）ゲルでの薬理的高分子重量標準蛋白質の電
気泳動の結果を示す。
T,2.6％Ｃ）ゲルでの薬理的高分子重量標準蛋白質の電
気泳動の結果を示す。
第４図は、ポリ（NAT＋ビス）勾配ゲル（４％ないし2
4％T,2.6％Ｃ）を使用することにより、第３図と類似し
ている。
4％T,2.6％Ｃ）を使用することにより、第３図と類似し
ている。
第５図は、両方のモノマー溶液内でビスの同等の濃度
（2.6％Ｃ）を有する、４％（Ｔ）NATで始まりかつ24％
（Ｔ）アクリルアミドで終わる勾配ゲルを使用すること
により、第３図および第４図と類似している。
（2.6％Ｃ）を有する、４％（Ｔ）NATで始まりかつ24％
（Ｔ）アクリルアミドで終わる勾配ゲルを使用すること
により、第３図および第４図と類似している。
第６図は、Ａ＝ポリアクリルアミド、Ｂ＝ポリ（NAT
＋ビス）およびＣ＝複合ポリ（NAT＋ビス）ポリアクリ
ルアミド勾配ゲルである、第３図、第４図および第５図
で使用された３つのゲル内の蛋白質の1200Vhの後の、泳
動距離（mmで表わされる）に対する対数分子重量のグラ
フである。
＋ビス）およびＣ＝複合ポリ（NAT＋ビス）ポリアクリ
ルアミド勾配ゲルである、第３図、第４図および第５図
で使用された３つのゲル内の蛋白質の1200Vhの後の、泳
動距離（mmで表わされる）に対する対数分子重量のグラ
フである。
第７図は、ポリ（NAT＋ビス）ゲル（６％T,3％Ｃ）内
の薬理的広pH範囲標準蛋白質の等電点電気泳動の結果を
示す。
の薬理的広pH範囲標準蛋白質の等電点電気泳動の結果を
示す。
NATの合成 合成のためのトリス、塩化アクリロイルおよび他の化
学薬品がフルカ（Fluka）からのものである。
学薬品がフルカ（Fluka）からのものである。
トリス（60.5g,0.5mol）が120mlの水で溶解した。こ
の溶液に3gのK2CO3および3.5gのNaNO2（重合インヒビタ
ー）が付加され、かつその溶液は氷槽内で冷却された。
約100mlのジクロロメタンが注ぎ込まれ、かつその混合
物が発煙棚で磁気撹拌器によって激しく撹拌された。
の溶液に3gのK2CO3および3.5gのNaNO2（重合インヒビタ
ー）が付加され、かつその溶液は氷槽内で冷却された。
約100mlのジクロロメタンが注ぎ込まれ、かつその混合
物が発煙棚で磁気撹拌器によって激しく撹拌された。
KOH（40g）が50mlの水の中で溶解されかつ冷却され
た。蒸留されたばかりの塩化アクリロイル（50g,0.55mo
l）が、50mlのジクロロメタンと混合された。この溶液
の約３分の１が15分間内に、撹拌された懸濁液に部分的
に付加され、それは引き続き水酸化カリウム溶液および
塩化アクリロイル溶液の交互の付加（1mlないし2mlアリ
コートで）に続く。pHは狭範囲のpH紙によってモニター
され、かつ８と９の間に保たれた。塩化アクリロイルの
すべてが付加された後で、pHがわずかにアルカリ性に保
たれた状態で、懸濁液が氷槽内で半時間激しく撹拌され
た。
た。蒸留されたばかりの塩化アクリロイル（50g,0.55mo
l）が、50mlのジクロロメタンと混合された。この溶液
の約３分の１が15分間内に、撹拌された懸濁液に部分的
に付加され、それは引き続き水酸化カリウム溶液および
塩化アクリロイル溶液の交互の付加（1mlないし2mlアリ
コートで）に続く。pHは狭範囲のpH紙によってモニター
され、かつ８と９の間に保たれた。塩化アクリロイルの
すべてが付加された後で、pHがわずかにアルカリ性に保
たれた状態で、懸濁液が氷槽内で半時間激しく撹拌され
た。
次いで相が分離され、かつより低い有機相が廃棄され
た。無水エタノールの４容が、氷槽内で冷却する間に水
の相に付加された。沈澱された塩が濾過によって除去さ
れた。塩化物の反応が陰性になるまで、強陽イオン交換
体（IR−120,H+型）のおよび弱陰イオン交換体（IRA−6
8,遊離基）の部分が撹拌された濾液に付加された。混合
されたイオン交換体が除去され、かつ漏斗の上または広
い棚の中で洗浄された。化合洗液および濾液が結晶皿
（30x180cm）に注ぎ込まれ、かつ発煙棚中に放置され
た。溶媒は、３日ないし５日間以内で蒸発した。結晶は
焼結漏斗上で収集され、かつ冷却されたエタノールで洗
浄された。収集は48gまたは55％であり、かつ結晶は＋
４℃で保存された。
た。無水エタノールの４容が、氷槽内で冷却する間に水
の相に付加された。沈澱された塩が濾過によって除去さ
れた。塩化物の反応が陰性になるまで、強陽イオン交換
体（IR−120,H+型）のおよび弱陰イオン交換体（IRA−6
8,遊離基）の部分が撹拌された濾液に付加された。混合
されたイオン交換体が除去され、かつ漏斗の上または広
い棚の中で洗浄された。化合洗液および濾液が結晶皿
（30x180cm）に注ぎ込まれ、かつ発煙棚中に放置され
た。溶媒は、３日ないし５日間以内で蒸発した。結晶は
焼結漏斗上で収集され、かつ冷却されたエタノールで洗
浄された。収集は48gまたは55％であり、かつ結晶は＋
４℃で保存された。
形成されたNATが長期間保存される必要がある場合、
混合されたイオン交換体での処理の後で、少量の（0.01
−0.1％,w/w）のｐ−メトオキシフェノールがNAT溶液に
付加されなければならない。ｐ−メトオキシフェノール
を除外した調製では、この付加された重合インヒビター
を伴った調製でよりも、非常に多くの不溶性のポリマー
が１年後に生じることが注目できる。
混合されたイオン交換体での処理の後で、少量の（0.01
−0.1％,w/w）のｐ−メトオキシフェノールがNAT溶液に
付加されなければならない。ｐ−メトオキシフェノール
を除外した調製では、この付加された重合インヒビター
を伴った調製でよりも、非常に多くの不溶性のポリマー
が１年後に生じることが注目できる。
こうして得られたNATはほとんどの応用に十分に純粋
であるが、さらに他の精製は、必要であれば、アセトニ
トリルからの再結晶によって達成され得る（参考文献1
8）。
であるが、さらに他の精製は、必要であれば、アセトニ
トリルからの再結晶によって達成され得る（参考文献1
8）。
重合インヒビターが存在せず、または温度が40−50℃
よりも上に上昇するとき、NATは合成および混合の間自
発的に重合化する傾向にある。インヒビター（ｐ−メト
オキシフェノール）が存在しかつ低い温度（30−35℃）
であるときでさえも、様々な量の不溶性ポリマーは、脱
塩溶液の蒸発が回転蒸発器上で行なわれたとき常に存在
した。これらのポリマーは濾過によって除去されること
ができるが、しかし形成された不溶性ポリマーの量が無
視し得るので、結晶皿から水が蒸発したときの方が優れ
ていた（上記を参照されたい）。結晶がアセトニトリル
から試みられる前に、インヒビター（ｐ−メトオキシフ
ェノール）が付加されなければならない。エタノールに
よる塩の沈澱は省かれ得るが、しかし次いでより多量の
イオン交換体が必要とされ、かつ収量が減少される。強
陽イオン交換体（IRA−400,水酸化物型）の弱のもの（I
RA−−68）との置換もまた、その収量を低下させた。混
合されたイオン交換体は、再生および再使用のために簡
単に塩化ナトリウム飽和溶液から回収され得る。
よりも上に上昇するとき、NATは合成および混合の間自
発的に重合化する傾向にある。インヒビター（ｐ−メト
オキシフェノール）が存在しかつ低い温度（30−35℃）
であるときでさえも、様々な量の不溶性ポリマーは、脱
塩溶液の蒸発が回転蒸発器上で行なわれたとき常に存在
