JP3325107B2 - 水性二相分離法 - Google Patents
水性二相分離法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、改良された水性二相分
離法に関する。
離法に関する。
【０００２】
【従来の技術】二種類以上の物質の混合物から目的の物
質を分離する方法として、水性溶媒もしくは水性溶液と
有機溶媒とを用い、それらの溶媒への各物質の分配係数
の差を利用して分離（あるいは抽出）する方法が一般的
に利用されている。しかしながら、この有機溶媒を用い
る方法は、特に蛋白質などの生体高分子の分離には使用
できないことが多い。すなわち、多くの生体高分子は有
機溶媒との接触によって変性を起すためである。従っ
て、蛋白質などの生体高分子を、分配溶媒として水のみ
を用い、水溶性高分子と、該水溶性高分子と組み合され
て二相分配系を形成する他の物質とを利用する水性二相
分離法（水性二相分配法あるいは単に二相分離法などと
も呼ばれる）が既に提案されており、実験室レベルでは
実際に使用されている。その分配系の例としては、二種
類の非電解性高分子の組合せ、非電解性高分子と電解性
高分子の組合せ、二種類の電解性高分子の組合せ、高分
子と低分子物質との組合せなどが知られており、分離対
象の目的物によって、各種使い分けられている。具体的
には、ポリエチレングリコールとデキストランとの組合
せ、ポリエチレングリコールとリン酸塩（ナトリウム
塩、カリウム塩など）との組合せ、ポリエチレングリコ
ールとクエン酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）と
の組合せ、ポリエチレングリコールと硫酸塩（ナトリウ
ム塩、カリウム塩など）との組合せ、ポリエチレングリ
コールとカルボキシメチルセルロースナトリウムとの組
合せ、ポリエチレングリコールとデキストラン硫酸塩と
の組合せ、ポリエチレングリコールとポリビニルアルコ
ールとの組合せなどの各種の物質の組合せが利用されて
いる。
質を分離する方法として、水性溶媒もしくは水性溶液と
有機溶媒とを用い、それらの溶媒への各物質の分配係数
の差を利用して分離（あるいは抽出）する方法が一般的
に利用されている。しかしながら、この有機溶媒を用い
る方法は、特に蛋白質などの生体高分子の分離には使用
できないことが多い。すなわち、多くの生体高分子は有
機溶媒との接触によって変性を起すためである。従っ
て、蛋白質などの生体高分子を、分配溶媒として水のみ
を用い、水溶性高分子と、該水溶性高分子と組み合され
て二相分配系を形成する他の物質とを利用する水性二相
分離法（水性二相分配法あるいは単に二相分離法などと
も呼ばれる）が既に提案されており、実験室レベルでは
実際に使用されている。その分配系の例としては、二種
類の非電解性高分子の組合せ、非電解性高分子と電解性
高分子の組合せ、二種類の電解性高分子の組合せ、高分
子と低分子物質との組合せなどが知られており、分離対
象の目的物によって、各種使い分けられている。具体的
には、ポリエチレングリコールとデキストランとの組合
せ、ポリエチレングリコールとリン酸塩（ナトリウム
塩、カリウム塩など）との組合せ、ポリエチレングリコ
ールとクエン酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）と
の組合せ、ポリエチレングリコールと硫酸塩（ナトリウ
ム塩、カリウム塩など）との組合せ、ポリエチレングリ
コールとカルボキシメチルセルロースナトリウムとの組
合せ、ポリエチレングリコールとデキストラン硫酸塩と
の組合せ、ポリエチレングリコールとポリビニルアルコ
ールとの組合せなどの各種の物質の組合せが利用されて
いる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これまで知られている
水性二相分離方法は、分離効率（分離速度、分配比率な
ど）において充分でなく、工業的には殆ど利用されてい
ない。本発明の主な目的は、工業的に利用可能な種々の
効率が優れた水性二相分離方法を提供することにある。
水性二相分離方法は、分離効率（分離速度、分配比率な
ど）において充分でなく、工業的には殆ど利用されてい
ない。本発明の主な目的は、工業的に利用可能な種々の
効率が優れた水性二相分離方法を提供することにある。
【０００４】また、本発明は、菌体と、該菌体から産出
される蛋白質もしくは低分子物質とを効率良く分離する
ことできる水性二相分離方法を提供することにもある。
される蛋白質もしくは低分子物質とを効率良く分離する
ことできる水性二相分離方法を提供することにもある。
【０００５】また、本発明は、二種類以上の蛋白質を効
率良く互いに分離することできる水性二相分離方法を提
供することにもある。
率良く互いに分離することできる水性二相分離方法を提
供することにもある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】少なくとも一種類の水溶
性高分子と、該水溶性高分子と組み合わされて二相分配
系を形成する他の物質とを利用する水性二相分離法の実
