CN101273125B - 酶的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种从菌体浓度为1%(v/v)以下且酶的浓度以蛋白质的含量计为1%(w/v)以上的含酶的液体通过精密过滤来回收酶的方法,其中,在该含酶的液体中添加0.01~1%(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。
Description
技术领域
本发明是有关酶的制造方法,具体地来说是关于从含有酶的液体中高效率地回收酶的方法。
背景技术
过滤发酵液,除去发酵液中的微粒、培养细胞以及孢子等的不溶解物质并回收作为目的的酶等的发酵产物的方法是众所周知的。但是,在过滤操作中由于接近于分离膜细孔大小的粒子会造成分离膜网眼的堵塞,并且不溶物质将在膜面上堆积,从而会招致过滤效率下降的问题。以前,对于这样的分离膜的物理性的网眼堵塞和膜面上的不溶解物质的堆积,通过一边在膜面上进行扫流(sweep-flow)一边进行过滤等的操作,来避免网眼的堵塞和不溶解物质的堆积,可是在含有高浓度菌体的发酵液的情况下,因为发酵液的粘度较高,所以扫流时的压力损失较大,从而使过滤压力增大,以至于招致在膜面上的不溶解物质的固结化,反而带来了过滤效率下降的问题。
为了解决这样的问题,在JP-A11-318482中,在精密过滤时将阳离子性表面活性剂添加到含有高浓度菌体的发酵培养液中,通过降低发酵液的粘度来抑制扫流时的压力损失和过滤压力的增大,由浓缩率的提高来提高发酵产物的回收率。另外,在JP-A4-354585中,建议在处理发酵液时将絮凝剂(阳离子型高分子物质)添加到发酵培养液中。但是,这些高分子絮凝剂的分子量达数十万,在反复使用时反而会引起膜的网眼被阳离子型高分子堵塞,因此存在膜的清洗恢复变得不可能的问题。
发明内容
本发明是一种酶的制造方法,其特征在于,该制造方法是从菌体的浓度为1%(v/v)以下且酶的浓度为1%(w/v)以上的含酶的液体, 通过精密过滤来回收酶的方法,在上述含酶的液体中添加0.01~1%(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。并且还提供一种酶的制造方法,其特征在于,从菌体浓度大于1%(v/v)的发酵培养液分离菌体,将所得到的含酶的液体通过超滤来进行精制·浓缩,在所得到的菌体浓度为1%(v/v)以下且在酶的浓度为1%(w/v)的含酶的液体中添加0.01~1%(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。
具体实施方式
在蛋白酶等的酶的发酵生产中采用的方法多数是,首先通过精密过滤等从发酵培养液中分离菌体,接着通过超滤来精制·浓缩由分离菌体而得到的含酶的液体。
根据该方法,虽然可以得到菌体浓度为1%(v/v)以下且酶浓度为1%(w/v)以上的含高浓度酶的液体,但是,从完全阻止酶产生菌、去除精制过程中所产生的杂菌、完全去除由于对酶溶液进行高浓度化而产生的不溶物以及残存的少量的杂质等的观点出发,就需要进一步精制·分离该含高浓度酶的液体。
在该含高浓度酶的液体的精制·分离过程中,可以考虑使用精密过滤膜,但像这样的含高浓度酶的液体的情况下,虽然是菌体浓度低且发酵液的粘度不成问题的溶液,还是因为蛋白质浓度高从而在精密过滤时的酶透过率以及透过流量不如人意,并存在生产效率非常差的问题。
另外,一般在通过精密过滤来进行的高蛋白质溶液的精制过程中,会有以下的问题点:即使存在少量的应去除的混入的细菌等的杂质,由于夹杂的ppb级的DNA等,在膜透过过程中的透过流量将会减少,并且蛋白质溶液的透过率变差。作为解决此问题的手段,在JP-A2004-89155中提出了如下方法:在使用膜对蛋白质溶液进行过滤时,用DNA分解酶以及DNase处理蛋白质溶液之后进行过滤,或者,一边进行DNase处理一边进行过滤。但是,在高浓度的蛋白酶的发酵液中,因为DNase本身也是蛋白质,所以不能期待由蛋白酶使得分解容易地进行的效果。
