JPS5837833B2 - 微生物リポプロテインリパ−ゼの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物リポプロテインリパーゼ（以下微生物Ｌ
ＰＬと略す）の高純度精製方法に関するものである。

更に詳細には本発明は微生物ＬＰＬを結晶化する精製方
法に関するものである。

一般にＬＰＬは生体液中におけるカイロマイクロン等の
リポプロテインのグリセライドを加水分解する酵素とし
て古くから知られていたが、これは生体内現象としてと
らえられているに過ぎなかった。

しかしながら、シュードモナス属、ムコール属、ストレ
プトミセス属、セラチア属、エアロモナス属、バチルス
属等の微生物によって、生体内リポプロテインリパーゼ
と類似した作用を有するリパーゼが生産され（特公昭４
１−７８３６号公報）微生物ＬＰＬと称している。

微生物ＬＰＬは大量生産が可能であることにより、その
利用研究が盛んで、特に近年、いわゆる診断用試薬関係
の開発が活発となり、微生物ＬＰＬが血清中蛋白により
阻害されないのみか、活性化を受ける特性を利用して血
中トリグリセライド定量用試薬として微生物ＬＰＬを用
いる方法が開発されてきたのである。

しかし血中トリグリセライド定量用試薬として使用され
る酵素には高純度が要求されるが、微生物ＬＰＬの精製
は困難であり、特にその結晶化は至難とされていた。

そこで本発明者は、微生物ＬＰＬをより高純度化し結晶
化をすることができれば産業上きわめて有益であるとの
考えのもとに、微生物ＬＰＬの効率的な精製方法を鋭意
研究してきたところ、簡便にして且つ高収率に従来至難
とされていた微生物ＬＰＬの結晶化に成功したのである
。

本発明は微生物ＬＰＬ含有液を高濃度の有機溶媒にて処
理し除沈後得られた微生物ＬＰＬ含有高濃度有機溶媒溶
液に更に有機溶媒または塩類を加えて高純度の微生物Ｌ
ＰＬを得ることを特徴とする微生物ＬＰＬの精製方法及
びかくして得られる高純度微生物ＬＰＬ含有液を脱塩処
理した後、有機溶媒中にて結晶化沈澱を生成せしめる微
生物ＬＰＬの精製方法である。

本発明においては微生物ＬＰＬ生産菌の培養物より得ら
れるあらゆる形態の微生物ＬＰＬ含有液に高濃度に有機
溶媒を加え生じた沈澱物を除去したものをＬＰＬ含有高
濃度有機溶媒溶液とする。

有機溶媒としてはアセトン、メタノール、エタノール、
グロパノール、イングロパノール、３級ブタノール等の
いずれか一種もしくはこれらの混合物が使用される。

添加する有機溶媒の量は、酵素濃度、塩析の際に用いら
れる塩の種類、有機溶媒の種類によっても最適量は変化
するが、微生物ＬＰＬ含有液量に対して１．０〜３．０
倍量が適当である。

一般に蛋白質類、糖類等は１．５〜３．０倍量以上の有
機溶媒の添加により、不溶化することが知られており、
この性質を利用して、含有液より、目的とする物質を回
収することが常である。

しかしながら微生物ＬＰＬは、これ等の有機溶媒濃度で
は全く沈降せず、沈降するに要する有機溶媒濃度は更に
高濃度であることが判明したので本発明者は、この性質
を利用しＬＰＬ含有液中に含まれる夾雑蛋白、糖類な除
去する手段として高濃度有機溶媒処理を提供するもので
この工程により比活性を一気に上げることが出来たので
ある。

次いで微生物ＬＰＬ含有高濃度有機溶媒溶液より、微生
物ＬＰＬの取得方法として更に有機溶媒を加えて有機溶
媒濃度を高めることにより微生物ＬＰＬを沈降させる方
法及び微生物ＬＰＬ含有高濃度有機溶媒溶液に直接塩類
を加えて、有機溶媒存在下に塩析する方法を提供するも
のである。

微生物ＬＰＬ含有高濃度有機溶媒溶液の溶媒を除去後塩
析により微生物ＬＰＬを取得する方法よりもその経済性
と得られる酵素の純度の点で遥かにすぐれている。

微生物ＬＰＬ含有濃度有機溶媒溶液に添加される塩とし
ては、酢酸ソーダ、硫安、酢酸カリ、硫酸リチウムなど
が挙げられる。

塩の添加量は、有機溶媒の種類、濃度により変化するが
微生物ＬＰＬ含有高濃度有機溶媒溶液量のｌＯ〜３０重
量％程度でよい。

微生物ＬＰＬ含有液の有機溶媒高濃度処理についでの微
生物ＬＰＬ含有高濃度有機溶媒溶液から有機溶媒濃度を
更に高める方法または塩類を加える方法によって微生物
のＬＰＬはそのほとんどすべてが沈澱として得られ、こ
の操作によりＬＰＬ活性を極めて効率良く取得でき、ま
た色素類、洞濁物質等を除去でき本酵素の比活性も２０
０倍以上に一挙に上昇する。