した。これらのポリマーは濾過によって除去されること
ができるが、しかし形成された不溶性ポリマーの量が無
視し得るので、結晶皿から水が蒸発したときの方が優れ
ていた（上記を参照されたい）。結晶がアセトニトリル
から試みられる前に、インヒビター（ｐ−メトオキシフ
ェノール）が付加されなければならない。エタノールに
よる塩の沈澱は省かれ得るが、しかし次いでより多量の
イオン交換体が必要とされ、かつ収量が減少される。強
陽イオン交換体（IRA−400,水酸化物型）の弱のもの（I
RA−−68）との置換もまた、その収量を低下させた。混
合されたイオン交換体は、再生および再使用のために簡
単に塩化ナトリウム飽和溶液から回収され得る。
NAT＋CL（ビス）の重合化 NATおよびビスはアクリル酸型の二重結合を持ち、か
つアクリル酸モノマーの重合は、様々な方法、たとえば
熱、ガンマ放射線、遊離基との反応などによって達成さ
れ得ることが公知である。NATおよびCLの濃度、温度、
様々な溶媒およびイニシエータのような重合状態に依存
して、形成された交差結合ポリマーはゲル状であっても
よく、またはゲルのものとは異なった特性を有してもよ
い。
つアクリル酸モノマーの重合は、様々な方法、たとえば
熱、ガンマ放射線、遊離基との反応などによって達成さ
れ得ることが公知である。NATおよびCLの濃度、温度、
様々な溶媒およびイニシエータのような重合状態に依存
して、形成された交差結合ポリマーはゲル状であっても
よく、またはゲルのものとは異なった特性を有してもよ
い。
電気泳動のためのゲルの生成 電気泳動のためのすべての材料はバイオ−ラドからの
ものであった。薬理的電気泳動装置内で、電気泳動が行
なわれた。薬理的ポリアクリルアミドゲル電気泳動マニ
ュアル（Pharmacia Polyacrylamide Gel Electropho
resis Manual）の指示に従ってＶ形の鋳込装置内のカ
セット容器（80x80x0.7mm）内で、勾配ゲル（４−24％
T,2.6％Ｃ）が調製された。
ものであった。薬理的電気泳動装置内で、電気泳動が行
なわれた。薬理的ポリアクリルアミドゲル電気泳動マニ
ュアル（Pharmacia Polyacrylamide Gel Electropho
resis Manual）の指示に従ってＶ形の鋳込装置内のカ
セット容器（80x80x0.7mm）内で、勾配ゲル（４−24％
T,2.6％Ｃ）が調製された。
４つのポリ（NAT＋ビス）ゲルを調製するために、次
の溶液が作られた。NAT（3.506g）およびビス（0.094
g）が、15mlの0.1Mトリス−HC1,pH9内で、もし必要とあ
ればわずかな加熱のもとで溶解された。（NATはトリス
緩衝液内よりも精製水内での方がよく溶解し、かつまず
初めにそれを水で溶解し、次いで濃縮されたトリス緩衝
液で所望の濃度にまで希釈することが、時々優先され
る。）次いで、3.5mlのこの（24％）溶液が、４％溶液
を作るようにトリス緩衝液で21mlにまで希釈された。こ
れらの溶液は、カセット容器を有する鋳込装置と同様
に、およそ＋４℃にまで冷却された（冷却室では、NAT
は冷却された24％溶液から結晶化する傾向にあり、また
したがって冷却された溶液はすぐに使用されるべきであ
る）。容量0.058mlのN,N,N′,N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED,触媒）および0.770mlの過硫酸アン
モニウム（イニシエータ）溶液（15mg/mlの水）が、21m
lの４＆（NAT＋ビス）溶液に付加された。短時間の混合
の後で、10mlのこの溶液が鋳込装置内に直ちにポンプ注
入された。次いで、11mlの同じ溶液が、（コントロン
（Kontron）から購買された）勾配ミクサの一室に置か
れ、かつ撹拌器が挿入された。24％溶液に0.017mlのTEM
EDおよび0.290mlの過硫酸アンモニウム（15mg/ml）が付
加され、混合され、かつ11mlのこの溶液が勾配ミクサの
別の一室に置かれた。撹拌器およびポンプ（ギルソン、
ミニプルズ（Gilson,minipuls））が始動され、かつ２
つの室の間の管が開かれた。両方の室の内容物が鋳込装
置内にポンプ注入された後、カセット容器内に勾配を置
換するように、（トリス緩衝液内の）40％（w/v）スク
ロース溶液が第１室内に置かれ、かつ鋳込装置内にポン
プ注入された。スクロースフロントがカセット容器の底
に達したとき、ポンプ注入が止められた。次いで、鋳込
装置とポンプとの間の管の取付がクランプによって閉じ
られ、ポンプから開放され、かつその開端部が鋳込装置
内の（NAT＋ビス）溶液のレベルの上に留まるような方
法で鋳込装置に取付けられた。次いで、鋳込装置が冷却
室から注意深く取出され、クランプが開けられ（重合の
間システムが開かれないとき勾配の妨害がたまに観察さ
れた）、かつ少なくとも２時間または好ましくはそれよ
りも長く（一晩中）重合化するようにゲルが妨害それな
いまま残った。ポリ（NAT＋ビス）ゲルは（＋４℃）冷
蔵されて保存されなければならない。なぜならば、この
ようなゲルはガラスプレートによく付着しないからであ
る。
の溶液が作られた。NAT（3.506g）およびビス（0.094
g）が、15mlの0.1Mトリス−HC1,pH9内で、もし必要とあ
ればわずかな加熱のもとで溶解された。（NATはトリス
緩衝液内よりも精製水内での方がよく溶解し、かつまず
初めにそれを水で溶解し、次いで濃縮されたトリス緩衝
液で所望の濃度にまで希釈することが、時々優先され
る。）次いで、3.5mlのこの（24％）溶液が、４％溶液
を作るようにトリス緩衝液で21mlにまで希釈された。こ
れらの溶液は、カセット容器を有する鋳込装置と同様
に、およそ＋４℃にまで冷却された（冷却室では、NAT
は冷却された24％溶液から結晶化する傾向にあり、また
したがって冷却された溶液はすぐに使用されるべきであ
る）。容量0.058mlのN,N,N′,N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED,触媒）および0.770mlの過硫酸アン
モニウム（イニシエータ）溶液（15mg/mlの水）が、21m
lの４＆（NAT＋ビス）溶液に付加された。短時間の混合
の後で、10mlのこの溶液が鋳込装置内に直ちにポンプ注
入された。次いで、11mlの同じ溶液が、（コントロン
（Kontron）から購買された）勾配ミクサの一室に置か
れ、かつ撹拌器が挿入された。24％溶液に0.017mlのTEM
EDおよび0.290mlの過硫酸アンモニウム（15mg/ml）が付
加され、混合され、かつ11mlのこの溶液が勾配ミクサの
別の一室に置かれた。撹拌器およびポンプ（ギルソン、
ミニプルズ（Gilson,minipuls））が始動され、かつ２
つの室の間の管が開かれた。両方の室の内容物が鋳込装
置内にポンプ注入された後、カセット容器内に勾配を置
換するように、（トリス緩衝液内の）40％（w/v）スク
ロース溶液が第１室内に置かれ、かつ鋳込装置内にポン
プ注入された。スクロースフロントがカセット容器の底
に達したとき、ポンプ注入が止められた。次いで、鋳込
装置とポンプとの間の管の取付がクランプによって閉じ
られ、ポンプから開放され、かつその開端部が鋳込装置
内の（NAT＋ビス）溶液のレベルの上に留まるような方
法で鋳込装置に取付けられた。次いで、鋳込装置が冷却