如以上所述,在含高浓度酶的液体的最终的精制·分离即通过精 密过滤进行的精制过程中,要体现充分的酶透过率和透过流量是非常困难的,并且还有生产效率非常差的问题。
本发明者研究探讨了在使用精密过滤膜的含高浓度酶的液体的最终的精制·分离中实现充分大的酶透过率和透过流量的方法,其结果完成了上述的本发明。
在本发明中,以菌体浓度为1%(v/v)以下且酶浓度以蛋白质的含量计为1%(w/v)以上的含酶的液体作为对象,通过对其进行精密过滤来回收酶。从在精密过滤过程中降低负荷的观点出发,菌体浓度更优选为0.5%(v/v)以下,特别优选为0~0.3%(v/v)。从根据处理液量和过滤速度的过滤效率以及酶的溶解性的观点出发,酶浓度更优选为2%(w/v)以上,特别优选为2~10%(w/v)。菌体浓度是以在离心效果12000G以及沉淀时间5min的条件下进行离心分离时的相对于含酶的液体量的菌体所占的容积的比例来定义。
本发明中的酶可以列举蛋白酶、酯酶以及糖酶等。作为蛋白酶的具体例子可以列举胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、角蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、氨基肽酶以及羧肽酶等。作为酯酶的具体例子可以列举胃脂肪酶、胰脂肪酶、植物脂肪酶类、磷脂酶类、胆碱酯酶类以及磷酸酯酶。作为糖酶可以列举纤维素酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、淀粉酶、果胶解聚酶、α-以及β-糖苷酶等。另外,考虑到本发明的效果大,优选酶的等电点为7~13,更为优选的是8~12,特别优选的是9~11。并且,本发明中的酶从酶的有用性以及本发明的效果大的方面出发优选使用蛋白酶,更加优选的是碱性蛋白酶。
酶的浓度以蛋白质的含量来定义。
本发明中的精密过滤使用精密过滤膜来进行。至于精密过滤膜的形式,只要是在膜面上进行扫流并进行过滤的形式就没有特别的限制,平膜、中空丝状膜以及管状膜等的任何一种都可以。膜的材质比如可以列举氧化铝、二氧化钛和氧化锆等的陶瓷、玻璃和金属等的无机膜,或者,乙酸纤维素类、硝化纤维素类、脂肪族聚酰胺类、聚砜类、聚烯烃类、聚丙烯腈类、聚醚砜类、聚氯乙烯类、聚乙烯醇类以及氟化高分子等的有机膜。
从在分离膜面上的扫流的观点来看,膜面速度越大膜面上的扫流效果就越大。但是,到了一定的速度之上压力损失就会变大,就会引起在膜附近的胶体层的压紧化,通过膜的流量以及含酶的液体中的酶的回收率就会降低。另外,如果膜面速度过低那么压力损失就会降低,虽然能避免压紧化的发生,但是胶体层的剥离效果会降低,含酶的液体中的酶的回收率也就会下降。从这些要点出发,膜面速度优选为0.5~3m/s,更为优选的是0.5~1.5m/s。
在本发明中,由精密过滤进行分离的时候的膜间压差是指入口与出口的膜之间的平均压差,通常优选为0.2MPa以下,更为优选的是0.02~0.15MPa。膜间压差如果小于0.02MPa那么透过流量就会下降,有处理性恶化的倾向。另外,如果膜间压差大于0.2MPa那么由膜面上的胶体层的压紧化等而产生膜闭塞,从而导致产生透过流量下降的情况,所以不优选。另外,给予膜间压差的方法可以是原液侧加压式、透过液侧减压式或者也可以是两者的组合。操作温度通常为0~40℃,优选为5~30℃。操作温度如果小于0℃则因为含酶的液体的粘度变大将导致透过膜的流量会下降,另外,如果温度超过40℃则含酶的液体的性状就会恶化,所以不优选。
作为本发明的运作方法,不仅可以采用如上所述的施加一定的压力使透过流量随之决定的定压过滤方式,还可以采用以一定的流量抽出透过液的定流量过滤方式。另外,为了维持膜的高过滤性,可以定期性地施行从膜的透过侧使透过液逆流的操作(逆向清洗)。