施に際して、カチオン性界面活性剤を該二相分配系に共
存させることを特徴とする水性二相分離法。
性高分子と、該水溶性高分子と組み合わされて二相分配
系を形成する他の物質とを利用する水性二相分離法の実
施に際して、カチオン性界面活性剤を該二相分配系に共
存させることを特徴とする水性二相分離法。
【０００７】菌体と、該菌体から産出される蛋白質もし
くは低分子物質とを、カチオン性界面活性剤の存在下
に、少なくとも一種類の水溶性高分子と、該水溶性高分
子と組み合わされて二相分配系を形成する他の物質とか
ら形成される水性二相分離系を利用して分離する方法。
二種以上の蛋白質を、カチオン性界面活性剤の存在下
に、少なくとも一種類の水溶性高分子と、該水溶性高分
子と組み合わされて二相分配系を形成する他の物質とか
ら形成される水性二相分離系を利用して互いに分離する
方法。
くは低分子物質とを、カチオン性界面活性剤の存在下
に、少なくとも一種類の水溶性高分子と、該水溶性高分
子と組み合わされて二相分配系を形成する他の物質とか
ら形成される水性二相分離系を利用して分離する方法。
二種以上の蛋白質を、カチオン性界面活性剤の存在下
に、少なくとも一種類の水溶性高分子と、該水溶性高分
子と組み合わされて二相分配系を形成する他の物質とか
ら形成される水性二相分離系を利用して互いに分離する
方法。
【０００８】次に本発明を詳しく説明する。本発明の二
相分配系に用いる分配系の例としては、前述の公知の二
種類の非電解性高分子の組合せ、非電解性高分子と電解
性高分子の組合せ、二種類の電解性高分子の組合せ、高
分子と低分子物質との組合せなどを挙げることができ
る。具体的には、前述したポリエチレングリコールとデ
キストランとの組合せ、ポリエチレングリコールとリン
酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）との組合せ、ポ
リエチレングリコールとクエン酸塩（ナトリウム塩、カ
リウム塩など）との組合せ、ポリエチレングリコールと
硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）との組合せ、
ポリエチレングリコールとカルボキシメチルセルロース
ナトリウムとの組合せ、ポリエチレングリコールとデキ
ストラン硫酸塩との組合せ、ポリエチレングリコールと
ポリビニルアルコールとの組合せなどを挙げることがで
き、これらを目的に応じて使い分ける。また、塩類とし
て、他のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、ハロゲ
ン化物、チオシアン酸塩なども使用できる。
相分配系に用いる分配系の例としては、前述の公知の二
種類の非電解性高分子の組合せ、非電解性高分子と電解
性高分子の組合せ、二種類の電解性高分子の組合せ、高
分子と低分子物質との組合せなどを挙げることができ
る。具体的には、前述したポリエチレングリコールとデ
キストランとの組合せ、ポリエチレングリコールとリン
酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）との組合せ、ポ
リエチレングリコールとクエン酸塩（ナトリウム塩、カ
リウム塩など）との組合せ、ポリエチレングリコールと
硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）との組合せ、
ポリエチレングリコールとカルボキシメチルセルロース
ナトリウムとの組合せ、ポリエチレングリコールとデキ
ストラン硫酸塩との組合せ、ポリエチレングリコールと
ポリビニルアルコールとの組合せなどを挙げることがで
き、これらを目的に応じて使い分ける。また、塩類とし
て、他のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、ハロゲ
ン化物、チオシアン酸塩なども使用できる。
【０００９】本発明において水性二相分配系に用いるカ
チオン界面活性剤としては以下のようなカチオン界面活
性剤を挙げることができる。ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム
塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシル
ピリジニウム塩などの第四級アミン塩、ドデシルアミン
塩、オクチルアミン塩、オクタデシルアミン塩などの第
一級アミン塩、その他各種の第二級アミン塩と第三級ア
ミン塩。本発明においてカチオン性界面活性剤は、水性
二相分配系を形成する成分（水を含む混合物）に対して
通常０．００１〜５重量％添加する。
チオン界面活性剤としては以下のようなカチオン界面活
性剤を挙げることができる。ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム
塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシル
ピリジニウム塩などの第四級アミン塩、ドデシルアミン
塩、オクチルアミン塩、オクタデシルアミン塩などの第
一級アミン塩、その他各種の第二級アミン塩と第三級ア
ミン塩。本発明においてカチオン性界面活性剤は、水性