室から注意深く取出され、クランプが開けられ（重合の
間システムが開かれないとき勾配の妨害がたまに観察さ
れた）、かつ少なくとも２時間または好ましくはそれよ
りも長く（一晩中）重合化するようにゲルが妨害それな
いまま残った。ポリ（NAT＋ビス）ゲルは（＋４℃）冷
蔵されて保存されなければならない。なぜならば、この
ようなゲルはガラスプレートによく付着しないからであ
る。
NATおよびビス（Ｔ＝６％,C＝３％）から構成された
等電点電気泳動のためのゲル（120x80x1mm）が、毛管使
用によって鋳込まれた。作られたばかりのモノマー溶液
は通常混合されたイオン交換体で処理され、かつ0.45μ
ｍ濾過膜で濾過された。薬理的PD−10コラムに（それぞ
れ３つのセグメントに）詰められた強陽イオン（Dowex
50,H+）交換体と弱陰イオン（IRA 68,遊離基）交換体と
の組合わせが、AG 501X8（Ｄ）混合されたイオン交換体
（バイオーラド）よりも優れていることがわかった。10
ml溶液では、水の中のNATおよびビス、0.020mlのTEMED
および0.250mlの過硫酸アンモニウム（15mg/ml）が使用
された。
等電点電気泳動のためのゲル（120x80x1mm）が、毛管使
用によって鋳込まれた。作られたばかりのモノマー溶液
は通常混合されたイオン交換体で処理され、かつ0.45μ
ｍ濾過膜で濾過された。薬理的PD−10コラムに（それぞ
れ３つのセグメントに）詰められた強陽イオン（Dowex
50,H+）交換体と弱陰イオン（IRA 68,遊離基）交換体と
の組合わせが、AG 501X8（Ｄ）混合されたイオン交換体
（バイオーラド）よりも優れていることがわかった。10
ml溶液では、水の中のNATおよびビス、0.020mlのTEMED
および0.250mlの過硫酸アンモニウム（15mg/ml）が使用
された。
ゲルはプラスチックシート（ゲルボンド）上で重合化
され、かつ使用されたガラスプレートは、重合化の後そ
の除去を容易にするために、シラン化によって疎水性に
された。
され、かつ使用されたガラスプレートは、重合化の後そ
の除去を容易にするために、シラン化によって疎水性に
された。
プラスチックシートに固定されたゲルは秤量され、か
つ蒸留水で（15分間に２回）洗浄された。次いでそれ
は、室温で一晩中放置することによって乾燥され（この
段階ではそれは少なくとも１週間＋４℃で保存されるこ
とができる）、かつ再び坪量された。次いで、両性電解
質（最終濃度２重量％）が、失われた重量（ｇ）と等し
い水の容量（m1）で混合され、かつゲルの上にそれが鋳
造されたとき使用された同じ態様で導入された。ゲルの
膨潤は通常２時間で完了され、かつそれは直ちに等電点
電気泳動（IEF）に使用されることができた。
つ蒸留水で（15分間に２回）洗浄された。次いでそれ
は、室温で一晩中放置することによって乾燥され（この
段階ではそれは少なくとも１週間＋４℃で保存されるこ
とができる）、かつ再び坪量された。次いで、両性電解
質（最終濃度２重量％）が、失われた重量（ｇ）と等し
い水の容量（m1）で混合され、かつゲルの上にそれが鋳
造されたとき使用された同じ態様で導入された。ゲルの
膨潤は通常２時間で完了され、かつそれは直ちに等電点
電気泳動（IEF）に使用されることができた。
重合運動およびゲルの試験 同じモル濃度のNATモノマー溶液およびアクリルアミ
ドモノマー溶液の重合運動が、アクリル酸二重結合の消
失と比例する近似UVの吸光度の減少（参考文献19）をモ
ニタすることによって分析された。
ドモノマー溶液の重合運動が、アクリル酸二重結合の消
失と比例する近似UVの吸光度の減少（参考文献19）をモ
ニタすることによって分析された。
0.1Mトリス−HC1緩衝液,pH9.0、石英キューベット、T
EMED（6ul,25％）および過硫酸アンモニウム（35ul,15m
g/ml）内のモノマーの1ml溶液に付加することによっ
て、試験が行なわれた。溶液は素早く混合され、かつジ
イソプロピルエーテルで覆われた。緩衝液に対する1.8
の出発吸光度を与える波長が選択された。その結果は第
１図に示される。
EMED（6ul,25％）および過硫酸アンモニウム（35ul,15m
g/ml）内のモノマーの1ml溶液に付加することによっ
て、試験が行なわれた。溶液は素早く混合され、かつジ
イソプロピルエーテルで覆われた。緩衝液に対する1.8
の出発吸光度を与える波長が選択された。その結果は第
１図に示される。
応用された状態のもとで、重合は２−５分間続くイン
キュベーション（温置）期間によって特徴づけられ、そ
れは、生長するポリマー鎖へのモノマーの急速変換へと
続く。アクリルアミド（第１図のＡ）のほとんどおよび
NAT（第１図のＢ）のすべてが、10分間以内で重合化さ
れる。重合の開始および終了で吸光度の比率から推定さ
れた変換収量（参考文献19）は、非常に類似しているよ
うである。
キュベーション（温置）期間によって特徴づけられ、そ
れは、生長するポリマー鎖へのモノマーの急速変換へと
続く。アクリルアミド（第１図のＡ）のほとんどおよび
NAT（第１図のＢ）のすべてが、10分間以内で重合化さ
れる。重合の開始および終了で吸光度の比率から推定さ
れた変換収量（参考文献19）は、非常に類似しているよ
うである。
低量の交差結合体で形成されたゲルは透明であるが、
しかしそれは高いビス濃度を有するポリ（アクリルアミ
ド＋ビス）ゲルは不透明であることが公知である（参考
文献７）。アクリルアミド−ビス混合物では、不透明度
のオンセットがビスに依存するだけでなくモノマーの全
体濃度にもまた依存することがわかった（参考文献
３）。こうして、モノマーの全体濃度が増加したとき、
より高量の交差結合体が透明なゲルを依然として精製し
た（参考文献３）。
しかしそれは高いビス濃度を有するポリ（アクリルアミ
ド＋ビス）ゲルは不透明であることが公知である（参考
文献７）。アクリルアミド−ビス混合物では、不透明度
のオンセットがビスに依存するだけでなくモノマーの全
体濃度にもまた依存することがわかった（参考文献
３）。こうして、モノマーの全体濃度が増加したとき、
より高量の交差結合体が透明なゲルを依然として精製し
た（参考文献３）。
これらのゲルの透明度をチェックするために、４％
（Ｔ）NATおよび１％（Ｃ）ビスで始まり、かつ24％
（Ｔ）NATおよび16％（Ｃ）ビスで終わる、42個の異な
ったNAT−ビス組合わせが重合化された。その結果は第
２図に示される。
（Ｔ）NATおよび１％（Ｃ）ビスで始まり、かつ24％
（Ｔ）NATおよび16％（Ｃ）ビスで終わる、42個の異な
ったNAT−ビス組合わせが重合化された。その結果は第
２図に示される。
３％よりも少ないビスを有する交差結合されたすべて
のゲルは透明であった。４％ビスを含む、より低いモノ
マー全体濃度（４％および８％）の２つのゲルはなおも
透明であったが、しかし他のより多くのすべての交差結
合されたゲルは濁った。ポリ（アクリルアミド＋ビス）
でわかったように、より濃縮された（24％よりも高い）
ポリ（NAT＋ビス）ゲルが、不透明に換わる前により多
くのビスで作られ得るかどうかを試験するのは不可能で
はなかった（参考文献３）。なぜならば、室温でのNAT
の飽和溶液は約24％であるからである。２個の４％の交
差結合されたゲルの透明度はいくぶんかは予期されない
が、しかし２つの付加的な独立した重合は同じ結果を与
えた。
のゲルは透明であった。４％ビスを含む、より低いモノ
マー全体濃度（４％および８％）の２つのゲルはなおも