在本发明中,在施行精密过滤之前,有必要在上述含酶的液体中添加0.01~1%(w/v)的阳离子性表面活性剂。在本发明中所使用的阳离子性表面活性剂没有特别的限定,但是从作用效果的观点出发,优选使用具有一个或者二个长链烷基的季铵盐型的化合物,具体可以列举含有平均碳原子数8~18的直链烷基的单烷基三甲基氯化铵、单烷基三甲基溴化铵、二烷基二甲基氯化铵、二烷基二甲基溴化铵以及单烷基二甲基苄基氯化铵(苯扎氯铵,benzalkonium chloride)等。从在含酶的液体中的溶解性以及作用效果的观点出发,平均碳原子数更优选为10~18,特别优选为12~18。
阳离子性表面活性剂的添加量以纯组分来定义。从提高酶的透过 性以及提高透过流量的观点出发,阳离子性表面活性剂向含酶的液体中的添加量为,以在含酶的液体中的浓度计,优选0.01~1%(w/v),更为优选的是0.02~0.5%(w/v),特别优选的是0.03~0.3%(w/v)。添加方法没有特别的限定,但是从能够充分作用于含酶的液体的观点出发,优选以将阳离子性表面活性剂预先溶解于水或者异丙醇等的溶剂中的状态添加到含酶的液体中,并优选以某些手段(比如通过搅拌马达的搅拌或者通过泵的液体循环)进行10分钟左右的搅拌·混合。
本发明中的阳离子性表面活性剂的添加量根据含酶的液体的种类和性状而不同。优选以如下所述的方法求得对应于含酶的液体的种类和性状的合适的阳离子性表面活性剂的添加量。在求得合适的添加量的过程中可以变换各种添加量并分别单独进行过滤,但由于操作繁琐,所以由以下的简便的过滤方法能够一次性求得必要的添加量。即,用指定的条件以全循环进行过滤(以不改变原液的活性的形式使透过液直接返回到原液中去),直至透过液的过滤速度以及酶的浓度达到恒定为止,进行大约2小时的过滤。透过液的过滤速度以及酶的浓度达到恒定后对透过液进行取样,测定透过液中的酶的浓度以及透过流量。透过液被取样后立刻倒回到原液中,以尽可能保持原液的酶的浓度以及液量不变。到达恒定状态后暂时停止装置的运转,将指定量的阳离子性表面活性剂添加到原液中并混合15分钟,再一次同样地进行15分钟过滤,之后测定透过液中的酶的浓度以及透过流量。之后,同样地添加阳离子性表面活性剂以增加活性剂的浓度,由此调查活性剂浓度与酶的透过率以及透过流量的关系。根据如上所述的操作可以简便地求得合适的添加量。
在本发明中,从菌体浓度超过1%(v/v)的发酵培养液中分离菌体,对所得含酶的液体通过超滤来进行精制·浓缩,在所得到的菌体浓度为1%(v/v)以下且酶的浓度以蛋白质的含量计为1%(w/v)以上的含酶的液体中,优选添加0.01~1%(w/v)的阳离子性表面活性剂,并进行精密过滤。
本发明中的发酵培养液是指发酵生成物,即,微生物分解有机物,含有作为其代谢物而积聚的生成物的溶液。发酵培养液比如可以是培养细菌、放线菌、真菌以及酵母等的微生物的培养液,也可以是培养动物或者植物的细胞的培养液。具体可以列举酒精发酵、酱油以及食醋等的食品发酵、抗生素物质以及抗癌物质的发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶的发酵等。发酵培养液优选菌体浓度超过1%(v/v),更为优选的是3%(v/v)以上,特别优选的是10~20%(v/v)。另外,发酵培养液中的酶的浓度为0.1~2%(w/v)左右。在该发酵终了时的发酵培养液中微生物等的菌体以高浓度存在,所以优选首先分离菌体。本发明中从发酵培养液分离菌体的方法可以列举比如精密过滤法、离心分离法以及压滤法等,可以将这些方法组合使用,但是优选使用精密过滤膜来进行过滤分离。
在进行从发酵培养液的菌体分离即发酵生成物的回收之后,通常优选通过超滤来进行浓缩。超滤是指如下工艺,使用膜口径为比如0.1nm~2nm的范围或者截留分子量为500~10万的范围的超滤膜来进行过滤,从而使比该值大的粒子和高分子物质被过滤膜阻止,而使低分子物质透过过滤膜,从而去除低分子物质。根据该操作,能够将发酵生成物的0.1~2%(w/v)的酶浓度浓缩至1~20%(w/v)的程度。