二相分配系を形成する成分（水を含む混合物）に対して
通常０．００１〜５重量％添加する。
【００１０】本発明の水性二相分配系で分離する対象と
なる物質系としては、菌体と、該菌体から産出される蛋
白質もしくは低分子物質との混合物、二種以上の蛋白質
の混合物などを挙げることができる。具体的には、蛋白
質生産菌などの各種の菌の培養液からの蛋白質（酵素な
ど）の分離、菌体破砕液からの生産物の分離などに特に
有用である。
なる物質系としては、菌体と、該菌体から産出される蛋
白質もしくは低分子物質との混合物、二種以上の蛋白質
の混合物などを挙げることができる。具体的には、蛋白
質生産菌などの各種の菌の培養液からの蛋白質（酵素な
ど）の分離、菌体破砕液からの生産物の分離などに特に
有用である。
【００１１】本発明における水性二相分配系でのカチオ
ン性界面活性剤の使用は、更に生物から分離された酵素
や蛋白質などの高分子が水性溶媒に溶解あるいは分散さ
れた液の色相改善にも有用である。すなわち、本発明に
従って、たとえば、酵素を含む培養液を、カチオン性界
面活性剤を含む水性二相分配系で処理すると、酵素が優
先的に分配された液相の色相が改善（着色の低減あるい
は脱色）されるとの利点もある。
ン性界面活性剤の使用は、更に生物から分離された酵素
や蛋白質などの高分子が水性溶媒に溶解あるいは分散さ
れた液の色相改善にも有用である。すなわち、本発明に
従って、たとえば、酵素を含む培養液を、カチオン性界
面活性剤を含む水性二相分配系で処理すると、酵素が優
先的に分配された液相の色相が改善（着色の低減あるい
は脱色）されるとの利点もある。
【００１２】
［実施例１］水性二相分離法による菌体の分離およびプ
ロテアーゼの回収 細胞外プロテアーゼ産生バチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ１
６菌株（特開平４−３４９８８２号公報に記載のもの）
を、５００ｍＬ容量＝坂口フラスコ中の液体培地（下記
培地組成からなるもの）５０ｍＬに接種し、３０℃にて
４８時間培養して、培養液を得た。 培地組成 グルコース ２．０ 重量％ ポリペプトンＳ １．０ 重量％ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ） ０．０５重量％ リン酸一カリウム ０．１ 重量％ 硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ ０．０２重量％ 炭酸ナトリウム １．０ 重量％
ロテアーゼの回収 細胞外プロテアーゼ産生バチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ１
６菌株（特開平４−３４９８８２号公報に記載のもの）
を、５００ｍＬ容量＝坂口フラスコ中の液体培地（下記
培地組成からなるもの）５０ｍＬに接種し、３０℃にて
４８時間培養して、培養液を得た。 培地組成 グルコース ２．０ 重量％ ポリペプトンＳ １．０ 重量％ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ） ０．０５重量％ リン酸一カリウム ０．１ 重量％ 硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ ０．０２重量％ 炭酸ナトリウム １．０ 重量％
【００１３】別に、５本の試験管を用意し、各試験管
に、水性二層分離の軽液側相形成物質（ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）４０００）と、重液側相形成物質
（クエン酸ナトリウム二水和物）とを、それぞれ粉末状
で０．７ｇ入れた。各試験管に、カチオン性界面活性剤
（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＨＤ
ＡＢ）を、第１表の濃度となるように濃度を変えて添加
した（無添加のものは比較対照用）。これらの試験管に
上記の培養液を添加し、撹拌混合して試験管内の粉末を
溶解させて、５ｍＬの混合液とした。これらの試験管を
１５℃で１時間静置して、菌体を下層に分離した後、上
層のＰＥＧ−プロテアーゼ溶液をパスツールピペットを
用いて採取した。各試験管とも、取り出された上層液量
は２．０ｍＬであり、下層液量は３．０ｍＬであった。
また、取り出された上層液には、ＰＥＧ４０００が約３
５重量％、クエン酸塩が５重量％、そしてＨＤＡＢが
０．１重量％含まれていた。
に、水性二層分離の軽液側相形成物質（ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）４０００）と、重液側相形成物質
（クエン酸ナトリウム二水和物）とを、それぞれ粉末状
で０．７ｇ入れた。各試験管に、カチオン性界面活性剤
（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＨＤ
ＡＢ）を、第１表の濃度となるように濃度を変えて添加
した（無添加のものは比較対照用）。これらの試験管に
上記の培養液を添加し、撹拌混合して試験管内の粉末を