透明であったが、しかし他のより多くのすべての交差結
合されたゲルは濁った。ポリ（アクリルアミド＋ビス）
でわかったように、より濃縮された（24％よりも高い）
ポリ（NAT＋ビス）ゲルが、不透明に換わる前により多
くのビスで作られ得るかどうかを試験するのは不可能で
はなかった（参考文献３）。なぜならば、室温でのNAT
の飽和溶液は約24％であるからである。２個の４％の交
差結合されたゲルの透明度はいくぶんかは予期されない
が、しかし２つの付加的な独立した重合は同じ結果を与
えた。
電気泳動の試験結果 ポリ（NAT＋ビス）ゲルのふるい分け特性は、４％な
いし24％の勾配ゲルを調製し、かつこの中の蛋白質と、
同じ濃度のポリ（アクリルアミド＋ビス）勾配ゲル内の
蛋白質との泳動を比較することによって試験された。ポ
リ（アクリルアミド＋ビス）勾配ゲル内の電気泳動は、
自然蛋白質をその大きさに従って分解する（参考文献4,
20）。
いし24％の勾配ゲルを調製し、かつこの中の蛋白質と、
同じ濃度のポリ（アクリルアミド＋ビス）勾配ゲル内の
蛋白質との泳動を比較することによって試験された。ポ
リ（アクリルアミド＋ビス）勾配ゲル内の電気泳動は、
自然蛋白質をその大きさに従って分解する（参考文献4,
20）。
異なった大きさの５つの蛋白質、（チログロブリン
（MW669,000）、フェリチン（440,000）、カタラーゼ
（232,000）、乳酸デヒドロゲナーゼ（140,000）および
ウシ血清アルブミン（67,000））が、ポリ（アクリルア
ミド＋ビス）勾配ゲルおよびポリ（NAT＋ビス）勾配ゲ
ルに与えられ、かつ400Vh−1400Vhの同等の状態のもと
で処理された。交差結合体濃度（Ｃ）は、４％のおよび
24％のモノマー溶液の両方内で2.6％であった。蛋白質
は、多様な回数で200Vで0.1Mトリス−HC1緩衝液,pH9.0
内で処理された。すなわち、１は400Vh、２は600Vh、３
は800Vh、４は1000Vh、５は1200Vh、６は1400Vhであっ
た。蛋白質はクーマシーブリリアントブルーＲ−250で
染色された。その結果は第３図および第４図に示され
る。
（MW669,000）、フェリチン（440,000）、カタラーゼ
（232,000）、乳酸デヒドロゲナーゼ（140,000）および
ウシ血清アルブミン（67,000））が、ポリ（アクリルア
ミド＋ビス）勾配ゲルおよびポリ（NAT＋ビス）勾配ゲ
ルに与えられ、かつ400Vh−1400Vhの同等の状態のもと
で処理された。交差結合体濃度（Ｃ）は、４％のおよび
24％のモノマー溶液の両方内で2.6％であった。蛋白質
は、多様な回数で200Vで0.1Mトリス−HC1緩衝液,pH9.0
内で処理された。すなわち、１は400Vh、２は600Vh、３
は800Vh、４は1000Vh、５は1200Vh、６は1400Vhであっ
た。蛋白質はクーマシーブリリアントブルーＲ−250で
染色された。その結果は第３図および第４図に示され
る。
理解され得るように、ポリ（アクリルアミド＋ビス）
勾配ゲル内の蛋白質は、ゲルの上部を占め、かつポリ
（NAT＋ビス）勾配内の蛋白質はゲルの下部を占める。1
400Vhの後、最大の蛋白質（チログロブリン,MW690,00
0）はポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲル内でほとんど
永動しなかったが、一方ポリ（NAT＋ビス）ゲルではゲ
ルの長さの３分の１よりも多く越えた。最小の蛋白質
（ウシ血清アルブミン,MW67,000）は、ポリ（アクリル
アミド＋ビス）ゲルの長さの3/4よりも少なく泳動した
とき、既にポリ（NAT＋ビス）ゲルから離れていた。
勾配ゲル内の蛋白質は、ゲルの上部を占め、かつポリ
（NAT＋ビス）勾配内の蛋白質はゲルの下部を占める。1
400Vhの後、最大の蛋白質（チログロブリン,MW690,00
0）はポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲル内でほとんど
永動しなかったが、一方ポリ（NAT＋ビス）ゲルではゲ
ルの長さの３分の１よりも多く越えた。最小の蛋白質
（ウシ血清アルブミン,MW67,000）は、ポリ（アクリル
アミド＋ビス）ゲルの長さの3/4よりも少なく泳動した
とき、既にポリ（NAT＋ビス）ゲルから離れていた。
アクリルアミドおよびNATの類似の重合運動が与えら
れたが（第１図）、４％（Ｔ）NATで始まりかつ24％
（Ｔ）アクリルアミドで終わる複合勾配ゲルを重合化す
ることは可能であるであろうと考えられた。このような
勾配ゲルが得られ、かつ標準蛋白質がゲル内で処理され
た。その結果は第５図に示される。純ポリ（アクリルア
ミド＋ビス）勾配ゲルまたは純ポリ（NAT＋ビス）勾配
ゲル（第３図および第４図）と対照して、ここで蛋白質
はゲルの全長にわたって均等に間隔づけられる。バンド
は直線的でかつ鋭く、２つのモノマーの共重合化の間い
かなる変則も存在しなかったことを示している。
れたが（第１図）、４％（Ｔ）NATで始まりかつ24％
（Ｔ）アクリルアミドで終わる複合勾配ゲルを重合化す
ることは可能であるであろうと考えられた。このような
勾配ゲルが得られ、かつ標準蛋白質がゲル内で処理され
た。その結果は第５図に示される。純ポリ（アクリルア
ミド＋ビス）勾配ゲルまたは純ポリ（NAT＋ビス）勾配
ゲル（第３図および第４図）と対照して、ここで蛋白質
はゲルの全長にわたって均等に間隔づけられる。バンド
は直線的でかつ鋭く、２つのモノマーの共重合化の間い
かなる変則も存在しなかったことを示している。
いくつかの数式が、ポリ（アクリルアミド＋ビス）勾
配ゲル内の蛋白質の分子重量と泳動距離を相関させるの
に使用され得る（参考文献20）。第３図ないし第５図に
使用されたゲルの排除限界を推定するために、1og MW
が、３つのゲル内の蛋白質の泳動距離（1200Vhの後）に
対してプロットされて、かつ第６図に示されるように直
線が得られた。かなり良い適応から、複合ポリ（NAT＋
ビス）−ポリ（アクリルアミド＋ビス）勾配ゲルが、純
ポリ（NAT＋ビス）勾配ゲルと同様に蛋白質をその大き
さに従って分解することが生じる。ゼロ泳動への外挿に
よって推定された４％−24％のポリ（NAT＋ビス）勾配
ゲルの排除限界は、3x106を越え、それは同じ濃度のポ
リ（アクリルアミド＋ビス）ゲルの排除限界よりも少な
くとも３倍は高い（第６図）。こうして、非常に少なく
多孔質のポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲルによって通
常広く遅延される大きな有生分子の分解に、ポリ（NAT
＋ビス）ゲルは特に適切であるようである。
配ゲル内の蛋白質の分子重量と泳動距離を相関させるの
に使用され得る（参考文献20）。第３図ないし第５図に
使用されたゲルの排除限界を推定するために、1og MW
が、３つのゲル内の蛋白質の泳動距離（1200Vhの後）に
対してプロットされて、かつ第６図に示されるように直
線が得られた。かなり良い適応から、複合ポリ（NAT＋
ビス）−ポリ（アクリルアミド＋ビス）勾配ゲルが、純
ポリ（NAT＋ビス）勾配ゲルと同様に蛋白質をその大き
さに従って分解することが生じる。ゼロ泳動への外挿に
よって推定された４％−24％のポリ（NAT＋ビス）勾配
ゲルの排除限界は、3x106を越え、それは同じ濃度のポ
リ（アクリルアミド＋ビス）ゲルの排除限界よりも少な