关于本发明中使用的超滤膜的形式·材质,与上述的精密过滤膜的情况相同。由超滤膜进行浓缩时用于在膜面上进行扫流的膜面速度越大则扫流效果也就越好,适当的范围为0.5~3m/s。膜间压差越大过滤速度变得越大,但是如果膜间压差过大则在膜附近的胶体层会被压紧化,所以不能提高过滤速度。因此,适当的膜间压差是0.05~0.3MPa。操作温度为0~40℃,优选5~30℃。操作温度如果小于0℃那么发酵生成物含有液的粘度就会变大,操作性就会恶化。另外,操作温度如果超过40℃那么发酵生成物的活性就会降低,所以不优选。
作为超滤的操作条件,在1次过滤后为了更进一步提高精制度也可以进行加水精制,即在加水后进一步进行浓缩。此时,存在若发酵液的盐浓度降低则酶的溶解度也会下降的情况,在加水精制过程中也可以使用氯化钙水溶液或者硫酸钠水溶液等。另外,也可以将这些盐添加到超滤结束后的浓缩液中。
附图说明
图1是表示表面活性剂浓度与酶透过率以及表面活性剂浓度与透过膜的流量的关系的图表。
实施例
下面的实施例中就有关本发明的实施进行叙述。实施例是关于本发明的例示所进行的叙述,并不是为了限定本发明。
实施例1~7以及比较例1、2
将Bacillus sp.KSM-9865(FEM-P18566号)的碱性蛋白酶(等电点9.5附近)的发酵液(菌体浓度10.8%(v/v))100L在10℃的温度条件下由有效膜面积0.41m2、细孔径0.1μm、丝内径1.9mmФ的中空丝精密过滤膜(旭化成株式会社,PSP-113L)进行精密过滤(MF)。浓缩3倍后,相对于浓缩液量添加等量的去离子水,进行再一次浓缩的操作重复3次,共计得到168L的MF透过液。将所得的MF透过液以截留分子量6000的超滤膜(旭化成株式会社,AIP-2013,膜面积1m2)进行超滤浓缩(UF)。浓缩7倍后,相对于浓缩液量添加等量的0.4%(v/v)氯化钙水溶液,进行再一次浓缩的操作重复9次,从而得到蛋白浓度4.8%(w/v)的UF浓缩液23.5L。此时的UF浓缩液中的菌体浓度为0%(v/v)。其后,以成为2%(v/v)的浓度的形式将硫酸钠溶解于UF浓缩液中。
将所述溶液1.5L在10℃的温度条件下由有效膜面积0.015m2、细孔径0.25μm、丝内径0.7mmФ、模块长度130mm、丝数目100的中空丝精密过滤膜(旭化成株式会社,PSP-003)进行精密过滤。处理条件为循环流量1.8L/min(膜内线速度0.8m/s)、平均压力0.06MPa、以15分钟间隔从膜的透过侧进行逆向清洗、测定从逆向清洗之后到下一次逆向清洗为止之间的15分钟期间的平均的酶透过率以及透过流量,达到成为恒定为止大约进行2小时的过滤。透过液进行取样后立刻倒回到原液中,以尽可能保持原液的酶的浓度以及液量不变(以下称之为“全循环操作”)。酶的透过率达到恒定后暂时停止装置的运转,分别添加表1所示的量的表1所示的表面活性剂,混合15分钟,再一次同样地在逆向清洗之后进行15分钟过滤,测定透过液中的酶的透过率以及透过流量。之后,同样地添加阳离子性表面活性剂以增加活性剂的浓度,由此调查活性剂浓度与酶的透过率以及透过流量之间的关系。 酶的透过率以下面的(1)式来进行定义。
酶的透过率(%)=透过液活性(单位)/原液活性(单位)×100(1)
酶的活性测定法-酪蛋白法
将含有酪蛋白1%(v/v)(hanmerstein,MERCK公司)的50mM硼酸缓冲液(pH10)1.0ml在30℃的温度条件下保温5分钟后,加入0.1ml的酶溶液,使之反应15分钟。加入反应停止液(0.11M三氯醋酸-0.22M醋酸钠-0.33M醋酸)2.0ml,在室温下放置10分钟之后进行过滤(No1滤纸,ADVANTEC东洋),将滤液中的酸可溶蛋白质通过Lowry法(J.Biol.Chem.,193,265275,1981)以如下方式进行定量。将碱性铜溶液(1%酒石酸钠钾∶1%硫酸铜∶1%碳酸钠=1∶1∶100)2.5ml添加到0.5ml的滤液中,在30℃的温度条件下放置10分钟后,加入苯酚稀释液(用去离子水将苯酚试剂(关东化学)稀释2倍)0.25ml并恒温30分钟之后,测定660nm波长下的吸光度。酶的1个单位是,在上述反应中在1分钟期间游离相当于1mmol的酪氨酸的酸可溶蛋白质分解物所必要的酶的量。