溶解させて、５ｍＬの混合液とした。これらの試験管を
１５℃で１時間静置して、菌体を下層に分離した後、上
層のＰＥＧ−プロテアーゼ溶液をパスツールピペットを
用いて採取した。各試験管とも、取り出された上層液量
は２．０ｍＬであり、下層液量は３．０ｍＬであった。
また、取り出された上層液には、ＰＥＧ４０００が約３
５重量％、クエン酸塩が５重量％、そしてＨＤＡＢが
０．１重量％含まれていた。
【００１４】各試験管から得た上層液と下層液とに存在
するプロテアーゼ酵素活性を下記のカゼイン法により求
め、それぞれの試験管中の混合液でのプロテアーゼの分
配係数（上層／下層）を求めた。プロテアーゼ酵素活性測定法（カゼイン法） カゼイン基質による活性測定法：カゼインを１重量％含
む５０ｍＭほう酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１
ｍＬを０．１ｍＬのプロテアーゼ含有溶液と混合し、４
０℃で１０分間反応させたのち、これに反応停止液
（０．１２３Ｍトリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ酢酸ナト
リウム−０．３６９Ｍ酢酸）２ｍＬを加えて３０℃で２
０分間放置した。この放置した反応液を次に、濾紙（ワ
ットマン社製、Ｎｏ．２）を用いて濾過し、濾液中の蛋
白分解物をフォーリンローリー法の改良法によって測定
した。なお、１Ｐ．Ｕ．は、上記反応条件下において１
分間に１ミリモルのチロシンを遊離させる酵素量とし
た。
するプロテアーゼ酵素活性を下記のカゼイン法により求
め、それぞれの試験管中の混合液でのプロテアーゼの分
配係数（上層／下層）を求めた。プロテアーゼ酵素活性測定法（カゼイン法） カゼイン基質による活性測定法：カゼインを１重量％含
む５０ｍＭほう酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１
ｍＬを０．１ｍＬのプロテアーゼ含有溶液と混合し、４
０℃で１０分間反応させたのち、これに反応停止液
（０．１２３Ｍトリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ酢酸ナト
リウム−０．３６９Ｍ酢酸）２ｍＬを加えて３０℃で２
０分間放置した。この放置した反応液を次に、濾紙（ワ
ットマン社製、Ｎｏ．２）を用いて濾過し、濾液中の蛋
白分解物をフォーリンローリー法の改良法によって測定
した。なお、１Ｐ．Ｕ．は、上記反応条件下において１
分間に１ミリモルのチロシンを遊離させる酵素量とし
た。
【００１５】測定結果 求められた各試験管中の混合液でのプロテアーゼの分配
係数そしてプロテアーゼ回収率を表１に示す。なお、プ
ロテアーゼ回収率は下記の方法により測定した。プロテアーゼ回収率 取り出された上層液を、分画分子量６０００〜１３００
０の限外濾過膜を用い、限外濾過膜法によりＰＥＧ、ク
エン酸塩、そしてＨＤＡＢを透過させ、プロテアーゼを
回収する。さらに、軽液相（上層）側の菌体濁度と添加
ＨＤＡＢ濃度との関係を図１に示す。
係数そしてプロテアーゼ回収率を表１に示す。なお、プ
ロテアーゼ回収率は下記の方法により測定した。プロテアーゼ回収率 取り出された上層液を、分画分子量６０００〜１３００
０の限外濾過膜を用い、限外濾過膜法によりＰＥＧ、ク
エン酸塩、そしてＨＤＡＢを透過させ、プロテアーゼを
回収する。さらに、軽液相（上層）側の菌体濁度と添加
ＨＤＡＢ濃度との関係を図１に示す。
【００１６】 表１ ──────────────────────────────────── ＨＤＡＢ濃度 （ｍＭ） ０ ２５ ５０ ７５ １００ ──────────────────────────────────── プロテアーゼ 分配係数 ３５ ５５ ６４ ７７ １１７ ──────────────────────────────────── プロテアーゼ 回収率（％） ９５．８ ９７．３ ９７．７ ９８．１ ９８．７ ────────────────────────────────────
【００１７】上記の結果から、水性二相分配系にカチオ
ン性界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムブロミドを存在させることによって、プロテアーゼ
の分配係数が大きくなり、従ってプロテアーゼの回収率
を向上させることが可能となることがわかる。
ン性界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムブロミドを存在させることによって、プロテアーゼ
の分配係数が大きくなり、従ってプロテアーゼの回収率
を向上させることが可能となることがわかる。
【００１８】［実施例２］水性二相分離法による蛋白質
の分離 多数の試験管を用意し、各試験管に、水性二層分離の軽
液側相形成物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４
０００）と重液側相形成物質（クエン酸ナトリウム二水
和物）とを、それぞれ粉末状で０．７ｇ入れた。各試験
管に、カチオン性界面活性剤（ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムブロミド、ＨＤＡＢ）を、順に濃度１０ｍ