くとも３倍は高い（第６図）。こうして、非常に少なく
多孔質のポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲルによって通
常広く遅延される大きな有生分子の分解に、ポリ（NAT
＋ビス）ゲルは特に適切であるようである。
広範囲の標準蛋白質のポリ（NAT＋ビス）ゲル（６％
T,3％Ｃ）内の典型的な等電点電気泳動パターンが、第
７図に示される。アノード溶液は0.2M NaOHであり、か
つカソード溶液は1M H3PO4であった。ゲルは２％の3.5
−10両性電解質を含み、かつ最終電圧2200V、2600Vhで
処理された。pl指標は、1,トリプシノーゲン（pl9.3
0）、2,ヒラマメレクチン塩基性バンド（pl8.65）、3,
ヒラマメレクチンミドルバンド（pl8.45）、4,ヒラマメ
レクチン酸性バンド（pl8.15）、5,ミオグロビン塩基性
バンド（pl7.35）、6,ミオグロビン酸性バンド（pl6.8
5）、7,ヒトのカルボニックアンヒドラーゼ（pl6.5
5）、8,ウシのカルボニックアンヒドラーゼ（pl5.8
5）、9,ベータラクトグロブリンＡ（pl5.20）、10,大豆
トリプシンインヒビター（pl4.55）、11,アミログルコ
シダーゼ（pl3.50）であった。標準蛋白質は三重に処理
され、かつヒトのカルボニックアンヒドラーゼは２つの
外側のレーンに与えられた。
T,3％Ｃ）内の典型的な等電点電気泳動パターンが、第
７図に示される。アノード溶液は0.2M NaOHであり、か
つカソード溶液は1M H3PO4であった。ゲルは２％の3.5
−10両性電解質を含み、かつ最終電圧2200V、2600Vhで
処理された。pl指標は、1,トリプシノーゲン（pl9.3
0）、2,ヒラマメレクチン塩基性バンド（pl8.65）、3,
ヒラマメレクチンミドルバンド（pl8.45）、4,ヒラマメ
レクチン酸性バンド（pl8.15）、5,ミオグロビン塩基性
バンド（pl7.35）、6,ミオグロビン酸性バンド（pl6.8
5）、7,ヒトのカルボニックアンヒドラーゼ（pl6.5
5）、8,ウシのカルボニックアンヒドラーゼ（pl5.8
5）、9,ベータラクトグロブリンＡ（pl5.20）、10,大豆
トリプシンインヒビター（pl4.55）、11,アミログルコ
シダーゼ（pl3.50）であった。標準蛋白質は三重に処理
され、かつヒトのカルボニックアンヒドラーゼは２つの
外側のレーンに与えられた。
ゲルはプラスチックシート（ゲルボンド）上に重合化
され、かつポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲルに既に提
案されたように（参考文献21）、重合化の後の両性担体
の導入は分離を大きく改良したことがわかった。pH勾配
は、電極溶液（示されていない）の濃度に非常に大きく
依存しており、かつおそらく最適ではないが、希釈され
たアノード溶液は、ポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲル
で通常使用される1M NaOHよりもはるかに優れたpH勾配
を与えた。2300Vの最終電圧での2000Vh−3000Vhのため
のフォーカシングは、新しいマトリックスにいかなる逆
効果をも引き起こさなかった。
され、かつポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲルに既に提
案されたように（参考文献21）、重合化の後の両性担体
の導入は分離を大きく改良したことがわかった。pH勾配
は、電極溶液（示されていない）の濃度に非常に大きく
依存しており、かつおそらく最適ではないが、希釈され
たアノード溶液は、ポリ（アクリルアミド＋ビス）ゲル
で通常使用される1M NaOHよりもはるかに優れたpH勾配
を与えた。2300Vの最終電圧での2000Vh−3000Vhのため
のフォーカシングは、新しいマトリックスにいかなる逆
効果をも引き起こさなかった。
議論 NATの調製 NATおよび他のいくつかの類似したアクリル酸モノマ
ーの合成および重合化が、20年前に述べられた（参考文
献18,22）。この発明の工程は上述のように、多少修正
された合成ルートである。その主な理由は、アセトニト
リル内のトリスと塩化アクリロイルとの反応（参考文献
18）が、この溶媒内のトリスおよびNATの低溶解度のた
め、より大きなスケールの調製に不十分であることがわ
かったからである。その合成は便宜上0.5モルのトリス
で始まってもよいが、しかしそれは容易にスケールアッ
プされるべきである。NATもまた他のものによって合成
された（参考文献23）が、しかし合成の説明は引用され
た元の参考文献（24）にはない。
ーの合成および重合化が、20年前に述べられた（参考文
献18,22）。この発明の工程は上述のように、多少修正
された合成ルートである。その主な理由は、アセトニト
リル内のトリスと塩化アクリロイルとの反応（参考文献
18）が、この溶媒内のトリスおよびNATの低溶解度のた
め、より大きなスケールの調製に不十分であることがわ
かったからである。その合成は便宜上0.5モルのトリス
で始まってもよいが、しかしそれは容易にスケールアッ
プされるべきである。NATもまた他のものによって合成
された（参考文献23）が、しかし合成の説明は引用され
た元の参考文献（24）にはない。
ゲルを作るためのNATの重合化 NATが、トリスアクリルという商標名のもとで、クロ
マトグラフィのための新しい親水性媒質の調製のために
主要なモノマーとして使用された（参考文献24）。イオ
ン交換体の官能基が、それぞれの機能性モノマーとNAT
との重合化によってゲルの中に取入れられた。第１の交
差結合体はN,N′−ジアリル酒石ジアミドであった（2
4）が、しかし同じ交差結合体がなおも商業的に使用さ
れているかどうかは明らかではない。なぜならば、NAT
とアクリル酸交差結合体の重合によってトリスアクリル
が生成されることが最近述べられた（参考文献25）。ト
リスアクリルゲルは、天然ポリマーに基づいたゲルより
もいくつかの有利な点を持つ（参考文献24）。しかしな
がら、NAT型ポリマーは、低pHで安定しているが、アク
リルアミドポリマーよりもアルカリ性加水分解を受けや
すいと予期される。なぜならば、トリスは、アミドカル
ボニル基上に水酸化物イオンの求核性攻撃の後に形成さ
れた四面体中間体からの脱離基として、アンモニアより
も優れているからである。アミド結合の加水分解は、ク
ロマトグラフィまたは電気泳動による分離に順に影響を
与えることができるマトリックス上にカルボキシル基を
生成するであろう。pH9で処理されたゲル内に（第４図
および第５図）、またはアノード溶液が0.2m NaOHであ
ったIEFゲル内にあるいかなる逆効果をも検出すること
は不可能であったので、この潜在的に有害な副反応は、
電気泳動分離内に通常応用された状態のもとでいかなる
重要性をも有しないように思われる。
マトグラフィのための新しい親水性媒質の調製のために
主要なモノマーとして使用された（参考文献24）。イオ
ン交換体の官能基が、それぞれの機能性モノマーとNAT
との重合化によってゲルの中に取入れられた。第１の交
差結合体はN,N′−ジアリル酒石ジアミドであった（2
4）が、しかし同じ交差結合体がなおも商業的に使用さ
れているかどうかは明らかではない。なぜならば、NAT
とアクリル酸交差結合体の重合によってトリスアクリル