蛋白质浓度的测定法
根据上述Lowry法,以牛血清白蛋白作为标准,测定蛋白质浓度。
从表1的结果可知,通过添加阳离子性表面活性剂,精密过滤中的酶的透过率以及透过流量有了大幅度的提高。另外,可知阴离子性表面活性剂与阳离子性表面活性剂相比较提高酶的透过率的效果小,并且阴离子性表面活性剂没有提高透过流量的效果。
实施例8以及比较例3、4
以成为2%浓度的形式将硫酸钠溶解于上述实施例1中所使用的碱性蛋白酶的UF浓缩液(蛋白浓度4.8%(w/v))中,将该溶液23.5L在10℃的温度条件下由有效膜面积0.2m2、细孔径0.25μm、丝内径0.7mmФ模块长度347mm、丝数目400根的中空丝精密过滤膜(旭化成株式会社制,PMP-102)以全循环操作进行精密过滤。处理条件为循环流量7.2L/min(膜内线速度0.8m/s)、平均压力0.05MPa,施行的操作与实施例1相同。酶的浓度达到恒定后暂时停止装置的运转,分别以表2所示的量将表2所示的表面活性剂添加到原液中,混合15分钟,再一次同样地在逆向清洗之后进行15分钟过滤,测定透过液中的酶的浓度以及透过流量。另外,图1表示相对于各自的表面活性剂的浓度的效果的差异。
表2
从表2以及图1的结果可知,即使膜的尺寸有所改变,但同样通过添加阳离子性表面活性剂,精密过滤中的酶的透过率以及透过流量仍然会有大幅度的提高。另外,可知阴离子性表面活性剂与阳离子性 表面活性剂相比较提高酶的透过率的效果小,并且阴离子性表面活性剂提高透过流量的效果也小。
实施例9以及比较例5
在比较例1和实施例4-1中,除了代替Bacillus sp.KSM-9865(FEM-P18566号)的碱性蛋白酶(等电点9.5附近)而使用Bacillus sp.KSM-K16的碱性蛋白酶(等电点10.2附近)的UF浓缩液(菌体浓度0%(v/v)、蛋白浓度5.6%(w/v))以外,施行的操作与比较例1和实施例4-1相同。其结果由表3所示。
表3
表面活性剂 | 商品名 | 实施例 No. | 表面活性剂浓度 (纯组分%(v/v)) | 酶透过率 (%) | 透过流量 (L/m2/Hr) |
- | - | 比较例5 | 0 | 55 | 35 |
鲸蜡基三甲基 氯化铵 | QUATAMIN-60W (花王株式会社) | 实施例9 | 0.03 | 100 | 112 |
从表3可知,即使是在不同的酶当中,通过添加阳离子性表面活性剂,精密过滤中的酶的透过率以及透过流量仍然会有大幅度的提高。
Claims (2)
1.一种酶的制造方法,其特征在于:
是一种从菌体浓度为1%(v/v)以下且酶的浓度以蛋白质的含量计为1%(w/v)以上且酶的等电点为7~13的含酶的液体通过精密过滤来回收酶的方法,
在该含酶的液体中添加0.03~0.3%(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。
2.一种酶的制造方法,其特征在于:
从菌体浓度大于1%(v/v)的发酵培养液分离菌体,将所得到的含酶的液体通过超滤来进行精制且浓缩,在所得到的菌体浓度为1%(v/v)以下且酶的浓度以蛋白质的含量计为1%(w/v)以上且酶的等电点为7~13的含酶的液体中添加0.03~0.3%(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。
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秦燕等.膜式酶生物反应器及其应用.粮油加工与食品机械 2.2000,(2),21-24. |
秦燕等.膜式酶生物反应器及其应用.粮油加工与食品机械 2.2000,(2),21-24. * |
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