Ｍ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭで加えた。また、Ｈ
ＤＡＢ無添加のものを比較対照用に用意した。そして、
このようなＨＤＡＢの濃度を変えた試験管のセットを三
組用意した。各組の試験管群に、それぞれ相異なる蛋白
質（牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、リゾチーム、そして
オバルブミン（卵製））の１ｇ／Ｌ溶液を添加し、撹拌
混合して試験管内の粉末を溶解させて、５ｍＬの混合液
とした。これらの試験管中の混合液を３０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離して二層に分離させた。このようにし
て分離した上層と下層とをそれぞれパスツールピペット
を用いて採取した。各試験管とも、取り出された上層液
量は２．０ｍＬであり、下層液量は３．０ｍＬであっ
た。
の分離 多数の試験管を用意し、各試験管に、水性二層分離の軽
液側相形成物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４
０００）と重液側相形成物質（クエン酸ナトリウム二水
和物）とを、それぞれ粉末状で０．７ｇ入れた。各試験
管に、カチオン性界面活性剤（ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムブロミド、ＨＤＡＢ）を、順に濃度１０ｍ
Ｍ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭで加えた。また、Ｈ
ＤＡＢ無添加のものを比較対照用に用意した。そして、
このようなＨＤＡＢの濃度を変えた試験管のセットを三
組用意した。各組の試験管群に、それぞれ相異なる蛋白
質（牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、リゾチーム、そして
オバルブミン（卵製））の１ｇ／Ｌ溶液を添加し、撹拌
混合して試験管内の粉末を溶解させて、５ｍＬの混合液
とした。これらの試験管中の混合液を３０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離して二層に分離させた。このようにし
て分離した上層と下層とをそれぞれパスツールピペット
を用いて採取した。各試験管とも、取り出された上層液
量は２．０ｍＬであり、下層液量は３．０ｍＬであっ
た。
【００１９】次いで、分離された各液を波長２８０ｎｍ
で分光測定して、各液中の蛋白質濃度を測定した。な
お、分光測定におけるブランクは蛋白質を含まない系と
した。そして上層の蛋白質濃度と下層の蛋白質濃度の比
（上層／下層）を求め、各蛋白質の分配係数とした。
で分光測定して、各液中の蛋白質濃度を測定した。な
お、分光測定におけるブランクは蛋白質を含まない系と
した。そして上層の蛋白質濃度と下層の蛋白質濃度の比
（上層／下層）を求め、各蛋白質の分配係数とした。
【００２０】ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロ
ミドの濃度を変えた場合の上記三種の蛋白質の分配係数
の変動を図２に示す。図２の結果から、蛋白質の種類に
よって効果の大小はあるものの、水性二相分配系にカチ
オン性界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムブロミドを存在させることによって、蛋白質を上
層側に移行させることが可能となることがわかる。この
作用効果を利用することによって、混合液中の下層側に
不純物（あるいは目的の蛋白質への混在が好ましくない
物質）が集中しやすい混合系から目的の蛋白質を高収率
で得ることが可能となる。
ミドの濃度を変えた場合の上記三種の蛋白質の分配係数
の変動を図２に示す。図２の結果から、蛋白質の種類に
よって効果の大小はあるものの、水性二相分配系にカチ
オン性界面活性剤であるヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムブロミドを存在させることによって、蛋白質を上
層側に移行させることが可能となることがわかる。この
作用効果を利用することによって、混合液中の下層側に
不純物（あるいは目的の蛋白質への混在が好ましくない
物質）が集中しやすい混合系から目的の蛋白質を高収率
で得ることが可能となる。
【００２１】［実施例３］水性二相分離法による菌体の
分離 バチルス属の菌株を培養したのち、限外濾過膜を用いて
培養液の菌体濁度を約５０に調整した。このようにして
調製した菌体濁度調整培養液を６試料用意し、それぞれ
に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００とリン
酸ナトリウムとをそれぞれ１４重量％となるように添加
し、次いでヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミ
ドを表２の濃度になるように、それぞれに添加した。次