が生成されることが最近述べられた（参考文献25）。ト
リスアクリルゲルは、天然ポリマーに基づいたゲルより
もいくつかの有利な点を持つ（参考文献24）。しかしな
がら、NAT型ポリマーは、低pHで安定しているが、アク
リルアミドポリマーよりもアルカリ性加水分解を受けや
すいと予期される。なぜならば、トリスは、アミドカル
ボニル基上に水酸化物イオンの求核性攻撃の後に形成さ
れた四面体中間体からの脱離基として、アンモニアより
も優れているからである。アミド結合の加水分解は、ク
ロマトグラフィまたは電気泳動による分離に順に影響を
与えることができるマトリックス上にカルボキシル基を
生成するであろう。pH9で処理されたゲル内に（第４図
および第５図）、またはアノード溶液が0.2m NaOHであ
ったIEFゲル内にあるいかなる逆効果をも検出すること
は不可能であったので、この潜在的に有害な副反応は、
電気泳動分離内に通常応用された状態のもとでいかなる
重要性をも有しないように思われる。
トリスアクリルイオン交換体の排除限界は、それらを
大きな分子の分離のための優れたマトリックスにする10
7を越えている（参考文献26）。トリスアクリル球は透
明ではなく、またしたがって、その分離に使用された交
差結合体の量はかなり高かったようである。不透明で高
度に交差結合されたゲルは、透明なものより多孔質であ
る。なぜならば、ポリマー鎖はマトリックス全体に均等
に分配されないが、残余のマトリックス内に大きな孔を
残す固体の「こぶ」を形成するからである（参考文献1
3）。トリスアクリル球（およびおそらくは別の交差結
合体）の不透明度のために、透明なポリ（NAT＋ビス）
ゲルの多孔率に関して何かを予知することは困難であっ
た。電気泳動（第３図および第４図）によって、ポリ
（アクリルアミド＋ビス）に関するポリ（NAT＋ビス）
ゲルの、より高い多孔率が明確に示され、かつこれは新
しいモノマーの固有の特性であるようである。この特性
もまたSDSゲル内で保持される（示されていない）。
大きな分子の分離のための優れたマトリックスにする10
7を越えている（参考文献26）。トリスアクリル球は透
明ではなく、またしたがって、その分離に使用された交
差結合体の量はかなり高かったようである。不透明で高
度に交差結合されたゲルは、透明なものより多孔質であ
る。なぜならば、ポリマー鎖はマトリックス全体に均等
に分配されないが、残余のマトリックス内に大きな孔を
残す固体の「こぶ」を形成するからである（参考文献1
3）。トリスアクリル球（およびおそらくは別の交差結
合体）の不透明度のために、透明なポリ（NAT＋ビス）
ゲルの多孔率に関して何かを予知することは困難であっ
た。電気泳動（第３図および第４図）によって、ポリ
（アクリルアミド＋ビス）に関するポリ（NAT＋ビス）
ゲルの、より高い多孔率が明確に示され、かつこれは新
しいモノマーの固有の特性であるようである。この特性
もまたSDSゲル内で保持される（示されていない）。
非常に多孔質の複数のマトリックスが、いくつかの電
気泳動技術では不可欠であり、かつそれらを作り出すの
に数多くの努力がなされてきた（参考文献5,9）。ポリ
（アクリルアミド＋ビス）ゲルでは、ビスの濃度が５％
よりも上に上昇するにつれて孔が増加する（参考文献
７）。これらのゲルは電気泳動で使用され得るが、しか
しそれらは濁性の、疎水性のおよび脆弱性のものであり
（参考文献13）、それは、バンドの取扱いおよび可視化
をかなり難しくさせる。N,N′−ジリアル酒石ジアミド
は、高い濃度で応用されるとき、より多孔質のゲルを与
える新しい交差結合体として導入された（参考文献
９）。しかしながら、この交差結合体が事実上重合化の
インヒビターであり、かてそれと交差結合されたゲルは
非常に多量の非重合材料を含んでいたことがわかった後
で、それを使用することは強く差し控えられた（参考文
献19）。N,N′−（1,2−ジヒドロキシエチレン）ビスア
クリルアミド、N,N′−ビス−アクリリルシスタミンお
よびジアクリル酸エチレンのような他の交差結合体は、
ビスに関連したいくつかの点で好ましいが（参考文献1
9）、より高い多孔率のゲルを作り出さない。こうし
て、ポリ（NAT）−ビスゲルは、電気泳動における、よ
り多孔質のマトリックスの現時点での長期間の必要性を
満たすと思われる。
気泳動技術では不可欠であり、かつそれらを作り出すの
に数多くの努力がなされてきた（参考文献5,9）。ポリ
（アクリルアミド＋ビス）ゲルでは、ビスの濃度が５％
よりも上に上昇するにつれて孔が増加する（参考文献
７）。これらのゲルは電気泳動で使用され得るが、しか
しそれらは濁性の、疎水性のおよび脆弱性のものであり
（参考文献13）、それは、バンドの取扱いおよび可視化
をかなり難しくさせる。N,N′−ジリアル酒石ジアミド
は、高い濃度で応用されるとき、より多孔質のゲルを与
える新しい交差結合体として導入された（参考文献
９）。しかしながら、この交差結合体が事実上重合化の
インヒビターであり、かてそれと交差結合されたゲルは
非常に多量の非重合材料を含んでいたことがわかった後
で、それを使用することは強く差し控えられた（参考文
献19）。N,N′−（1,2−ジヒドロキシエチレン）ビスア
クリルアミド、N,N′−ビス−アクリリルシスタミンお
よびジアクリル酸エチレンのような他の交差結合体は、
ビスに関連したいくつかの点で好ましいが（参考文献1
9）、より高い多孔率のゲルを作り出さない。こうし
て、ポリ（NAT）−ビスゲルは、電気泳動における、よ
り多孔質のマトリックスの現時点での長期間の必要性を
満たすと思われる。
上記で論議されたように、ポリ（アクリルアミド＋ビ
ス）ゲルのいくつかの特性を改良しようとする第１の試
みは、新しい交差結合体をビスと置換することを含ん
だ。この発明によって示されたように、より顕著な効果
が主要なモノマーを変更することによって明らかに得ら
れる。主な有利な点としてみなされる、より高い多孔率
の他に、ポリ（NAT＋ビス）ゲルはポリ（アクリルアミ
ド＋CL）ゲルよりも容易に乾燥されることができる。最
近になって、等電点電気泳動のための固定化pH勾配を有
する乾燥されたポリ（アクリルアミド＋CL）ゲルが商業
的に利用可能になった（参考文献20）。狭範囲の固定化
pH勾配のフォーカシング時間は、その等電点に近い蛋白
質の低移動度のため、かなり長くなっている。マトリッ
クスによって与えられたいかなるふるい分けも、蛋白質
によってその等電点に達するように必要とされた時間を
明らかに引き延ばす。ポリ（NAT＋ビス）ゲルは、ポリ
（アクリルアミド＋ビス）ゲルよりも少なくふるい分け
し（第３図および第４図）、またしたがって、それらは
IPGにおける等電点電気泳動に有利であるべきである。
固定化pH勾配（pH5.8−6.8）での予備実験が、試験され
た最も強い電解においてマトリックスが完全に安定して
いる、すなわち電極の間の9cm距離にわたって5000Vであ
る（示されていない）ことを示した。こうして、試験さ
れた他のマトリックスと対照して（参考文献６）、ポリ
（NAT＋ビス）ゲルはIPGにおける等電点電気泳動に有望
であると思われる。
ス）ゲルのいくつかの特性を改良しようとする第１の試
みは、新しい交差結合体をビスと置換することを含ん
だ。この発明によって示されたように、より顕著な効果
が主要なモノマーを変更することによって明らかに得ら
れる。主な有利な点としてみなされる、より高い多孔率
の他に、ポリ（NAT＋ビス）ゲルはポリ（アクリルアミ