この様にして得られた高純度微生物ＬＰＬを少量の水に
溶解し常法により脱塩し、そのまま、もしくは本酵素の
失格をまねかない方法で濃縮して有機溶媒を添加し、結
晶化を行なう。

添加する有機溶媒はアセトン、メタノール、エタノール
、プロパノール、インプロパノール、３級ブタノール等
好ましくはアセトン、プロパノール、イソプロパノール
、３級ブタノールでその添加量は酵素溶液量に対して１
．０〜２．０倍量である。

有機溶媒を添加した酵素液はそのまま室温か、好ましく
は冷蔵庫中に放置して結晶を生成せしめる。

結晶化の条件としては、酵素液中の酵素濃度が低い場合
には添加する有機溶媒量を多くする必要がある。

尚、結晶析出に際してあらかじめＭ／５０〜Ｍ／１０程
度の酢酸ソーダを存在させておくと析出時間を早める効
果があることが判明した。

得られた結晶は菱形の板状結晶であり、電気泳動的に単
一であり、オスファターゼ、Ａ ’ｌ’ ｐ ａｓｅ、
ＮＡＤレダクターゼ、ＮＡＤＨオキシターゼを全く含ま
ない。

得られた結晶微生物ＬＰＬの理化学的性質は次の通りで
ある。

結晶微生物ＬＰＬの理化学的性質 至適ｐＨ ： ４．０及び８．０（第１図に示す通り）
ｐＨ安定性：４．０〜１１．０（４５℃３０分処理）（
第２図に示す通り） 分子量：約３００００ （ゲル沢過及びＳＤＳディスク
電気泳動法による） ０．１％ 紫外部吸収：Ｅ ＝０．９８２、２ ８ ０ ｎ
ｍｌｃＩｒＬ （第３図に示す通り） 等電点：ｐＨ４．３±０．１（アンホライン等電点電気
泳動法による） 分解点：２３８〜２７９℃ ■Ｒ：第４図に示す通り 糖含量：陰性（フェノール硫酸法） 結晶形：菱形の板状（第５図に示す通り）次に本発明に
おける微生物ＬＰＬの活性の測定法を示す。

〔活性測定法〕

基質として合成カイロマイクロン〔牛血清アルブミン（
和光プ級）：ファットゲン（大日本製薬社製品）＝４：
１の容量割合にて混合活性化したもの〕１ｒｒＬｌ．Ｍ
／１０燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）０． ５ ｍｌ酵素液
０． ５ ｒｎｌを共栓付試験管に入れ、３７℃にて２
０分間反応させ、次に抽出液ｎ−へプタン：イソプロビ
ルアルコール： ２ Ｎ硫酸−１ ０ ：４：１（容量
比）の混合液５ｍｌを加え、反応を停止させ、同時に強
く振盪して１０分間以上放置する。

さらにｎ−ヘプタン３ｒＩ１ｌ蒸留水２ｍｌを加え強く
振盪後放置する。

その上層へブタン部分を適量採取し、指示薬として１％
チモールブルーアルコール溶液を添加し、Ｍ／１００苛
性カリ溶液にて窒素ガスを通じながら中和滴定し、苛性
カリの使用量から遊離脂肪酸の濃度を求め、１分間に１
μ当量の脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とする。

次に本発明の実施の態様について試験例及び実施例を示
す。

試験例 １ ＊＊
シュードモナス・フルオレツセンスＩＡＭｌ０５７を
実施例１に示す微生物ＬＰＬ生産培地で培養後、除菌濃
縮して得た微生物ＬＰＬ含有培養液及び菌体抽出して得
られる微生物ＬＰＬ含有液を合せて得られる酵素液に各
種水溶性有機溶媒を各割合加え、攪拌、静置後、生じた
夾雑蛋白質等の沈澱を沢過により除去し、沢液の微生物
ＬＰＬ活性の回収率（％）を測定した。

その結果を表１に示す。上記結果より有機溶媒の種類及
び濃度により微生物ＬＰＬ活性の回収率は異なるものの
、高濃度有機溶媒処理によっても微生物ＬＰＬは沈澱せ
ず溶液中に留まり、他方夾雑蛋白質等は沈澱除去出来る
のである。