いで、各試料液を２５℃で５時間静置し、分離した上層
と下層のそれぞれの菌体濁度を測定した。その結果を表
２に示す。
分離 バチルス属の菌株を培養したのち、限外濾過膜を用いて
培養液の菌体濁度を約５０に調整した。このようにして
調製した菌体濁度調整培養液を６試料用意し、それぞれ
に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００とリン
酸ナトリウムとをそれぞれ１４重量％となるように添加
し、次いでヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミ
ドを表２の濃度になるように、それぞれに添加した。次
いで、各試料液を２５℃で５時間静置し、分離した上層
と下層のそれぞれの菌体濁度を測定した。その結果を表
２に示す。
【００２２】 表２ ──────────────────────────────────── ＨＤＡＢ濃度 （ｍＭ） ０ ５ １０ ２５ ５０ ７５ ──────────────────────────────────── 上層濁度 １２．３． ０．４ ０ ０ ０ ０ 下層濁度 ６５．４．７６．２ ７８．０ ７７．６ ７８．０ ８０．１ ──────────────────────────────────── 菌体 分配係数 0.188 0.005 −−−−−−−−（約０）−−−−−−− ────────────────────────────────────
【００２３】上記の二層分配系ではヘキサデシルトリメ
チルアンモニウムブロミドの添加により菌体が下層側に
より多く分配されることがわかる。
チルアンモニウムブロミドの添加により菌体が下層側に
より多く分配されることがわかる。
【００２４】［実施例４］水性二相分離法による色相の
改善 試験管を多数用意し、各試験管に、実施例１で得た上記
の培養液を入れ、水性二層分離の軽液側相形成物質（ポ
リエチレングリコール４０００）と、重液側相形成物質
（クエン酸ナトリウム二水和物）とを、それぞれ粉末状
で９重量％と、１４．５重量％となるように入れ、また
カチオン性界面活性剤（ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムブロミド、ＨＤＡＢ）を濃度を変えて添加した
（無添加のものは比較対照用）。これらの試験管を１５
℃で１時間静置して、菌体を下層に分離させた後、上層
の色相をクレット法により測定した。その測定結果を図
３に示す。なお、クレット法による測定値（クレットナ
ンバー）は値が小さいほど着色が低いことを意味する。
改善 試験管を多数用意し、各試験管に、実施例１で得た上記
の培養液を入れ、水性二層分離の軽液側相形成物質（ポ
リエチレングリコール４０００）と、重液側相形成物質
（クエン酸ナトリウム二水和物）とを、それぞれ粉末状
で９重量％と、１４．５重量％となるように入れ、また
カチオン性界面活性剤（ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムブロミド、ＨＤＡＢ）を濃度を変えて添加した
（無添加のものは比較対照用）。これらの試験管を１５
℃で１時間静置して、菌体を下層に分離させた後、上層
の色相をクレット法により測定した。その測定結果を図
３に示す。なお、クレット法による測定値（クレットナ
ンバー）は値が小さいほど着色が低いことを意味する。
【００２５】また、カチオン性界面活性剤としてＨＤＡ
Ｂの代りに、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロ
リド（カチオン−Ａ）とアルキルトリメチルアンモニウ
ムクロリド（アルキルは炭素数１４〜１８アルキル基）
（カチオン−Ｂ）を用いても同様な測定を行なった。そ
れらの測定結果も併せて図３に示す。図３に示された結
果から、水性二相分離系にカチオン性界面活性剤を存在
させることによって、回収される酵素などを含む色相が
改善され、これにより分離回収される酵素などの色相が
改善されることがわかる。
Ｂの代りに、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロ
リド（カチオン−Ａ）とアルキルトリメチルアンモニウ
ムクロリド（アルキルは炭素数１４〜１８アルキル基）
（カチオン−Ｂ）を用いても同様な測定を行なった。そ
れらの測定結果も併せて図３に示す。図３に示された結
果から、水性二相分離系にカチオン性界面活性剤を存在
させることによって、回収される酵素などを含む色相が
改善され、これにより分離回収される酵素などの色相が
改善されることがわかる。
【００２６】
【発明の効果】本発明の水性二相分離方法は、分離効
率、色相改善効率などの種々の効率に優れ、従って、工
業的な利用に非常に有利となる。そして、たとえば、菌
体と、該菌体から産出される蛋白質もしくは低分子物質
との分離、あるいは二種類以上の蛋白質の分離を効率良
く実現することができる。
率、色相改善効率などの種々の効率に優れ、従って、工
業的な利用に非常に有利となる。そして、たとえば、菌
体と、該菌体から産出される蛋白質もしくは低分子物質
との分離、あるいは二種類以上の蛋白質の分離を効率良