ド＋CL）ゲルよりも容易に乾燥されることができる。最
近になって、等電点電気泳動のための固定化pH勾配を有
する乾燥されたポリ（アクリルアミド＋CL）ゲルが商業
的に利用可能になった（参考文献20）。狭範囲の固定化
pH勾配のフォーカシング時間は、その等電点に近い蛋白
質の低移動度のため、かなり長くなっている。マトリッ
クスによって与えられたいかなるふるい分けも、蛋白質
によってその等電点に達するように必要とされた時間を
明らかに引き延ばす。ポリ（NAT＋ビス）ゲルは、ポリ
（アクリルアミド＋ビス）ゲルよりも少なくふるい分け
し（第３図および第４図）、またしたがって、それらは
IPGにおける等電点電気泳動に有利であるべきである。
固定化pH勾配（pH5.8−6.8）での予備実験が、試験され
た最も強い電解においてマトリックスが完全に安定して
いる、すなわち電極の間の9cm距離にわたって5000Vであ
る（示されていない）ことを示した。こうして、試験さ
れた他のマトリックスと対照して（参考文献６）、ポリ
（NAT＋ビス）ゲルはIPGにおける等電点電気泳動に有望
であると思われる。
参考文献 1. Jonhansson,B.G.,およびHjerten,S.（1974）Anal.B
iochem.59,200−213. 2. Bothe,D.,Simonis,M.,およびDohren,H.V.,（1985）
Anal.Biochem.151,49−54. 3. Campbell,W.P.,Wrigley,C.W.,およびMargolis,J.,
（1983）Anal.Biochem.129,31−36. 4. Lambin,P.,（1978）Anal.Biochem.85,114−125. 5. Bosisio,A.B.,Loeherlein,C.,Snyder,R.S.,およびR
ighetti,P.G.,（1980）J.Chromatogr.189,317−330. 6. Righetti,P.G.,（1986）Sci.Tools 33,1−4. 7. Rodbard,D.,Levitov,C.,およびChrambach,A.,（197
2）Sep.Sci.7,705−723. 8. Chrambach,A.,およびRodbard,D.,（1971）Science
172,440−451. 9. Baumann,G.,およびChrambach,A.,（1976）Anal.Bio
chem 70,32−38. 10. Bode,H.J.,（1977）Anal.Biochem.83,204−210. 11. Bode,H.J.,（1977）Anal.Biochem.83,364−371. 12. Pino,R.M.,およびHart,T.K.,（1984）Anal.Bioche
m.139,77−81. 13. Righetti,P.G.,（1983）「等電点電気泳動 理
論、方法論および応用」（Isoelectric Focusing:Theo
ry,Methodology and Applications）（Work,T.S.およ
びBurdon,R.H.Eds）．エルゼビール アムステルダム
ニューヨーク。
iochem.59,200−213. 2. Bothe,D.,Simonis,M.,およびDohren,H.V.,（1985）
Anal.Biochem.151,49−54. 3. Campbell,W.P.,Wrigley,C.W.,およびMargolis,J.,
（1983）Anal.Biochem.129,31−36. 4. Lambin,P.,（1978）Anal.Biochem.85,114−125. 5. Bosisio,A.B.,Loeherlein,C.,Snyder,R.S.,およびR
ighetti,P.G.,（1980）J.Chromatogr.189,317−330. 6. Righetti,P.G.,（1986）Sci.Tools 33,1−4. 7. Rodbard,D.,Levitov,C.,およびChrambach,A.,（197
2）Sep.Sci.7,705−723. 8. Chrambach,A.,およびRodbard,D.,（1971）Science
172,440−451. 9. Baumann,G.,およびChrambach,A.,（1976）Anal.Bio
chem 70,32−38. 10. Bode,H.J.,（1977）Anal.Biochem.83,204−210. 11. Bode,H.J.,（1977）Anal.Biochem.83,364−371. 12. Pino,R.M.,およびHart,T.K.,（1984）Anal.Bioche
m.139,77−81. 13. Righetti,P.G.,（1983）「等電点電気泳動 理
論、方法論および応用」（Isoelectric Focusing:Theo
ry,Methodology and Applications）（Work,T.S.およ
びBurdon,R.H.Eds）．エルゼビール アムステルダム
ニューヨーク。
14. Jovin,T.M.,（1973）Biochemistry 12,871−879. 15. Jovin,T.M.,（1973）Biochemistry 12,879−890. 16. Jovin,T.M.,（1973）Biochemistry 12,890−898. 17. Wyckoff,M.,Rodbard,D.,およびChrambach,A.,（19
77）Anal.Biochem.78,459−482. 18. Jedinski,Z.,およびPaprotny,J.,（1966）Ann.So
c.Chim.Pol.40,1487−1493. 19. Gelfi,C.,およびRighetti,P.G.,（1981）Electrop
horesis 2,213−219. 20. Rothe,G.M.,およびPurkhanbaba,H.,（1982）Elect
rophoresis 3,33−42. 21. Eckersall,P.D.,およびConner,J.G.,（1984）Ana
l.Biochem.138,52−56. 22. Jedinski,Z.,およびPaprotny,J.,（1967）Ｊ Pol
ym.Sci.5,2957−2960. 23. Girot,P.,およびBoschetti,E.,（1981）J.Chromat
ogr.213,389−396. 24. Brown,E.,Racois,A.,Boschetti,E.,およびCorgie
r,M.,（1978）J.Chromatogr.150,101−110. 25. Saint−Blancard,J.,Boschetti,E.,Riberon,P.,Cl
audel,P.,Girot,P.,およびAllary,M.,（1985）Sci.Tool
s 32,37−40. 26. Boschetti,E.,（1985）「アフィニティクロマトグ
ラフィ−実際的応用」（Affinity Chromatography−Ａ
Practical Approach）（Dean,P.D.G.,Johnson,W.S.,
およびMiddle,F.A.,Eds.）pp 11−14 IRL Press,ワ
シントンD.C. 27. LKB News Spring（1986）p.13. 28. Kozulic,B.,Mosback,K.,およびPietrzak,M.（198
8）Anal.Biochem.170,478−484.