かくして本処理操作により微生物ＬＰＬの比活性が一気
に上昇するのである。

試験例 ２ 試験例１と同様にして得られた微生物ＬＰＬ含有液に１
．５倍量のアセトンを添加し生゛じた沈澱を除去したア
セトン処理液５０ｒｒＬｌに各種塩類を加え、攪拌静置
後塩析物を含まない上層、下層の両液層区分に存在する
微生物ＬＰＬ活性を測定した。

その結果を表２に示す。

上記結果は塩析処理により微生物ＬＰＬが溶液にはほと
んど残存せず従って沈澱部に移行していることを示して
いる。

試験例 ３ 試験例１と同様にして得た微生物ＬＰＬ含有液にインプ
ロパノールを１．５倍量加え、これに各種塩類を各種添
加量で加え攪拌、静置後、生じた微生物ＬＰＬの沈澱部
を沢過により除去した除沈液中の微生物ＬＰＬ活性の残
存率（％）を測定した。

その結果表３に示す。

実施例 １ ’／ ユ− トモナス・フルオレツセンスＩＡＭ１０５
７を肉エキス０．３％、ポリペプトン１．５％、尿素０
．６％、グルコースｉ．ｏ％、ＫＨ３ＰＯ４０．２％、
ＭｇＳ０４−７Ｈ２００．０５％、ＫＣＩ０．０５％、
オリーブ油１．０％を含有するｐＨ６．０の培地に２６
℃で４日間ジャーファメンターにて通気攪拌培養し、そ
の培養液に珪藻土を加えて沢過し、沢液を減圧下で約１
／５に濃縮して微生物ＬＰＬ含有液２ｌを得る。

この濃縮液に冷インプロパノール３ｌを加え生じる沈澱
を除去後、硫安７５０′？を加え塩析操作を行ない静置
後上層の溶媒を除去して後、沢過によって生じた沈澱を
集め、インプロパノールによる洗浄をくり返したのち、
真空乾燥する。

こうして比活性２０００の微生物ＬＰＬ５００■が得ら
れる。

実施例 ２ シュードモナス・エルギノー？ＩＡＭ１０９５をコーン
スチープリ力−１％、尿素０．６％、グルコース０．５
％、大豆油１％を含有するｐＨ６．０の培地に２６℃で
４日間ジャーファメンターにて通気攪拌培養し、沢過助
剤を加えて沢過を行ない１０ｌの除菌液を得る。

これを１ｌに濃縮し、アセトン１．５ｌを加えて生じた
沈澱を除去後、酢酸ソーダ３０ｏｚを加えて塩析処理を
行なう。

静置後アセトン層を除き、生じた沈澱を集め、このもの
を精製水０． ３ Ｊに溶解し、あらかじめＭ／１０酢
酸ノーダ液で緩衝化したセファデツクスＧ−５０（ファ
ルマシア製品・商標名）に通す。

次いで微生物ＬＰＬの活性区分０．３ｌを集め、１／３
０に濃縮後、冷アセトン１５７７ｌｌを加えて結晶を析
出せしめる。

かくして比活性５０００の微生物ＬＰＬの菱形板状結晶
４０■が得られる。

実施例 ３ 実施例１と同様にして培養されたシュードモナス・エル
ギノーサＩＡＭ１０９５の培養液の除菌液及び菌体抽出
液より得られる微生物ＬＰＬ含有酵素液１２ｌを１ｌに
濃縮後エタノール３．Ｏｌを加えて生じた沈澱を除去後
、さらにエタノール９．Ｏｌを加え静置し、生じた沈澱
を集め少量の精製水で溶解後セファデツクスＧ−５０に
通した後活性区分を集め、凍結乾燥する。

こうして比活性１５００の微生物ＬＰＬ ７ ０ ０Ｔ
ｎ９が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は微生物リポプロテインリパーゼの至適ｐＨ曲線
、第２図はその安定ｐＨ範囲、第Ｑはそのの紫外線吸収
曲線、第４図はその赤外線吸収曲線、第５図はその結晶
写真を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微生物リポプロテインリパーゼ含有液を高濃度の有
   機溶媒で処理し、降沈後、得られる該微生物リポプロテ
   インリパーゼ含有高濃度有機溶媒溶液に更に有機溶媒ま
   たは塩類を加えて高純度の微生物リポプロテインリパー
   ゼを得ることを特徴とする微生物リポプロテインリパー
   ゼの精製方法。 ２ 特許請求の範囲第１項の方法で得られた高純度微生
   物リポプロテインリパーゼの水溶液を脱塩処理後、親水
   性有機溶媒存在下で微生物リポプロテインリハーゼ結晶
   を生戒せしめることを特徴とする微生物リポプロテイン
   リパーゼの精製方法。