く実現することができる。
【図１】本発明の実施例である実施例１の結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図２】本発明の実施例である実施例２の結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図３】本発明の実施例である実施例４の結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 黒田 和一 千葉県佐原市長島321−３ (72)発明者 川村 成 茨城県鹿島郡波崎町土合本町１−8762− 23 (56)参考文献 特開 昭62−61922（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−154515（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) B01D 11/00 - 11/04
Claims (3)
- 【請求項１】 少なくとも一種類の水溶性高分子と、該
水溶性高分子と組み合わされて二相分配系を形成する他
の物質とを利用する水性二相分離法の実施に際して、カ
チオン性界面活性剤を該二相分配系に共存させることを
特徴とする水性二相分離法。 - 【請求項２】 菌体と、該菌体から産出される蛋白質も
しくは低分子物質とを、カチオン性界面活性剤の存在下
に、少なくとも一種類の水溶性高分子と、該水溶性高分
子と組み合わされて二相分配系を形成する他の物質とか
ら形成される水性二相分離系を利用して分離する方法。 - 【請求項３】 二種以上の蛋白質を、カチオン性界面活
性剤の存在下に、少なくとも一種類の水溶性高分子と、
該水溶性高分子と組み合わされて二相分配系を形成する
他の物質とから形成される水性二相分離系を利用して互
いに分離する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34635893A JP3325107B2 (ja) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | 水性二相分離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34635893A JP3325107B2 (ja) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | 水性二相分離法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07171303A JPH07171303A (ja) | 1995-07-11 |
| JP3325107B2 true JP3325107B2 (ja) | 2002-09-17 |
Family
ID=18382875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34635893A Expired - Fee Related JP3325107B2 (ja) | 1993-12-22 | 1993-12-22 | 水性二相分離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3325107B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005312376A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Asahi Kasei Corp | 細胞表面消化度検出用化合物 |
| CN102430265B (zh) * | 2011-09-26 | 2014-06-04 | 武汉大学 | 一种混合表面活性剂双水相萃取体系 |
| CN104474737A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-01 | 常州工程职业技术学院 | 一种亲和温敏聚合物在双水相体系中的应用 |
| WO2023174022A1 (en) * | 2022-03-16 | 2023-09-21 | The University Of Hong Kong | Synergistic control and dynamic assembly of viscoelastic networks and biomolecular condensates by aqueous liquid-liquid phase separation and liquid-solid phase separation (aqll-ls ps2) |
-
1993
- 1993-12-22 JP JP34635893A patent/JP3325107B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07171303A (ja) | 1995-07-11 |
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