77）Anal.Biochem.78,459−482. 18. Jedinski,Z.,およびPaprotny,J.,（1966）Ann.So
c.Chim.Pol.40,1487−1493. 19. Gelfi,C.,およびRighetti,P.G.,（1981）Electrop
horesis 2,213−219. 20. Rothe,G.M.,およびPurkhanbaba,H.,（1982）Elect
rophoresis 3,33−42. 21. Eckersall,P.D.,およびConner,J.G.,（1984）Ana
l.Biochem.138,52−56. 22. Jedinski,Z.,およびPaprotny,J.,（1967）Ｊ Pol
ym.Sci.5,2957−2960. 23. Girot,P.,およびBoschetti,E.,（1981）J.Chromat
ogr.213,389−396. 24. Brown,E.,Racois,A.,Boschetti,E.,およびCorgie
r,M.,（1978）J.Chromatogr.150,101−110. 25. Saint−Blancard,J.,Boschetti,E.,Riberon,P.,Cl
audel,P.,Girot,P.,およびAllary,M.,（1985）Sci.Tool
s 32,37−40. 26. Boschetti,E.,（1985）「アフィニティクロマトグ
ラフィ−実際的応用」（Affinity Chromatography−Ａ
Practical Approach）（Dean,P.D.G.,Johnson,W.S.,
およびMiddle,F.A.,Eds.）pp 11−14 IRL Press,ワ
シントンD.C. 27. LKB News Spring（1986）p.13. 28. Kozulic,B.,Mosback,K.,およびPietrzak,M.（198
8）Anal.Biochem.170,478−484.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−3806（ＪＰ，Ａ)
Claims (29)
- 【請求項１】実質的に透明であり、実質的に電荷なしで
あり、実質的に水不溶性である、電気泳動のためのゲル
であって、前記ゲルは、Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（NAT）から誘導された
単位を含む約４％から約24％のポリマーと、N,N′−メ
チレン−ビス−アクリルアミド（BIS）を含む交差結合
体とを含み、前記ゲルは両性担体がない場合に重合化に
よって調製される、ゲル。 - 【請求項２】電荷において分子を分離する方法であっ
て、改良点は分離媒質のない場合に分離を行なうステッ
プを含み、前記分離媒質は、実質的に透明であり、実質
的に電荷なしであり、かつ実質的に水不溶性であるゲル
を含み、前記ゲルは、Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒド
ロキシメチル）から誘導された単位を含む約４％から約
24％のポリマーと、N,N′−メチレン−ビス−アクリル
アミド（BIS）を含む約１％から約５％の交差結合体を
含み、前記ゲルは両性担体のない場合に重合化によって
調製される、方法。 - 【請求項３】ゲルは乾燥されかつ再び膨潤されている、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】ゲルは支持物上にその場的に調製される、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】ゲルは勾配ゲルの形である、請求項２に記
載の方法。 - 【請求項６】分子はタンパク質を含み、分離は変性状態
または非変性状態で行なわれる、請求項２に記載の方
法。 - 【請求項７】分子は拡散またはポリヌクレオチドを含
み、分離は変性状態または非変性状態で行なわれる、請
求項２に記載の方法。 - 【請求項８】分子は固有の帯電群を有する、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項９】前記分子は非帯電分子の誘導化によって形
成された電荷を有する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１０】連続的または不連続的な緩衝系において
行なわれる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１１】時間のおよび／または電界の不連続性の
下で行なわれる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１２】タンパク質は両性担体によって形成され
たpH勾配においてその等電点に従って分離され、前記両
性担体はゲルにその重合化の後に誘導される、請求項２
に記載の方法。 - 【請求項１３】タンパク質をその等電点に従って分離す
る方法であって、分離媒質のない場合に分離を行なうス
テップを含み、前記媒質は、実質的に透明であり、かつ
実質的に電荷なしであり、かつ実質的に水不溶性である
ゲルを含み、前記ゲルは、Ｎ−アクリロイル−トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（NAT）から誘導さ
れた単位を含む約４％から約24％のポリマーと、N,N′
−メチレン−ビス−アクリルアミド（BIS）を含む１％
から約５％の交差結合体とを含み、前記ゲルは固定化pH
勾配を含み、前記ゲルは両性担体のない場合に重合化に
よって調製される、方法。 - 【請求項１４】電界において分子を分離する方法であっ
て、改良点は分離媒質のない場合に分離を行なうステッ
プを含み、前記媒質は、実質的に透明であり、実質的に
電荷なしであり、かつ実質的に水不溶性であるゲルを含
み、前記ゲルは、Ｎ−アクリロイル−トリス−（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（NAT）から誘導された単位
を含む約４％から約24％（W/V）のポリマーと、付加的
なゲル材料とを含み、前記ゲルは両性担体のない場合に
重合化によって調製される、方法。 - 【請求項１５】前記付加的なゲル材料は、２つ以上のエ
チレン二重結合を含み、かつ0.0001から0.05のCL対（NA
T＋CL）の重量比において存在する交差結合体を含む、
請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】前記ゲル材料はアクリルアミドおよびア
ガロース、またはその混合物からなるグループから選択
される、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】前記ゲル材料は0.5％から25％（W/V）の
濃度でアクリルアミドを含む、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】前記ゲル材料は0.1％から６％（W/V）の
濃度でアガロースを含む、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１９】前記ゲルは乾燥されかつ再び膨潤されて
いる、請求項14に記載の方法。 - 【請求項２０】ゲルは固体支持物に固定される、請求項
14に記載の方法。 - 【請求項２１】ゲルは支持物上にその場的に調製され
た、請求項14に記載の方法。 - 【請求項２２】ゲルは勾配ゲルの形である、請求項14に
記載の方法。 - 【請求項２３】分子はタンパク質を含み、分離は変性状
態または非変性状態で行なわれる、請求項14に記載の方
法。 - 【請求項２４】分子は拡散またはポリヌクレオチドを含
み、分離は変性状態または非変性状態で行なわれる、請
求項14に記載の方法。 - 【請求項２５】分子は固有の帯電群を有する、請求項14
に記載の方法。 - 【請求項２６】前記分子は非帯電分子の誘導化によって
形成された電荷を有する、請求項14に記載の方法。 - 【請求項２７】連続的または不連続的な緩衝系において
行なわれる、請求項14に記載の方法。 - 【請求項２８】時間のおよび／または電界の不連続性の
下で行なわれる、請求項14に記載の方法。 - 【請求項２９】タンパク質は両性担体によって形成され
たpH勾配においてその等電点に従って分離され、前記両
性担体はゲルにその重合化の後に誘導される、請求項14
に記載の方法。
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